Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65137

⸱

12 mei 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

Samenvatting

Magnetisch pincet met één molecuul (MT's) heeft gediend als krachtig hulpmiddel om biomoleculen, zoals nucleïnezuren en eiwitten, krachtig te ondervragen en is daarom klaar om nuttig te zijn op het gebied van mechanobiologie. Omdat de methode vaak afhankelijk is van beeldgebaseerde tracking van magnetische kralen, heeft de snelheidslimiet bij het opnemen en analyseren van afbeeldingen, evenals de thermische fluctuaties van de kralen, de toepassing ervan lang belemmerd bij het observeren van kleine en snelle structurele veranderingen in doelmoleculen. Dit artikel beschrijft gedetailleerde methoden voor de constructie en werking van een MT-opstelling met hoge resolutie die nanoschaal, millisecondedynamiek van biomoleculen en hun complexen kan oplossen. Als toepassingsvoorbeelden worden experimenten met DNA-haarspelden en SNARE-complexen (membraanfusiemachines) gedemonstreerd, waarbij de nadruk ligt op hoe hun voorbijgaande toestanden en overgangen kunnen worden gedetecteerd in de aanwezigheid van piconewton-schaalkrachten. We verwachten dat snelle MT's zeer nauwkeurige nanomechanische metingen mogelijk zullen blijven maken op moleculen die krachten in cellen waarnemen, overbrengen en genereren, en daardoor ons begrip van mechanobiologie op moleculair niveau verdiepen.

Inleiding

Cellen voelen en reageren actief op mechanische prikkels. Daarbij vertonen veel biomoleculen krachtafhankelijke eigenschappen die dynamische structurele veranderingen mogelijk maken. Bekende voorbeelden zijn mechanosensitieve ionkanalen en cytoskeletelementen die de cellen voorzien van belangrijke mechanische informatie uit hun omgeving.

Daarnaast kunnen moleculen die een unieke krachtdragende aard vertonen ook in bredere zin als mechanosensitief worden beschouwd. Lokale vorming en smelten van nucleïnezuurduplexen, evenals hogere-ordestructuren zoals G-quadruplexen, spelen bijvoorbeeld een cruciale rol bij replicatie, transcriptie, recombinatie en meer recent genoombewerking. Bovendien voeren sommige neuronale eiwitten die betrokken zijn bij synaptische communicatie hun functies uit door fysieke krachten te genereren die de niveaus van typische intermoleculaire interacties overschrijden. Het maakt niet uit welk voorbeeld men bestudeert, het onderzoeken van nanomechanica van de betrokken biomoleculen met hoge spatiotemporale precisie zal zeer nuttig blijken te zijn bij het onthullen van moleculaire mechanismen van de bijbehorende mechanobiologische processen 1,2,3.

Single-molecule krachtspectroscopiemethoden hebben gediend als krachtige hulpmiddelen om de mechanische eigenschappen van biomoleculen 2,4,5,6 te onderzoeken. Ze kunnen structurele veranderingen in nucleïnezuren en eiwitten gelijktijdig met de toepassing van kracht volgen, waardoor krachtafhankelijke eigenschappen worden onderzocht. Twee bekende opstellingen zijn optische pincetten en magnetische pincetten (MT's), die kralen ter grootte van een micron gebruiken om moleculen 5,6,7,8 te manipuleren. In deze platforms worden polystyreen (voor optische pincetten) of magnetische kralen (voor MT's) vastgebonden aan doelmoleculen (bijv. Nucleïnezuren en eiwitten) via moleculaire "handvatten", meestal gemaakt van korte fragmenten van dubbelstrengs DNA (dsDNA). De kralen worden vervolgens verplaatst om kracht uit te oefenen en in beeld gebracht om hun locaties te volgen die rapporteren over structurele veranderingen in doelmoleculen. Optische en magnetische pincetten zijn grotendeels uitwisselbaar in hun toepassingen, maar er zijn belangrijke verschillen in hun benaderingen van het regelen van kracht. Optische pincetten zijn intrinsiek positiekleminstrumenten die kralen in positie vangen, waardoor de uitgeoefende kracht fluctueert wanneer een doelconstructie vormveranderingen ondergaat; Extensieverhoging, zoals door het uitvouwen, maakt de tether los en vermindert de spanning, en vice versa. Hoewel actieve feedback kan worden geïmplementeerd om de kracht in optische pincetten te regelen, werken MT's daarentegen van nature als een krachtklemapparaat, waarbij gebruik wordt gemaakt van stabiele, verafgelegen magnetische krachten door permanente magneten, die ook bestand zijn tegen omgevingsverstoring.

Ondanks hun lange geschiedenis en eenvoudige ontwerp zijn MT's achtergebleven bij optische pincetten in hun toepassingen voor zeer nauwkeurige metingen, grotendeels vanwege technische uitdagingen bij het volgen van snelle kralen. Onlangs hebben verschillende groepen echter gezamenlijk leiding gegeven aan een veelzijdige verbetering van zowel hardware als software voor MT-instrumenten 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In dit werk introduceren we een voorbeeld van een dergelijke opstelling die op 1,2 kHz draait en beschrijven we hoe deze kan worden gebruikt om nanomechanische metingen uit te voeren op krachtgevoelige biomoleculen. Als modelsystemen gebruiken we DNA-haarspelden en neuronale SNARE-complexen en onderzoeken we hun snelle, structurele veranderingen in het piconewton-regime. DNA-haarspelden vertonen eenvoudige tweetoestandsovergangen in een goed gedefinieerd krachtbereik van20,21 en dienen daarom als speelgoedmodellen om de prestaties van een pincetopstelling te verifiëren. Terwijl de SNARE-eiwitten zich samenvoegen tot een krachtgevoelig complex dat membraanfusie22 aandrijft, zijn ze ook uitgebreid bestudeerd door krachtspectroscopie met één molecuul 14,23,24,25. Standaardbenaderingen voor het analyseren van gegevens en het extraheren van nuttige informatie over thermodynamica en kinetiek worden gepresenteerd. We hopen dat dit artikel de toepassing van zeer nauwkeurige MT's in mechanobiologische studies kan vergemakkelijken en lezers kan motiveren om hun eigen krachtgevoelige interessesystemen te verkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden beschreven, worden vermeld in de materiaaltabel. LabVIEW-software om de hieronder beschreven snelle MT-installatie te bedienen, evenals de MATLAB-scripts om voorbeeldgegevens te analyseren, worden gedeponeerd op GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) en openbaar beschikbaar.

1. Constructie van apparatuur

OPMERKING: Het algemene principe van de high-speed MT-constructie is vergelijkbaar met standaard, conventionele MT-systemen, met uitzondering van het gebruik van een high-speed complementaire metaaloxide halfgeleider (CMOS) camera en een krachtige, coherente lichtbron (figuur 1). Raadpleeg andere bronnen voor meer beschrijvingen van standaard MT-instrumenten 5,26,27.

  1. Plaats een omgekeerde microscoop op een optische antitrillingstafel. Installeer een high-speed CMOS-camera en een frame grabber.
  2. Bouw een vertaalfase voor het manipuleren van magneten in 3D. Monteer een gemotoriseerde lineaire trap (>20 mm veerweg) verticaal bovenop een handmatige XY-trap.
    OPMERKING: De verticale beweging regelt de kracht, terwijl de XY-trap is voor de handmatige uitlijning van magneten op de optische as voor de initiële constructie van de opstelling.
  3. Installeer een roterende stappenmotor en een riem- en katrolsysteem voor roterende magneten.
    OPMERKING: De riem geeft de roterende beweging door tussen de motoras en magneten die een paar centimeter van elkaar verwijderd zijn. De rotatie van magneten is intern in de translatiemanipulatie.
  4. Monteer de magneten. Gebruik een acrylhouder (besteld bij een productiebedrijf; zie aanvullende figuur S1) die twee identieke magneten strak parallel kan huisvesten, met een goed gedefinieerde opening van 1 mm tussen de magneten (figuur 1B). Om de maximale kracht te gebruiken die met een bepaald paar magneten kan worden verkregen, past u de verticale positie van de translatietrap zo aan dat het onderste oppervlak van de magneten wordt uitgelijnd met het monstervlak wanneer het naar de laagste positie wordt verplaatst.
    OPMERKING: Raadpleeg Lipfert et al. voor meer informatie over het ontwerp en de configuratie van magneten28. De hoogte en oriëntatie van magneten worden geregeld door de LabVIEW-software in combinatie met data-acquisitie.
  5. Als u met een objectief objectief met lage vergroting kijkt, lijnt u de magneten uit op het midden van het gezichtsveld. Controleer of het draaien van de magneten geen grote verplaatsing van het midden van het magneetpaar veroorzaakt.
    OPMERKING: Als het middelpunt tussen de magneten om de rotatieas draait, is het waarschijnlijk dat de magneten uit het midden zijn gecentreerd vanwege een onvolmaakte houder. Een klein niveau van verkeerde uitlijning ten opzichte van de spleetgrootte is aanvaardbaar, omdat de magneetrotatie alleen is voor het controleren van tethers en het toepassen van koppels in specifieke toepassingen.
  6. Installeer een superluminescente diode (SLD) voor de verlichting van kralen. Laat de bundel door de opening van 1 mm tussen de twee magneten lopen. Zorg ervoor dat de bundel goed gecollimeerd is om in de opening te passen en dat de verlichting niet wordt overschaduwd door de magneten.
  7. Installeer een piëzolensscanner op het neusstuk en monteer een 100x olie-immersie objectieflens (numeriek diafragma [NA]: 1.45) voor het volgen van kralen. Om potentiële artefacten in trackingresultaten te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de verlichting gelijkmatig wordt gehandhaafd wanneer de magneten worden verplaatst. Pas ten slotte het lichtniveau aan op de maximale helderheid zonder pixels te verzadigen.
    OPMERKING: Voor de vergelijking van verschillende lichtbronnen voor het snel volgen van kralen, zie Dulin et al.29.

2. Kalibratie van magnetische kracht

  1. Bereid met behulp van polymerasekettingreactie (PCR; zie tabel 1) 5 kbp dsDNA-fragmenten (met primer B, primer Z_5k en λ-DNA) die aan het ene uiteinde zijn gelabeld met biotine (voor oppervlaktebevestiging) en azide aan het andere uiteinde (voor kralenaanhechting).
  2. Bereid na rubriek 6 een stroomcel voor met de 5 kbp-moleculen.
  3. Identificeer volgens paragraaf 7 een goede kraal-tetherconstructie door de extensie en rotatie ervan te verifiëren. Zorg er in het bijzonder voor dat u een kraal kiest met een minimaal rotatietraject (d.w.z. met een straal < 200 nm) om de verschuiving van de kraalhoogte te minimaliseren als gevolg van een niet-gecentreerde bevestiging30,31. Zodra een goede tether is geïdentificeerd, begint u met het volgen van kralen, verwijzend naar sectie 9.
  4. Als de opstelling nieuw is, karakteriseer dan de ruis en stabiliteit voor betrouwbare metingen met hoge resolutie. Plaats de magneet ~3 mm van het oppervlak van de stromingscel (om >10 pN toe te passen en de Brownse beweging van een kraal te onderdrukken), volg de z-positie van de kraal op 1,2 kHz en bereken de Allan-afwijking (AD) van de z-coördinaat tijdreeks32,33 (figuur 2C). Controleer of AD-waarden van enkele nanometers haalbaar zijn in het hogesnelheidsregime (<0,1 s) en of differentiële tracking (magnetische kraalpositie ten opzichte van een referentiekraal) AD in de langere tijdschaal vermindert.
    OPMERKING: We verkrijgen meestal een AD van <3 nm met de maximale snelheid (1,2 kHz of 0,83 ms resolutie), en de AD blijft ten minste tot 10 s dalen, wat een minimale drift impliceert. Anderen hebben vergelijkbare waarden gemeld op vergelijkbare opstellingen 9,10,11,12,34.
  5. Noteer met magneten in de ruststand (F ~ 0 pN) de x- en y-coördinaten van de vastgebonden kraal op 1,2 kHz. Noteer de positie gedurende een voldoende lange periode (dat wil zeggen voldoende langer dan de karakteristieke relaxatietijd van fluctuatie35) zodat de Brownse beweging voldoende wordt bemonsterd.
    OPMERKING: Hier is de x-richting langs de richting van het magnetisch veld, terwijl de beweging in y de transversale beweging loodrecht op het veld vertegenwoordigt.
  6. Beweeg de magneten dichter bij de stroomcel en herhaal de kraalpositiemetingen totdat de magneten de bovenkant van de stroomcel zachtjes raken. Beweeg in grote stappen (bijv. 1-2 mm) wanneer de magneten zich op meer dan 7 mm afstand van het monstervlak bevinden (omdat de uitgeoefende kracht langzaam toeneemt in het verre veld van magneten), maar verklein de stapgrootte geleidelijk (bijv. 0,1-0,5 mm) naarmate ze dichterbij komen voor fijnere kalibratie bij hogere krachtniveaus (figuur 2B).
  7. Bereken de kracht op elke magneetpositie, d, met behulp van een van de twee alternatieve methoden (een MATLAB-script "force calibration.m" inclusief beide methoden wordt verstrekt; zie Aanvullend bestand 1).
    1. Meet de variantie van de y-coördinaten figure-protocol-1 van de kraal (figuur 2D) en de gemiddelde z-positie van de kraal ten opzichte van de laagste positie figure-protocol-2 (figuur 2B, onder). Gebruik vervolgens vergelijking (1)7,27,36 om de kracht te schatten (met een vaste kralenstraal R = 1.400 nm en thermische energie kRT = 4,11 pN∙nm):
      figure-protocol-3(1)
    2. U kunt ook de vermogensspectrale dichtheid (PSD) van de y-coördinaten, Sy(figuur 2E) berekenen. Bepaal de uitgeoefende kracht F door een dubbel-Lorentzisch model37 op de gemeten Sy te monteren met behulp van vergelijking (2).
      figure-protocol-4(2)
      figure-protocol-5Hier is , R de kralenstraal, γ yen γφ zijn respectievelijk de translatie- en rotatieweerstandscoëfficiënten (geschat op basis van de Stokes-Einsteinvergelijking), kRT is de thermische energie, f + en f- zijn twee karakteristieke frequenties verkregen met behulp van vergelijking (3).
      figure-protocol-6 (3)
      OPMERKING: Aangezien de tether-extensie L een functie van kracht is die het gevestigde wormachtige ketenmodel (WLC) volgt, laten de bovenstaande uitdrukkingen F als de enige passende parameter (we stellen R vast op 1.400 nm voor eenvoud omdat het wordt gedeeld over alle krachtniveaus en de exacte waarde de resultaten niet merkbaar beïnvloedt). Indien nodig moeten bewegingsonscherpte en aliasing van cameragebaseerde beeldacquisitie worden beschouwd als38,39, maar dit effect is verwaarloosbaar in onze hogesnelheidsmetingen boven 1 kHz met 5 kbp tethers.
  8. Herhaal stap 2.4-2.7 voor nog een paar constructies. Onderzoek drie tot vijf verschillende kralen om de krachtvariabiliteit tussen de magnetische kralen te berekenen.
    OPMERKING: Krachtvariatie tussen de gebruikte magnetische kralen moet worden overwogen om het juiste aantal constructies voor middeling te bepalen. Deze variabiliteit is klein, maar kan leiden tot meer dan 1 pN fout in de gemeten kracht, zelfs voor commerciële producten31. Voor de meeste toepassingen, waar de absolute bepaling van de betrokken krachten niet cruciaal is, is het gemiddelde van de kalibratieresultaten van drie tot vijf kralen over het algemeen voldoende. Een alternatieve benadering om deze variatie te verklaren is om de kracht te meten met individuele tethers aan het begin van het experiment, wat tijdrovend kan zijn. Een andere optie is om haarspeldstructuren in te bedden die op bekende krachtniveaus in elke constructie31 worden uitgepakt.
  9. Plot de gemeten kracht als een functie van de magneetafstand en pas een dubbele exponentiële functie toe aan de gegevens (figuur 2F) met behulp van vergelijking (4).
    figure-protocol-7(4)
    Hier zijn F0 (basislijn), A 1 en A 2 (amplitudes) en d 1 en d2 (vervalconstanten) passende parameters. Zorg ervoor dat de krachtwaarden van de twee methoden, evenals de resulterende dubbele exponentiële aanvallen, grotendeels overeenkomen (figuur 2F, G).
    OPMERKING: Om te bevestigen dat de krachtkalibratie correct wordt uitgevoerd, controleert u de kracht-uitbreidingsrelatie van de sondeconstructies door de extensie uit te zetten ten opzichte van de gemeten kracht.
  10. Om te corrigeren voor de kraalhoogte offset z off als gevolg van krachtafhankelijke kanteling van de magnetische kralen30,31, schat z off van de laterale offset x off, rekening houdend met de geometrie van een off-centered tether met een kralenstraal met behulp van vergelijking (5), en past u de waarden toe op de gemeten extensiewaarden. Deze stap is geïmplementeerd in het MATLAB-script "force calibration.m" (regels 252-254).
    figure-protocol-8(5)
    OPMERKING: Hoewel deze correctie kleine wijzigingen aanbrengt in de extensie, vooral voor de kralen met een kleine rotatieradius (<200 nm), heeft deze verschuiving vaak een kritische invloed op de elastische respons, zoals te zien is in de verandering van figuur 2H naar figuur 2I 30,31.
  11. Controleer de persistentielengte Lp door een uitbreidbaar WLC-model aan de gegevens toe te passen met behulp van vergelijking (6).
    figure-protocol-9(6)
    Hier is L 0 de contourlengte (1,7 μm voor 5 kbp) en K0 de modulus voor enthalpische stretching.
    OPMERKING: Hoewel de L p van dsDNA algemeen wordt geaccepteerd als 40-50 nm in een typische buffer zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), onderschat de WLC-formule toegepast op korte moleculen (<5 kbp) systematisch L p als L0 31,40 afneemt. Dit komt omdat het klassieke WLC-model uitgaat van een polymeer waarvan de ketenlengte voldoende langer is dan de persistentielengte. Hier verkregen we L p = 40 ± 3 nm voor de 5 kbp-constructie (figuur 2H), en de extensiecorrectie leverde verder een homogene K0 op van 1.100 ± 200 pN (figuur 2I). Het toepassen van een eindig WLC-model 31,40, evenals een correctie voor niet-Gaussianiteit in extensieverdeling 41, zal Lp licht verhogen.
  12. Zodra de krachtkalibratie is geverifieerd, past u de verkregen aanpassingsparameters van het dubbel-exponentiële model toe op de meegeleverde LabVIEW-software (aanvullend bestand 2) en wacht u tot de software de huidige kracht in realtime berekent op basis van motormetingen (d.w.z. magneetpositie). Aangezien er geen analytische expressie voor de inverse functie d(F) beschikbaar is, stelt u een opzoektabel van d versus F voor in stappen van 0,1 pN door numerieke schatting van voor de d-doelkrachtniveaus. Sla deze tabel ook op in de software om de krachtcontrole te regelen.

3. Synthese van DNA-haarspelden

OPMERKING: DNA-haarspeldconstructies voor MT-experimenten worden voorbereid door PCR-amplificatie van een 510 bp-gebied in λ-DNA met twee aangepaste primers, waarvan er één een haarspeldstructuur bevat op het 5′-uiteinde (figuur 3A). Op deze manier wordt aan het ene uiteinde van het PCR-product een haarspeldmotief geplaatst.

  1. Bereid de primers voor.
    1. Voorwaartse primer: Primer B_hp die 5′-biotine-gelabeld is voor bevestiging van het glasoppervlak en bindt aan λ-DNA. Deze primer bevat een haarspeldmotief met een steel van 8 bp en een lus van 6 nt, 5′ naar het λ-bindende gebied.
    2. Omgekeerde primer: Primer Z_hp die 5′-azide-gelabeld is voor magnetische kraalbevestiging en bindt aan λ-DNA 1 kbp verwijderd van de voorwaartse primer.
  2. Stel de PCR in en voer deze uit met λ-DNA (sjabloon), nTaq-polymerase en standaard PCR-condities (zie tabel 1). Reinig het product met een commerciële zuiveringskit.
  3. Meet de DNA-concentratie door UV-absorptie bij 260 nm (A260) en voer agarosegel-elektroforese (2% gel) uit (zie tabel 2) om de productgrootte te controleren. Een typische opbrengst is ~35 μL van ~600 nM oplossing.

4. Bereiding van SNARE-eiwitten

OPMERKING: Neuronale SNARE-complexen worden samengesteld door drie gezuiverde ratteneiwitten te combineren die tot expressie komen uit E. coli: VAMP2 / synaptobrevine-2, syntaxine-1A en SNAP-25 (figuur 3B). Om hun assemblage te vergemakkelijken, worden syntaxine en SNAP-25 samen uitgedrukt met een VAMP2-fragment (zonder het N-terminale gebied; genaamd "ΔN-VAMP2") in een structuur die het "ΔN-complex" wordt genoemd, en vervolgens gemengd met VAMP2 over de volledige lengte na DNA-handgreepaanhechting om volledige complexen te vormen.

  1. Bereid plasmiden die cDNA bevatten voor de expressie van SNARE-eiwitten voor (DNA-sequenties voor alle plasmiden worden gegeven in de tabel met materialen).
    1. Bereid 6×His-tagged VAMP2 voor zonder het transmembraandomein (2-97; L32C/I97C voor disulfidekoppelingen) gekloond tot een pET28a-vector.
    2. Bereid syntaxine-1A voor zonder de Habc en het transmembraandomein (191-267, I202C/I266C-substituties voor disulfidekoppelingen) gekloond samen met 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49-96) in een pETDuet-1-vector.
    3. Bereid de volledige lengte SNAP-25 isovorm b (2-206, alle C tot A) gekloond in een pET28a vector. Dit zal worden gebruikt voor het voorbereiden van ΔN-complexen.
    4. Bereid de 6×His-tagged full-length SNAP-25 isoform b (1-206, alle C tot A) gekloond in een pET28a vector voor voor directe toevoeging aan de MT assay buffer om de SNARE complexen na het ontvouwen weer samen te stellen.
  2. Bereid twee buisjes Rosetta (DE3) E. coli cellen. Transformeer één groep met VAMP2-plasmiden (uit stap 4.1.1), één met zowel syntaxine-1A/ΔN-VAMP2 als niet-gelabelde SNAP-25-plasmiden (uit stappen 4.1.2 en 4.1.3) voor het tot expressie brengen van het ΔN-complex, en de andere met His-tagged SNAP-25-plasmiden (uit stap 4.1.4).
  3. Breng de getransformeerde cellen over in Luria-Bertani-bouillon (LB) met geschikte antibiotica (hier kanamycine en chlooramfenicol voor VAMP2 en His-tagged SNAP-25; kanamycine, chlooramfenicol en ampicilline voor ΔN-complex). Kweek ze bij 37 °C in een schudincubator (220 rpm) totdat de optische dichtheid (OD) van de bouillon 0,7-0,9 bereikt.
  4. Voeg 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe om eiwitexpressie te induceren en incubeer de cellen gedurende 3-4 uur bij 37 °C in een schudincubator (220 rpm).
  5. Pellet de cellen door de cultuur gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 4.500 × g te centrifugeren.
  6. Bereid buffers voor eiwitzuivering voor (zie tabel 2).
  7. Suspensie SNARE-tot expressie brengende celpellets in 40 ml ijskoude lysisbuffer en lyseer de cellen door ultrasoonapparaat op ijs (15% amplitude, 5 s aan en 5 s uit, 30 minuten totaal).
  8. Centrifugeer het lysaat bij 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C om onoplosbare materialen te verwijderen.
  9. Passeer het supernatant door een zwaartekrachtkolom gevuld met 1 ml Ni-NTA-hars. Was de hars met wasbuffer A, vervolgens met wasbuffer B en elueer de eiwitten met 10 ml elutiebuffer.
  10. Verwijder tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en imidazool uit het eluent met behulp van een ontzoutingskolom (volg de instructies van de fabrikant). Elueer het monster met PBS.
  11. Concentreer de eiwitten met centrifugaalfilters (10 kDa cutoff) tot ~ 70 μM met behoud van de eiwitten in PBS (meestal met een opbrengst van 2 ml). Meet de eiwitconcentratie door ultraviolette (UV) absorptie bij 280 nm (A280) of door de Bradford-test.
  12. Bereid kleine aliquots, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Volledige SNARE-complexen worden geassembleerd na conjugatie van ΔN-complex op een DNA-handvat (zie hieronder).

5. Bevestiging van DNA-handgrepen

OPMERKING: Twee 510 bp dsDNA-handgrepen met primaire aminegroepen aan het ene uiteinde worden eerst bereid door PCR en de aminegroepen worden vervolgens omgezet in maleimidegroepen met behulp van een bifunctionele crosslinker, SM (PEG) 2. De twee handvatten worden vervolgens covalent gekoppeld aan SNARE-complexen via hun cysteïnegroepen voor plaatsspecifieke conjugatie (figuur 3B).

  1. Bereid primers voor.
    1. Bereid voorwaartse primers voor: Primer B (voor het versterken van handvat B) die 5′-biotine-gelabeld is voor bevestiging van het glasoppervlak en bindt aan λ-DNA; Primer Z (voor het versterken van Handle Z) die 5′-azide-gelabeld is voor magnetische kraalbevestiging en dezelfde volgorde heeft als Primer B.
    2. Bereid een omgekeerde primer voor: Primer N (gedeeld voor Handle B en Handle Z) die 5′-amine-gelabeld is voor eiwitconjugatie en bindt aan λ-DNA 510 bp weg van de voorwaartse primer.
  2. Stel twee sets PCR-reacties in (18 buisjes met een reactie van 200 μL voor elk handvat) met λ-DNA (sjabloon), nTaq-polymerase en standaard PCR-condities (zie tabel 1). Reinig het product met een PCR-reinigingskit en elueer elk handvat met 45 μL ultrapuur water. Gebruik een minimaal volume water om hoge concentraties handgrepen te verkrijgen voor een effectieve reactie in latere stappen.
  3. Meet de DNA-concentratie met A260. De typische opbrengst is ~650 μL ~2 μM oplossing voor elk handvat. Houd kleine monsters uit elkaar voor latere verificatie bij agarosegel-elektroforese.
  4. Reageer elke handgreep (1 μM in PBS) met 5 mM SM(PEG)2. Incubeer bij kamertemperatuur met zachte rotatie. Gebruik na 1 uur een DNA-zuiveringskit om niet-gereageerde SM(PEG)2 te verwijderen. Elueer elk handvat met 250 μL PBS om ~2 μM oplossingen te verkrijgen.
  5. Meng de oplossingen van handvat B en ΔN-complex in een molaire verhouding van 1:16 (bijv. 1 μM handvat B en 16 μM ΔN-complex) in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met roeren. Houd een klein monster apart voor agarosegel-elektroforese.
  6. Voeg een oplossing van VAMP2 toe in een 2,5-voudige molaire overmaat over het ΔN-complex dat in de vorige stap is gebruikt. Incubeer het mengsel gedurende nog eens 1 uur bij kamertemperatuur met roeren. In deze stap worden volledige SNARE-complexen geassembleerd.
  7. Verwijder vrije eiwitten door bufferuitwisseling met verse PBS en een centrifugaalfilter (100 kDa-afsnijding): centrifugeer bij 14.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, herhaal ten minste 6x en laat 15 minuten draaien voor de laatste spin. Meet de toename van de A260/A280-verhouding om de verwijdering van vrije eiwitten te controleren. Houd een klein monster apart voor agarosegel-elektroforese.
  8. Voeg handvat Z toe aan de oplossing in een 15-voudige kiesovermaat boven handvat B. Houd de concentratie van handvat Z ten minste boven 1 μM om de reactie te vergemakkelijken. Incubeer het mengsel een nacht bij 4 °C met roeren.
  9. Controleer de tussenproducten (handvat B en de eiwitconjugaten daarvan) en het eindproduct (SNARE-complex met twee handvatten) door agarosegel-elektroforese (figuur 3B, inzet) (zie tabel 2).
    OPMERKING: Als de eiwitten met succes aan handvat B zijn bevestigd, wordt een mobiliteitsverschuiving gedetecteerd. In het bijzonder kan de vorming van volledige SNARE-complexen op DNA-handgrepen worden bevestigd door hun resistentie tegen natriumdodecylsulfaat (SDS), in tegenstelling tot ΔN-complexen, die in SDS worden gedemonteerd en alleen syntaxine aan DNA gebonden laten (vergelijk b en c in figuur 3B).
  10. Bereid kleine aliquots, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Hoewel de uiteindelijke oplossing niet-gereageerde handgrepen bevat, wordt alleen het gewenste construct dat dubbel is gelabeld met biotine en azide geselecteerd tijdens de monsterassemblage in een stroomcel.

6. Fabricage van flowcellen

OPMERKING: Flowcellen voor MT-metingen zijn opgebouwd uit twee glazen afdekplaten die met dubbelzijdige tape aan elkaar zijn verbonden (figuur 3C). Eén coverslip is gecoat met een mengsel van PEG en gebiotinyleerde polyethyleenglycol (PEG) om niet-specifieke binding te voorkomen en om specifieke tethering van doelmoleculen via biotine-NeutrAvidin-koppeling mogelijk te maken (figuur 3D). Vervolgens worden de oplossingen van materialen voor MT-experimenten sequentieel in een stroomcel toegediend met behulp van een spuitpomp (figuur 3C, D).

  1. Bereid twee glazen afdekplaten voor, elk één voor het oppervlak aan de bovenkant (24 mm × 50 mm, nr. 1,5 dikte) en het onderste (24 mm × 60 mm, nr. 1,5 dikte). Reinig de coverslips door sonicatie in 1 M KOH gedurende 30 minuten. Spoel na het ultrasoonapparaat de afdekstroken af met gedestilleerd water en bewaar in water tot de volgende stap.
  2. PEGylateer de onderste coverslip volgens gepubliceerde protocollen42,43. Gebruik N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethyleendiamine voor silanisatie en een 1:100 (ww) mengsel van biotine-PEG-SVA en mPEG-SVA in 100 mM bicarbonaatbuffer. Houd de PEGylated coverslips droog bij -20 °C en bewaar ze enkele weken.
  3. Haal op de dag van de experimenten de PEGylated coverslips eruit en föhn ze met een stikstofpistool. Inspecteer ze visueel op vuil om er zeker van te zijn dat ze schoon zijn.
  4. Om de monsterkanalen te maken, bereidt u ~ 2 mm brede stroken dubbelzijdige tape voor en legt u vier stroken neer op een bodemafdekplaat (PEGylated surface up), evenwijdig aan en van elkaar gescheiden door ~ 5 mm (figuur 3C).
    OPMERKING: Op deze manier kunnen drie 5 mm brede monsterkanalen worden gemaakt in een enkele stroomcel.
  5. Plaats een bovenste coverslip in het midden van de onderste coverslip, waardoor ~ 5 mm ruimte overblijft aan de korte randen voor kanaalinlaten en -uitlaten. Druk voorzichtig met een pincet op de achterkant van de bovenste coverslip om de kanalen stevig af te sluiten.
  6. Om een inlaatreservoir te maken, snijdt u de rand van een pipetpunt van 200 μL af. Snijd ~ 10 mm uit de bredere opening om ~ 200 μL oplossing vast te houden. Maak er drie voor de drie stroomkanalen. Om de uitlaten te configureren, bereidt u drie spuitnaalden voor die passen op de slang voor de spuitpomp.
  7. Lijm met behulp van 5 minuten epoxy de reservoirs en naaldnaven op de stroomcel. Zorg ervoor dat een volledige afdichting wordt gevormd om lekkage te voorkomen en dat de kanalen niet worden geblokkeerd met overtollige lijm. Laat het minstens 30 minuten drogen.

7. Montage van kralen-tether constructies

OPMERKING: De oplossingen van materialen voor MT-experimenten, inclusief die voor bead-tether-constructen, worden sequentieel in stroomcellen gebracht met behulp van een spuitpomp (figuur 3C, D).

  1. Bereid magnetische kralen voor. Neem 5 mg M270-epoxykorrels uit een stamoplossing (~3,3 × 108 kralen in 167,5 μL dimethylformamide) en vervang het oplosmiddel door fosfaatbuffer (zie tabel 2) door magnetische scheiding van de kralen.
  2. Bereid de kralen op ~1,1 × 109 kralen ml−1 in een fosfaatbuffer met 1 M ammoniumsulfaat en reageer ze met 2 mM dibenzocyclooctyne (DBCO)-NH2. Incubeer het mengsel gedurende 3 uur op een roterende mixer bij kamertemperatuur. Was na de reactie de kralen 3x met verse fosfaatbuffer om niet-gereageerde moleculen te verwijderen.
    OPMERKING: De gewassen kralen kunnen zonder extra rotatie bij 4 °C enkele weken voor gebruik worden bewaard.
  3. Sluit een naald op de uitgang van het stroomcelkanaal aan op de spuitpomp met polyethyleenslang. Breng de kanalen in evenwicht met PBS.
  4. Introduceer de volgende oplossingen sequentieel in het kanaal door met de pomp te zuigen: NeutrAvidin, doelconstructies (DNA-haarspelden of SNARE-complexen met DNA-handgrepen), referentiepolystyreenparels en DBCO-gecoate magnetische kralen. Draai voor gebruik de kraaloplossingen grondig om potentiële kralenaggregaten te verspreiden.
  5. Was ongebonden kralen weg terwijl je 0,1 pN kracht uitoefent.
    OPMERKING: De toepassing van een kleine opwaartse kracht vergemakkelijkt het verwijderen van ongebonden kralen en helpt het scheuren van specifiek gebonden kralen-tetherconstructies te voorkomen.
  6. Neem voor experimenten met SNARE-complexen 1,5 μM SNAP-25 op in de uiteindelijke buffer.
    OPMERKING: De vrije SNAP-25-moleculen kunnen SNARE-complexen na het ontvouwen opnieuw binden en herhaalde metingen op een enkel complex mogelijk maken.

8. Identificatie van doelconstructies

  1. Zoek op het oppervlak van een stroomcelkanaal naar de magnetische kralen die zijn vastgebonden door afzonderlijke moleculen van het doelconstruct. Zorg ervoor dat een referentiekraal zich in de buurt bevindt.
  2. Draai een kandidaat-kraal en controleer of deze vrij kan draaien. Als de kraal door meerdere moleculen is vastgebonden, vertoont deze een beperkte beweging.
  3. Draai de kraal een paar volledige beurten en ontdek de rotatiestraal (deze functie is geïmplementeerd in de meegeleverde software). Kies bij voorkeur een kraal met een kleine draaicirkel.
    OPMERKING: Deze straal geeft aan hoeveel de kraal niet gecentreerd is van de tether-as, die willekeurig wordt bepaald tijdens de kraal-tether-assemblage30,31. In alle experimenten verlicht minimale off-centering van een kraal veel artefacten die verband houden met de hoge verhouding tussen kraalstraal en tether-extensie die we gebruiken.
  4. Verhoog de kracht van 0 tot 5 pN om goede enkel-gebonden kralen te identificeren. Zoek naar een grote verandering in het diffractiepatroon van een kraal als gevolg van het uitrekken van een 1 kbp-tether (of de equivalente twee handgrepen van 510 bp). Als het diffractiepatroon niet significant verandert, verlaagt u de kracht tot nul en scant u naar een andere kandidaat-kraal.
    OPMERKING: Het ~ 300 nm optillen van een kraal kan gemakkelijk worden opgemerkt aan de hand van de onbewerkte afbeeldingen zonder het trackingproces daadwerkelijk te starten.

9. Kraal tracking voor uitbreidingsmetingen

OPMERKING: Het volgen van kralen wordt uitgevoerd door kralenafbeeldingen in realtime te analyseren in de LabVIEW-software die bij dit artikel wordt geleverd. De trackingmethode en zijn varianten zijn gebruikt in de meeste conventionele MT-systemen en worden uitgelegd in eerdere literatuur 2,5,7,26. Door de positie van een magnetische kraal ten opzichte van een vaste referentiekraal te meten (d.w.z. differentiële tracking), worden de positiemetingen extreem robuust voor een externe verstoring.

  1. Zodra een goede magnetische kraal zich samen met een referentiekraal bevindt, klikt u op de knop Kalibreren om te beginnen met de voorbereidingen voor het volgen van kralen.
  2. Klik op de kralen in de afbeelding om de locaties van de kralen te definiëren. De afbeeldingen worden vervolgens bijgesneden tot interessante regio's (ROI's) (bijvoorbeeld 150 x 150 pixels voor een kraal van 3 μm) rond de kralen en vervolgens verder geanalyseerd om de precieze kraalcoördinaten te extraheren.
  3. Wacht tot de magneetrotatie is voltooid. Dit proces registreert de x- en y-coördinaten van de kraal (door 2D-kruiscorrelatie 44 te berekenen of door radiale symmetrie 45 van de kraalafbeeldingen te gebruiken, met vergelijkbare prestaties) terwijl de magneten worden gedraaid om de niet-gecentreerde bevestiging van de kraal31 te documenteren.
  4. Voor het volgen in de z-richting, wacht tot de software een opzoektabel met diffractiebeelden van de kralen op verschillende afstanden van het brandpuntsvlak genereert. Dit wordt uitgevoerd door de objectieflens met een piëzoscanner in equidistante stappen te stappen en fluctuatiegemiddelde kraalbeelden op elke positie vast te leggen. Vervolgens worden de z-coördinaten van de kralen in daadwerkelijke experimenten bepaald door de real-time kralenafbeeldingen te vergelijken met de opzoektabel met interpolatie7.
  5. Wanneer het genereren van de opzoektabel is voltooid, schakelt u tracking en autofocus in (druk op track? en AF? Knoppen) en klik op de knop Verkrijgen om te beginnen met het opnemen van kraalposities.
    OPMERKING: Autofocus is optioneel, maar wordt aanbevolen om te corrigeren voor de faseafwijking in z tijdens de acquisitie.

10. Regelingen voor gedwongen toepassing

  1. Force-ramp experimenten: Om de kracht-uitbreidingsrelatie van de constructie te controleren, past u een krachtverhoging op en neer toe met een constante belastingssnelheid (± 1,0 pN s−1) (figuur 4A). Pas bijvoorbeeld drie rondes van een 0-20-0 pN-cyclus toe om de totale lengte van de constructie en de krachtuitbreidingscurve van de handgrepen te controleren.
  2. Door de tether-parameters in de software op te geven, legt u een WLC-krachtuitbreidingscurve over de gemeten gegevens en bepaalt u of de doelkraal is vastgebonden door een echte monsterconstructie met de juiste DNA-handgrepen. Gebruik de bekende contourlengte (bijvoorbeeld ~340 nm voor 1 kbp dsDNA) en WLC-persistentielengte (30-45 nm voor kortweg dsDNA31) van het construct als uitgangspunt. Pas indien nodig de extensiecorrectiemethode toe die wordt beschreven in stap 2.11.
  3. Als het construct is geverifieerd, onderzoekt u de krachtuitbreidingsrespons in detail om te zoeken naar extra uitbreiding als gevolg van de doelmoleculen-haarspelden of SNARE-complexen.
  4. Experimenten met constante kracht: Varieer geleidelijk de uitgeoefende kracht in discrete stappen om de krachtgevoeligheid van de doelmoleculen te onderzoeken (figuur 4B).
    OPMERKING: MT's maken eenvoudige en effectieve experimenten met constante kracht mogelijk omdat de uitgeoefende kracht constant wordt gehouden wanneer de magneten stil worden gehouden.
    1. Voor DNA-haarspelden past u 4-8 pN kracht toe met stappen van 0,2-0,5 pN en meet u de kraalpositie gedurende ~ 10 s op elk krachtniveau.
    2. Voor SNARE-complexen past u 14-16 pN kracht toe met stappen van 0,1-0,2 pN en meet u de kraalpositie gedurende ~ 10 s op elk krachtniveau.
  5. Force-jump experimenten: Observeer de overgangsgebeurtenissen van SNARE-complexen.
    OPMERKING: Force-jump experimenten, zoals constante-kracht experimenten, omvatten veranderingen in krachtniveaus. Krachtsprongen maken echter gebruik van meer abrupte veranderingen in de toegepaste kracht, waardoor de door kracht veroorzaakte gebeurtenissen in de onderzochte moleculen kunnen worden gevolgd, zoals een plotselinge breuk van eiwitcomplexen. Omdat SNARE-complexen bijvoorbeeld structurele hysterese vertonen in krachtcycli23, is het informatief om force-jump-experimenten uit te voeren en de latentie naar overgang te meten (figuur 4C).
    1. Uitpakken: Afpellen van een VAMP2-molecuul van een intact, ternair SNARE-complex, waardoor een binair complex van syntaxine-1A en SNAP-25 overblijft.
    2. Rezippen: Ritsen van het uitgepakte VAMP2-molecuul om een intact SNARE-complex te regenereren.
      1. Ontvouwen: Volledige demontage van een SNARE-complex vergezeld van volledige dissociatie van SNAP-25. Alleen VAMP2- en syntaxinemoleculen blijven na ontvouwen in het construct.
      2. Opnieuw vouwen: Regeneratie van een SNARE-complex bij binding van een vrij SNAP-25-molecuul uit de buffer.
  6. Induceer bij 2 pN de assemblage van een intact SNARE-complex door te wachten (~ 30 s) op de associatie van een vrij SNAP25-molecuul. Een plotselinge afname van de extensie wordt waargenomen bij de vorming van een SNARE-complex.
  7. Om unzipping-gebeurtenissen te observeren, wacht u een paar seconden bij 10-12 pN en gaat u vervolgens abrupt naar 14-15 pN met de maximaal mogelijke motorsnelheid. Afhankelijk van de doelkracht zal het SNARE-complex een omkeerbare overgang vertonen tussen gedeeltelijk uitgepakte tussenproducten (zoals in experimenten met constante kracht) of een sprong van ~ 25 nm naar een hogere, uitgepakte toestand na een willekeurige wachttijd (of latentie).
  8. Om rezipping-gebeurtenissen te observeren, verlaagt u de kracht tot 10-12 pN onmiddellijk nadat het uitpakken is waargenomen. Nogmaals, het SNARE-complex vertoont een stochastische overgang naar de lagere, ritstoestand na enige willekeurige latentie. Als het uitvouwen is opgetreden na het uitpakken, zal het complex niet opnieuw kunnen worden uitgevouwen, omdat een SNAP-25-molecuul ontbreekt.
  9. Om zich ontvouwende gebeurtenissen te observeren, wacht u een langere periode nadat het uitpakken is waargenomen om een verdere toename van de extensie (~ 2 nm) te detecteren.

11. Data-analyse

OPMERKING: De soorten analyses die men kan uitvoeren met MT-gegevens zijn afhankelijk van het doelsysteem. Er zijn echter gemeenschappelijke benaderingen voor het extraheren van nuttige informatie uit de respectieve experimenten die in figuur 4 worden beschreven. Alle analyses worden uitgevoerd met MATLAB (R2021a) met behulp van de aangepaste codes die bij dit artikel worden geleverd. Deze codes genereren plots met behulp van dezelfde gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd. Merk op dat terwijl ruwe gegevens van 100 Hz-tracking rechtstreeks voor analyse werden genomen, gegevens van 1,2 kHz-tracking meestal mediaan-gefilterd waren (met een vijfpunts schuifvenster) voorafgaand aan de analyse om ruis te verminderen (behalve voor ruisanalyse).

  1. Force-ramp experimenten: Analyseer de kracht-uitbreidingsrelatie (bijv. Elasticiteit van polymeren) en schakel de kracht over om informatie over nanomechanische eigenschappen te extraheren.
  2. Experimenten met constante kracht: Analyseer staatspopulaties en verblijftijd (of overgangssnelheid) als een functie van kracht om structurele (bijv. Regio's die betrokken zijn bij de overgang), thermodynamische (bijv. Vrije energieverschil) en kinetische (bijv. Energiebarrière) parameters van de conformatieveranderingen te extraheren.
  3. Force-jump experimenten: Analyseer de breukkinetiek (bijv. eiwit-eiwitinteracties en receptor-ligandbinding) of de levensduur van voorbijgaande tussenproducten (bijv. Ontvouwen van biomoleculen) om de stabiliteit van doelmoleculen en hun toestanden te extraheren.
  4. Analyseer als representatieve toepassingen de monstergegevens voor DNA-haarspelden en SNARE-complexen:
    1. Twee-toestandsovergangen van een DNA-haarspeld: unzipping force, openingsafstand, krachtafhankelijkheid van bevolkingsverschuiving en toestandstoewijzing en overgangssnelheidsmetingen met een verborgen Markov-model (HMM) (MATLAB-codes meegeleverd).
    2. Conformatieveranderingen van SNARE-complexen: unzipping force, force afhankelijkheid van tussenliggende toestanden en unzipping latency, hysterese in rezipping en unfolding/refolding gedrag.
      OPMERKING: Krachtuitbreidingsmodellen voor DNA-handgrepen, DNA-haarspelden en SNARE-complexe conformaties worden gegeven in eerdere referenties14,31.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Krachtkalibratie
De resultaten van de twee krachtmeetmethoden (laterale verplaatsingsvariantie van kralen en vermogensspectrumanalyse) verschilden met 0-2 pN (figuur 2G). Volgens de resultaten in figuur 2F kunnen we betrouwbaar tot 30 pN bereiken met gewone neodymiummagneten.

Twee-toestandsovergangen van een 8 bp DNA-haarspeld
We onderzochten eerst de nanomechanica van een korte DNA-haarspeld (<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk introduceerden we een single-molecule krachtspectroscopie-opstelling die structurele veranderingen van biomoleculen met hoge spatiotemporale precisie kan waarnemen. De gebruikte high-speed CMOS-camera verkrijgt 1.200 frames s−1 met een resolutie van 1.280 x 1.024, waardoor 1,2 kHz kralentracking mogelijk is. De snelheid van metingen wordt momenteel echter beperkt door de kraalvolgsoftware, dus de ROI wordt meestal teruggebracht tot kleinere gebieden bij metingen met hoge snelheid. Het hoge vermogen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 en NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. werd ondersteund door de NRF-subsidie (2021R1C1C2009717).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis systemAdvanceMupid-2plus
DNA ladderBioneerD-1037
nTaq polymeraseEnzynomicsP050A
PCR purification kitLaboPassCMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2ThermoFisher Scientific22102For SNARE–DNA coupling
Primer BBioneer5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hpIDT5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		For hairpin construct
Primer NBioneer5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'For DNA handles
Primer ZBioneer5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'For DNA handles
Primer Z_5kBioneer5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hpBioneer5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3'For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102
λ-DNABioneerD-2510Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28ahomemadetggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctga

Referenties

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25(2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301(2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712(2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885(2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639(2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083(2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348(2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328(2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335(2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302(2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697(2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115(2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397(2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114(2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920(2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271(2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152(2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028(2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7(2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Kracht van enkelvoudige moleculenDNA-hairpinsSNARE-complexenbead-trackingkrachtkalibratiemechanosensitieve eiwittenhigh-speed imagingDNA-unzipping
High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.