Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

Samenvatting

Dit werk beschrijft een protocol voor de vrije vorm ingebed 3D-printen van neurale stamcellen in zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrixcomposieten. Het protocol maakt het mogelijk om met hoge getrouwheid patronen te maken van onderling verbonden menselijke neurale weefselconstructies.

Samenvatting

Het ingebedde 3D-printen van cellen in een granulair ondersteuningsmedium is in het afgelopen decennium naar voren gekomen als een krachtige benadering voor de vrije vorm biofabricage van weke delen constructies. Granulaire gelformuleringen zijn echter beperkt tot een beperkt aantal biomaterialen die de kosteneffectieve generatie van grote hoeveelheden hydrogelmicrodeeltjes mogelijk maken. Daarom hebben granulaire gelondersteuningsmedia over het algemeen de celklevende en celinstructieve functies gemist die worden aangetroffen in de native extracellulaire matrix (ECM).

Om dit aan te pakken is een methodologie ontwikkeld voor het genereren van zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrix (SHAPE) composieten. SHAPE-composieten bestaan uit een korrelige fase (microgels) en een continue fase (viskeuze ECM-oplossing) die samen zowel programmeerbare high-fidelity printing als een instelbare biofunctionele extracellulaire omgeving mogelijk maken. Dit werk beschrijft hoe de ontwikkelde methodologie kan worden gebruikt voor de precieze biofabricage van menselijke neurale constructies.

Ten eerste worden alginaatmicrodeeltjes, die dienen als de korrelige component in de SHAPE-composieten, vervaardigd en gecombineerd met een op collageen gebaseerde continue component. Vervolgens worden menselijke neurale stamcellen in het ondersteuningsmateriaal geprint, gevolgd door het gloeien van de ondersteuning. De geprinte constructies kunnen wekenlang worden onderhouden om de differentiatie van de geprinte cellen in neuronen mogelijk te maken. Tegelijkertijd zorgt de continue fase van collageen voor axonale uitgroei en de onderlinge verbinding van regio's. Ten slotte biedt dit werk informatie over het uitvoeren van live-cell fluorescentie beeldvorming en immunocytochemie om de 3D-geprinte menselijke neurale constructies te karakteriseren.

Inleiding

Het nauwkeurig en programmeerbaar 3D-printen van met cellen beladen hydrogelconstructies die zachte weefsels in vitro nabootsen, vormt een grote uitdaging. Pogingen op basis van de directe extrusie van zachte hydrogels zijn bijvoorbeeld inherent problematisch, omdat de slechte mechanische eigenschappen die nodig zijn om de in vivo micro-omgeving samen te vatten, leiden tot een gebrek aan structurele integriteit, vervormingen van de vooraf gedefinieerde kenmerken of de volledige ineenstorting van de gefabriceerde structuren. Een conventionele oplossing voor dit probleem is om een ondersteunende steiger af te drukken van een stijver biocompatibel materiaal waarmee de uiteindelijke constructie zijn vorm kan behouden. Deze aanpak beperkt echter de ontwerpmogelijkheden sterk en vereist een zorgvuldige reologische fijnafstemming van de aangrenzende inkten.

Om de beperkingen van het traditionele laag-voor-laag extrusie-gebaseerde 3D-printen te overwinnen, is embedded 3D-printen de afgelopen jaren naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor de fabricage van zacht materiaal en weefsel 1,2,3,4,5,6. In plaats van de inkt in omgevingslucht bovenop een oppervlak te extruderen, wordt de inkt rechtstreeks via een spuitnaald afgezet in een steunbad dat in rust vastelijk, maar omkeerbaar fluïdiseert rond de bewegende naaldpunt om de precieze afzetting van zacht celbeladen materiaal mogelijk te maken. Het afgezette materiaal wordt op zijn plaats gehouden terwijl de steun opnieuw wordt geslingerd in het kielzog van de naald. Als zodanig maakt ingebed 3D-printen de hoge resolutie vrije vorm fabricage van ingewikkelde structuren uit zachte biomaterialen met uitgebreide ontwerpmogelijkheden ^7,8.

Granulaire gels zijn uitgebreid onderzocht als ondersteunende badmaterialen voor ingebed 3D-printen, omdat ze kunnen worden geformuleerd om gladde, gelokaliseerde en omkeerbare overgangen van vaste stof naar vloeistof te vertonen bij lage vloeispanningen 9,10,11. Hoewel ze uitstekende reologische eigenschappen vertonen voor afdrukken met hoge resolutie, zijn korrelige gels beperkt tot een handvol biomaterialen¹². Het gebrek aan diversiteit in korrelige gelformuleringen, wat vooral duidelijk is als men kijkt naar het brede scala aan biomaterialen dat beschikbaar is voor bulk hydrogelformuleringen, wordt veroorzaakt door de behoefte aan de kosteneffectieve generatie van een groot aantal microgels met behulp van eenvoudige chemicaliën. Vanwege het beperkte biomateriaallandschap van korrelige gelsteunen, vormt de afstemming van de extracellulaire micro-omgeving die door de printondersteuning wordt geboden een uitdaging in het veld.

Onlangs is een modulaire aanpak ontwikkeld voor het genereren van ingebedde 3D-printsteunen, genaamd self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites¹³. Deze aanpak combineert de verschillende reologische eigenschappen van korrelige gels met de biofunctionele veelzijdigheid van bulk hydrogelformuleringen. De gepresenteerde SHAPE composiet ondersteuning bestaat uit verpakte alginaat microdeeltjes (korrelfase, ~70% volumefractie) met een verhoogde interstitiële ruimte gevuld met een viskeuze collageen-gebaseerde ECM pregel oplossing (continue fase, ~30% volume fractie). Verder is aangetoond dat de SHAPE-ondersteuning de hoge resolutie afzetting van menselijke neurale stamcellen (hNSC's) vergemakkelijkt die, na het gloeien van het ondersteuningsbad, kunnen worden gedifferentieerd in neuronen en wekenlang kunnen worden gehandhaafd om functionele rijping te bereiken. Ingebed 3D-printen in het SHAPE-ondersteuningsbad overwint enkele van de belangrijkste beperkingen met betrekking tot conventionele technieken voor neurale weefselbiofabricage en biedt tegelijkertijd een veelzijdig platform.

Dit werk beschrijft de stappen voor het ingebedde 3D-printen van hNSC's in de SHAPE-ondersteuning en hun daaropvolgende differentiatie in functionele neuronen (figuur 1). Ten eerste worden alginaatmicrodeeltjes gegenereerd via afschuiving tijdens interne gelatie. Deze aanpak maakt het mogelijk om eenvoudig grote hoeveelheden microdeeltjes te genereren zonder de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur en cytotoxische reagentia. Bovendien is alginaat een algemeen beschikbare en economische materiaalbron voor de vorming van biocompatibele hydrogelsubstraten voor een breed scala aan celtypen. De gegenereerde alginaatmicrodeeltjes worden gecombineerd met een collageenoplossing om het SHAPE composietondersteuningsmateriaal te vormen. Vervolgens worden de hNSC's geoogst en in een spuit geladen als cellulaire bioink voor 3D-printen. Een 3D-bioprinter wordt gebruikt voor het extrusie-gebaseerde embedded printen van hNSC's in de SHAPE-composiet. De 3D-geprinte cellen worden gedifferentieerd in neuronen om aanleiding te geven tot ruimtelijk gedefinieerde en functionele menselijke neurale constructies. Ten slotte beschrijft het protocol hoe de gegenereerde weefselconstructies kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van live-cell imaging en immunocytochemie. Daarnaast worden tips gegeven voor optimalisatie en probleemoplossing. Met name kunnen zowel de componenten van de granulaire als de continue fasen worden uitgewisseld met andere hydrogelformuleringen om verschillende biofunctionele moieties, mechanische eigenschappen en crosslinking-mechanismen te accommoderen, zoals vereist door andere cel- en weefseltypen buiten neurale toepassingen.

Protocol

1. Bereiding van de buffers en reagentia

1. Bereid celgroeimedium voor door de volgende supplementen toe te voegen aan DMEM / F12 met L-alanyl-L-glutaminedipeptide: 30 mM glucose, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipiderijke runderserumalbumine, 40 μM L-alanine, 40 μM L-asparaginemonohydraat, 40 μM L-asparaginezuur, 40 μM L-glutaminezuur, 40 μM L-proline, 1% N2-supplement, 1% penicilline-streptomycine en 20 ng / L elk van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblastgroeifactor (FGF). Voer deze stappen uit in een laminaire luchtstroombank (LAF).
2. Bereid 1% m/v alginaatoplossing in ultrapuur water door gedurende 4 uur krachtig te roeren bij 60 °C. Steriel filter de opgeloste, hete alginaatoplossing met een poriefilter ter grootte van 0,45 μm in een LAF-bank. Bewaar het bij 4 °C.
   OPMERKING: Als de temperatuur van de alginaatoplossing lager is dan 60 °C, is het niet mogelijk om deze door het filter te laten gaan.
3. Bereid een NaHCO_3-oplossing van 37 g/l in ultrapuur water. Stel de pH van de oplossing in op 9,5 met NaOH en filter steriliseer in een LAF-bank. Bewaar de oplossing bij 4 °C.

2. SHAPE composiet materiaal voorbereiding

1. Alginaat microdeeltjes generatie
   1. Bereid een CaCO_3-oplossing van 2 mg/ml in ultrapuur water in een steriele beker. Meng het 1:1 met de alginaatoplossing en roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een magnetische roerder.
   2. Voeg azijnzuur toe in een verhouding van 1:500 en laat een nacht roeren bij 650 tpm.
      OPMERKING: De alginaatoplossing begint onmiddellijk te geleren. Zorg ervoor dat u een roermagneet gebruikt met dezelfde lengte als de diameter van het gebruikte glaswerk om een optimale, homogene roergel van de vormgel te garanderen. De volgende dag zal de oplossing die wordt gegenereerd door roeren tijdens gelation stroperig lijken (figuur 2A).
   3. Fragmenteer de gelled alginaatoplossing mechanisch in microdeeltjes door deze gedurende 10 minuten bij 15.000 tpm te homogeniseren met een homogenisator die in een LAF-bank wordt geplaatst (figuur 2B).
   4. Centrifugeer de microdeeltjes gedurende 20 minuten bij 18.500 × g (figuur 2C) bij kamertemperatuur.
   5. Gooi het supernatant voorzichtig weg in de LAF-bank, resuspendien de deeltjes in DMEM met 2 mM NaOH en 1% P/S en incubeer 's nachts bij 4 °C (figuur 2D).
      OPMERKING: De kleur van de suspensie moet teruggaan naar rood. Als de suspensie geel blijft, voeg dan NaOH druppelsgewijs toe en meng totdat deze rood wordt (figuur 2E).
   6. Homogeniseer de deeltjes bij 15.000 tpm gedurende 3 minuten en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 18.500 × g bij kamertemperatuur.
   7. Observeer de pellet (figuur 2F) en verwijder het supernatant voorzichtig.
      OPMERKING: De pellet van dicht opeengepakte alginaatmicrodeeltjes kan bij 4 °C worden bewaard tot verder gebruik. Als de alginaatoplossing niet filtergesteriliseerd is, moeten de microdeeltjes binnen 1 week worden opgebruikt.
2. SHAPE composiet formulering
   1. De dag voor het afdrukken resuspendeert u de alginaatmicrodeeltjeskorrel in tweemaal het volume groeimedium met 4% HEPES (1 M bouillon) en 4% NaHCO_3-oplossing in een LAF-bank en incubeer u deze een nacht bij kamertemperatuur.
   2. Centrifugeer de microgelsuspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 18.500 × g en gooi het supernatant weg.
   3. Neutraliseer het collageen dat moet worden gemengd met de alginaatmicrodeeltjes in een LAF-bank. Verdun de collageenstockoplossing om een eindconcentratie van 1 mg / ml te bereiken en neutraliseer deze door 4% HEPES en 4% NaHCO₃ toe te voegen. Meng bijvoorbeeld voor 3 ml SHAPE-composiet 2 ml alginaatmicrodeeltjes met 1 ml geneutraliseerd collageen (0,12 ml HEPES, 0,12 ml NaHCO₃, 0,16 ml groeimedium en 0,6 ml collageen).
      OPMERKING: Alle materialen die worden gemengd met collageen moeten op ijs worden behandeld om collageenpolymerisatie te voorkomen. Zodra het collageen is geneutraliseerd, zal de polymerisatie langzaam op gang komen.
   4. Genereer het SHAPE-composiet door de alginaatmicrodeeltjespellet te mengen met het verdunde en geneutraliseerde collageen in een verhouding van 2:1. Meng de gel grondig door langzaam op en neer te pipetteren op ijs in een LAF-bank.
      OPMERKING: Niet vortex, omdat dit bubbels in het ondersteuningsmateriaal zal introduceren.
   5. Breng in een LAF-bank het gegenereerde composietmateriaal over in een gekoelde microwellplaat of een geschikte drukcontainer en gebruik deze binnen 30 minuten (figuur 3E, F).

3. hNSC cultuur en bioink voorbereiding

1. Kweek de cellen in een met extract beklede T75-kolf met keldermembraan in groeimedium. Passeer de cellen minstens twee keer na het ontdooien voordat je ze gebruikt voor een 3D-printexperiment.
2. Dissocieer de cellen voor het afdrukken enzymatisch met behulp van een 0,025% trypsine-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 °C, neutraliseer de trypsine met groeimedium en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 400 × g . Na de centrifugatie zuigt u het supernatant op en resuspensie u de pellet in 2-3 ml groeimedium.
3. Voer een celtelling uit, centrifugeer de cellen bij 400 × g en resuspensie van de pellet in groeimedium aangevuld met 0,1% xanthaangom (om te voorkomen dat de cellen bezinken) bij een eindconcentratie van 9 × 10⁶ cellen / ml.
4. Gebruik een stompe metalen naald van 21 G om 100 μl dicht opeengepakte alginaatmicrodeeltjes in een spuit te laden (figuur 3A).
   OPMERKING: Het maken van een plug met de alginaatmicrodeeltjes dient twee doelen: het helpt de extrusiestabiliteit tijdens het afdrukken te behouden en maakt de volledige extrusie van de geladen cellulaire inkt mogelijk (geen dood volume).
5. Laad met dezelfde naald de voorbereide celsuspensie in de spuit (figuur 3B).
   OPMERKING: Let er extra op dat u geen luchtbellen introduceert tijdens de stappen voor het laden van de spuit. Luchtbellen veroorzaken instabiliteit tijdens het afdrukken.
6. Vervang de laadnaald door een stompe metalen naald van 27 G, die wordt gebruikt voor het afdrukken (figuur 3C).

4. Ingesloten 3D-printen

1. Ontwerp een structuur om af te drukken met behulp van de software waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de beginhoogte van de afgedrukte structuur aanpast aan de diepte van de SHAPE-composietsteun. Ontwerpsuggesties zijn te vinden in figuur 4A (spiraal- en houtstapelontwerpen).
2. Genereer een G-Code door op Genereren te klikken.
3. Plaats de met cellen beladen glazen spuit in een volumetrische extrusiekop op een op extrusie gebaseerde bioprinter (figuur 3D).
4. Meet de naaldlengte van de met cellen beladen glazen spuit door op Naaldlengtemeting te klikken.
5. Plaats de microwellplaat of container geladen met het SHAPE-composiet op de printer.
   OPMERKING: Houd de celplaat of container op 4 °C tot het afdrukken om voortijdige verknoping van de drager te voorkomen.
6. Meet de oppervlaktehoogte van een lege put binnen dezelfde microwellplaat of container waarin de SHAPE-gel is geladen door op SHM (surface height measurement) te klikken.
   OPMERKING: U kunt ook de oppervlaktehoogte handmatig bepalen door de hoogte van de put met de naald te meten.
7. Stel de extrusiesnelheid in op 3,6 μl/min en de voedingssnelheid op 0,3 mm/s.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de extrusie test voordat u afdrukt. Celbezinking kan verstopping van de spuitmond veroorzaken en kan worden vermeden door een klein volume vooraf te extruderen voordat het daadwerkelijk wordt ingebed of door een intrekvolume aan de volumetrische spuit toe te voegen. In sommige gevallen moet de invoersnelheid onder 0,5 mm/s worden gehouden wanneer de naald in of uit de SHAPE-gel wordt gestoken om slepen van de inkt te voorkomen.
8. Laad de G-code in de gebruikersinterface van de printer.
   OPMERKING: Er moet een nieuwe G-code worden gegenereerd telkens wanneer er wijzigingen worden aangebracht in de ontworpen structuur.
9. Start de afdrukprocedure door op Uitvoeren te klikken (Afbeelding 3G).
10. Plaats de SHAPE-gel onmiddellijk na het afdrukken gedurende 30 minuten bij 37 °C in een celkweekincubator voor gloeien.
11. Voeg groeimedium zachtjes toe aan de gegloeide SHAPE-gelondersteuning.
12. Vervang de volgende dag het groeimedium door differentiatiemedium dat als volgt is geformuleerd: DMEM/F12 met L-alanyl-L-glutaminedipeptide met 30 mM glucose, 5 μM HEPES, 0,5% m/v lipiderijk runderserumalbumine, 40 μM L-alanine, 40 μM L-asparaginemonohydraat, 40 μM L-asparaginezuur, 40 μM L-glutaminezuur, 40 μM L-proline, 1% N2-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 100 μM dibutyryl-cyclisch adenosinemonofosfaat (dibutyryl-cAMP), en 2 ng/ml gliacellijn afgeleide neurotrofe factor (GDNF).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de hydrogel niet beschadigt tijdens de mediumwisselingen. Kantel de plaat en verwijder het oude medium voorzichtig. Voeg vers medium druppelsgewijs toe aan de wand van de put met de gel in plaats van direct bovenop de gel. Gebruik geen aspirator om het medium te verwijderen.
13. Ververs het differentiatiemedium elke 2 dagen tot het experimentele eindpunt.

5. Live-cell fluorescentie beeldvorming

1. Verwijder overtollig medium uit de gel.
2. Voeg een gelijk volume van 20 μM Calceïne AM (verdund in differentiatiemedium van de stamoplossing) toe aan het volume van de ondersteuningsgel.
3. Incubeer gedurende 40 minuten bij 37 °C.
4. Verwijder de Calcein AM-oplossing en voeg een geschikt volume vers differentiatiemedium toe.
5. Breng de plaat over naar de microscoop voor beeldvorming.

6. Immunocytochemie

1. Verwijder het overtollige medium uit de gel.
2. Breng de gel met een kleine spatel over in een grotere container met DPBS.
3. Was drie keer gedurende 20 minuten elke keer met DPBS en breng de plaat over naar een zuurkast.
4. Verwijder de DPBS, voeg voldoende 4% formaldehyde-oplossing toe om de gel te bedekken en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
5. Was drie keer met DPBS gedurende telkens 20 minuten.
6. Bereid een blokkeeroplossing bestaande uit 5% ezelsserum, 0,25% reinigingsmiddel en 0,02% natriumazide in DPBS.
   OPMERKING: Bereid drie keer het volume voor dat nodig is om de gel te bedekken; Het zal later worden gebruikt als basis voor de primaire en secundaire antilichaamoplossingen.
7. Voeg na het wassen met DPBS de blokkerende oplossing toe aan de gel en incubeer gedurende 6 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen. Wieg de plaat zachtjes.
8. Bereid de primaire antilichaamoplossing door het TUBB3-antilichaam te verdunnen in een blokkerende oplossing in een verhouding van 1:1.000.
9. Verwijder de blokkerende oplossing uit de gel, voeg de primaire antilichaamoplossing toe en incubeer gedurende 48 uur bij 4 °C. Wieg de plaat zachtjes.
10. Was drie keer met DPBS gedurende telkens 20 minuten.
11. Bereid de secundaire antilichaamoplossing door 4',6-diamidino-2-fenylindolol (DAPI, 1:1.000) en het secundaire antilichaam (1:200) in een blokkerende oplossing te verdunnen.
12. Incubeer de gel na het wassen met DPBS gedurende 24 uur bij 4 °C in de secundaire antilichaamoplossing. Wieg de plaat zachtjes.
13. Was drie keer met DPBS gedurende 20 minuten per keer en bewaar bij 4 °C tot het beeld.
14. Breng vóór de beeldvorming de gekleurde gel met een spatel over naar een schaal of een putplaat met een dunne beeldvormende bodem.

Resultaten

Alginaat microgel preparaat via shear thinning tijdens interne gelation gevolgd door mechanische fragmentatie levert alginaat microgels op die polydispersed in grootte en schilferachtig van vorm zijn zoals te zien in figuur 2G. De grootte van deze onregelmatige deeltjes varieert van minder dan 1 μm tot ongeveer 40 μm in diameter. Dicht opeengepakt vormen de microdeeltjes een transparant bulkmateriaal dat slechts iets ondoorzichtiger is dan het overeenkomstige celkweekmedium (figuur 2F). De transparantie van het ondersteunende materiaal is een belangrijk aspect van het platform, omdat het de visualisatie van de geprinte structuren tijdens de kweekperiode mogelijk maakt, evenals voor de confocale microscopie met hoge resolutie van constructen die zowel met levende celkleurstoffen als via immunocytochemie zijn gelabeld. Wanneer gedrenkt in gebufferd celkweekmedium, moet de resulterende pH-aangepaste gel een rode kleur hebben, wat wijst op fysiologische omstandigheden (figuur 2F). Het is om twee redenen belangrijk om de pH van de alginaatmicrodeeltjes te neutraliseren. Zure microdeeltjes kunnen de cellen direct beschadigen. Bovendien zal een zure omgeving het succesvol gloeien van de SHAPE-composietondersteuning voorkomen, omdat dit de collageenpolymerisatie zou verstoren.

Het afdrukken van de hNSC-inkt met behulp van de hierboven beschreven parameters levert een filament op van cellen met een diameter van ~ 200 μm (figuur 4A). De geprogrammeerde geometrie blijft zowel behouden bij het afdrukken in één vlak als bij het afdrukken van structuren op elkaar. Bij meerlaags printen blijven de geprinte structuren intact, met een minimale laag-op-laagafstand van 200 μm¹³. De levensvatbaarheid van cellen mag niet significant worden beïnvloed tijdens de inktbereiding en extrusie. De geprinte strengen zijn rijk aan levende cellen met een ronde morfologie (figuur 4B, links). Gaten in de geprinte strengen kunnen de dag na het afdrukken verschijnen, zelfs als de gefabriceerde constructie niet onmiddellijk na het afdrukken vervormingen vertoont. Dit is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van een inhomogene vermenging van de ondersteuning. Omdat de cellen geen interactie hebben met de alginaatmicrodeeltjes, migreren ze weg van de alginaatrijke gebieden naar de collageen- en celrijke gebieden, waardoor breuken in de geprinte strengen ontstaan. Bovendien moet de SHAPE-ondersteuning bubbelvrij zijn, omdat luchtzakken de afdrukgetrouwheid kunnen verstoren.

Succesvolle differentiatie van hNSC's zou 30 dagen na het afdrukken neuronrijke structuren moeten opleveren, waarbij cellen neuronale morfologie vertonen met kleine cellichamen en lange dunne processen (figuur 4B, rechts). Bovendien, als dichte patronen worden afgedrukt, zoals een rechthoekig vel cellen, mogen er geen zichtbare openingen of aggregaten ontstaan tijdens differentiatie, maar moet een continue laag cellen intact blijven (figuur 4C). In dit protocol wordt een procedure beschreven voor fluorescentie immunocytochemie van de 3D-geprinte monsters. Kleuring voor TUBB3, een cytoplasmatische neuronale marker, maakt de directe visualisatie van de gegenereerde neuronale netwerken mogelijk. De fluorescentiemicroscopie van de gedifferentieerde prints moet structuren onthullen die rijk zijn aan TUBB3 en met behoud van geometrie (figuur 4D, links). Tijdens het differentiatieproces migreren de cellen niet uit de geprinte strengen, zoals kan worden waargenomen door kleuring voor celkernen met DAPI (figuur 4D, midden). Als gevolg hiervan worden neuronale lichamen waargenomen binnen de grenzen van de geprinte geometrie, met axonale projecties die honderden micrometers uitstralen in de SHAPE-ondersteuning rond het construct. De axonale verkenning van het omringende volume geeft aan dat de SHAPE-ondersteuning biofunctionele aanwijzingen biedt die axonale pathfinding mogelijk maken. Meer volwassen neuronale markers of subtype-specifieke markers kunnen worden gebruikt in de immunocytochemie om de gegenereerde neuronale populaties verder te karakteriseren. Bovendien kon het geprinte neuronale construct worden gekarakteriseerd met behulp van RT-qPCR of elektrofysiologie¹³. Beide benaderingen zouden echter de verwijdering van collageen met behulp van collagenase vereisen, omdat de hydrogellaag zowel RNA-extractie als fysieke toegang tot de cellen met een micropipet belemmert.

Figuur 1: Conceptuele illustratie van de SHAPE embedded printing aanpak. Een collageenoplossing wordt gemengd met alginaatmicrodeeltjes om het SHAPE-composiet te vormen; het SHAPE-composiet wordt gebruikt als ondersteuningsmateriaal voor het ingebedde 3D-printen van hNSC's, die worden gedifferentieerd in neuronen in de gegloeide ondersteuning. De biofunctionele eigenschappen van de SHAPE-composiet stellen de neuronen in staat om projecties uit te breiden en het lege deel van de ondersteuning te vullen met hun axonale projecties. Dit cijfer is aangepast van Kajtez et ^al.13. Afkortingen: SHAPE = zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrix; hNSC's = menselijke neurale stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Bereiding van alginaatmicrodeeltjes . (A) De alginaatoplossing na gelatie gedurende de nacht. (B) De alginaatmicrodeeltjes die door homogenisatie worden gegenereerd. (C) De deeltjespellet na centrifugeren. (D) De pellet geresuspendeerd in DMEM (E) vóór de pH-aanpassing en na de pH-aanpassing. (F) De microdeeltjes na incubatie in medium nacht en centrifugatie. (G) Een helder beeld van de gefabriceerde alginaatmicrodeeltjes. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbereiding op het 3D-printproces. (A) Een slurryplug (~100 μL) wordt in de spuit geladen, gevolgd door (B) de belading van de cellulaire bioink (hier aangevuld met gekleurde kralen voor visualisatiedoeleinden). (C) De conische plastic punt (21 G) die wordt gebruikt voor het laden van inkt, wordt vervangen door een stompe metalen naaldpunt van 27 G. (D) De spuit wordt in de 3D-printkop geplaatst. (E,F) Het SHAPE-composiet wordt gepipetteerd in een put van een 48-putplaat. De buis met het SHAPE-composiet wordt op ijs gehouden wanneer deze niet wordt gehanteerd. (G) De punt van de afdruknaald wordt in de SHAPE-drager gestoken en het afdrukken van het pad dat door het computerontwerp is gedefinieerd, wordt gestart (hier wordt het afdrukken van een spiraal afgebeeld). Afkorting: SHAPE = zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrix. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: 3D-geprinte neurale constructies in de SHAPE composite support. (A) Brightfield-afbeeldingen van geprinte hNSC's in de dragerhydrogel. Spiraalvormige (links) en houtstapel (rechts) constructies ontwerpen worden weergegeven. (B) Live-cell imaging van een 3D-geprinte constructie de dag na het printen (links) en na neuronale differentiatie (rechts). (C) Een 3D-geprinte vierkante constructie die met een spatel uit een kweekput is verwijderd, vertoont structurele integriteit. (D) Fluorescentie confocale beelden van hetzelfde vierkante construct immunolabel voor een neuronale marker (TUBB3) en met tegengekleurde kernen (DAPI) die de succesvolle differentiatie van de hNSC's binnen de 3D-geprinte constructen bevestigen. Schaalbalken = 500 μm (A, rechts); 100 μm (B,D). De panelen C en D in deze figuur zijn gewijzigd ten opzichte van Kajtez et ^al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De SHAPE composite material benadering biedt een veelzijdige route voor de formulering van gloeibare en biofunctionele ondersteuningsbaden voor het ingebed 3D-printen van cellulaire inkten. Hoewel dit protocol een voorbeeld is van het 3D-printen van neurale constructies, kan de SHAPE-toolbox eenvoudig worden aangepast aan biofabricage met andere celbronnen voor de precieze engineering van een reeks doelweefseltypen. De printbenadering zou ook de precieze patronen van meerdere celtypen mogelijk maken om hun interactie te bestuderen of om weefsels te engineeren met een gedefinieerde ruimtelijke rangschikking van de cellulaire compartimenten (bijv. Neuronen en gliacellen). In tegenstelling tot de traditionele korrelige gels, bevat het SHAPE-composiet een uitgebreide interstitiële ruimte (~ 30% volumefractie voor de formulering die in dit protocol wordt gepresenteerd). De korrelige component dient als een reologische modifier die het composiet voorziet van gunstige materiaaleigenschappen voor ingesloten afdrukken met hoge resolutie. Dit opent een route naar een rationeel ontwerp van de cellulaire micro-omgeving door de formulering van de continue component te veranderen met behoud van dezelfde granulaire component. Andere functionele ECM-moleculen kunnen bijvoorbeeld in het ondersteuningsbad worden geïntroduceerd (bijv. hyaluronzuur, laminines, fibronectine), of verschillende crosslinking-mechanismen kunnen worden gebruikt (bijv. enzymatisch, op licht gebaseerd)¹³. Bovendien kan het alginaat in de korrelige component worden vervangen door microdeeltjes uit verschillende hydrogelmaterialen (bijv. Gelatine⁸, polyethyleenglycol^14,15, agarose ¹⁶) of in verschillende maten en vormen worden gemaakt in overeenstemming met de behoeften van verschillende weefselmanipulatie- of ziektemodelleringstoepassingen. De verhouding tussen de granulaire en continue fase kan worden afgestemd op de behoeften van individuele 3D-printprojecten, maar het verhogen van de continue fase tot meer dan 30% kan de printgetrouwheid en resolutie in gevaar brengen.

Tijdens de microgelproductiestappen is het van cruciaal belang dat het roeren van de alginaatoplossing na toevoeging van azijnzuur effectief is gedurende het hele volume van de geleeroplossing. Als de roersnelheid te laag is of de magnetische roerder te klein is, kan het roeren de bovenste lagen van de oplossing niet bereiken, wat zal veranderen in een groot volume verknoopte bulkhydrogel, terwijl de onderste lagen worden geschoren. De homogenisatie van een inconsistent geschoren alginaathydrogel zal resulteren in het genereren van alginaatmicrodeeltjes die suboptimaal zijn voor 3D-printtoepassingen. Bovendien moeten de alginaatmicrodeeltjes grondig worden gemengd met de collageenoplossing, omdat een niet-homogeen mengsel zal resulteren in vlekken van het ondersteuningsmateriaal zonder collageen; Deze patches zouden niet worden gegloeid en zouden dus geen cel-interactieve functies hebben. Er kunnen ook patches zijn die geen alginaatmicrodeeltjes missen en daarom het afdrukken niet ondersteunen. Een inhomogeen gemengde afdrukondersteuning zou daarom niet in staat zijn om high-fidelity afdrukken te ondersteunen en zou structureel worden aangetast, omdat het niet gedurende het hele volume zou worden gegloeid. Bubbels moeten ook worden vermeden, niet omdat ze schadelijk kunnen zijn voor de cellen, maar omdat luchtzakken vervormingen kunnen veroorzaken tijdens het afdrukken en de beeldvorming van de constructen kunnen verstoren. Twee veel voorkomende bronnen van bubbels zijn vortexing (microbubbels in de koude ondersteuning die uitzetten tijdens het ondersteunen van gloeien bij 37 °C) en krachtig pipetteren.

De SHAPE-composietondersteuning in dit werk werd niet geformuleerd als een opofferingsmateriaal dat na het afdrukken moet worden verwijderd, maar eerder als een biofunctionele ondersteuning op lange termijn voor zowel stamceldifferentiatie als neuronale groei en functionele rijping. In vergelijking met korrelige gels die na het printen niet zijn gegloeid, bieden de structurele stabiliteit en transparantie van het gegloeide SHAPE-composietmateriaal een beschermende omgeving voor delicate neuronale kenmerken tijdens het proces van fixatie en immunolabeling, en als zodanig vergemakkelijkt dit materiaal morfologische karakterisering via de visualisatie van antigenen. Fluorescentiereporters kunnen ook worden gebruikt om veranderingen in cellulaire morfologie in de loop van de tijd te volgen, evenals om cellulaire proliferatie en migratie binnen de gegloeide afdrukondersteuning te volgen. Bovendien kunnen calciumbeeldvormingsbenaderingen worden gebruikt om informatie te verschaffen over spontane cellulaire activiteit (bijvoorbeeld het afvuren van actiepotentialen in neuronen of zelfs synchrone neuronale netwerkactiviteit). Chemische stimulatie van de gemanipuleerde cellulaire constructen (bijv. Neuronale stimulatie met behulp van KCl) kan echter moeilijk zijn vanwege de hydrogellaag rond de cellen, die diffusie vertraagt en de onmiddellijke modulatie van de cellulaire micro-omgeving voorkomt. Optogenetische stimulatie biedt een betere optie voor de controle van cellulaire activiteit, omdat de SHAPE-hydrogels de optische toegang tot de cellen niet belemmeren.

Zuurstofgevoelige kralen kunnen worden opgenomen in de bioink of in het dragermateriaal (via direct printen of dispersie tijdens composietvoorbereiding) om live ruimtelijke en temporele mapping van de zuurstofspanningsniveaus in en rond de geprinte constructies met hoge gevoeligheid mogelijk te maken¹³. Deze niet-invasieve 3D-zuurstofkarteringsbenadering op basis van fosforescentielevensduurmetingen biedt een route naar technische weefselconstructies met verbeterde oxygenatie en waarschijnlijk ook verbeterde toevoer van voedingsstoffen. Slechte oxygenatie kan leiden tot de vorming van necrotische gebieden binnen de geprinte constructen, interfereren met stamceldifferentiatie en het neuronale metabolisme beïnvloeden. Oxygen mapping biedt een uitlezing op basis waarvan het 3D-printontwerp kan worden gewijzigd om uniforme oxygenatie in het hele construct, de fijnafstemming van de zuurstofniveaus op fysiologische omstandigheden of het genereren van zuurstofgradiënten te vergemakkelijken.

Technische kanalen kunnen ook in de gloeibare druksteun worden opgenomen door een opofferingsinkt te printen, zoals gelatine, die stolt in het koude ondersteuningsbad, maar gemakkelijk kan worden geëvacueerd bij 37 °C ^4,13. Kanalen zouden nodig zijn om voedingsstoffen en zuurstof te leveren aan weefselconstructies met een hoge celdichtheid of afmetingen die de mogelijkheden van een op ontwerp gebaseerde benadering van zuurstofspanningsmanipulatie overschrijden. Bovendien kunnen vaatachtige kanalen worden gebruikt om gradiënten van kleine moleculen te creëren die het patroon van de cellulaire identiteit aansturen, cellulaire activiteit moduleren of chemotaxis begeleiden.

Kortom, ingebed 3D-printen in het SHAPE-composiet biedt een modulair materiaalplatform dat gemakkelijk kan worden aangepast en veelzijdig potentieel heeft voor het functioneel modelleren van mechanisch gevoelige weefsels. Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde uitleg van de noodzakelijke stappen en basisprincipes die nodig zijn om het ondersteuningsmateriaal te genereren en de cellulaire inkt met hoge getrouwheid af te drukken. De aanpak maakt gebruik van betaalbare materialen en toegankelijke apparatuur en biedt tegelijkertijd ruimte voor personalisatie van de aanpak voor de behoeften en toepassingen van individuele onderzoekers.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Azijnzuur	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secundair antilichaam	ThermoFisher	A-11001	Geit anti-muis
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD-software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calciumcarbonaat	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP natriumzout	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkeyserum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehydeoplossing 4%, gebufferd, pH 6,9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES-buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydraat	Sigma-Aldrich	A4284
L-Asparaginezuur	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutaminzuur	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetische roerder RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicilline-streptomycine	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispergeerdool	IKA	4447100
Natriumalginaat (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S5761
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenisator	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsine/EDTA-oplossing	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antilichaam	BioLegend	801213	Muis
Xanthaangom	Sigma-Aldrich	G1253