Methodenartikel

Gerichte micro-injectie en elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten voor genetische modificatie

5.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65176

⸱

24 maart 2023

 ,  ,  , 
1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

In dit artikel

Samenvatting

De elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten biedt een nauwkeurige en efficiënte benadering om voorbijgaande genetische modificatie (s) te introduceren in verschillende voorlopertypen en neuronen in een modelsysteem dat dicht bij de ontwikkeling van primaat (patho) fysiologische neocortex ligt. Dit maakt de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen mogelijk en kan ook worden toegepast voor ziektemodellering.

Samenvatting

De hersenschors is de buitenste hersenstructuur en is verantwoordelijk voor de verwerking van sensorische input en motorische output; Het wordt gezien als de zetel van cognitieve vaardigheden van hogere orde bij zoogdieren, in het bijzonder primaten. Het bestuderen van genfuncties in primatenhersenen is een uitdaging vanwege technische en ethische redenen, maar de oprichting van de hersenorganoïde technologie heeft de studie van de hersenontwikkeling mogelijk gemaakt in traditionele primatenmodellen (bijv. Resusapen en gewone marmoset), evenals in voorheen experimenteel ontoegankelijke primatensoorten (bijv. Mensapen), in een ethisch verantwoord en minder technisch veeleisend systeem. Bovendien maken menselijke hersenorganoïden het geavanceerde onderzoek van neurologische en neurologische aandoeningen mogelijk.

Omdat hersenorganoïden veel processen van hersenontwikkeling samenvatten, vormen ze ook een krachtig hulpmiddel om verschillen in de genetische determinanten die ten grondslag liggen aan de hersenontwikkeling van verschillende soorten in een evolutionaire context te identificeren en functioneel te vergelijken. Een groot voordeel van het gebruik van organoïden is de mogelijkheid om genetische modificaties te introduceren, waardoor genfuncties kunnen worden getest. De introductie van dergelijke wijzigingen is echter arbeidsintensief en duur. Dit artikel beschrijft een snelle en kostenefficiënte benadering van het genetisch modificeren van celpopulaties binnen de ventrikelachtige structuren van cerebrale organoïden van primaten, een subtype van hersenorganoïden. Deze methode combineert een aangepast protocol voor de betrouwbare generatie van cerebrale organoïden uit mens-, chimpansee-, rhesusmakaak- en gewone marmoset-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met een microinjectie- en elektroporatiebenadering. Dit biedt een effectief hulpmiddel voor de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen die ook kunnen worden toegepast voor ziektemodellering.

Inleiding

Het onderzoeken van de (patho)fysiologische ontwikkeling en evolutie van de hersenschors is een formidabele taak die wordt belemmerd door het ontbreken van geschikte modelsystemen. Voorheen waren dergelijke studies beperkt tot tweedimensionale celkweekmodellen (zoals primaire neurale voorloper- of neuronale celculturen) en evolutionair verre diermodellen (zoals knaagdieren)1,2. Hoewel deze modellen nuttig zijn voor het beantwoorden van bepaalde vragen, zijn ze beperkt in het modelleren van de complexiteit, celtypesamenstelling, cellulaire architectuur en genexpressiepatronen van de zich ontwikkelende menselijke neocortex in gezonde en zieke toestanden. Deze beperkingen leiden bijvoorbeeld tot de slechte vertaalbaarheid van muismodellen van menselijke ziekten naar de menselijke situatie, zoals beschreven voor bepaalde gevallen van microcefalie (bijv. Zhang et al.3). Onlangs zijn transgene niet-menselijke primaten, die een evolutionair, functioneel en morfologisch dichterbij model van menselijke neocortexontwikkeling zijn, in beeld gekomen 4,5,6,7,8 omdat ze veel beperkingen van op celcultuur en knaagdieren gebaseerde modellen overwinnen. Het gebruik van niet-menselijke primaten in onderzoek is echter niet alleen zeer duur en tijdrovend, maar roept ook ethische bezwaren op. Meer recent is de ontwikkeling van hersenorganoïde technologie 9,10 naar voren gekomen als een veelbelovend alternatief dat veel van de beperkingen van eerdere modellen 11,12,13,14,15,16 oplost.

Hersenorganoïden zijn driedimensionale (3D), meercellige structuren die de belangrijkste kenmerken van de cytoarchitectuur en celtypesamenstelling van een of meerdere hersengebieden nabootsen voor een gedefinieerd ontwikkelingstijdvenster 11,12,13,14,17. Deze 3D-structuren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) of, indien beschikbaar voor de betrokken soort, uit embryonale stamcellen (SER's). Over het algemeen kunnen twee soorten hersenorganoïden worden onderscheiden op basis van de gebruikte methodologie: ongeleide en geregionaliseerde (geleide) hersenorganoïden18. Bij het genereren van het laatste type organoïden worden kleine moleculen of factoren verstrekt die de differentiatie van de pluripotente stamcellen naar organoïden van een bepaald hersengebied (bijv. Voorhersenen organoïden) sturen)18. Bij ongeleide organoïden daarentegen wordt de differentiatie niet geleid door de toevoeging van kleine moleculen, maar berust deze uitsluitend op de spontane differentiatie van de iPSC's/SER's. De resulterende hersenorganoïden bestaan uit celtypen die verschillende hersengebieden vertegenwoordigen (bijvoorbeeld cerebrale organoïden)18. Hersenorganoïden combineren veel belangrijke kenmerken van hersenontwikkeling met relatief kosten- en tijdefficiënte generatie van elke soort van belang waarvoor iPSC's of SER's beschikbaar zijn11,12,13,14. Dit maakt hersenorganoïden een uitstekend model voor vele soorten neurobiologische studies, variërend van evolutionaire en ontwikkelingsvragen tot ziektemodellering en medicijntesten15,16. Het beantwoorden van dergelijke vragen met behulp van hersenorganoïden hangt echter sterk af van de beschikbaarheid van verschillende methoden voor genetische modificatie.

Een belangrijk aspect van het bestuderen van neocortex (patho)fysiologische ontwikkeling en de evolutie ervan is de functionele analyse van genen en genvarianten. Dit wordt meestal bereikt door (ectopische) expressie en/of door knock-down (KD) of knock-out (KO) van die genen. Dergelijke genetische modificaties kunnen worden ingedeeld in stabiele en voorbijgaande genetische modificatie, evenals in de modificaties die tijdelijk en ruimtelijk beperkt zijn of niet beperkt zijn. Stabiele genetische modificatie wordt gedefinieerd door de introductie van een genetische verandering in het gastheergenoom die wordt doorgegeven aan alle volgende celgeneraties. Afhankelijk van het tijdstip van genetische modificatie kan het alle cellen van een organoïde beïnvloeden of kan het worden beperkt tot bepaalde celpopulaties. Meestal wordt stabiele genetische modificatie bereikt in hersenorganoïden op iPSC / ESC-niveau door lentivirussen, transposon-achtige systemen en de CRISPR / Cas9-technologie toe te passen (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 en Teriyapirom et al.20). Dit heeft als voordeel dat alle cellen van de hersenorganoïde de genetische modificatie dragen en dat deze niet tijdelijk of ruimtelijk beperkt is. Het genereren en karakteriseren van deze stabiele iPSC/ESC-lijnen is echter zeer tijdrovend en duurt vaak enkele maanden voordat de eerste gemodificeerde hersenorganoïden kunnen worden geanalyseerd (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 of Teriyapirom et al.20).

Daarentegen wordt voorbijgaande genetische modificatie gedefinieerd door de levering van genetische lading (bijvoorbeeld een genexpressieplasmide) die niet integreert in het gastheergenoom. Hoewel deze modificatie in principe kan worden doorgegeven aan volgende celgeneraties, zal de geleverde genetische lading bij elke celdeling geleidelijk worden verdund. Daarom is dit type genetische modificatie meestal tijdelijk en ruimtelijk beperkt. Voorbijgaande genetische modificatie kan worden uitgevoerd in hersenorganoïden door adeno-geassocieerde virussen of door elektroporatie (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 en Teriyapirom et al.20), waarbij de laatste in detail wordt beschreven in dit artikel. In tegenstelling tot stabiele genetische modificatie is deze aanpak zeer snel en kostenefficiënt. Inderdaad, elektroporatie kan binnen enkele minuten worden uitgevoerd en, afhankelijk van de doelcelpopulatie (en), zijn geëlektroporeerde organoïden binnen enkele dagen klaar voor analyse (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17 en Kyrousi et al.19). Grove morfologische veranderingen van de hersenorganoïde, zoals verschillen in grootte, kunnen echter niet worden gedetecteerd met deze methode, omdat dit type genetische modificatie tijdelijk en ruimtelijk beperkt is. Deze beperking kan ook een voordeel zijn, bijvoorbeeld in het geval van het bestuderen van individuele celpopulaties binnen de organoïde of de effecten op hersenorganoïden op specifieke ontwikkelingstijdstippen (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17 en Kyrousi et al.19).

Een klassieke benadering om de genfunctie tijdens de ontwikkeling en evolutie van de hersenen te bestuderen, is in utero-elektroporatie. In utero is elektroporatie een bekende en bruikbare techniek voor de afgifte van genexpressieconstructen in knaagdier 21,22,23 en fret 24,25 hersenen. Ten eerste wordt een oplossing met de expressieconstructie(s) van belang micro-geïnjecteerd door de baarmoederwand in een bepaalde ventrikel van de embryonale hersenen, afhankelijk van het te richten gebied. In de tweede stap worden elektrische pulsen toegepast om de cellen direct langs de beoogde ventrikel te transfecteren. Deze benadering is niet alleen beperkt tot ectopische expressie of de overexpressie van genen, omdat het ook kan worden toegepast in KD- of KO-studies door micro-injecterende korte haarspeld (shRNA) of CRISPR / Cas9 (in de vorm van expressieplasmiden of ribonucleoproteïnen [RNP's]), respectievelijk26,27. De in utero elektroporatie van muizen-, ratten- en frettenembryo's heeft echter dezelfde beperkingen als hierboven beschreven voor deze diermodellen.

Idealiter zou men in utero elektroporatie direct bij primaten willen uitvoeren. Hoewel dit in principe technisch mogelijk is, wordt elektroporatie in utero niet uitgevoerd bij primaten vanwege ethische overwegingen, hoge onderhoudskosten voor dieren en kleine worpgroottes. Voor bepaalde primaten, zoals mensapen (inclusief mensen), is dit helemaal niet mogelijk. Deze primaten hebben echter het grootste potentieel voor de studie van de menselijke (patho)fysiologische neocortexontwikkeling en de evolutie ervan. Een oplossing voor dit dilemma is om de elektroporatietechniek toe te passen op primatenhersenorganoïden28.

Dit artikel presenteert een protocol voor de elektroporatie van een subtype van primaat hersenorganoïden, primaten cerebrale organoïden. Deze aanpak maakt de snelle en kostenefficiënte genetische modificatie van celpopulaties binnen de ventrikelachtige structuren van de organoïden mogelijk. In het bijzonder beschrijven we een uniform protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van primaten van menselijke (Homo sapiens), chimpansee (Pan troglodytes), resusaap (Macaca mulatta) en gewone marmoset (Callithrix jacchus) iPSC's. Bovendien beschrijven we de micro-injectie- en elektroporatietechniek in detail en bieden we "go" en "no-go" -criteria voor het uitvoeren van cerebrale organoïde elektroporatie van primaten. Deze benadering is een effectief hulpmiddel voor het bestuderen van de (patho)fysiologische neocortexontwikkeling en de evolutie ervan in een model dat bijzonder dicht bij de menselijke situatie staat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Kweek van iPSC's van primaten

OPMERKING: Vanwege de robuustheid kan de hier gepresenteerde methode worden toegepast op elke iPSC-lijn van primaten. In dit artikel beschrijven we de productie van cerebrale organoïden uit menselijke (iLonza2.2)29, chimpansee (Sandra A)30, resusapen (iRh33.1)29 en gewone marmoset (cj_160419_5)31 iPSC-lijnen. De kweekcondities zijn samengevat in tabel 1. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Voor het kweken van de respectievelijke iPSC's, volg de oorspronkelijk beschreven kweekomstandigheden. Over het algemeen gebruikt u voor de succesvolle generatie en elektroporatie van cerebrale organoïden iPSC-lijnen die niet gedurende meer dan 90 passages zijn gekweekt. Zorg er bovendien aan het begin van de cerebrale organoïdegeneratie voor dat iPSC's kenmerken van pluripotentie vertonen zonder tekenen van differentiatie.

2. Generatie van cerebrale organoïden uit iPSC's van primaten

OPMERKING: Het protocol voor het genereren van cerebrale organoïden is gebaseerd op een aangepaste versie 28,30,32,33 van het oorspronkelijke cerebrale organoïde protocol 10,34 met enkele soortspecifieke wijzigingen (hieronder beschreven).

  1. Zaaien van iPSC's om embryoïde lichamen (EB's) te genereren
    1. Zodra de iPSC's 80% -90% confluentie hebben bereikt, wast u ze met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en voegt u 500 μL recombinant trypsinesubstituut of 1 ml proteolytisch en collagenolytisch mengsel toe.
      OPMERKING: Meestal worden iPSC's gekweekt in een celkweekschaal van 60 mm om ongeveer 900.000 cellen te verkrijgen, wat genoeg is om 96 cerebrale organoïden te genereren. De celnummers kunnen worden aangepast afhankelijk van het aantal organoïden dat nodig is. Houd er rekening mee dat niet alle gegenereerde cerebrale organoïden geschikt kunnen zijn voor elektroporatie.
    2. Incubeer de schaal bij 37 °C gedurende 2 minuten om de cellen los te maken.
      OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte iPSC-lijn of het gebruikte enzym kan tot 2 minuten extra incubatie bij 37 °C nodig zijn. Het wordt geadviseerd om de schaal onder een microscoop te onderzoeken om er zeker van te zijn dat de cellen zijn begonnen los te komen.
    3. Voeg 1,5 ml voorverwarmd (37 °C) iPSC-kweekmedium toe om de reactie te stoppen en pipetteer 7x-10x (niet meer dan 10x) op en neer om de cellen van de celkweekschaal te scheiden en een eencellige suspensie te verkrijgen.
    4. Breng de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 200 × g .
    5. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 2 ml iPSC-kweekmedium aangevuld met 50 μM Y27632 of 50 μM pro-overlevingsverbinding.
    6. Gebruik 10 μL van de celsuspensie om de cellen te tellen met behulp van een Neubauer-kamer.
    7. Stel de celsuspensie in op een concentratie van 9.000 cellen per 150 μL (60.000 cellen/ml) met behulp van iPSC-kweekmedium aangevuld met 50 μM Y27632 of 50 μM pro-overlevingsverbinding.
    8. Om embryoïde lichamen (EB's) te genereren, zaait u 150 μL van de celsuspensie in elke put van een ultralage aanhechtingsplaat met 96 putten. Schud tijdens het pipetteren voorzichtig de buis met de celsuspensie om te voorkomen dat de cellen bezinken.
    9. Kweek de EB's in een gehumificeerde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht bij 37 °C (0 dagen na het zaaien [dp's]). Verstoor de EB's niet binnen de eerste 24 uur na het zaaien.
      OPMERKING: EB's gegenereerd uit marmoset iPSC's moeten worden gekweekt in een gehumificeerde atmosfeer onder hypoxische omstandigheden (5% CO 2, 5% O 2 en 90% N 2) bij 37 °C.
    10. Verander na ~48 h (2 dps) het medium in iPSC-kweekmedium zonder Y27632/pro-overlevingsverbinding. Verwijder 100 μL medium per putje en voeg 150 μL voorverwarmd (37 °C) vers medium toe zonder Y27632. Ga rij voor rij.
    11. Voer om de dag verdere mediumwisselingen uit; verwijder 150 μL medium uit elke put en voeg 150 μL voorverwarmd (37 °C) vers medium zonder Y27632/pro-overlevingsverbinding per put toe.
      OPMERKING: Na 4-5 dps zou de periferie van de EB's doorschijnend moeten worden.
  2. Inductie van neuro-ectoderm
    OPMERKING: Over het algemeen moeten EB's van goede kwaliteit in dit stadium gladde contouren en doorschijnende randen hebben. De tijdspunten van neurale inductie verschillen enigszins tussen primatensoorten en iPSC-lijnen. In het geval van de hier gebruikte cellijnen (zie rubriek 1 en materiaaltabel) moet neurale inductie voor marmoset EB's meestal worden gestart bij 4 dps, voor resusapen bij 5 dps en voor menselijke en chimpansee EB's bij 4-5 dps (figuur 1A), afhankelijk van de toestand van de EB's (zie hierboven).
    1. Verwijder 150 μL medium uit elke put van de eerste rij van de 96-putplaat en voeg 150 μL voorverwarmd (37 °C) neuraal inductiemedium (zie tabel 2) per put in dezelfde rij toe.
    2. Ga door met het veranderen van het medium zoals hierboven beschreven, rij voor rij voor de hele plaat met 96 putten. Voer om de dag verdere neurale inductiemediumveranderingen (NIM) uit door 150 μL NIM uit elke put te verwijderen en 150 μL voorverwarmde (37 °C) verse NIM toe te voegen.
      OPMERKING: Vanaf dit punt moeten de marmoset EB's worden gekweekt onder dezelfde omstandigheden als de andere primaat EB's (gehumificeerde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht bij 37 °C).
  3. Inbedding in keldermembraanmatrix
    OPMERKING: Zodra de EB's een uitgesproken, doorschijnend, radiaal georganiseerd neuro-epitheel op het oppervlak hebben ontwikkeld, moet structurele ondersteuning worden geboden voor de ontwikkeling van ventrikelachtige structuren. Dit wordt bereikt door de EB's in te bedden in een keldermembraanmatrix. Vanwege verschillen in ontwikkelingssnelheden zijn marmoset- en resusapen EB's al klaar voor inbedding bij 7 dps, terwijl menselijke en chimpansee-EB's meestal zijn ingebed bij 8-9 dps. Voor de eenvoud verwijst keldermembraanmatrix in dit protocol alleen naar Matrigel. Geltrex kan echter als vervanging worden gebruikt.
    1. Ter voorbereiding op het insluiten, UV-steriliseren schaar, tang, een klein rek voor 0,2 ml buizen, en drie tot zes vierkanten parafilm behandeld met 70% (vol / vol) ethanol onder de laminaire stroomkap gedurende 15 minuten. Laat de keldermembraanmatrix enkele uren op ijs ontdooien (~ 1,5 ml keldermembraanmatrix is meestal voldoende voor 96 EBs).
      OPMERKING: Houd de keldermembraanmatrix altijd op ijs.
    2. Maak een 4 x 4 kuiltjesraster op de parafilm. Plaats het parafilmrooster op het buisrek van 0,2 ml zodat de met papier omhulde kant naar boven is gericht en druk voorzichtig een gehandschoende vinger tegen elk gat van het rek.
    3. Verwijder het papier en knip het kuiltjesraster uit het parafilm-vierkant met een schaar om de grootte aan te passen zodat het in een celkweekschaal van 60 mm past. Plaats de gerimpelde parafilm terug op het buisrek van 0,2 ml om een basis te bieden voor het genereren van druppels van de keldermembraanmatrix.
    4. Gebruik een pipet met een gesneden pipetpunt van 200 μL en breng de EB's voorzichtig achter elkaar over van de put van de kweekschaal naar de parafilmkuilen.
    5. Nadat u 16 EB's naar het rooster hebt verplaatst, neemt u een nieuwe pipetpunt van 200 μL en verwijdert u het resterende medium uit de kuiltjes.
    6. Pipetteer één druppel (~ 15 μL) keldermembraanmatrix op elk kuiltje met één EB.
    7. Neem een pipetpunt van 10 μL en verplaats de EB's snel naar het midden van elke druppel zonder de druppelranden te verstoren.
    8. Plaats de gerimpelde parafilm met de druppels van de keldermembraanmatrix in een celkweekschaal van 60 mm en incuber gedurende 15-30 minuten bij 37 °C om de matrix te laten polymeriseren.
    9. Om de in de matrix ingebedde EB's los te maken van de parafilm, voegt u 5 ml differentiatiemedium (DM) zonder vitamine A ( zie tabel 2) toe aan de schaal en draait u het parafilmvierkant ondersteboven met een tang, zodat de kant met de EB's naar de bodem van de schaal is gericht.
    10. Schud de schaal voorzichtig om de druppels van de keldermembraanmatrix met de EB's los te maken van de parafilm. Als sommigen van hen nog steeds zijn bevestigd, neem dan een rand van het parafilm-vierkant met een tang en rol het snel meerdere keren op naar het midden van de schotel.
    11. Kweek de cerebrale organoïden op een orbitale shaker bij 55 rpm in een gehumificeerde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht bij 37 °C. Houd ze in DM zonder vitamine A met medium veranderingen om de andere dag. Om de productie van neuronen te induceren, schakelt u over op DM met vitamine A (retinoïnezuur, RA) na 13 dps voor marmoset en resusapen cerebrale organoïden of 14-15 dps voor menselijke en chimpansee cerebrale organoïden (figuur 1A). Verander vanaf dit punt het medium om de 3-4 dagen.
      OPMERKING: Om neuronale overleving te ondersteunen, kan DM met vitamine A worden aangevuld met 20 μg / ml humaan neurotrofine 3 (NT3), 20 μg / ml van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en 1 μL / ml keldermembraanmatrix vanaf 40 dps.

3. Elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten

OPMERKING: Vanuit technisch oogpunt kan de elektroporatie van cerebrale organoïden worden uitgevoerd zodra de ventrikelachtige structuren voldoende zijn uitgesproken om te worden gericht door micro-injectie. Het optimale elektroporatietijdvenster hangt af van de biologische vraag en van de celpopulatie(s) van belang. Als bijvoorbeeld apicale voorlopers (AP's) het belangrijkste doelwit zijn, dan zijn cerebrale organoïden bij ongeveer 30 dps al geschikt. Als basale voorlopers (BP's) of neuronen de belangrijkste doelwitten zijn, moeten oudere cerebrale organoïden van meer dan 50 dps worden gebruikt (zie bijvoorbeeld Fischer et al.28).

  1. Voorbereiding van de elektroporatie-opstelling
    OPMERKING: De elektroporatie-efficiëntie wordt sterk beïnvloed door de grootte en de concentratie van de geëlektroleerde plasmide (en) (zie de discussiesectie voor details).
    1. Bereid een voldoende hoeveelheid elektroporatiemengsel voor de controle- en gen-inactiviteit (GOI), bijvoorbeeld 10 μL elektroporatiemengsel voor elke controle en de Indiase overheid om ongeveer 30 cerebrale organoïden per aandoening te elektroporeren.
      OPMERKING: Voor de samenstelling van de elektroporatiemengsels, zie tabel 3.
    2. Voorwarm (niet-steriel) Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium/nutriëntenmengsel F-12 (DMEM/F12) en DM met vitamine A tot 37 °C. Maak een kleine spatel en een fijne en normale schaar en spuit de instrumenten met 70% (vol/vol) ethanol.
      OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd onder steriele of niet-steriele omstandigheden omdat de DM antibiotica bevat (zie tabel 2). Onze ervaring is dat de afwezigheid van steriliteit nooit enige besmetting heeft veroorzaakt.
    3. Bereid 35 mm celkweekschalen voor en sluit de petrischaalelektrodekamer aan op de elektroporator.
      OPMERKING: Petrischalen elektrodekamers zijn in de handel verkrijgbaar. Ze kunnen echter eenvoudig op een kostenefficiënte manier worden geproduceerd (zie Aanvullend dossier 1).
    4. Gebruik microloadertips om micro-injectienaalden te vullen met 8 μL van elke elektroporatiemix. Knip de uiteinden van de naalden af met een fijne schaar voor het eerste gebruik om een stabiele stroming te bereiken. Verwijder echter slechts een klein deel van de punt, omdat een stompe en brede punt de organoïden ernstig kan beschadigen.
      OPMERKING: Microinjectienaalden zijn in de handel verkrijgbaar als voorgetrokken microinjectienaalden of kunnen in het laboratorium worden getrokken als er een naaldtrekker beschikbaar is. Volg de instructies van de naaldtrekkerfabrikant om micro-injectienaalden te genereren met een lange taps toelopende en een tipdiameter van 10 μm.
  2. Micro-injectie en elektroporatie
    1. Kies onder een microscoop vijf cerebrale organoïden met gladde randen en duidelijk zichtbare ventrikelachtige structuren. Verplaats ze naar een celkweekschaal van 35 mm met voorverwarmde (37 °C) DMEM/F12 met behulp van een gesneden pipetpunt van 1.000 μL.
      OPMERKING: Kies cerebrale organoïden met uitgesproken en toegankelijke ventrikelachtige structuren (zie figuur 1B).
    2. Om een ventrikelachtige structuur te injecteren, steekt u de naald voorzichtig door de wand en infundeert u deze met het elektroporatiemengsel totdat deze zichtbaar gevuld is. Oefen geen overmatige druk uit op ventrikelachtige structuren om te voorkomen dat ze barsten. Ga op deze manier verder met zes tot acht ventrikelachtige structuren van elke cerebrale organoïde.
      OPMERKING: Als de naald verstopt raakt tijdens het micro-injectieproces, moet de punt iets worden bijgesneden.
    3. Breng één micro-geïnjecteerde cerebrale organoïde over naar de elektrodekamer van de petrischaal met een kleine hoeveelheid DMEM/F12. Schik de organoïde op een manier dat de oppervlakken van de micro-geïnjecteerde ventrikelachtige structuren naar de elektrode gericht zijn die is verbonden met de positieve pool van de elektroporator.
      OPMERKING: Door de structuren op deze manier te oriënteren, zorgt u ervoor dat de cellen worden getransfecteerd aan de kant van de ventrikelachtige structuur die niet wordt beïnvloed door een aangrenzende structuur.
    4. Elektroporate de cerebrale organoïden één voor één met behulp van de volgende instellingen: 5 pulsen van 80 V, een pulsduur van 50 ms en een interval van 1 s. Verplaats de geëlektroporeerde organoïden naar een nieuwe 35 mm celkweekschaal gevuld met voorverwarmde (37 °C) DMEM/F12.
      OPMERKING: De elektroporatie-instellingen kunnen afhankelijk zijn van de beschikbare blokgolfelektroporator. Deze instellingen zijn geoptimaliseerd voor het elektroporatiesysteem waarnaar wordt verwezen. Het verhogen van de spanning kan leiden tot de verplaatsing van de cellen.
    5. Ga op dezelfde manier te werk met de volgende vijf cerebrale organoïden met behulp van de tweede elektroporatiemix (bijvoorbeeld GOI).
      OPMERKING: Herhaal stap 3.2.1-3.2.5 totdat het gewenste aantal geëlektroporeerde cerebrale organoïden is bereikt.
    6. Als de micro-injectie en elektroporatie onder niet-steriele omstandigheden werden uitgevoerd, breng de geëlektropoleerde organoïden dan over naar een steriele 35 mm celkweekschaal onder een laminaire stroomkap terwijl u zo min mogelijk DMEM / F12 naar de nieuwe celkweekschaal verplaatst.
  3. Verdere kweek en fixatie van cerebrale organoïden
    1. Kweek de geëlektroporeerde organoïden in DM met vitamine A op een orbitale shaker bij 55 rpm in een gehumificeerde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht bij 37 °C.
    2. Controleer de volgende dag na elektroporatie de hersenorganoïden op succesvolle elektroporatie onder een conventionele omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: Afhankelijk van de lengte van de verdere cultuur na elektroporatie, worden verschillende celpopulaties binnen de cerebrale organoïde beïnvloed (zie ook de rubriek met representatieve resultaten).
    3. Ga verder met downstream-toepassingen na het kweken van de geëlektroforeerde cerebrale organoïden gedurende een hoeveelheid tijd die geschikt is voor de biologische kwestie van belang.
      OPMERKING: Geëlektroporeerde cerebrale organoïden kunnen worden verwerkt voor verschillende downstream-toepassingen (bijv. Fixatie voor immunofluorescentiekleuring of snap-frozen voor RNA-isolatie en qRT-PCR). Hier beschrijven we de fixatie van geëlektroporeerde cerebrale organoïden.
    4. Breng de geëlektropoeerde organoïden over in een conische centrifugebuis van 15 ml met behulp van een gesneden pipetpunt van 1.000 μl en verwijder overtollig medium.
    5. Voeg een voldoende hoeveelheid van 4% paraformaldehyde (PFA) toe in DPBS (pH 7,5) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      LET OP: PFA is geclassificeerd als een carcinogeen voor de mens en kan onherstelbare gezondheidsschade veroorzaken. Aanvullende voorzorgsmaatregelen, waaronder nitrilhandschoenen en brillen, worden sterk aanbevolen.
    6. Zuig de PFA aan, voeg 5 ml DPBS toe, schud een beetje en zuig de DPBS op. Herhaal dit 2x. Bewaar de organoïden in DPBS bij 4 °C tot verder gebruik.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd, omdat PFA-gefixeerde cerebrale organoïden gedurende enkele maanden bij 4 °C kunnen worden bewaard. PFA-vaste geëlektroporeerde organoïden kunnen worden geanalyseerd door cryosectionering en immunofluorescentiekleuring 10,28 of door whole-mount kleuring en clearing35,36. Zie bijvoorbeeld afbeeldingen de sectie representatieve resultaten (zie tabel 4 voor antilichaamdetails).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier beschreven protocol maakt de efficiënte generatie van cerebrale organoïden mogelijk van menselijke, chimpansee-, resusaap- en gewone marmoset iPSC-lijnen met minimale timingwijzigingen die nodig zijn tussen soorten (figuur 1A). Deze organoïden kunnen worden geëlektropoeerd in het bereik van 20 dps tot 50 dps, afhankelijk van de toegankelijkheid van de ventrikelachtige structuren en de overvloed van de celpopulatie (en) van belang. Voorafgaand aan elektroporatie is het echter belangr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven procedures vertegenwoordigen een uniform protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van verschillende primatensoorten met een gerichte elektroporatiebenadering. Dit maakt de ectopische expressie van een Indonesische overheid mogelijk in een modelsysteem dat de ontwikkeling van primaten (inclusief menselijke) (patho)fysiologische neocortex emuleert. Dit uniforme protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van primaten maakt gebruik van dezelfde materialen (bijv. Media) en protocolstap...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

We verontschuldigen ons bij alle onderzoekers wiens werk niet kon worden geciteerd vanwege ruimtebeperkingen. Wij danken Ulrich Bleyer van de technische dienst van DPZ en Hartmut Wolf van de werkplaats van MPI-CBG voor de bouw van de petrischaalelektrodekamers; Stoyan Petkov en Rüdiger Behr voor het verstrekken van menselijke (iLonza2.2), resusapen (iRh33.1) en marmoset (cj_160419_5) iPSC's; Sabrina Heide voor de cryosectieing en immunofluorescentiekleuring; en Neringa Liutikaite en César Mateo Bastidas Betancourt voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk in het laboratorium van W.B.H. werd ondersteund door een ERA-NET NEURON (MicroKin) subsidie. Het werk in het laboratorium van M.H. werd ondersteund door een ERC starting grant (101039421).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20 µL MicroloaderEppendorf5242956003
2-MercaptoethanolMerck8.05740.0005
35 mm cell culture dishesSarstedt83.3900
60 mm cell culture dishesCytoOneCC7682-3359
Activin ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence MicroscopeZeissvervangbaar door vergelijkbare fluorescentiemicroscopen
AZD0530Selleckchem S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)Gibco17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTX45-2052
CGP77675Sigma-AldrichSML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra Adoi: 10.7554/elife.18683 
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco14190-094pH 7.0−7.3; warmen tot kamertemperatuur voor gebruik
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050-061glutamine vervangende supplement
Heparin (1 mg/mL stock)Sigma-AldrichH3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)PeproTech450-03
InsulinSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)Leica10473849vervangbaar door vergelijkbare stereomicroscopen
MatrigelCorning354277/354234bazale membraan matrix; alternatief kan Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) worden gebruikt
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Sigma-AldrichM7145
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldehyde Merck818715handel met voorzichtigheid vanwege kankerogeniteit
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)PanBiotechP06-07100
Petri dish electrode chamberzelf geproduceerd (zie aanvullend bestand 1)ook commercieel verkrijgbaar
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LTborosilicaat glazen pipetten met lange tapsheid, 10 µm tip diameter
Pro-Survival CompoundMerckMillipore529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)PeproTechAF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501proteolytisch en collagelytisch enzymmengsel
TrypLEGibco12604-013recombinant trypsin substituut; warmen tot kamertemperatuur voor gebruik
Ultra-Low Attachment 96-well platesCostar7007
Y27632Stemcell Technologies72305

Referenties

  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
  3. Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612(2019).
  4. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  5. Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
  6. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  7. Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
  8. Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
  9. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  12. Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  13. Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
  14. Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
  15. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  16. Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30(2021).
  17. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558(2019).
  18. Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
  19. Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347(2020).
  20. Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
  21. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  22. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  23. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  24. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
  25. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24(2012).
  26. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  27. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  28. Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728(2022).
  29. Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349(2020).
  30. Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683(2016).
  31. Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422(2020).
  32. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  33. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  34. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  35. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  36. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884(2019).
  37. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129(2022).
  38. Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
  39. Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
  40. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  41. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hersenontwikkeling bij primatenmicroinjectietechniekelectroporatiemethodege nduceerde pluripotente stamcellenventrikelachtige structurencorticale progenitorcellenneurodevelopmentele stoornissenevolutionaire hersenstudies

Gerelateerde artikelen