Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Duke University of de gelijkwaardige lokale autoriteit die onderzoek met dieren reguleert. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van het instrument
- Zorg ervoor dat alle benodigde items en chirurgische instrumenten op hun plaats zitten (Figuur 2): hoofdhuidreinigingsoplossing (alcoholdoekjes), tape, pincet, schaar en een boormachine voor het plaatsen van de kleine (0.5 mm) braamgaten.
- Bereid de extracraniële oppervlakte-elektroden voor op het aanbrengen van de schedel en zorg ervoor dat eventuele chirurgische lijm ervan is verwijderd als ze eerder zijn gebruikt.
- Controleer de impedantie van deze tACS-elektroden direct voordat u ze op de schedel aanbrengt. Gebruik hiervoor de ingebouwde meetfunctie van de tACS-stimulator waarbij beide elektroden in een zoutoplossing zijn geplaatst.
NOTITIE: De gewenste impedantie is <5 KΩ per elektrodepaar om voldoende stroom over de schedel te laten lopen. De stimulator controleert de impedantie voordat er constantstroompulsen worden afgegeven en geeft direct de waarde door.

Figuur 2: Een foto van de benodigde instrumenten, inclusief ontleedinstrumenten en scharen, voor de voorbereiding van de extracraniële stimulatie. 1. Micro-ontleedschaar, 11,5 cm; 2. Pincet, 11,5 cm, lichte kromming, gekarteld; 3. Dumont #7 pincet, gebogen; 4. Dumont #5 pincet; 5. Microcurette, 13 cm; 6. Wattenstaafjes; 7. Chirurgische tape; 8. Alcohol pads. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Voorbereiding van het dier op de operatie
OPMERKING: Voor deze experimenten gebruikten we 14 C57BL/6 controlemuizen tussen 12 weken en 33 weken oud, waarvan vijf mannelijk en negen vrouwelijk.
- Verdoof het dier in een inductiekamer met isofluraan in 30% O2 bij ~1,5 l/min, met ~4% aanvankelijk om te induceren en ~1,25%-1,5% om op een niveau van anesthesie te blijven met spontane ademhaling en voldoende om de staartknijpreactie te elimineren.
- Breng het dier na inductie over naar het stereotaxische frame en zet vervolgens de kop vast in de neuskegel en oorbalken voor het vervolgens aanbrengen van de elektrode en de braamprocedure (Figuur 1 en Figuur 3).
- Sluit de neuskegel van het stereotaxische frame aan op de verdamper via een inlaat en op een uitlaat om eventuele isofluraanresten te verwijderen via een opruimsysteem (bijv. houtskool of een vacuüm). Zorg ervoor dat er geen luchtlekken uit de neuskegel komen, zowel om het anesthesieniveau met de isofluoraan op peil te houden als om onbedoelde lekkage in de kamerlucht te voorkomen (Figuur 3).
- Controleer de positie van de muis in het stereotaxische frame, inclusief de positie van de neuskegel, om spontane ademhaling zonder intubatie mogelijk te maken, evenals passend anesthesieherstel en opruimen om het onderzoekspersoneel te beschermen (Figuur 3).
- Plaats de sondes voor het meten van de polsslag, pulszuurstofverzadiging (puls OX), bloeddruk en temperatuur op het dier; Zorg ervoor dat de minimale pulsoxygenatie 90% is en dat de puls >450/min is (de ondergrens van het alarm wordt weergegeven als 380 pulsen/min). Registreer deze parameters tijdens de procedure met regelmatige tussenpozen of continu, afhankelijk van het registratiesysteem (figuur 3).
- Controleer voordat u met de procedure begint de mate van sedatie van het dier met behulp van (bijvoorbeeld) een teenknijp om de reflexen te controleren. Als er geen reflex is, is het niveau van sedatie optimaal, zolang het dier spontane ademhaling en voldoende pulsoxygenatie behoudt. Als er een reflex is, verhoog dan de afgifte van isofluraan om het niveau van de anesthesie te verdiepen en controleer vervolgens de reflex opnieuw. Observeer en controleer continu de ademhalingsfrequentie van het dier en pas de isofluraanafgifte dienovereenkomstig aan.
- Scheer het hoofdhaar of verwijder het haar met ontharingscrème (reinig de resterende crème met alcoholkussentjes).
- Breng oogzalf aan en reinig vervolgens de hoofdhuid aseptisch met drie passages jodium en alcohol voorafgaand aan de excisie met een schaar.

Figuur 3: Een afbeelding van het dier in het stereotactische frame, met de schedel bloot en alleen de elektroden van de tACS-stimulator op hun plaats (voorafgaand aan het plaatsen van het braamgat). Let op het bloeddrukapparaat rond de staart en de pulsoximeter op de poot, met de meting aan de linkerkant. Rond de neuskegel zitten opruimbuisjes voor de isofluraan. Afkorting: tACS = transcraniële wisselstroomstimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Chirurgische ingreep: het aanbrengen van de stimulerende elektroden en het maken van de braamgaten
- Voor een terminaal onderzoek verwijdert u de hoofdhuid met een chirurgische schaar en stelt u de schedel caudaal ~3 mm bloot van de lambdoïde hechting en ~3 mm frontaal ten opzichte van het bregma om een deel van de achterste frontale hechting bloot te leggen. Snijd de hoofdhuid pariëtaal weg om het eerste deel van de temporale spier aan beide zijden bloot te leggen (Figuur 3).
- Verwijder eventueel achtergebleven onderhuids bindweefsel zodat de schedel schoon en droog is voor het aanbrengen van de stimulerende elektroden.
- Breng geleidende gel of pasta aan op de zijkant van de elektroden die in contact komen met de schedel en zet de elektroden vast met chirurgische secondelijm rond de rand op intermitterende plaatsen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de geleidende gel de chirurgische secondelijm niet hindert om een betere hechting aan het schedeloppervlak mogelijk te maken. Het buitenoppervlak van de elektroden kan ook worden geïsoleerd (van de hoofdhuid als deze tijdens een overlevingsoperatie wordt gesloten) met behulp van chirurgische secondelijm.
- Gebruik commerciële platte elektroden of maak interne elektroden met behulp van geïsoleerde draad met een diameter van 100 μm (gesoldeerd aan de plaat) en een flexibele, geïsoleerde (op één oppervlak) koperen plaat van 1 mm x 3 mm die is gesneden volgens de grootte van de schedel.
- Breng lidocaïnepasta aan op de temporale spier en hoofdhuid aan beide kanten zonder de elektroden te verstoren om de activering van de spier en perifere zenuw te verminderen.
- Zodra de extracraniële stimulerende elektroden 4 mm zijdelings aan elke kant van de schedel (tussen de bregma en lambda) zijn geplaatst, boort u twee braamgaten van 0,5 mm voor de glaselektroden 2 mm aan elke kant van de middellijn, 4 mm uit elkaar, loodrecht op de sagittale hechting (Figuur 1). Vul deze braamgaten met steriele minerale olie om te voorkomen dat er stroom van de extracraniale elektroden in de schedel komt.
- Indien gewenst voor een bepaald experiment om spreidingsdepressie te induceren (d.w.z. kaliumgeïnduceerde spreidingsdepressie [K+-SD]), voeg dan aan de rechterkant van de schedel een derde braamgat van 0,5 mm ~1,5 mm rostraal toe aan de coronale hechting en ~1 mm lateraal aan de achterste frontale hechtdraad. Vul dit maalgat met zoutoplossing voor latere toepassing van 1 M KCl om K+-SD te induceren.
- Test de impedantie van de extracraniële stimulerende elektroden, zowel voorafgaand aan het plaatsen van het maalgat (en vergeleken met dezelfde elektroden die in een zoutoplossing zijn geplaatst) als na het plaatsen van het maalgat om te controleren of de braamgaten de stroom naar de hersenen niet verstoren (d.w.z. zorg ervoor dat de weerstand ongewijzigd blijft).
NOTITIE: De impedantiemeting wordt rechtstreeks door het stimulerende apparaat geleverd. Over het algemeen hebben we geconstateerd dat de algehele systeemimpedantie (d.w.z. van de extracraniale elektroden over de schedel/hersenbaan, meestal ~ 3 KΩ) relatief constant is, ongeacht de braamgaten en glazen micro-elektroden, wat aangeeft dat er minimale stroomlekkage rechtstreeks in de hersenen is via de braamgaten.
- Plaats de chronische transcraniële stimulatie-elektroden voor chronische stimulatie op een vergelijkbare manier. Isoleer in dit geval het buitenoppervlak van de elektroden, sluit de hoofdhuid en tunnel de geïsoleerde draden door de hoofdhuid of leid ze naar een vaste hoofdtrap die op de schedel is gemonteerd.
4. Fysiologische procedure
- Begin met de fysiologische aspecten van het experiment, zodra het dier volledig is voorbereid op het niet-overlevende, fysiologische experiment. Handhaaf het anesthesieniveau voldoende voor zowel spontane ademhaling als voldoende pols-, ademhalings- en polsniveaus.
- Meet de CBF die het gevolg is van de extracraniële stimulatie met een van de volgende twee methoden.
- Plaats de muis onder een laserspikkelbeeldvormingsapparaat met of zonder intracraniële opname-elektroden om het intracraniële elektrische veld tijdens stimulatie-episodes te meten (Figuur 3).
- Breng het dier over naar een fysiologisch preparaat voor de plaatsing van bilaterale laser-Doppler-sondes en intracraniële elektroden om het intracraniële elektrische veld te meten tijdens stimulatie-episodes (figuur 1).
5. Plaatsing van bilaterale laserdoppler- en glaselektroden
- Breng het dier over naar een microscooptafel voor de toepassing van bilaterale laser Doppler-sondes. Plaats de sondes op de bovenkant van het schedeloppervlak tussen de bilaterale braamgaten en de coronale hechting (Figuur 1).
- Vul getrokken glazen micro-elektroden (~0,1 μM, 2-6 MΩ impedantie) met 0,2 M NaCl en plaats ze met behulp van een micromanipulator in de twee braamgaten die lateraal op de sagittale hechting 3,14 zijn geplaatst (Figuur 1).
OPMERKING: Deze braamgaten bevinden zich tussen de twee symmetrische extracraniële stimulatie-elektroden (Figuur 1).
- Eenmaal ingebracht in de hersenen, zorg ervoor dat deze glazen micro-elektroden zich ~1 mm binnen de hersenschors bevinden. Voer diepteprofielen uit op verschillende symmetrische dieptes. Vul de maalschijven opnieuw met steriele minerale olie om dit pad te isoleren voor stroom.
6. Stimulatieprocedure en meting van de intensiteit van de transcraniële wisselstroomstimulatie (tACS) of transcraniële gelijkstroomstimulatie (tDCS)
- Registreer continue gegevens van de dubbele laser Doppler-sondes op de schedel en de twee intracraniële micro-elektrode-uitgangen (opgenomen met behulp van een DC-versterker met hoofdtrappen) met behulp van een digitaliseringssysteem en software met ten minste vier kanalen (bij een bemonsteringsfrequentie van 1 KHz). Zodra alle waarden zijn geregistreerd gedurende een voldoende stabiele basislijnduur (d.w.z. >10 min), test u de extracraniële stimulatie.
OPMERKING: Figuur 4 toont een voorbeeld van de vier kanalen met de twee intracraniële opname-elektroden in de bovenste kanalen en de CBF-respons in de onderste kanalen.
- Pas korte perioden van aan/uit-stimulatie toe op verschillende amplitudes (d.w.z. 20-30 s, 0.5-2.0 mA, binnen het aanvaardbare bereik) om een duidelijke basislijn voor en na stimulatie te verkrijgen (Figuur 4). Pas de stimulatie toe tussen de twee schedel tACS-elektroden aan weerszijden (Figuur 1) met behulp van een commercieel, menscompatibel stimulerend apparaat dat een constante stroom levert.
- Observeer de muis nauwlettend op spiertrekkingen of andere reacties op de tACS, zoals een verandering in de pols of ademhaling, om een bovengrens van verdraagbaarheid te creëren (meestal ~2 mA).
- Blijf de impedantie over de elektroden bewaken met stimulatie-epochs om ervoor te zorgen dat deze constant is.
- Voeg een kleine hoeveelheid (2-3 μL) van 1 M KCl toe aan het voorste braamgat14 om spontane K+-SD-gebeurtenissen te induceren. Deze genereren een grote CBF-respons en interacties tussen de K+-SD-geïnduceerde CBF-respons en de CBF-respons. Schat de tACS CBF-respons en pas de tACS-stimulatie zowel voor als na het optreden van de SD toe.
- Voer aan het einde van het experiment euthanasie uit door middel van een overdosis isofluraan (5%) en onthoofd vervolgens zodra de ademhaling en hartslag zijn gestopt.

Figuur 4: Gegevens met vier kanalen van ruwe gegevens als reactie op tACS met lage intensiteit. De gegevens zijn gerangschikt met de bovenste twee rijen als de intracraniële, directe DC elektrische opnames (gelabeld als ingang 1 [IN0] en ingang 2 [IN1]) en de onderste twee rijen als de bilaterale laser Doppler-opnames van de cerebrale bloedstroom. Merk op dat de reacties asymmetrisch zijn tussen de rechter (bovenste) en linker (onderste) elektrische en cerebrale bloedstroomsporen. (A) Een kleine respons (16% toename van de bloedstroom) als reactie op een stimulus van 1,2 mV/mm 20 s (0,75 mA). (B) Een grotere respons (21% toename van de bloedstroom) als reactie op een stimulus van 1,4 mV/mm (1,0 mA). Afkorting: tACS = transcraniële wisselstroomstimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Berekening van het elektrisch veld
- Meet het verschil in de output van de twee intracraniële elektroden met behulp van het verschil in de halve golf (één cyclus) van de twee geregistreerde sinusgolven (de bovenste twee sporen in figuur 4). Deel dit verschil (mV) door de afstand tussen de twee elektroden (mm, hier ~4 mm maar telkens direct gemeten) om tot de veldsterkte (mV/mm) te komen3,6.