Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakterisering van zinktransporters bij zoogdieren met behulp van een in-vitro-zinktransporttest

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65217

⸱

2 juni 2023

 ,  , 
1Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University, 2Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University

In dit artikel

Samenvatting

Zinktransport is een uitdaging gebleken om te meten vanwege de zwakke causale verbanden met de eiwitfunctie en de lage temporele resolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren, met hoge temporele resolutie, van Zn 2+ extrusie uit levende cellen door gebruik te maken van een Zn 2+ gevoelige fluorescerende kleurstof, waardoor een directe meting van Zn2+ efflux wordt verkregen.

Samenvatting

Overgangsmetalen zoals Zn2+-ionen moeten streng worden gereguleerd vanwege hun cellulaire toxiciteit. Voorheen werd de activiteit van Zn 2+ transporters indirect gemeten door het expressieniveau van de transporter onder verschillende concentraties van Zn2+ te bepalen. Dit werd gedaan door gebruik te maken van immunohistochemie, het meten van mRNA in het weefsel of het bepalen van de cellulaire Zn2+-niveaus. Met de ontwikkeling van intracellulaire Zn 2+-sensoren worden de activiteiten van zinktransporters momenteel voornamelijk bepaald door het correleren van veranderingen in intracellulair Zn 2+, gedetecteerd met fluorescentiesondes, met de expressie van de Zn2+-transporters. Maar zelfs vandaag de dag zijn er maar een paar laboratoria die dynamische veranderingen in intracellulair Zn2+ monitoren en gebruiken om de activiteit van zinktransporters rechtstreeks te meten. Een deel van het probleem is dat van de 10 zinktransporters van de ZnT-familie, behalve ZnT10 (transporteert mangaan), alleen zinktransporter 1 (ZnT1) gelokaliseerd is op het plasmamembraan. Daarom is het moeilijk om de transportactiviteit te koppelen aan veranderingen in de intracellulaire Zn2+-concentratie. Dit artikel beschrijft een directe manier om de kinetiek van het zinktransport te bepalen met behulp van een test op basis van een zinkspecifieke fluorescerende kleurstof, FluoZin-3. Deze kleurstof wordt in zijn estervorm in zoogdiercellen geladen en vervolgens gevangen in het cytosol als gevolg van cellulaire di-esterase-activiteit. De cellen worden geladen met Zn 2+ door gebruik te maken van het Zn2+ ionofoorpyrithion. De ZnT1-activiteit wordt beoordeeld aan de hand van het lineaire deel van de vermindering van de fluorescentie na het uitspoelen van de cel. De fluorescentie gemeten bij een excitatie van 470 nm en emissie van 520 nm is evenredig met het vrije intracellulaire Zn2+. Door de cellen te selecteren die ZnT1 tot expressie brengen die zijn gelabeld met de mCherry-fluorofoor, kunnen alleen de cellen worden gecontroleerd die de transporter tot expressie brengen. Deze test wordt gebruikt om de bijdrage van verschillende domeinen van het ZnT1-eiwit aan het transportmechanisme van humaan ZnT1 te onderzoeken, een eukaryotisch transmembraaneiwit dat overtollig zink uit de cel extrudeert.

Inleiding

Zink is een essentieel sporenelement in het cellulaire milieu. Het bevat een derde van alle eiwitten en is betrokken bij verschillende cellulaire processen, zoals katalyse1, transcriptie2 en structurele motieven3. Ondanks dat ze redox-inert zijn, zijn hoge zinkconcentraties echter giftig voor de cel, en daarom heeft geen enkel zoogdierorganisme overleefd zonder de aanwezigheid van mechanismen die de zinkhomeostase reguleren. Bij zoogdieren zijn drie mechanismen verantwoordelijk voor dit proces: (1) metallothioneïnen, cytosolische cysteïnerijke eiwitten die zink met een hoge affiniteit binden, waardoor een teveel aan vrij cytosolisch zink wordt voorkomen4; (2) Zrt/Irt-achtige eiwitten (ZIP's), die zinktransporters zijn die verantwoordelijk zijn voor de instroom van zink in het cytosol via het plasmamembraan of uit intracellulaire organellen 4,5,6,7,8; en (3) ZnT's, die een zoogdiersubset zijn van de alomtegenwoordige kationdiffusiefacilitator (CDF)-familie en zinktransporters zijn, omdat ze zink uit het cytosol over het plasmamembraan of in de intracellulaire organellen extruderen 4,5,6,7,8,9. Vanwege het belang van zink voor het cellulaire metabolisme, is het van vitaal belang om de cellulaire zinkdynamiek te begrijpen.

Eerdere methoden om de zinkdynamiek te beoordelen, waren afhankelijk van het beoordelen van de expressieniveaus van mRNA onder verschillende zinkomstandigheden door ze te correleren met cellulaire zinkmetingen van vaste weefsels of cellen10,11,12. Deze methoden omvatten chemische detectie en immunohistochemische kleuring. Deze methoden leveren echter slechts indirecte metingen op en bepalen dus alleen een offline correlatie tussen de intracellulaire zinkconcentratie en de expressie van zinktransporters. Bijgevolg kunnen deze methoden geen parameters afleiden die een hoge temporele resolutie vereisen.

Een meer directe meting van het Zn2+ transport maakt gebruik van radioactieve isotopen van zink13. Deze methode is gebaseerd op de meting van radioactief gelabeld Zn2+ om het zinktransport en de kinetiek ervan te monitoren. Vanwege het belang van zink voor cellulaire homeostase reguleren meerdere cellulaire processen echter de intracellulaire zinkconcentratie. Hiertoe behoren extracellulaire binding en verschillende transportsystemen die samenwerken om de intracellulaire Zn2+- niveaus strak onder controle te houden. De combinatie van deze processen zorgt voor veel achtergrondgeluid, wat het moeilijk maakt om individuele zinkgerelateerde transportfuncties te testen.

Dit artikel demonstreert een methode om de zinktransportsnelheid direct te controleren door de intracellulaire vrije zinkconcentratie te meten met behulp van een zinkspecifieke fluorescerende kleurstof, FluoZin-3. De kleurstof heeft een hoge specificiteit voor Zn2+ en weinig interferentie van andere tweewaardige kationen, zoals calcium. Bovendien komt het in zijn estervorm de cellen binnen door niet-ionische diffusie en wordt het vervolgens gevangen door de activiteit van intracellulair di-esterase. De fluorescentie is dus voornamelijk gecorreleerd met de vrije cytosolische zinkconcentratie. Deze experimenten werden uitgevoerd om de structuur-functierelatie van zinktransporter 1 (ZnT1), een lid van de ZnT-familie, te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cel transfectie

  1. Kweek HEK293T cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine en 1x penicilline/streptomycine (zie materiaaltabel) in een bevochtigde incubator bij 37 °C/5% CO2 tot samenvloeiing op een plaat van 10 cm (8,8 x 106 cellen in totaal).
  2. Plaats een dekglaasje van 13 mm in elk van de putjes van een plaat met 12 putjes. Verdun 0,44 x 106 trypsinized cellen uit stap 1.1 in 12 ml volledige DMEM. Meng goed door drie tot vijf keer op en neer te pipetteren. Vul elk putje met 1 ml van de gemengde oplossing. Kweek 's nachts in een bevochtigde incubator bij 37 °C/5% CO2 .
  3. Vervang de volledige DMEM in elk putje door 1 ml serumvrije DMEM (zie Materiaaltabel) in elk putje. Plaats de plaat met 12 putjes terug in de bevochtigde incubator zoals in stap 1.1.
  4. Verdun voor elk transfectieputje 1 μg pAAV2-plasmide met het eiwit van belang gelabeld met mCherry fluorescerend eiwit (aanvullend bestand 1) in 100 μL serumvrije DMEM in een buisje van 1,5 ml.
  5. Voeg 3 μg polyethyleenimine (PEI, zie materiaaltabel) toe aan 100 μL serumvrije DMEM per transfectie, waarbij elke transfectie in een ander buisje van 1,5 ml wordt geplaatst. De plasmide:PEI-verhouding moet 1:3 (μg:μg) zijn.
  6. Draai beide buizen uit stap 1.4 en stap 1.5 gedurende 10 s en laat minimaal 5 minuten rusten bij kamertemperatuur.
  7. Meng één deel (100 μL per putje) van de DNA-oplossing uit stap 1.4 met één deel (100 μL per putje) van de PEI-oplossing uit stap 1.5. Draai de uiteindelijke oplossing gedurende 10 s en laat deze minimaal 20 minuten en maximaal 6 uur bij kamertemperatuur rusten.
  8. Neem de plaat met 12 putjes uit de couveuse. Draai de uiteindelijke oplossing uit stap 1.7 en voeg 200 μL toe aan elk van de putjes in de plaat met 12 putjes uit stap 1.3. Plaats de plaat met 12 putjes terug in de bevochtigde incubator (stap 1.1).
  9. Vervang na 3 uur het medium in elk putje door 1 ml volledige DMEM. Plaats de plaat met 12 putjes terug in de bevochtigde incubator zoals in stap 1.1.
  10. Neem na 2 dagen de getransfecteerde celkweek uit de incubator van 37 °C/5% CO2 en plaats deze op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 10x.
  11. Gebruik het scherpstelwiel van de microscoop om scherp te stellen op de cellen terwijl u helderveldlicht gebruikt.
  12. Schakel over naar de fluorescerende mCherry-excitatie (587 nm) en emissiegolflengten (610 nm) en schakel het helderveldlicht uit. Controleer op de fluorescentie van de cellen om de expressie van ZnT1 mCherry te bevestigen.
  13. Bereid de oplossing voor het laden van de kleurstof.
    1. Neem een aliquotum van 4 μl zinkspecifieke fluorescerende kleurstof (zie materiaaltabel) in de vorm van een acetoxymethylester (AM), opgelost in DMSO (1 μg/μl), uit een tegen licht beschermde voorraad die in een vriezer van -20 °C is bewaard. Deze vorm zorgt ervoor dat de kleurstof de cel kan binnendringen via het plasmamembraan door eenvoudige diffusie.
    2. Voeg 4 μl 10% pluronzuur (of 2 μl 20% pluronzuur, zie materiaaltabel) toe aan het aliquot van stap 1.13.1. Meng de oplossing goed door drie keer op en neer te pipetteren en voeg vervolgens alle 8 μL toe aan een buisje van 1,5 ml.
    3. Voeg 750 μL Ringer's oplossing (in eigen huis bereid, zie Materiaaltabel voor samenstelling) aangevuld met 1 mg/ml (~0,1%) runderserumalbumine toe aan de buis uit stap 1.13.2 en draai krachtig mee. Voeg nog eens 750 μL van dezelfde oplossing toe en draai opnieuw om een maximale menging te garanderen.
  14. Voeg 750 μl van de uiteindelijke oplossing van stap 1.13.3 toe aan twee putjes in een nieuwe kweekplaat met 6 putjes. Dek af met aluminiumfolie.
    NOTITIE: Om bleken te voorkomen, wordt de plaat met 6 putjes vanaf deze stap altijd afgedekt met aluminiumfolie.
  15. Neem met een fijn pincet maximaal vier gerepliceerde dekglaasjes van de getransfecteerde celkweekplaat en plaats ze in het eerste gevulde putje (maximaal vier glaasjes per putje) van de nieuwe plaat met 6 putjes uit stap 1.14. Herhaal dit proces voor de tweede gevulde put.
    OPMERKING: Alle dekglaasjes in hetzelfde gevulde putje moeten in dezelfde staat verkeren. Elke put kan echter verschillende aandoeningen bevatten.
  16. Dek af met aluminiumfolie en schud voorzichtig gedurende 15-20 minuten.
  17. Verwijder de oplossing voor het laden van de kleurstof en vervang deze door een nieuwe wasoplossing van Ringer's plus albumine, zoals gebruikt in stap 1.13.3. Dek af met aluminiumfolie. Laat opnieuw 20 minuten schudden. Dit maakt de splitsing van de AM-ester door de intracellulaire esterasen mogelijk.

2. Voorbereiding van de microscoop

  1. Rangschik de benodigde gereedschappen (zie Tabel met materialen) zoals vermeld: een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die GFP- en mCherry-fluoroforen kan detecteren, een perfusiesysteem waarmee kan worden geschakeld tussen ten minste twee oplossingen, een afzuigsysteem en een perfusiekamer.
  2. Schakel de microscoop, de lichtbron en de camera in. Schakel het afzuigsysteem in.
  3. Was het perfusiesysteem. Was de eerste kamer met Ringer's oplossing en de tweede kamer met Ringer's oplossing die 7 μM zinkoplossing bevat, aangevuld met 7 μM pyrithion (zinkionofoor, zie Materiaaltabel). Om luchtbellen of openingen te voorkomen, laat u wat vloeistof in elke kamer achter.
    NOTITIE: Aangezien beide containers zijn aangesloten op dezelfde buis die aan de perfusiekamer is aangesloten, moet u er altijd voor zorgen dat het gedeelde segment wordt gewassen met de oplossing van Ringer.
  4. Sluit de kranen en vul de juiste kamers met Ringer's oplossing en Ringer's zinkoplossing, zoals in stap 2.3.

3. Voorbereiding van het monster

  1. Neem de perfusiekamer en plaats deze met de smalle kant van de groef naar boven gericht.
    NOTITIE: De groef is een gat in het midden van de perfusiekamer. Het geeft de perfusievloeistof toegang tot de cellen. De ene kant van de groef is smal en de andere kant is breed.
  2. Breng een afdichtende siliconen (zie Tabel met materialen) aan rond de groef. Reinig eventuele afdichtende siliconen uit de groef met behulp van een pipetpunt.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat er voldoende siliconenafdichting rond de groef is om een dekglaasje van 22 mm af te dichten.
  3. Neem met een fijn pincet een dekglaasje uit de wasoplossing en plaats het op de groef met de cellen naar beneden gericht. Op deze manier worden de cellen tijdens het experiment blootgesteld aan de oplossing die de groef doorlaat.
  4. Plaats een dekglaasje van 22 mm op het dekglaasje van 13 mm en draai het vast met het pincet. Zorg ervoor dat de dekglaasjes niet barsten.
  5. Draai de kamer om en druk erop om alle aanwezige vloeistoffen vrij te geven. Vul de groef met 100 μL Ringer's wasoplossing en druk opnieuw om lekkage te voorkomen.
    NOTITIE: Als er een lekkage wordt gedetecteerd, breng dan een afdichtingsmiddel aan op de plaats van de lekkage en test opnieuw.
  6. Monteer de perfusiekamer op het platform en zet deze vast. Plaats de perfusie- en zuigbuizen om perfusie over de cellen in de groef mogelijk te maken.
  7. Verander de perfusiesnelheid in ongeveer 2 ml/min en schakel de perfusie van de Ringer-oplossing in. Zorg ervoor dat het perfusiesysteem werkt zonder lekkage of overloop.

4. Voorbereiding van de meting

  1. Open de beeldvormingssoftware (zie Materiaaltabel) door te dubbelklikken op het pictogram. Log in met de relevante inloggegevens. Kies de aangesloten camera en druk op OK.
  2. Stel de vergroting van de microscoop in op 10x met behulp van de knop aan de linkerkant van de microscoop.
  3. Kies live view en gebruik de joystick om het platform te verplaatsen om scherp te stellen op de cellen in de groef.
  4. Terwijl de perfusie is ingeschakeld, schakelt u de lichten uit en wijzigt u de golflengte in mCherry door op de speciale knop in de interface te drukken. Pas de scherpstelling aan met behulp van het microscoopfocuswiel.
  5. Zodra de microscoop op de cellen is gericht, beweegt u het platform met behulp van de joystick om de juiste celpatches te selecteren.
    OPMERKING: Een geschikt gebied wordt beschouwd als een gebied met ten minste 10 cellen voor een ROI en een leeg gebied voor de achtergrond.
  6. Selecteer het vervolgkeuzemenu ROI's in-/uitschakelen en kies Circulaire ROI's tekenen.
  7. Teken ROI's van celclusters met de mCherry-expressiecellen (geeft de expressie van ZnT1 aan).
  8. Klik in dezelfde werkbalk als stap 4.6 op de knop Achtergrond-ROI's in-/uitschakelen en pas de locatie en grootte van de achtergrond-ROI aan naar een gebied zonder cellen.
    1. Controleer met de mCherry- en EGFP-golflengten om er zeker van te zijn dat er geen cellen in de geselecteerde achtergrond-ROI staan.
      OPMERKING: De golflengten werden zo aangepast dat mCherry een excitatiegolflengte van 520 nm en een emissiegolflengte van 610 nm gebruikte en EGFP een excitatiegolflengte van 470 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.
  9. Selecteer het subtabblad Golflengte (λ ). Markeer het selectievakje en zorg ervoor dat de GFP-golflengte aanwezig is en dat het selectievakje is gemarkeerd. Zo niet, voeg het dan toe en markeer het.
  10. Selecteer het subtabblad Duur . Definieer het meetinterval als elke 5 s en wijzig het aantal intervallen dat past bij de duur van het experiment.
  11. Klik in het gedeelte Focus op het microscooppaneel onder het oculair op de knop Aan om het perfecte focussysteem (PFS) in te schakelen.
  12. Gebruik het PFS-scherpstelwiel om de scherpstelling aan te passen. Zorg ervoor dat PFS aan is aangevinkt in de software-interface, onder ND-acquisitie.
  13. Klik op Nu uitvoeren.

5. Experimentele procedure

  1. Begin met een nulmeting van 90 seconden met behulp van Ringer's oplossingsperfusie.
  2. Nadat de basislijnperiode is afgelopen, schakelt u de Ringer-oplossingsperfusie uit en schakelt u vervolgens de zinkoplossingsperfusie van de Ringer in. Markeer het wisselen van de oplossing door op de rode vlag rechtsonder in het hoofdinterfacepaneel te klikken. Verwacht wordt dat er een stijging van de fluorescentie zal optreden.
  3. Zodra de fluorescentiestijging begint te verzadigen, schakelt u terug naar perfusie met de oplossing van Ringer. Schakel de zinkoplossingsperfusie van de Ringer uit en schakel vervolgens de oplossingsperfusie van de Ringer in.
  4. Wacht tot de experimenttijd is verstreken. Een merkbare maar gestage afname van de fluorescentie wordt verwacht als de ZnT1 goed werkt.

6. Gegevens exporteren

  1. Om de gegevens met basislijnaftrek te exporteren, drukt u op de knop Basislijn aftrekken en bekijkt u de wijzigingen in het "ND-acquisitievenster".
  2. Klik op de knop Exporteren in de software-interface in het "ND-acquisitievenster". Er wordt een Excel-gegevensblad geopend. Opslaan op de gewenste locatie.

7. Data-analyse

  1. Creëer voor elke ROI een gemiddelde basislijnfluorescentie van de eerste 90-100 s.
  2. Druk de fluorescentie uit die voor elke ROI is berekend als een percentage van de achtergrond voor die ROI.
  3. Maak een rijgemiddelde van alle ROI's en teken het resultaat als een lijngrafiek. Dit creëert een gemiddelde van alle ROI's als functie van de tijd.
  4. Selecteer met behulp van de lineaire pasvormfunctie de beginsnelheid voor de afname van de fluorescentie na het wassen met Ringer's oplossing. De hellingswaarde van de vergelijking correleert met de transportsnelheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

ZnT1 is een zinktransporter van zoogdieren die zich op het celplasmamembraanbevindt 13. Het is een lid van de kationdiffusiefacilitator (CDF) eiwitfamilie die zink extrudeert van het cytosol naar het extracellulaire millieu14. ZnT1 heeft een architectuur met twee domeinen: het transmembraandomein, dat de ionen over het membraan transporteert, en een C-terminaal domein14. In tegenstelling tot andere bekende CDF-eiwitten heeft ZnT1 een uitgebreid onges...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hierboven beschreven methode maakt het mogelijk om de intracellulaire zinkconcentratie direct te meten met een hoge temporele resolutie. In vergelijking met andere methoden kan deze methode, waarbij veranderingen in intracellulair Zn2+ worden gemonitord, achtergrondruis aanzienlijk verminderen. Bovendien elimineert de selectiviteit van de kleurstof voor zink mogelijke kruisinteracties met andere metaalkationen18,19. Ten slotte maakt het ontbreken va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Raz Zarivach wordt ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef en Arie Moran worden ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 2047/20). We willen Daniel Gitler en zijn groep aan de Ben-Gurion Universiteit bedanken voor hun samenwerking, steun en expertise.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm plategreiner bio-one664160
12-well cell culture plategreiner bio-one665180
13 mm coverslipsSuperior Marienfeld111530
22 mm cover slidesSuperior Marienfeld101050
6-well culture plategreiner bio-one657160
Bovine serum albuminbioWorld22070008
Calcium chloride anhydrous, granularSigma AldrichC1016Concentration in Ringer-oplossing: 1 mM
D-(+)-GlucoseGlentham Life ScienceGC6947Concentration in Ringer-oplossing: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) Sartorius01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscopeNikonTI-DHUit productie. Vervangen door Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)CytivaSH30088.03
Fine tweezersDumont0203-55-PS
Fluozin-3AMInvitrogenF24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solutionCytivaSV30010 
LED illumination systemCoolLEDpE-4000
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrateMerck1.05833Concentration in Ringer-oplossing: 0,8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)FormediumHEPES10Concentration in Ringer-oplossing: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS cameraANDORDC-152Q-FI
NIS-Elements imaging softwareNikonAR
Pluronic acid F-127Millipore540025
Potassium chlorideBio-Lab163823Concentration in Ringer-oplossing: 5,4 mM
PyrithioneSigma AldrichH3261Concentration in Ringer zink-oplossing: 7 μM
Silicone Grease KitWarner InstrumentsW4 64-0378
Sodium chlorideBio-Lab190305Concentration in Ringer-oplossing: 120 mM
Zinc sulfateSigma Aldrich31665Concentration in Ringer zink-oplossing: 7 μM

Referenties

  1. Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
  2. Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
  3. Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
  4. Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336(2016).
  5. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  6. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  7. Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
  8. Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320(2021).
  9. Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
  10. Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
  11. Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
  12. Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
  13. Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
  14. Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
  15. Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
  16. Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
  17. Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
  18. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  19. Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
  20. Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
  21. Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
  22. Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
  23. Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
  24. Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Intracellulair zinkFluoZin-3 kleurstofHEK293T-cellenzinkinstroomfluorescentiemicroscopiemCherry-labelingRingersoplossingzinktransportkinetiek
Karakterisering van zinktransporters bij zoogdieren met behulp van een in-vitro-zinktransporttest
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.