Levensvatbaarheidstest van Trichoderma stromaticum Conidia in menselijk perifeer bloed Mononucleair-afgeleide macrofagen

Samenvatting

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het evalueren van de fagocytose en klaringsmogelijkheden van mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed gestimuleerd met Trichoderma stromaticum conidia.

Samenvatting

Macrofagen vormen een cruciale verdedigingslinie en zijn verantwoordelijk voor het voorkomen van de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Conidiumfagocytose is een sleutelproces dat het mogelijk maakt om de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken die betrokken zijn bij interacties tussen macrofagen en pathogenen, evenals voor het bepalen van het tijdstip van overlijden van geïnternaliseerde conidiën. De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen zijn mechanismen van schimmelvirulentie. Hier rapporteren we de methoden die kunnen worden gebruikt voor de analyse van de fagocytose, klaring en levensvatbaarheid van T. stromaticum conidia, een schimmel die wordt gebruikt als biologisch bestrijdingsmiddel en biomeststof en in staat is om menselijke infecties te veroorzaken. Het protocol bestaat uit 1) Trichoderma-kweek , 2) wassen om conidia te verkrijgen, 3) de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van de polysucrose-oplossingsmethode en de differentiatie van de PBMC's in macrofagen, 4) een in vitro fagocytosemethode met behulp van ronde glazen dekglaasjes en kleuring, en 5) een klaringstest om de levensvatbaarheid van conidia na conidia-fagocytose te beoordelen. Samengevat kunnen deze technieken worden gebruikt om de efficiëntie van het opruimen van schimmels van macrofagen te meten.

Inleiding

Het geslacht Trichoderma (Orde: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) is samengesteld uit alomtegenwoordige, saprofytische schimmels die parasieten zijn van andere schimmelsoorten en in staat zijn om een reeks commercieel nuttige enzymen te produceren¹. Deze schimmelsoorten worden gebruikt voor de productie van heterologe eiwitten², de productie van cellulose³, ethanol, bier, wijn en papier⁴, in de textielindustrie⁵, de voedingsindustrie⁶ en in de landbouw als biologische bestrijders ^7,8

Protocol

Ethische overwegingen en menselijke subjecten
Alle experimenten met mensen die in deze studie worden beschreven, werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en de Braziliaanse federale wetten en goedgekeurd door de ethische commissie van de Staatsuniversiteit van Santa Cruz (projectidentificatiecode: 550.382/ 2014).

Menselijk perifeer bloed werd verzameld van gezonde vrijwilligers uit de stad Ilhéus, Bahia, Brazilië, die niet werden blootgesteld aan beroepsactiviteiten die verband hielden met de bestudeerde schimmel. Personen met gemelde gezondheidsproblemen of die medicijnen gebruikten, werden uitgesloten. Alle....

Resultaten

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. We gebruikten de fagocytose van T. stromaticum conidia om de levensvatbaarheid van de conidia na fagocytose te beoordelen, aangezien het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen mechanismen zijn van schimmelvirulentie. Onderzoekers zouden deze technieken moeten uitvoeren als een van de eerste tests bij het onderzo.......

Discussie

Voor verschillende schimmelpathogenen, waaronder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans en anderen, is conidiale of gistfagocytose een sleutelproces dat het onderzoek mogelijk maakt van de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen in macrofaag-pathogene interacties, evenals voor de bepaling van het tijdstip van overlijden van de geïnternaliseerde conidia 14,39,40. Fagocytose is het .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropyleen, conische bodem met deksel, individueel steriel
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Gemaakt van polystyreen met alfanumerieke identificatie; De Cell Culture Plate is DNase, RNase en pyrogeenvrij en vrij van cytotoxische stoffen; Gesteriliseerd door gammastraling;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	Een CO2-incubator dient om omstandigheden te creëren en te beheersen die vergelijkbaar zijn met een menselijk lichaam, waardoor de in vitro groei en proliferatie van verschillende celtypen mogelijk is.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Gemaakt van polypropyleen, met een dop aan de buis bevestigd voor openen en sluiten met slechts één hand. Het heeft een gepolijst interieur tegen eiwitbinding en voor zichtbaarheid van monsters, vrij van DNase, RNase en pyrogenen
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circulaire dekglasjes worden gebruikt voor microscopietechnieken in celcultuur. Gemaakt van super transparant doorschijnend glas; met een dikte van 0,13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) bieden bescherming voor product, operator en omgeving en zijn geschikt voor werk met sporen van toxische chemicaliën en agentia toegewezen aan biologische veiligheidsniveaus I, II of III. In een Class II Type B2 kast wordt alle instroom en neerstroom lucht na HEPA/ULPA-filtratie afgevoerd naar de externe omgeving zonder hercirculatie over het werkoppervlak.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar wordt gebruikt voor de cultivering en telling van gisten en schimmels
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is het aanbevolen anticoagulans voor hematologieroutines omdat het de beste anticoagulans is voor het behoud van de celmorfologie.
Entellan	Merck	1.07961	Fixeermiddel; Entellan is een waterloos montagemedium voor permanente montage voor microscopie.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Foetaal bovien serum (FBS) is een universeel groeisupplement van cel- en weefselkweekmedia. FBS is een natuurlijke cocktail van de meeste factoren die nodig zijn voor celbinding, groei en proliferatie, effectief voor de meeste soorten menselijke en dierlijke (inclusief insect) cellen.
Flaticon			database van afbeeldingen
Glycerol	Merck	24900988	Het cryoprotectiemiddel glycerol wordt gebruikt voor het invriezen van cellen en sporen
Histopaque-1077			polysucrose oplossing
Image J			Beeldanalyse software
Microscopy slides	Precision	7105	Microscoopglaasje 26 x 76 mm Matte Lapped Dikte 1,0 tot 1,2 mm. Gemaakt van speciaal optisch glas en verpakt met zijden papier scheider met hoge kwaliteit transparantie vrij van onvolkomenheden
Mini centrifuge	Prism	C1801	De Prism Mini Centrifuge is ontworpen om extreem compact te zijn met een uitzonderlijk kleine voetafdruk. Bevat 2 verwisselbare snel losmaakbare rotors die tot 6000 tpm draaien. Een elektronische rem zorgt voor snelle vertraging en de zelfopenende deksel biedt gemakkelijk toegang tot het monster, waardoor de bedieningstijd wordt verkort.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	De Neubauer Counting Chamber wordt gebruikt voor het tellen van cellen of andere gesuspendeerde deeltjes.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is een kit voor snel kleuring in hematologie
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibioticum wordt gebruikt om mogelijke besmetting door manipulatie buiten de laminar flow te voorkomen.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Vaste Petri schotel; Gemaakt van zeer transparant polystyreen (PS); vlakke bodem; Smooth;Grootte: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is een op water gebaseerde zoutoplossing met een eenvoudige formulering. Het is isotoon en niet toxisch voor de meeste cellen. Het bevat natriumchloride en fosfaatbuffer en is geformuleerd om osmotische shock te voorkomen terwijl het waterevenwicht van levende cellen wordt gehandhaafd.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERIELE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPET met 3 mL capaciteit, gemaakt van transparant polyethyleen met lage dichtheid (LDPE) en individueel steriel
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	De Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R gekoelde centrifuge is een gekoelde centrifuge met het gebruiksvriendelijke controlepaneel waarmee het eenvoudig is om de snelheid, RCF-waarde, looptijd, temperatuur en loopprofiel vooraf in te stellen. De Megafuge 16R kan maximale snelheden bereiken van 15.200 tpm en een maximale RCF van 25.830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modificatie, met L-glutamine en 25 mM HEPES, zonder natriumbicarbonaat, poeder, geschikt voor celkweek
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipetten worden gebruikt om nauwkeurig zeer kleine hoeveelheden vloeistoffen over te brengen en te meten.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capaciteit van 10 µL en 1.000 µL Autoclaveerbaar
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	Het stelt u in staat om cellen in buizen en flessen te observeren zonder ze te