Levensvatbaarheidstest van Trichoderma stromaticum Conidia in menselijk perifeer bloed Mononucleair-afgeleide macrofagen

Summary

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het evalueren van de fagocytose en klaringsmogelijkheden van mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed gestimuleerd met Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Macrofagen vormen een cruciale verdedigingslinie en zijn verantwoordelijk voor het voorkomen van de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Conidiumfagocytose is een sleutelproces dat het mogelijk maakt om de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken die betrokken zijn bij interacties tussen macrofagen en pathogenen, evenals voor het bepalen van het tijdstip van overlijden van geïnternaliseerde conidiën. De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen zijn mechanismen van schimmelvirulentie. Hier rapporteren we de methoden die kunnen worden gebruikt voor de analyse van de fagocytose, klaring en levensvatbaarheid van T. stromaticum conidia, een schimmel die wordt gebruikt als biologisch bestrijdingsmiddel en biomeststof en in staat is om menselijke infecties te veroorzaken. Het protocol bestaat uit 1) Trichoderma-kweek , 2) wassen om conidia te verkrijgen, 3) de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van de polysucrose-oplossingsmethode en de differentiatie van de PBMC's in macrofagen, 4) een in vitro fagocytosemethode met behulp van ronde glazen dekglaasjes en kleuring, en 5) een klaringstest om de levensvatbaarheid van conidia na conidia-fagocytose te beoordelen. Samengevat kunnen deze technieken worden gebruikt om de efficiëntie van het opruimen van schimmels van macrofagen te meten.

Introduction

Het geslacht Trichoderma (Orde: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) is samengesteld uit alomtegenwoordige, saprofytische schimmels die parasieten zijn van andere schimmelsoorten en in staat zijn om een reeks commercieel nuttige enzymen te produceren¹. Deze schimmelsoorten worden gebruikt voor de productie van heterologe eiwitten², de productie van cellulose³, ethanol, bier, wijn en papier⁴, in de textielindustrie⁵, de voedingsindustrie⁶ en in de landbouw als biologische bestrijders ^7,8. Naast de industriële belangstelling voor deze schimmelsoorten, heeft het toenemende aantal infecties bij mensen sommige Trichoderma-soorten de status van opportunistische^{pathogenen gegeven}.

Trichoderma spp. groeit snel in cultuur, met aanvankelijk witte en donzige kolonies die groengeel tot donkergroen worden¹⁰. Ze zijn aangepast om te leven in een breed scala aan pH- en temperatuuromstandigheden, en de opportunistische soorten zijn in staat om te overleven bij fysiologische pH en temperaturen en zo verschillende menselijke weefsels te koloniseren 11,12,13. Belangrijk is dat de stijging van het infectiepercentage van Trichoderma spp. kan in verband worden gebracht met virulentiefactoren, en deze zijn niet goed bestudeerd. Bovendien zijn studies die zich richten op het begrijpen van de immuunrespons tegen opportunistische Trichoderma-soorten nog steeds zeldzaam.

Tijdens een infectie vertegenwoordigen macrofagen, samen met neutrofielen, de verdedigingslinie die verantwoordelijk is voor fagocytose en voorkomen ze dus de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Met behulp van patroonherkenningsreceptoren, zoals Toll-achtige receptoren en C-type lectinereceptoren, fagocytose macrofagen schimmels en verwerken ze tot fagolysosomen, waardoor een respiratoire uitbarsting, de afgifte van pro-inflammatoire cytokines en de vernietiging van de gefagocyteerde micro-organismen wordt bevorderd¹⁴. Het mechanisme van fagocytose kan echter worden beïnvloed en ontweken door verschillende microbiële strategieën, zoals de grootte en vorm van de schimmelcellen; de aanwezigheid van capsules die fagocytose belemmeren; vermindering van het aantal fagocytose-inducerende receptoren; de hermodellering van de structuur van actinevezels in het cytoplasma; het belemmeren van de vorming van pseudopodia; en fagosoom of fagolysosoom ontsnappen na het fagocytoseproces¹⁴.

Veel ziekteverwekkers, waaronder Cryptococcus neoformans, gebruiken macrofagen als een niche om in de gastheer te overleven, zich te verspreiden en infectie te induceren¹⁵. De fagocytose- en klaringstest wordt gebruikt om de immuunrespons tegen ziekteverwekkers te evalueren en om de microbiële strategieën te identificeren die worden gebruikt om het aangeboren immuunsysteem te omzeilen 15,16,17. Dit type techniek kan ook worden gebruikt om de differentiële kinetiek van fagocytose, vertraagde fagosoomverzuring en oxidatieve uitbarsting te onderzoeken die resulteren in verminderde schimmeldoding¹⁸.

Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om fagocytose, schimmeloverleving en het ontwijken van het fagosoomrijpingsproces te evalueren. Deze omvatten fluorescentiemicroscopie, die wordt gebruikt om fagocytose, de cellulaire locatie en de moleculen die tijdens fagocytose worden geproduceerd te observeren¹⁹; flowcytometrie, die kwantitatieve gegevens over fagocytose oplevert en wordt gebruikt om de verschillende markers die bij het proces betrokken zijn te evalueren^20,21; intravitale microscopie, die wordt gebruikt om microbiële vangst en fagosoomrijping te beoordelen²²; antilichaam-gemedieerde fagocytose, die wordt gebruikt om de specificiteit van het fagocytoseproces voor een ziekteverwekker te beoordelen²³; en anderen 24,25,26,27.

Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een veelgebruikte, goedkope en directe methode met behulp van een optische microscoop en plaatgroeitest om de fagocytose en het doden van schimmelconidia te beoordelen. Dit protocol geeft de lezers stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van de fagocytose- en klaringstest met behulp van mononucleair afgeleide macrofagen uit menselijk perifeer bloed die zijn blootgesteld aan T. stromaticum. PBMC's werden gebruikt omdat Trichoderma conidia wereldwijd worden toegepast als biologische bestrijding tegen fytopathogenen en als biomeststof voor plantaardige gewassen en verschillende menselijke infecties hebben veroorzaakt, Trichodermose genaamd. Daarnaast zijn er slechts twee eerdere werken die zich richten op de interactie tussen Trichoderma conidia en het menselijke immuunsysteem, waarin we neutrofielen²⁸ en autofagie in macrofagen²⁹ hebben onderzocht. Dit artikel laat eerst zien hoe de fagocytose van de conidia van T. stromaticum door PBMC-afgeleide macrofagen kan worden bestudeerd, en vervolgens hoe de levensvatbaarheid van de verzwolgen conidia kan worden beoordeeld met behulp van eenvoudige microscopie-gebaseerde technieken. Dit protocol kan verder onderzoek vergemakkelijken naar macrofaag-geassocieerde immuunrespons of immuunsysteemmodulatie-gerelateerde mechanismen.

Protocol

Ethische overwegingen en menselijke subjecten
Alle experimenten met mensen die in deze studie worden beschreven, werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en de Braziliaanse federale wetten en goedgekeurd door de ethische commissie van de Staatsuniversiteit van Santa Cruz (projectidentificatiecode: 550.382/ 2014).

Menselijk perifeer bloed werd verzameld van gezonde vrijwilligers uit de stad Ilhéus, Bahia, Brazilië, die niet werden blootgesteld aan beroepsactiviteiten die verband hielden met de bestudeerde schimmel. Personen met gemelde gezondheidsproblemen of die medicijnen gebruikten, werden uitgesloten. Alle proefpersonen stemden er vrijwillig mee in om deel te nemen en ondertekenden een formulier voor geïnformeerde toestemming voordat ze in dit onderzoek werden opgenomen.

1. Bereiding van de reagentia en oplossingen

NOTITIE: Bereid de volgende reagentia en oplossingen voor voordat u verder gaat. Zie de Materiaaltabel (TOM) voor informatie over het reagens en de leverancier van het materiaal.

1. Bereid 1x een uitgebalanceerde steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   OPMERKING: In dit protocol werd geen endotoxinevrije PBS gebruikt.
2. Bereid aardappeldextrose-agar (PDA) medium en giet 20 ml in elke petrischaal voor de T. stromaticum-cultuur . Bereid zes platen met PDA voor elke donor en gebruik één plaat voor elke aandoening: 3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur. Gebruik bovendien drie platen voor elke regeling: drie voor de Trichoderma-regeling en drie voor de R10-mediumregeling. Gebruik petrischaaltjes van 60 mm x 15 mm of 100 mm x 15 mm voor een optimaal herstel van de conidia.
3. Steriliseer 100% glycerol.
4. Bereid een R10-medium voor de celkweek: RPMI-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% antibioticum (penicilline/streptomycine).
5. Steriliseer gedestilleerd water voor de cellyse.
6. Bereid water met een pH van 7.0 voor op het kleurproces.
   OPMERKING: Pas indien nodig de pH aan met behulp van een pH-meter en oplossingen van 0.1 M/L NaOH en 0.1 M/L HCl.
7. Steriliseer rond glazen dekglaasje (13 mm) en pincet.

2. Trichoderma stromaticum kweek en verwerking

1. Bereiding van een moederstam (M1) van T. stromaticum:
   OPMERKING: Een moederstam (M1) is vereist om ervoor te zorgen dat alle experimenten worden uitgevoerd in de cultuur van dezelfde verse generatie (F1).
   1. Kweek een T. stromaticum-inoculum in petrischaaltjes met PDA bij 28 °C in het donker gedurende 7-10 dagen totdat de conidia worden waargenomen en de cultuur groen wordt.
   2. Was de cultuur van T. stromaticum. Voeg met een pipet 3-5 ml PBS toe aan het kweekoppervlak. Verzamel de PBS van de plaat en verdeel het opnieuw over de kweek om de conidia geleidelijk te verwijderen met behulp van de pipet. Herhaal dit proces zo vaak als nodig is totdat de suspensie donkergroen wordt.
      OPMERKING: Als alternatief wordt voorgesteld om de cultuur voorzichtig te wassen door 3-5 ml PBS aan de plaat toe te voegen, gevolgd door een cirkelvormige beweging uit te voeren totdat de suspensie groen wordt om de conidia te herstellen. Bij herhaald pipetteren kunnen meer conidia worden verzameld.
   3. Breng de teruggewonnen suspensie van de plaat over in een steriele buis van 15 ml met een pipet. Herhaal stap 2.1.2-2.1.3 zo vaak als nodig is om meer conidia te verkrijgen.
   4. Centrifugeer de suspensie bij 1.160 x g gedurende 5 minuten bij 12 °C en resuspendeer de pellet in 5 ml PBS. Herhaal deze stap (2.1.4) driemaal om een hyfen vrije suspensie te verkrijgen.
      NOTITIE: Om de pellet goed te resuspenderen, wordt na het centrifugeren een korte vortex aanbevolen.
   5. Resuspendeer de laatste pellet in 2-3 ml PBS en tel de conidia in een Neubauer-kamer met een verdunning van 1:100 of 1:1.000.
      OPMERKING: In optimale omstandigheden kan een eindconcentratie van 2 x 10⁸ conidiën/ml uit de kweek worden teruggewonnen. Het beoordelen van de levensvatbaarheid van conidia met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode is optioneel.
   6. Aliquot de suspensie in steriele buisjes van 1,5 ml door 0,5 ml van de conidia-suspensie (uit stap 2.1.5) aan elk buisje toe te voegen. Voeg vervolgens 0,5 ml steriele 100% glycerol toe om M1-voorraden te verkrijgen. Vortex kort, identificeer de buizen en bewaar ze bij -20 °C of -80 °C.
2. Kweek van T. stromaticum en het verkrijgen van conidia voor het experiment
   1. Plaat 10 μL van de M1-suspensie (bereid in stap 2.1) in PDA bij 28 °C in het donker gedurende 7-10 dagen totdat de conidia zijn waargenomen en de cultuur groen wordt om de nieuwe F1-generatie te verkrijgen.
      OPMERKING: Om een verse T. stromaticum-cultuur voor het experiment te garanderen, beoordeelt u de tijd die nodig is voor schimmelgroei en de tijd die nodig is voor macrofaagdifferentiatie.
   2. Verzamel de conidia en herhaal stap 2.1.2-2.1.4.
   3. Resuspendeer de laatste pellet in 2-3 ml PBS. Beoordeel de levensvatbaarheid van de conidia met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode, of tel de conidia zoals vermeld in stap 2.1.5.

3. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC)

OPMERKING: De PBMC's worden verkregen door de dichtheidsbarrièremethode met behulp van een polysucroseoplossing met een dichtheid van 1.077 g/ml³⁰.

1. Aliquot 15 ml van de polysucrose-oplossing op één buisje van 50 ml voor elk donormonster dat wordt afgenomen.
2. Verzamel 20 ml bloed van elke donor met behulp van drie tot vier EDTA-buisjes. Rekruteer minimaal vier donoren per experiment. Verzamel het bloed van de donoren niet; Gebruik in plaats daarvan elk monster afzonderlijk als een biologische replicatie. Breng voor elke donor het bloed over naar een buis van 50 ml en voeg PBS toe om een uiteindelijk volume van 35 ml te verkrijgen.
3. Breng de bloedsuspensie (stap 3.2) langzaam over langs de wand van de buis met de polysucroseoplossing (stap 3.1) om een bifasische suspensie te vormen.
   OPMERKING: Om vermenging van het bloed met de polysucrose-oplossing te voorkomen, voegt u het bloed langzaam toe. Het gebruik van minimaal 7 ml bloed van elke donor voor de PBMC-isolatie wordt aanbevolen.
4. Centrifugeer de buis met de bifasische suspensie onmiddellijk bij 1.600 x g gedurende 30 minuten bij 24 °C. Programmeer de centrifugatie van de PBMC's: gebruik versnelling 1 en vertraging 0 om een abrupte stop van de centrifugatie te voorkomen.
5. Observeer de vorming van een witte ring die de PBMC's bevat na centrifugeren. De rode bloedcellen en granulocyten bevinden zich in de onderste laag, de volgende laag bevat de polysucrose-oplossing en de PBMC's bevinden zich in de witte ring tussen de polysucrose-oplossing en het plasma (bovenste laag). Vang de witte ring op door voorzichtig op te zuigen met een pipet of een steriele pasteurpipet om geen rode bloedcellen, plasma of polysucrose-oplossing te vangen en over te brengen naar een buisje van 15 ml.
6. Voeg PBS toe aan de tube van 15 ml met de PBMC's om een eindvolume van 10 ml te verkrijgen. Homogeniseer de suspensie en centrifugeer de buis bij 1.600 x g gedurende 30 minuten bij 24 °C.
7. Was de cellen driemaal op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij 24 °C met 10 ml PBS. Resuspendeer vervolgens de laatste pellet in 2 ml R10 medium.
8. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode en tel de cellen in een Neubauer-kamer.

4. Kinetiek van fagocytose

OPMERKING: De mononucleair afgeleide macrofagen van menselijk perifeer bloed worden behandeld met T. stromaticum conidia bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 1:10 of alleen R10-medium als controle. De multipliciteit van infectie (MOI) vertegenwoordigt de verhouding van de infectieuze agentia die aan de infectiedoelen zijn toegevoegd en wordt gepresenteerd als absolute getallen: MOI = agenten:doelen³¹. Hier gebruiken we 1 T. stromaticum conidia (agent) voor 10 macrofagen (targets). Vervolgens worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende verschillende perioden (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur). Vervolgens wordt een rond glazen dekglaasje gebruikt om de aanhangende macrofagen die betrokken zijn bij het fagocytoseproces onder een microscoop te visualiseren. Er wordt een experimentele ontwerpfiguur gegeven (Figuur 1).

OPMERKING: Het gebruik van platen met 24 putjes wordt aanbevolen.

1. Behandeling van van mensen afkomstige macrofagen met T. stromaticum conidia
   1. Voeg met een steriel pincet een steriel rond glazen dekglaasje (13 mm) toe aan elk putje.
   2. Pas het volume van de in de stappen 3.7-3.8 verkregen celsuspensie aan om 8 x 10⁵ cellen per putje te plaatsen tot een eindvolume van 1 ml met R10-medium. Gebruik een omgekeerde microscoop om de celmorfologie te beoordelen.
      OPMERKING: De cellen moeten in het medium worden gesuspendeerd en een afgeronde morfologie hebben.
   3. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 7 dagen in een atmosfeer van 5% CO₂ en vervang het medium om de 2 dagen door vers R10-medium voor de differentiatie van de monocyten in macrofagen³². Observeer de celmorfologie met behulp van een omgekeerde microscoop. De macrofagen zullen een spindelmorfologie vertonen, met afgeplatte en verlengde vormen; Een verhoogde cytoplasmatische ratio en de aanwezigheid van pseudopodia kunnen ook worden waargenomen. Zoek naar aanhangende mononucleair afgeleide macrofagen.
      OPMERKING: Een zeer klein deel van ongedifferentieerde monocyten kan in het medium blijven zweven.
   4. Verwijder het medium van elk putje met een pipet en was de cellen met 1 ml PBS om vuil en niet-klevende cellen te verwijderen.
   5. Gebruik de in stap 2.2 bereide suspensie voor de bereiding van een nieuwe suspensie van T. stromaticum conidia in een eindconcentratie van 8 x 10⁴ conidiën/ml in R10-medium.
   6. Voeg 1 ml van de in stap 4.1.5 bereide conidia suspensie toe aan elk behandelingsputje (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur) om een MOI van 1:10 te verkrijgen. Voeg aan de bedieningselementen slechts 1 ml R10-medium toe aan het putje.
   7. Daag de macrofagen gedurende 3 uur uit met T. stromaticum conidia bij 37 °C onder een atmosfeer van 5% CO₂ . Verwijder na 3 uur het medium en was de cellen om de niet-gefagocytoseerde conidia te verwijderen.
   8. Voeg 1 ml R10 medium toe aan elk putje en incubeer de plaat op verschillende tijdstippen (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur) bij 37 °C onder een atmosfeer van 5% CO₂ .
2. Kleuring en analyse
   1. Verwijder het medium uit elk putje nadat de overeenkomstige incubatie (stap 4.1.8) is voltooid en voeg 1 ml PBS toe aan dat putje.
   2. Verwijder de ronde glazen dekglaasjes uit de putjes met een steriel pincet en een naald om te kleuren met een kleurset.
      OPMERKING: Als alternatief kan de kleuring worden gedaan met May Grünwald-Giemsa-beits³³.
   3. Voeg aan elk van de ronde glazen dekglaasjes vlekfixator (5 s), kleurstof 1 (5 s), kleurstof 2 (2 s) en gebufferd water pH 7.0 (5 s) toe, de componenten van de kleuringsset. Wacht tot ze droog zijn en bevestig de dekglaasjes met behulp van montagemiddel op een glasplaatje.
   4. Kwantificeer het resultaat: Tel in totaal 100 macrofagen (Mø) voor elke tijdsvoorwaarde. Tel met behulp van een optische microscoop het aantal macrofagen met gefagocyteerde conidia met behulp van een 100x objectief en immersieolie (vergelijking [1]).
      (1)
   5. Verkrijg het aantal conidia dat per macrofaag is gefagocyteerd: Correleer de conidia die aanwezig zijn in 100 macrofagen gedeeld door het aantal macrofagen met ten minste één gefagocyteerd conidium (vergelijking [2])³⁴.
      (2)
      OPMERKING: Om de conidia te evalueren en te tellen, kan de ImageJ-software worden gebruikt³⁵.
   6. Fotografeer de fagocytose van elk monster en elke tijdsvoorwaarde met behulp van 40x en 100x objectieven om de resultaten te presenteren.

Figuur 1: Schematische weergave van de fagocytose- en conidiumlevensvatbaarheidstest met behulp van mononucleair afgeleide macrofagen uit humaan perifeer bloed. (1-10) Fagocytose-test: De T. stromaticum moet worden gekweekt in PDA en de conidia worden hersteld door de plaat te wassen met PBS. De PBMC's moeten worden geïsoleerd door de dichtheidsbarrièremethode met behulp van het beschreven protocol, gedurende 7 dagen worden gekweekt in platen met 24 putjes met steriele ronde glazen dekglaasjes voor differentiatie in macrofagen, en vervolgens worden behandeld met een MOI van 1:10 met verschillende tijdsintervallen. De ronde glazen dekglaasjes worden verwijderd en gekleurd met de kleurkit en de resultaten worden geanalyseerd met behulp van lichtmicroscopie. (1-8,11-13) Conidia levensvatbaarheidstest: Na isolatie worden de PBMC's gedurende 7 dagen gekweekt in platen met 24 putjes zonder ronde glazen dekglaasjes voor differentiatie in macrofagen en vervolgens behandeld met een MOI van 1:10 gedurende verschillende tijdsintervallen. De cellen moeten worden gelyseerd door incubatie met gedestilleerd water; de suspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd en vervolgens wordt de geresuspendeerde pellet geplateerd in PDA om de groeikinetiek van Trichoderma te analyseren. Deze figuur is ontworpen met behulp van een database met afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Conidiumlevensvatbaarheidstest na fagocytose

OPMERKING: Er wordt een experimentele ontwerpfiguur meegeleverd (Figuur 1).

NOTITIE: Gebruik platen met 24 putjes.

1. Daag de van mensen afkomstige macrofagen uit met T. stromaticum conidia.
   1. Herhaal stap 4.1.2-4.1.8 om de monocyten te differentiëren en behandel de macrofagen met T. stromaticum conidia.
      NOTITIE: Gebruik geen ronde glazen dekglaasjes in de putjes. Gebruik dezelfde tijdsintervallen die worden gebruikt voor het bepalen van de fagocytosekinetiek, zodat de fagocytose kan worden gecorreleerd met de conidiale levensvatbaarheid.
   2. Evalueer het effect van het R10-medium op de groei van T. stromaticum door putjes met de in stap 4.1.5 bereide suspensie (R10-medium + conidiën) als controle te gebruiken.
2. Conidium-levensvatbaarheidstest
   1. Verwijder het medium na elke incubatieperiode (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur) en was de cellen tweemaal met PBS om de conidia te verwijderen die niet zijn gefagocyteerd.
      OPMERKING: De controle die R10 medium + conidia bevat, mag niet worden gewassen.
   2. Voeg 0,5 ml steriel gedestilleerd water toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO₂ . Observeer na deze tijd de celmorfologie onder een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen zijn gelyseerd.
   3. Vang de suspensie op en breng deze over in buisjes van 1,5 ml. Centrifugeer de suspensie met behulp van een minicentrifuge op 6.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Gooi het supernatans voorzichtig weg, resuspendeer de pellet in 10 μL steriel gedestilleerd water en inoculeer 10 μL van de suspensie in de PDA-houdende plaat bij 28 °C in het donker.
   5. Bereid een positieve controle voor de groei van T. stromaticum voor: Gebruik de suspensie van T. stromaticum conidia (stap 2.2) om een nieuwe suspensie te bereiden met een eindconcentratie van 8 x 10⁶ conidiën/ml. Plaat 10 μL van deze suspensie in PDA bij 28 °C in het donker.
      OPMERKING: 10 μL van deze suspensie bevat hetzelfde aantal conidia (8 x 10⁴) dat werd gebruikt om de mononucleair afgeleide macrofagen in het bloed te infecteren. Het verschil tussen deze positieve controle en de in stap 5.1.2 genoemde controle is dat de hierboven in stap 5.1.2 genoemde controle wordt gebruikt om de mogelijke invloed van het R10-medium op de groei van Trichoderma tijdens de fagocytose te evalueren. Deze positieve controle in stap 5.2.5 met behulp van de suspensie van T. stromaticum conidia verzameld in PBS vertegenwoordigt een controle voor de groei van Trichoderma zonder de invloed van R10-medium om weer te geven hoe de schimmel van nature groeit. Met behulp van deze controle is het mogelijk om te evalueren of het R10-medium de groei van Trichoderma beïnvloedt.
   6. Observeer elke dag de groeikinetiek van T. stromaticum in PDA en fotografeer de kweek.
   7. Analyse: Twee punten kunnen worden gebruikt om de resultaten te evalueren: 1) de tijd (in dagen) die nodig is voor de kweek om de hele kweekplaat in beslag te nemen, en 2) de tijd (in dagen) tot het verschijnen van de karakteristieke groene pigmentatie van de T. stromaticum conidia in cultuur.

6. Statistische analyse

1. Gebruik een Kruskal-Wallis-test om statistisch significante verschillen tussen de 8 groepen/behandelingen vast te stellen. Beschouw p < 0,05 als statistisch significant. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). In de figuren geeft # statistische significantie aan bij p < 0,05.

Results

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. We gebruikten de fagocytose van T. stromaticum conidia om de levensvatbaarheid van de conidia na fagocytose te beoordelen, aangezien het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen mechanismen zijn van schimmelvirulentie. Onderzoekers zouden deze technieken moeten uitvoeren als een van de eerste tests bij het onderzo...

Discussion

Voor verschillende schimmelpathogenen, waaronder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans en anderen, is conidiale of gistfagocytose een sleutelproces dat het onderzoek mogelijk maakt van de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen in macrofaag-pathogene interacties, evenals voor de bepaling van het tijdstip van overlijden van de geïnternaliseerde conidia 14,39,40. Fagocytose is het ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropyleen, conische bodem met deksel, individueel steriel
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Gemaakt van polystyreen met alfanumerieke identificatie; De Cell Culture Plate is DNase, RNase en pyrogeenvrij en vrij van cytotoxische stoffen; Gesteriliseerd door gammastraling;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	Een CO2-incubator dient om omstandigheden te creëren en te beheersen die vergelijkbaar zijn met een menselijk lichaam, waardoor de in vitro groei en proliferatie van verschillende celtypen mogelijk is.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Gemaakt van polypropyleen, met een dop aan de buis bevestigd voor openen en sluiten met slechts één hand. Het heeft een gepolijst interieur tegen eiwitbinding en voor zichtbaarheid van monsters, vrij van DNase, RNase en pyrogenen
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circulaire dekglasjes worden gebruikt voor microscopietechnieken in celcultuur. Gemaakt van super transparant doorschijnend glas; met een dikte van 0,13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) bieden bescherming voor product, operator en omgeving en zijn geschikt voor werk met sporen van toxische chemicaliën en agentia toegewezen aan biologische veiligheidsniveaus I, II of III. In een Class II Type B2 kast wordt alle instroom en neerstroom lucht na HEPA/ULPA-filtratie afgevoerd naar de externe omgeving zonder hercirculatie over het werkoppervlak.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar wordt gebruikt voor de cultivering en telling van gisten en schimmels
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is het aanbevolen anticoagulans voor hematologieroutines omdat het de beste anticoagulans is voor het behoud van de celmorfologie.
Entellan	Merck	1.07961	Fixeermiddel; Entellan is een waterloos montagemedium voor permanente montage voor microscopie.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Foetaal bovien serum (FBS) is een universeel groeisupplement van cel- en weefselkweekmedia. FBS is een natuurlijke cocktail van de meeste factoren die nodig zijn voor celbinding, groei en proliferatie, effectief voor de meeste soorten menselijke en dierlijke (inclusief insect) cellen.
Flaticon			database van afbeeldingen
Glycerol	Merck	24900988	Het cryoprotectiemiddel glycerol wordt gebruikt voor het invriezen van cellen en sporen
Histopaque-1077			polysucrose oplossing
Image J			Beeldanalyse software
Microscopy slides	Precision	7105	Microscoopglaasje 26 x 76 mm Matte Lapped Dikte 1,0 tot 1,2 mm. Gemaakt van speciaal optisch glas en verpakt met zijden papier scheider met hoge kwaliteit transparantie vrij van onvolkomenheden
Mini centrifuge	Prism	C1801	De Prism Mini Centrifuge is ontworpen om extreem compact te zijn met een uitzonderlijk kleine voetafdruk. Bevat 2 verwisselbare snel losmaakbare rotors die tot 6000 tpm draaien. Een elektronische rem zorgt voor snelle vertraging en de zelfopenende deksel biedt gemakkelijk toegang tot het monster, waardoor de bedieningstijd wordt verkort.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	De Neubauer Counting Chamber wordt gebruikt voor het tellen van cellen of andere gesuspendeerde deeltjes.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is een kit voor snel kleuring in hematologie
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibioticum wordt gebruikt om mogelijke besmetting door manipulatie buiten de laminar flow te voorkomen.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Vaste Petri schotel; Gemaakt van zeer transparant polystyreen (PS); vlakke bodem; Smooth;Grootte: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is een op water gebaseerde zoutoplossing met een eenvoudige formulering. Het is isotoon en niet toxisch voor de meeste cellen. Het bevat natriumchloride en fosfaatbuffer en is geformuleerd om osmotische shock te voorkomen terwijl het waterevenwicht van levende cellen wordt gehandhaafd.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERIELE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPET met 3 mL capaciteit, gemaakt van transparant polyethyleen met lage dichtheid (LDPE) en individueel steriel
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	De Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R gekoelde centrifuge is een gekoelde centrifuge met het gebruiksvriendelijke controlepaneel waarmee het eenvoudig is om de snelheid, RCF-waarde, looptijd, temperatuur en loopprofiel vooraf in te stellen. De Megafuge 16R kan maximale snelheden bereiken van 15.200 tpm en een maximale RCF van 25.830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modificatie, met L-glutamine en 25 mM HEPES, zonder natriumbicarbonaat, poeder, geschikt voor celkweek
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipetten worden gebruikt om nauwkeurig zeer kleine hoeveelheden vloeistoffen over te brengen en te meten.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capaciteit van 10 µL en 1.000 µL Autoclaveerbaar
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	Het stelt u in staat om cellen in buizen en flessen te observeren zonder ze te