Methodenartikel

Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

DOI:

10.3791/65237

⸱

30 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Department of Ophthalmology, University of Virginia, 4Program in Fundamental Neuroscience, University of Virginia, 5Department of Psychology, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol schetst de stappen voor het in vivo uitlijnen van optische coherentietomografie-vezelgrafiebeelden (vis-OCTF) in vivo met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen met het oog op het verifiëren van de waargenomen morfologie van de axonbundel van retinale ganglioncellen in de in vivo beelden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is in vivo retinale beeldvorming, die niet-invasieve, real-time en longitudinale informatie over biologische systemen en processen biedt, steeds vaker toegepast om een objectieve beoordeling van neurale schade bij oogziekten te verkrijgen. Ex vivo confocale beeldvorming van hetzelfde netvlies is vaak nodig om de in vivo bevindingen te valideren, vooral in dieronderzoek. In deze studie demonstreerden we een methode om een ex vivo confocaal beeld van het netvlies van de muis uit te lijnen met de in vivo beelden. Een nieuwe klinische beeldvormingstechnologie, optische coherentietomografievezelgrafie met zichtbaar licht (vis-OCTF) genaamd, werd toegepast om in vivo beelden van het netvlies van de muis te verkrijgen. Vervolgens voerden we de confocale beeldvorming uit van hetzelfde netvlies als de "gouden standaard" om de in vivo vis-OCTF-beelden te valideren. Deze studie maakt niet alleen verder onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen mogelijk, maar legt ook de basis voor een gevoelige en objectieve evaluatie van neurale schade in vivo.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale ganglioncellen (RGC's) spelen een cruciale rol bij de visuele informatieverwerking, ontvangen synaptische input via hun dendritische bomen in de binnenste plexiforme laag (IPL) en verzenden de informatie via hun axonen in de retinale zenuwvezellaag (RNFL) naar de hersenen 1,2,3,4. Bij zieke aandoeningen zoals glaucoom kan vroege RGC-degeneratie leiden tot subtiele veranderingen in de RNFL, de ganglioncellaag (GCL), de IPL en de oogzenuw bij zowel patiënten als knaagdiermodellen 5,6,7,8,9. Vroege detectie van deze morfologische veranderingen in RGC's is dus essentieel voor tijdige interventie om RGC en verlies van gezichtsvermogen te voorkomen.

We hebben onlangs een nieuwe klinische beeldvormingstechnologie ontwikkeld, genaamd optische coherentietomografie met zichtbaar licht (vis-OCT) om te voldoen aan de behoefte aan in vivo monitoring van RGC-schade. Vis-OCT verbeterde de axiale resolutie en bereikte 1,3 μm in het netvlies10,11, waardoor de visualisatie van individuele RGC-axonenbundels in de RNFL mogelijk werd. Vervolgens werd vis-OCT-vezelgrafie (vis-OCTF) vastgesteld om RGC-schade op het niveau van de enkele axonbundel bij muizen te volgen en te kwantificeren11,12,13. Ex vivo confocale beeldvorming van hetzelfde netvlies als de gouden standaard is echter vaak nodig om de in vivo bevindingen te valideren. Daarom zal deze studie aantonen hoe in vivo beelden verkregen door vis-OCTF kunnen worden uitgelijnd met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen. Het protocol heeft tot doel de in vivo bevindingen te valideren door middel van ex vivo confocale beeldvorming en een basis te leggen voor het onderzoeken van de moleculaire en cellulaire veranderingen die ten grondslag liggen aan RGC-schade bij zieke aandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia en voldoen aan de richtlijn voor het gebruik van dieren van het National Institute of Health (NIH). Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. In vivo vs-OCT-beeldvorming

  1. Het vis-OCT-systeem
    1. Stel de ogen van de muizen voor met behulp van een vis-OCT-systeem voor kleine dieren dat een supercontinuümlichtbron gebruikt, die zichtbaar licht levert tussen 480 nm en 650 nm. Zorg ervoor dat het invallende vermogen op het hoornvlies 1 mW is en gebruik een A-lijnsnelheid van 25 kHz en een integratietijd van 39.3 μs per A-lijn.
    2. Zorg ervoor dat het spectrale detectiebereik van de spectrometer tussen 508 nm en 613 nm ligt, wat een axiale resolutie van 1.3 μm in het netvlies oplevert. Het totale beeldvormingsvolume is ongeveer 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). De laterale resolutie ligt tussen 4,5 μm in het midden van het gezichtsveld en 8,7 μm op 350 μm van het midden11,13.
  2. Anesthesie van muizen
    1. Verdoof muizen met een C57BL/6-achtergrond en beide geslachten met een intraperitoneale injectie van ketamine (114 mg/kg) en xylazine (17 mg/kg) cocktail en verwijd hun pupillen met 1% tropicamidedruppels. Bevestig adequate verdoving door verlies van pedaalreflex na een stevige teenkneep.
    2. Houd de muis tijdens de beeldvorming warm met behulp van een infrarood warmtelamp. Breng na elke beeldacquisitie kunsttranen aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  3. Positionering van de muis voor beeldvorming
    1. Plaats de verdoofde muis op de dierenhouder en houd de muis op zijn plaats met behulp van twee klittenbandsluitingen.
      NOTITIE: De dierhouder maakt beweging in drie dimensies mogelijk (verticale aanpassing, fijne horizontale aanpassing, evenals pitch- en yaw-aanpassingen) om de laser in het oog van de muis te plaatsen.
  4. Beeldvormingsparameters aanpassen
    1. Schakel de computer in en open de software waarnaar wordt verwezen, waardoor de laser automatisch wordt ingeschakeld.
    2. Stel de dierhouder af totdat de laser stabiel en gecentreerd is in het oog van de muis. Visualiseer het achterste deel van het oog door middel van een En Face-voorbeeld in de software-interface, het gezichtsveld (FOV) van de oppervlakkige vasculaire plexus en een B-scan, de dwarsdoorsnede van het netvlies binnen het FOV.
    3. Verkrijg een vis-OCT-volume door op de knop Verwerven op de software-interface te klikken na het uitvoeren van kleine aanpassingen van de optische focus, die bestaat uit 512 A-lijnen/B-scan en 512 B-scans/volume.
      OPMERKING: Dit proces duurt ~10.5 s. Beeldacquisitie wordt geleid door een ingebouwde QI-schatter (Quality Index) om ervoor te zorgen dat afbeeldingen onder een vooraf bepaalde drempel (QI < 45) niet worden opgenomen.
      1. Verkrijg voor elke muis vier vis-OCT-volumes van hetzelfde oog. Lijn de oogzenuwkop (ONH) uit in elk van de vier hoeken in het gezichtsveld om verschillende delen van het netvlies te bedekken.
        OPMERKING: Een dergelijke plaatsing minimaliseert de kromming van het netvlies, waardoor de RNFL-reflectie over het hele gezichtsveld wordt gemaximaliseerd. Het duurt ~1 min om het oog tussen elke acquisitie te herpositioneren (Figuur 1A,B).
  5. Vis-OCTF-analyse
    OPMERKING: MATLAB wordt gebruikt om beeldanalyse uit te voeren.
    1. Om vis-OCT-vezelgrammen te genereren uit het vis-OCT-volume, gebruikt u een op intensiteit gebaseerde drempelmethode (MATLAB-coderegel 808) om het oppervlak van het netvlies te detecteren.
      NOTITIE: Deze lijnen gebruiken de functie Niet aanpassen om de intensiteitswaarden van de bScan aan te passen. Het argument [0,0087 0,08] dat is doorgegeven om niet aan te passen , specificeert het bereik van intensiteiten dat moet worden toegewezen aan het volledige dynamische bereik van het uitvoerbeeld.
    2. Snijd de RNFL bij door de eerste ~16 μm in diepte te selecteren. Zie Matlab coderegel 782.
      OPMERKING: De typische in vivo RNFL-dikte in een volwassen wildtype C57BL/6-muis is ~14 μm en kan variëren tussen verschillende segmentatiemethoden13.
    3. Wijzig de paden van het RAW-bestand (regel 9), Bestanden voor reconstructie (regel 11) en bestandsnaam (regel 15), klik op Uitvoeren en wacht tot de OCT-afbeelding is geanalyseerd door de MATLAB-code. Bereken de projectie van de gemiddelde intensiteit langs de axiale (z) richting (MATLAB-coderegels 905-908) om het fibergrambeeld te genereren dat is samengesteld uit RGC-axonbundels en het omringende vaatstelsel. Monteer de vier afbeeldingen na vezelgramverwerking voor elk gezichtsveld door de bloedvaten uit te lijnen met een grafische editor naar keuze, die in totaal ~ 1,2 x 1,2 mm beslaat. De RAW-bestanden worden meestal opgeslagen in de map: Halo Data, onder de datum van OCT-beeldvorming (bijv. 0606 Opticent).
      OPMERKING: De MATLAB-codes zijn beschikbaar in aanvullend bestand 1.

2. Ex vivo confocale beeldvorming

  1. Euthanasie bij muizen
    1. Na het verkrijgen van vis-OCT-gegevens, euthanaseert u de muizen met een mengsel van pentobarbital-natrium (390 mg/ml) en fenytoïnenatrium (50 mg/ml). Fenytoïnenatrium werkt door de effecten van pentobarbital-natrium te versterken, dat op grote schaal is toegepast bij euthanasie bij knaagdieren14,15. Gebruik voor elke muis 0,2 ml/20 g van het verdunde mengsel (156 mg/ml) en doordrenk met 20 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens 20 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS16,17.
  2. Oogdissectie en oriëntatie
    1. Ontnucleer de ogen en maak een markering aan de tijdelijke zijde om de oriëntatie aan te geven.
    2. Na het voorzichtig verwijderen van de voorste oogkamer, de ooglens, glasvocht, en fixeer de oogschelpen in PFA gedurende 30 minuten.
    3. Was de oogschelpen 30 minuten met PBS en vervang de PBS-oplossing 3x tijdens het wassen. Was vervolgens met 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,5) gedurende 30 min.
    4. Incubeer de oogschelpen in een blokkeerbuffer (5% ezelinnenserum met 2,5% runderserumalbumine en 0,5% Triton X-100 in Tris-gebufferde zoutoplossing [pH 7,5]) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  3. Immunokleuring
    OPMERKING: De oogschelpen zijn nu klaar om te worden gekleurd met de primaire antilichamen van muizen anti-Tuj1 om RGC-axonbundels te detecteren en rattenanti-ICAM-2 om bloedvaten te detecteren.
    1. Incubeer de oogschelpen 's nachts met de primaire antilichamen, muizen anti-Tuj1 (1:200 in blokkeerbuffer) en ratten anti-ICAM-2 (1:500 in blokkeerbuffer), bij 4 °C.
    2. Was de oogschelpen 3-5x gedurende 1 uur per keer, met een fosfaatgebufferde zoutoplossing die 0,5% Triton X-100 (PBST) bevat om de achtergrond te minimaliseren en eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen.
    3. Na het wassen de oogschelpen een nacht incuberen met de secundaire antilichamen, ezel anti-muis Immunoglobuline G geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 kleurstof (groene fluorescentie) en ezel anti-rat IgG geconjugeerd aan Alexa Fluor 594 kleurstof (rode fluorescentie), allemaal 1:1000 verdund in blokkeerbuffer, bij 4 °C.
    4. Was de oogschelpen de volgende dag 3-5x gedurende 1 uur elk met PBST om de achtergrond te minimaliseren en ongebonden antilichamen te verwijderen.
    5. Breng de oogschelpen over naar een petrischaal van PBS voor de platte montage.
  4. Plat gemonteerd netvlies
    1. Isoleer na het immunokleuringsproces het netvlies van de oogschelpen onder de microscoop.
    2. Snijd de netvliezen in vier bladeren en monteer ze plat met de RGC-laag naar boven gericht. Laat de markering aan de tijdelijke zijde aan het netvlies achter om de oriëntatie aan te geven.
    3. Dekglaasje het netvlies met bevestigingsmedium13,18. Plak de glaasjes dicht met nagellak13,18,19.
  5. Confocale beeldvorming
    OPMERKING: De beeldverwerking van confocale beelden werd uitgevoerd met behulp van ZEN-microscopiesoftware.
    1. Schakel de confocale microscoop in en zoek in de modus Lokaliseren het interessegebied met behulp van het oculair van de microscoop.
    2. Stel in de acquisitiemodus tegels in om het hele netvlies te bedekken en z-stack-plakjes om alle informatielagen te bedekken. Beeld: ten minste 25 tegels over het hele netvlies om het totale volume van 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) te bedekken bij een pixelgrootte van 1,24 μm/pixel.
    3. Projecteer de Z-stack slices om tweedimensionale confocale microscopiebeelden te maken (Figuur 1C,D)11,13,19,20,21.

3. Uitlijning van in-vivo- en ex-vivobeelden

  1. Maak na het verwerken van het fibergram een samengestelde afbeelding met de vier afbeeldingen die van elke muis zijn verkregen door alle bloedvaten uit te lijnen met een grafische editor naar keuze.
    OPMERKING: Gemiddeld is de uiteindelijke samengestelde afbeelding ongeveer 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), zoals weergegeven in afbeelding 1B.
  2. Gebruik de oogzenuwkop (ONH) en het patroon van bloedvaten als oriëntatiepunten om het samengestelde vezelgram uit te lijnen. Verkrijg de in vivo en ex vivo uitlijning door het bloedvatpatroon van de samengestelde OCT-beelden te overlappen met de confocale beelden van hetzelfde netvlies gekleurd met ICAM-2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het composiet vis-OCT-fibergram wordt vergeleken met het overeenkomstige confocale beeld van plat gemonteerd netvlies dat immuungekleurd is met Tuj-1 voor RGC-axonen (Figuur 1D, bovenste paneel). Axonbundels afgebeeld door vis-OCTF kunnen worden gematcht met de Tu-j1-gelabelde axonbundels op de confocale afbeelding. Bloedvaten vertonen meestal te onderscheiden vertakkingsstructuren in vergelijking met omringende axonbundels in vezelgrambeelden, die kunnen worden vergeleken met de ICAM-2-gela...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn twee stappen in dit protocol die aandacht behoeven. Ten eerste is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het dier onder diepe anesthesie is en dat hun ogen volledig verwijd zijn voordat ze OCT-beeldvorming zien. Als de muizen niet voldoende worden verdoofd, kan hun snelle ademhaling leiden tot onstabiele bewegingen van de en-face beelden, wat de kwaliteit van het fibergram nadelig kan beïnvloeden. Bovendien kan onvoldoende ontsluiting ook een negatieve invloed hebben op de beeldkwaliteit, aangezien de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chang, S., Geen; Xu, W., Geen; Fan, W., Geen; McDaniel, J.A., Geen; D.A. Molenaar, Geen; M. Grannonico, Geen; M. Liu, Geen; X. Liu, Geen; H.F. Zhang heeft financiële belangen in Opticent Health, dat dit werk niet ondersteunde.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie wordt ondersteund door de Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 en Knights Templar Eye Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 druppels
Bovine serum albumin poederFisher Scientific, BP9706-1001:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 kleurstofThermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1.000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 kleurstofThermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1.000
Euthasol (een mengsel van pentobarbital natrium (390 mg/mL) en fenytoïne natrium (50 mg/mL))Covetrus, NDC 11695-4860-115,6 mg/mL
KetamineCovetrus, NADA043304114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1Een geschenk van Anthony J. Spano, Universiteit van Virginia1:200
Normaal donkey serum (NDS)Millipore Sigma, S30-100 mL1:100
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 10x), pH 7,4
(Bevat 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, en 20 mM KH2PO4)		Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K31:10
Rat anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
Tropicamide druppels Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagenskwaliteit)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield montagemediumVector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769(2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756(2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

OCT met zichtbaar lichtconfocale microscopieretinale zenuwvezelsbeeldvorming van de muisretinaretinale ganglioncellenimmuungekleurde retinauitlijning van het vezelgramretinale vasculatuurmapping van bloedvatenbeoordeling van neurale schade

Gerelateerde artikelen