Methodenartikel

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

DOI:

10.3791/65393

⸱

21 juli 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Pharmacy, University of Patras, 3Division of Flow Cytometry and Division of MDx & Life Sciences, SB BioAnalytica, 4Basic Sciences Laboratory, Department of Physiotherapy, University of Peloponnese, 5Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical School, University of Patras, 6School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana at Monroe

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het lymfestelsel neemt deel aan de regulering van immuunbewaking, lipidenabsorptie en weefselvochtbalans. De isolatie van lymfatische endotheelcellen van muizen is een belangrijk proces voor lymfatisch onderzoek, omdat het de uitvoering van in vitro en biochemische experimenten op de geïsoleerde cellen mogelijk maakt. Bovendien heeft de ontwikkeling van de Cre-lox-technologie de weefselspecifieke deficiëntie van genen mogelijk gemaakt die niet wereldwijd kunnen worden aangepakt, wat heeft geleid tot een nauwkeurige bepaling van hun rol in de bestudeerde weefsels. De ontleding van de rol van bepaalde genen in de lymfefysiologie en pathofysiologie vereist het gebruik van lymfatisch-specifieke promotoren, en dus de experimentele verificatie van de expressieniveaus van de beoogde genen.

Methoden voor efficiënte isolatie van lymfatische endotheelcellen van wildtype of transgene muizen maken het gebruik van ex vivo en in vitro assays mogelijk om de mechanismen te bestuderen die de lymfefuncties reguleren en de identificatie van de expressieniveaus van de bestudeerde eiwitten. We hebben een protocol ontwikkeld, gestandaardiseerd en gepresenteerd voor de efficiënte isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen (DLEC's) van muizen via magnetische parelzuivering op basis van LYVE-1-expressie. Het geschetste protocol is bedoeld om onderzoekers uit te rusten met een hulpmiddel om belangrijke spelers van lymfatische endotheelcelfuncties verder te begrijpen en op te helderen, vooral in faciliteiten waar fluorescentie-geactiveerde celsorteerapparatuur niet beschikbaar is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het lymfestelsel speelt een cruciale rol in de menselijke fysiologie. Het wordt beschouwd als een essentiële homeostatische factor, die belangrijke functies faciliteert, zoals het behoud van de weefsel-plasmavochtbalans, immuunbewaking en lipidenabsorptie1, evenals recent geïdentificeerde functies, zoals het herstelvermogen van het hart2 en het regeneratieve vermogen van bot en hematopoëse3. Ondanks de belangrijke rol van het lymfestelsel, blijven verschillende aspecten van de rol van de lymfevaten, evenals de moleculaire mechanismen die bepaalde fysiologische parameters en reacties beheersen, ongrijpbaar. Bovendien zijn lymfatische vasculaire defecten uitlokkende of verslechterende factoren bij bepaalde pathofysiologische aandoeningen. Bekende voorbeelden zijn de primaire en secundaire lymfoedeem, afhankelijk van respectievelijk de genetische of niet-genetische oorsprong van de ziekte, terwijl de rol van het lymfestelsel op de primaire tumorgroei en metastatische verspreiding cruciaal is, omdat het kan fungeren als een kanaal voor metastase en modulator van immuunfuncties1.

De achterstand in de studie en kennis van het lymfestelsel ten opzichte van het bloedvaatstelsel is voornamelijk te wijten aan de latere ontdekking van het lymfestelsel in vergelijking met het bloedvaatstelsel en de vertraging in de identificatie van lymfespecifieke moleculaire markers. Dit is de afgelopen decennia sterk verbeterd, wat heeft geleid tot een verandering van het conventionele beeld van de lymfevaten bij steady state en in ziekeomstandigheden1. Net als angiogenese is lymfangiogenese de vorming van nieuwe lymfevaten uit reeds bestaande lymfevaten en speelt het een cruciale rol bij de ontwikkeling van een breed spectrum van ziekten 4,5,6. In tegenstelling tot angiogenese is het onderzoek naar lymfangiogenese echter beperkt gebleven tot voornamelijk in vivo modellen die zich richten op de vorming van ontwikkelingsvaten en structurele defecten in pathologische modellen. De isolatie van de lymfatische endotheelcellen is belangrijk voor in vitro studies, en dit kan worden geboden door het gepresenteerde protocol.

Er zijn verschillende protocollen ontwikkeld voor lymfatische endotheliale isolatie van muizen, die het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering vereisen7. Het voordeel van de celsorteerder, indien beschikbaar, is de hogere zuiverheidsgraad, in tegenstelling tot isolatie op basis van kralen, waarbij deze laatste een hoger rendement oplevert. Het protocol maakt gebruik van de expressie van lymfatische endotheliale hyaluronreceptor 1 (LYVE-1), een lymfatische endotheliale marker, belangrijk voor celverkeer in de lymfevaten 4,8. Aangezien de expressie van LYVE-1 beperkt is tot de lymfatische capillairen en niet tot de verzamelende lymfevaten, is de techniek geschikt voor de isolatie van lymfatische endotheelcellen specifiek uit de lymfecapillairen, in tegenstelling tot andere lymfatische markers, zoals podoplanine, die uniform tot expressie komen in alle lymfatische endotheelcellen9. Voor het protocol werden andere belangrijke lymfatische markers die niet transmembraan waren, zoals Prox1, uitgesloten.

Omdat het fysiologische resultaat lymfangiogenese was, die meestal wordt geïnitieerd bij de lymfatische haarvaten, werd LYVE-1 als doelwit geselecteerd vanwege de selectiviteit in deze cellen en omdat het geselecteerde antilichaam een hoge opbrengst opleverde. De gebruikte enzymen waren collagenase type II, waarvan algemeen bekend is dat het effectiever is bij collageendissociatie dan type I10, en dispase, een breder protease, dat regelmatig wordt gebruikt voor de scheiding van dermis en epidermis11; Er zijn echter andere enzymen voor weefselscheiding gemeld12,13 en kunnen worden gebruikt. Het doel van dit protocol is het beschrijven van een methode voor dermale lymfatische endotheelcelisolatie uit lymfatische haarvaten van volwassen muizen met een hoge opbrengst met behulp van magnetische parelzuivering, vooral op plaatsen waar fluorescentie-geactiveerde celsortering niet direct beschikbaar is. De methode is geschikt voor toepassingen waarbij de zuiverheid van lymfatische endotheelcellen in het gedrang kan komen voor stroomafwaartse toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) voor de experimenten bij TTUHSC en door de veterinaire administratie van de prefectuur West-Griekenland volgens Richtlijn 2010/63 voor de experimenten aan de Universiteit van Patras. Volg nauwgezet de voorschriften voor afvalverwerking bij het weggooien van dierlijk afval.

1. Isolatie van de dermis van muizen

  1. Dag 1
    OPMERKING: Op dag 1; Zorg dat u de volgende materialen en apparatuur bij de hand heeft: anesthesiekamer, tondeuse voor dierenhaar, isofluraan, fijne pincet, spuitfilters van 0,2 μm.
    1. Bereid een 2 mg/ml Dispase-oplossing in DMEM met 1x antibiotica-antimycotische oplossing en filtreer deze.
      OPMERKING: Het gebruik van medium of PBS kan worden vervangen door HBSS, aangezien het met succes is gebruikt in andere gerapporteerde protocollen12. De 1x antibioticum-antimycotische oplossing kan worden vervangen door de toevoeging van penicilline (100 IE/ml), streptomycine (100 μg/ml) en amfotericine (2,5 μg/ml).
    2. Verdoof de muis door de muis in een anesthesiekamer te plaatsen met isofluraan toediening (0,5-2% isofluraan, debiet: 1 l/min). Nadat de muis stopt met bewegen, brengt u deze uit de kooi en gaat u verder met de anesthesie waarbij u een neuskegel aanpast met een vergelijkbare isofluraanstroom. Knijp in de tenen van het dier om te bevestigen dat er voldoende anesthesieniveaus zijn en controleer de muis constant om ervoor te zorgen dat diepe anesthesie behouden blijft (geen beweeglijkheid). Knip ongeveer 9cm2 van de dorsale en ventrale vacht (respectievelijk muisrug en buik) in de lengterichting langs de middellijn met een tondeuse. Laat de muis herstellen van de narcose en breng hem terug naar de kooi.
      OPMERKING: In plaats daarvan kan ontharingscrème (ontharing) worden gebruikt. Zorg ervoor dat de vacht volledig wordt verwijderd in de te isoleren huidgebieden met behoud van de integriteit van de huid. Probeer een zo groot mogelijk deel van de huid te knippen. Om ervoor te zorgen dat mogelijke ontstekingen door de ontharing worden opgelost, moet de celisolatie de volgende dag plaatsvinden. Om het aantal geïsoleerde cellen te verhogen, poolen 2 tot 4 muizen per groep.
  2. Dag 2
    OPMERKING: Houd de volgende materialen en apparatuur bij de hand: euthanasiekamer, bioveiligheidskast, CO2 -incubator, ethanol, fijne schaar, fijne pincet, stompe pincet, 100 mm weefselkweekplaat, Dispase, DMEM, 1x antibiotica-antimycotische oplossing.
    1. Euthanaseer de muis door CO2 - toediening en plaats deze in rugligging, waarbij het geknipte gebied bloot komt te liggen. Spuit 70% ethanol als ontsmettingsmiddel.
      OPMERKING: Vanaf deze stap moeten alle stappen onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd (in een bioveiligheidskast).
    2. Plaats een steriele weefselkweekplaat van 100 mm op ijs.
    3. Maak een oppervlakkige snede van 0,5 inch in de buik en snijd in de lengterichting langs de middellijn naar de nek en de onderbuik. Maak zijwaartse sneden om de huid open te kunnen fladderen.
      OPMERKING: De incisiegrootte en het geïsoleerde huidgebied zijn afhankelijk van de grootte van de muis.
    4. Scheid met een stompe tang de huid voorzichtig van de omliggende weefsels. Doe dit door de hele romp van de muis rond te gaan en snijd de huid zijdelings rond de nek en de onderbuik.
    5. Plaats de huid voorzichtig in de weefselkweekplaat van 100 mm, met de dermiszijde naar beneden, waarbij de huid zo uitgerekt mogelijk blijft. Dek de borden af en bewaar ze op het ijs. Voltooi de isolatie van alle muizen uit de groep.
    6. Nadat de huid van alle muizen is geëxtraheerd, broedt u de platen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur uit om de explantatie plat te maken.
    7. Voeg 6 ml Dispase-oplossing toe aan het bord, zorg ervoor dat de huid volledig is ondergedompeld en incubeer een nacht met lichte beweging bij 4 °C.
      OPMERKING: In plaats van Dispase kan ook trypsinevertering worden uitgevoerd12, gevolgd door Liberase in plaats van Collagenase Type II-behandeling (hieronder).

2. Celisolatie uit de dermis

  1. Dag 3
    OPMERKING: Houd de volgende materialen en apparatuur bij de hand: centrifuge, CO2 -incubator, bioveiligheidskast, schaar, DMEM, 1x antibioticum-antimycotische oplossing, collagenase type II, PBS, conische buis van 50 ml, weefselkweekplaten van 100 mm en 60 mm, DNAse I-oplossing, collageen type I, celzeven van 70 μm en 40 μm, spuitfilters van 0,2 μm, LEC-medium.
    1. Bereid 500 ml 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) en autoclaaf gedurende 20 minuten op 15 psi of filtreer. U kunt ook in de handel verkrijgbare steriele PBS gebruiken.
    2. Bereid 10 ml 2 mg/ml collagenase type II-oplossing in DMEM met 1x antibioticum-antimycoticum en filtreer deze.
      OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder een steriele kap om de kans op besmetting van het monster te verkleinen.
    3. Gebruik een pipet om het vocht uit de schaal te verwijderen.
    4. Gebruik een tang om de dermis (onderkant van de huid) te scheiden van de epidermis (bovenkant) en verwijder al het zichtbare vetweefsel. Breng de dermis over naar een schone weefselkweekplaat.
    5. Voeg 1 ml DMEM met 1x antibioticum-antimycotische oplossing toe aan de schone weefselkweekplaat en kantel deze zodat de vloeistof zich aan één kant van de plaat ophoopt.
    6. Hak de dermis in stukken van 1-2 mm2 en breng ze over in een nieuwe conische buis van 50 ml.
      OPMERKING: Deze stap moet idealiter binnen 4-5 minuten worden voltooid, omdat een langere verwerking naar verwachting geen hogere opbrengst of celoverleving zal opleveren.
    7. Voeg 10 ml van de Collagenase Type II-oplossing toe.
    8. Voeg 50 μl (25 eenheden/ml van de oplossing) DNAse I-oplossing toe (vermindert celklontering) en verteer de dermisoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C met continue beweging (gebruik een roterende/schuddende incubator bij 30-50 tpm).
      OPMERKING: Controleer regelmatig of het grootste deel van de dermis is verteerd. Als dit niet het geval is, verhoog dan de verteringstijd (maximaal 1 uur extra) en de roersnelheid, indien mogelijk.
    9. Smeer 60 mm weefselkweekplaten in met 2 ml 10 μg/ml collageen type I in 0,02 m azijnzuur gedurende >20 minuten bij 37 °C. 2x wassen met steriel PBS.
    10. Filtreer de celsuspensie met behulp van een celzeef van 70 μm en centrifugeer bij 250 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg.
    11. Resuspenderen in 10 ml DMEM met 1x antibioticum-antimycotische oplossing.
    12. Filtreer de celsuspensie met behulp van een celzeef van 40 μm en centrifugeer bij 250 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg.
    13. Resuspendeer in 1 ml volledig LEC-medium (basismedium voor endotheelcelgroei met supplement).
    14. Plaat de cellen in de met collageen beklede 60 mm weefselkweekplaat in volledige LEC-media. Dit wordt dag 0 van de celkweek.
    15. Vervang de media na elke 2 dagen door de cellen twee keer te wassen met 1x PBS en verse LEC-media toe te voegen.
    16. Herhaal stap 2.1.15 totdat de cellen voor 80-90% samenvloeien.
      OPMERKING: Als de zuivering wordt uitgevoerd voordat de cellen voor 80-90% samenvloeien, zullen er minder lymfatische endotheelcellen worden geïsoleerd. Dit proces duurt ongeveer 7 tot 10 dagen.

3. Magnetische parelcoating met LYVE-1-antilichaam

OPMERKING: Zorg dat u een dag voor de zuiveringsstap de volgende materialen en apparatuur bij de hand heeft: 4 °C koelkast, rotor, magnetische scheider, PBS, Anti-Rabbit IgG magnetische kralen, microcentrifugebuisjes, 0,2 μm spuitfilters, Magnetic Bead Coating Solution, LYVE-1-antilichaam.

  1. Bereid de Magnetic Bead Coating Solution voor: 20 ml PBS met 0,1% BSA en 2 mM EDTA en filtreer het. Bewaar het bij 4 °C.
    OPMERKING: Meer dan een paar dagen opslag wordt niet aanbevolen; Controleer voor gebruik op neerslag of vervuiling.
  2. Pipetteer 500 μL Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads in een microcentrifugebuisje en voeg 1 ml ijskoude Magnetic Bead Coating Solution toe.
  3. Gebruik een magnetische scheider om de kralen te wassen.
  4. Herhaal de wasbeurten 2x met 1 ml van de ijskoude Magnetic Bead Coating Solution.
  5. Resuspendeer de korrels in 500 μL Magnetic Bead Coating Solution en maak aliquots van 150 μL in microcentrifugebuisjes.
  6. Voeg 15 μg van het LYVE-1-antilichaam toe aan elk buisje (15 μL van 1 mg/ml antilichaamvoorraadconcentratie).
  7. Incubeer een nacht bij 4 °C met continue agitatie.

4. Zuivering van lymfatische endotheelcellen

OPMERKING: Zorg dat u de volgende materialen en apparatuur bij de hand heeft: CO2 -incubator, shaker, timer, parafilm, DMEM, 1x Antibioticum-Antimycotic Solution, BSA, PBS, Magnetic Bead Coating Solution, trypsine-EDTA, 100 mm of 60 mm weefselkweekplaten, 0,2 μm spuitfilters, Collageen Type I, Azijnzuur, LEC-medium.

  1. Bereid 50 ml DMEM met 1x Antibioticum-Antimycoticum Solution en 0,1% BSA en filtreer het.
  2. Smeer 60 mm weefselkweekplaten in met 10 μg/ml collageen Type I in 0,02 m azijnzuur gedurende >20 minuten bij 37 °C. 2x wassen met steriel PBS.
  3. Was de voorgecoate kralen met 1 ml Magnetic Bead Coating Solution, met behulp van een magnetische scheider.
  4. Resuspendeer de korrels in 150 μL DMEM met 0,1% BSA.
    LET OP: De kralen kunnen nu maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
  5. Was de cellen 2x met PBS.
  6. Voeg 3 ml DMEM met 0,1% BSA (voor een weefselkweekplaat van 60 mm) en 50 μl van de antilichaam-geconjugeerde bolletjes toe aan de cellen.
    OPMERKING: Als de cellen van twee of meer muizen zijn samengevoegd, gebruik dan een weefselkweekplaat van 100 mm en voeg 6 ml DMEM toe met 0,1% BSA.
  7. Sluit de schaal af met parafilm.
  8. Plaats de schaal op een shaker die op 10 RPM op RT schudt en incubeer precies 10 min.
    OPMERKING: Langere incubatie zal resulteren in niet-specifieke binding. Om ervoor te zorgen dat de kralen in wisselwerking staan met het hele plaatoppervlak, draait u de plaat na elke paar minuten handmatig terwijl deze blijft schudden.
  9. Gooi het medium weg en was de cellen eenmaal met PBS. Inspecteer snel de cellen om de aanwezigheid van LEC-kolonies op de plaat te verifiëren.
  10. Trypsiniseer de cellen: gebruik 1 ml trypsine-EDTA en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C. Inspecteer de cellen op succesvolle celloslating.
  11. Neutraliseer de oplossing met 2 ml volledig LEC-medium en breng de oplossing over in een steriele polypropyleen buis van 5 ml.
  12. Gebruik een magnetische scheider om cellen 4 x 3 ml DMEM met 0,1% BSA te wassen om ongebonden cellen te verwijderen.
  13. Resuspendeer de resterende parelgebonden cellen in volledige LEC-media en plaat op de eerder met collageen beklede 60 mm weefselkweekplaten.
  14. Incubeer de cellen bij 37 °C en vervang de media om de dag na twee PBS-wasbeurten.
  15. Kweek de cellen totdat ze samenvloeiing bereiken (het duurt normaal 7 tot 10 dagen).
  16. Controleer op dat moment de cellen onder de microscoop op samenvloeiing en ga verder met het voorbereiden van cellen op flowcytometrie. Als een hoog percentage F4/80+ wordt geïdentificeerd, herhaal dan de zuiveringsstap met LYVE-1 (Stap 4: Lymfatische endotheelcelzuivering) opnieuw of idealiter een andere lymfemarker (d.w.z. podoplanine14).
    OPMERKING: De hoge expressie van het eiwit waarop het antilichaam zich richt op de magnetische parel-gezuiverde celpopulatie is aangetoond 15,16. Voor LYVE-1 is het echter belangrijk om een flowcytometriecontrole uit te voeren voor de identificatie van het percentage andere LYVE-1+-cellen, meestal macrofagen. LYVE-1 komt alleen tot expressie in subsets van macrofagen die geassocieerd zijn met tumoren en wonden, terwijl in een gezonde huid de expressie van LYVE-1 meer beperkt is tot lymfatische endotheelcellen17. De F4/80-screening is dus niet verplicht, maar eerder afhankelijk van de experimentele context. De muizen die voor demonstratie werden gebruikt, droegen geen tumoren of wonden, alleen mogelijke ontsteking door ontharing, maar we hebben de F4/80-kleuring opgenomen als basislijn van het percentage LYVE-1+ macrofagen.

5. Flowcytometrie

OPMERKING: Zorg dat u de volgende materialen en apparatuur bij de hand heeft: centrifuge, CO2-incubator , timer, hemocytometer, EDTA-oplossing, 1x antibiotica-antimycotische oplossing, BSA, PBS, trypsine-EDTA, polypropyleen buisjes, 0,2 μm spuitfilters, 70% ethanol, F4/80 FITC-geconjugeerd antilichaam.

  1. Bereid PBS met 0,1% BSA en filtreer het.
  2. Bereid 1 mM EDTA-oplossing voor in PBS.
  3. Trypsiniseer de cellen: incubeer de cellen met 1 ml 1 mM EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Incubatie met EDTA-oplossing is een mildere methode van celloslating, die de transmembraaneiwitten beter behoudt en de voorkeur heeft, maar het vereist langere incubatieperioden. Als alternatief kan trypsine-EDTA-oplossing worden gebruikt voor een incubatietijd van 1 minuut bij 37 °C, maar dit kan de affiniteit van antilichamen voor flowcytometrietoepassingen beïnvloeden.
  4. Neutraliseer de oplossing met 2 ml volledig LEC-medium en breng de oplossing over in een steriele polypropyleen buis van 5 ml.
  5. Centrifugeer de monsters bij 250 × g gedurende 5 minuten.
  6. Wassen met PBS.
  7. Herhaal de centrifugatie en PBS-wasbeurt.
  8. Resuspendeer de cellen in PBS die 0,1% BSA bevatten en tel ze met behulp van een hemocytometer of een alternatieve methode. Aliquot ~1 × 106 cellen in polypropyleen buisjes met een eindvolume van 100 μl. Voer vanaf deze stap alle stappen uit bij 4 °C.
    OPMERKING: De cellen kunnen worden gefixeerd voordat ze worden gekleurd of tijdens het leven worden gekleurd. Fixatie kan suboptimaal zijn voor flowcytometrie, omdat sommige antilichamen de antigenen mogelijk niet detecteren na fixatie; Daarom raden we aan om flowcytometrie onmiddellijk na de vorige stap uit te voeren en de fixatiestap over te slaan. Als dat niet mogelijk is, zal fixatie voorafgaand aan het flowcytometrie-experiment een vertraging in de flowcytometriestap mogelijk maken. Als fixatie moet worden uitgevoerd, moeten de prestaties van de antilichamen in de context van gefixeerde cellen vooraf worden geëvalueerd.
  9. Voer fixatie uit (optionele stap; als de cellen niet moeten worden gefixeerd, ga dan verder met immunokleuring): resuspendeer de cellen in ijskoude 70% ethanol en meng voorzichtig gedurende 10 minuten op ijs.
    OPMERKING: Ethanolfixatie kan de cellen permeabiliseren en leiden tot het vrijkomen van GFP; Fixatie op basis van paraformaldehyde kan echter kleurstoffen vernietigen die worden gebruikt voor flowcytometrie en kan idealiter worden vermeden.
  10. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Was de cellen 2x door centrifugeren bij 250 × g gedurende 5 minuten in 1x PBS.
  12. Ga verder met de volgende stap of resuspendeer de cellen in 0,5-1 ml 1x PBS en bewaar bij 4 °C.

6. Immunokleuring

OPMERKING: Behandel de cellen voorzichtig en vermijd uitgebreid pipetteren, indien mogelijk, om de integriteit van het celmembraan te behouden en celdood te minimaliseren, zodat de cellen geen klonten vormen. Bereid uit de geïsoleerde endotheelcellen de volgende groepen: ongekleurde cellen en gekleurde cellen met een andere endotheelcelmarker (d.w.z. VEGFR3, podoplanine), F4/80 en beide. Neem in de handel verkrijgbare lymfatische endotheelcellen en macrofagen van muizen, indien beschikbaar, op als positieve controles. Voor demonstratiedoeleinden, en vanwege de endogene tdTomato-fluorescentie (PE+), hebben we FITC-geconjugeerde F4/80-kleuring gebruikt.

  1. Verdun het primaire antilichaam in PBS met 0,1% BSA volgens de aanbevolen of geoptimaliseerde verdunning. Voeg 0,5 μg (1 μL antilichaamoplossing) van het F4/80 FITC-geconjugeerde antilichaam toe aan de 100 μL van de celsuspensie.
  2. Resuspendeer de cellen na toevoeging van het verdunde fluorescerend geconjugeerde antilichaam. Meng door op de polypropyleen buis te tikken om ervoor te zorgen dat er geen klonten zijn en dat alle cellen goed bedekt zijn.
  3. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (vaste cellen) of 30 minuten op ijs (levende cellen) in het donker.
  4. Was de cellen 2x door ze 5 minuten te centrifugeren bij 250 × g bij 4 °C (voor levende cellen) of bij kamertemperatuur (voor vaste cellen), met behulp van PBS met 0,1% BSA in het donker.
  5. Voor niet-fluorescerend geconjugeerde antilichamen
    1. Verdun het fluorocheen-geconjugeerde secundaire antilichaam in de incubatiebuffer. Gebruik voor Alexa Flour-antilichamen een verdunning van 1:500.
    2. Voeg het secundaire antilichaam toe aan 100 μL van de celsuspensieoplossing.
    3. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (vaste cellen) of op ijs (levende cellen).
    4. Tweemaal wassen door centrifugeren bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (voor levende cellen) of bij kamertemperatuur (voor vaste cellen) in de incubatiebuffer.
  6. Resuspendeer cellen in 0,5 ml 1x PBS en analyseer ze met behulp van een flowcytometer.
  7. Volg deze stappen van de gatingstrategie om de macrofaagpopulatie in de cellen die LYVE-1 tot expressie brengen te identificeren:
    1. Overweeg voorwaartse en zijwaartse verstrooiing om de cellulaire populatie te onderscheiden.
    2. Overweeg voorwaartse verstrooiing voor celgrootte, oppervlakte en hoogte om de afzonderlijke cellen (singlets) te onderscheiden.
    3. Houd rekening met F4/80 (FITC)-expressie en RFP (PE)-expressie om macrofagen (F4/80+) te identificeren in de geïsoleerde muizencellen die tdTomato (PE) tot expressie brengen (vanwege de aanwezigheid van een fluorescerende tdTomato-reporter in de specifieke muizen, hieronder beschreven).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode werd ontwikkeld om de eiwitexpressie te identificeren van een klein GTPase, RhoA, waarvan het coderende gen in beide allelen werd gefloxed en verwijderd onder invloed van de tamoxifen-induceerbare lymfatische endotheelspecifieke promotor Prox1-CreERT2 18. De geïsoleerde LEC's kunnen tot vier generaties lang worden gekweekt, waarna ze veroudering worden. Ze zijn ingevroren, ontdooid en met succes gestimuleerd met angiopoëtine-2. Vanwege het beperkte aantal celpassages...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het lymfestelsel is een belangrijke regulator van de homeostatische functie van het lichaam, met als belangrijkste functies het behoud van vloeibaar plasma, de verwijdering van bijproducten van het cellulaire metabolisme en toxische moleculen, de opname van lipidenen het transport van immuuncellen1,19. De identificatie van geschikte markers heeft geleid tot een uitbarsting van nieuwe gegevens op het gebied van lymfe, die nieuwe functies van het lymfevaatuur aan h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), de National Institutes of Health, het National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], de Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences-beurs (aan CMM), en door het College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up financiering, de National Institutes of Health (NIH) via het National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] en het Research Competitiveness Subprogram (RCS) van de Louisiana Board of Regents via het Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (aan GM). De gebruikelijke TTUHSC-apparatuur die werd gebruikt, werd verkregen via de Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Grants RP190524 en RP200572. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, de beslissing om te schrijven of de voorbereiding van het manuscript. De grafische samenvatting in figuur 1A is gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249verdund in 0,02 M azijnzuur in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2.500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319(2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691(2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464(2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725(2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063(2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165(2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497(2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

lymfatische endotheelcellenisolatie van murine dermiszuivering met magnetische beadsLYVE1 expressiedermale lymfecapillairencollagenase digestieweefkweekplaattransgene muizenfiltratie met celzeeftrypsinisatie

Gerelateerde artikelen