Methodenartikel

Geoptimaliseerde productie en analyse van recombinante met eiwitten gevulde blaasjes van E. coli

DOI:

10.3791/65442

⸱

30 juni 2023

 ,  ,  , 
1School of Biosciences, University of Kent

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bacteriële productie van recombinante eiwitten, waaronder typisch onoplosbare of disulfide-bindingsbevattende eiwitten, verpakt in extracellulaire membraangebonden blaasjes. Dit heeft het potentieel om te worden toegepast op veelzijdige gebieden van wetenschappelijk onderzoek, waaronder toegepaste biotechnologie en geneeskunde.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit innovatieve systeem, met behulp van een korte peptidetag, die meerdere recombinante eiwitten exporteert in membraangebonden blaasjes van E. coli, biedt een effectieve oplossing voor een reeks problemen die verband houden met bacteriële recombinante eiwitexpressie. Deze recombinante blaasjes compartimenteren eiwitten in een micro-omgeving die de productie van anders uitdagende, toxische, onoplosbare of disulfide-bindingsbevattende eiwitten van bacteriën vergemakkelijkt. De eiwitopbrengst is aanzienlijk verhoogd in vergelijking met typische bacteriële expressie in afwezigheid van de vesikel-nucleating peptide tag. De afgifte van vesikelverpakte eiwitten ondersteunt de isolatie van het kweekmedium en maakt langdurige actieve eiwitopslag mogelijk. Deze technologie leidt tot hogere opbrengsten van vesikelverpakte, functionele eiwitten voor vereenvoudigde downstream-verwerking voor een breed scala aan toepassingen, van toegepaste biotechnologie tot ontdekkingswetenschap en geneeskunde. In dit artikel en de bijbehorende video wordt een gedetailleerd protocol van de methode gegeven, waarin de belangrijkste stappen in de methodologie worden belicht om de productie van recombinante eiwitgevulde blaasjes te maximaliseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Gram-negatieve bacterie E. coli is een aantrekkelijk systeem voor recombinante eiwitproductie op zowel industriële als academische schaal. Het is niet alleen kosteneffectief en eenvoudig te kweken in batches tot hoge dichtheden, maar er is een breed spectrum van reagentia, stammen, hulpmiddelen en promotors vastgesteld om de generatie van functionele eiwitten in E. coli1 te bevorderen. Bovendien overwinnen synthetische biologietechnieken nu obstakels die typisch zijn voor de toepassing van posttranslationele modificaties en het vouwen van complexe eiwitten2. Het vermogen om de secretie van recombinante eiwitten in kweekmedia te richten is aantrekkelijk voor het verbeteren van de opbrengst en het verlagen van de productiekosten. Gecontroleerde verpakking van door de gebruiker gedefinieerde eiwitten in membraanblaasjes helpt bij de ontwikkeling van producten en technologieën binnen de toegepaste biotechnologie en medische industrie. Tot nu toe was er een gebrek aan breed toepasbare methoden voor het afscheiden van recombinante eiwitten uit E. coli 3.

Eastwood et al. hebben onlangs een op peptide tagging gebaseerde methode ontwikkeld voor het produceren en isoleren van recombinante eiwitbevattende blaasjes van E. coli1. Dit Vesicle Nucleating peptide (VNp) maakt de productie van extracellulaire bacteriële membraanblaasjes mogelijk, waarin het recombinante eiwit van keuze kan worden gericht om de zuivering en opslag van het doeleiwit te vereenvoudigen, en maakt aanzienlijk hogere opbrengsten mogelijk dan normaal toegestaan van schudflesculturen. Opbrengsten van bijna 3 g recombinant eiwit per liter kolfcultuur zijn gemeld, met >100x hogere opbrengsten dan die verkregen met equivalente eiwitten zonder de VNp-tag. Deze recombinante eiwitverrijkte blaasjes kunnen snel worden gezuiverd en geconcentreerd uit de kweekmedia en bieden een stabiele omgeving voor opslag. Deze technologie betekent een belangrijke doorbraak in de productie van E. coli recombinant eiwit. De blaasjes compartimenteren toxische en disulfide-bindingsbevattende eiwitten in een oplosbare en functionele vorm en ondersteunen de eenvoudige, efficiënte en snelle zuivering van met blaasjes verpakte, functionele eiwitten voor langdurige opslag of directe verwerking1.

De grote voordelen van deze technologie ten opzichte van de huidige technieken zijn: (1) de toepasbaarheid op verschillende maten (1 kDa tot >100 kDa) en soorten eiwitten; (2) het vergemakkelijken van de vorming van inter- en intra-eiwitdisulfidebinding; (3) van toepassing op multiproteïnecomplexen; (4) kan worden gebruikt met een reeks promotors en standaard laboratorium E. coli-stammen ; 5) het genereren van eiwitgehalten uit schudkolven die normaliter alleen bij fermentatieculturen worden waargenomen; eiwitten worden geëxporteerd en verpakt in membraangebonden blaasjes die (6) een stabiele omgeving bieden voor de opslag van het actieve oplosbare eiwit; en (7) vereenvoudigt downstream verwerking en eiwitzuivering. Deze eenvoudige en kosteneffectieve recombinante eiwittool zal waarschijnlijk een positieve impact hebben op de biotechnologie en medische industrie, evenals de ontdekkingswetenschap.

Hier beschrijft een gedetailleerd protocol, ontwikkeld over meerdere jaren, de optimale omstandigheden om recombinante eiwitgevulde blaasjes van bacteriën te produceren met de VNp-technologie. Voorbeeldbeelden van dit systeem in de praktijk worden getoond, waarbij een fluorescerend eiwit tot expressie wordt gebracht, waardoor de aanwezigheid van blaasjes tijdens verschillende stadia van de productie, zuivering en concentratie kan worden gevisualiseerd. Ten slotte worden richtlijnen gegeven voor het gebruik van live cell imaging om de productie van VNp-fusiebevattende blaasjes uit de bacteriën te valideren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het uitgevoerde bacteriële werk volgt de lokale, nationale en internationale voorschriften voor de inperking van de bioveiligheid die passen bij het specifieke bioveiligheidsrisiconiveau van elke stam.

1. Selectie van verschillende VNps

  1. Identificeer de VNp-sequenties.
    OPMERKING: Voor deze studie zijn drie VNp-sequenties geïdentificeerd1 die resulteren in maximale opbrengst en vesiculaire export van de tot nu toe onderzochte eiwitten: VNp2, VNp6 en VNp15. Het is op dit moment niet duidelijk waarom bepaalde VNp-varianten met sommige eiwitten efficiënter presteren dan andere; daarom wordt aanbevolen dat fusies worden gegenereerd tussen een nieuw eiwit van belang met elke VNp-variant (d.w.z. VNp2, 6 of 15).
    VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
    AGKTKEGVL
    VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
    AEKTKEGVM
    VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
    Plasmiden die expressie van het eiwit van belang met verschillende VNp amino terminale fusies mogelijk maken, zijn commercieel beschikbaar gesteld (zie tabel met materialen).
  2. Ontwerp een kloonstrategie om het gen van belang in te voegen aan het 3'-uiteinde van het cDNA-dat codeert voor de VNp in een van deze constructen, of pas een bestaand plasmide aan door gesynthetiseerd VNp cDNA stroomopwaarts van het eerste ATG-codon van het gen dat codeert voor het eiwit van belang te integreren. Gebruik de methoden zoals beschreven in1.
  3. Gebruik voor toxische eiwitten een vector met een onderdrukkende expressiebevorderaar of een promotor met minimale niet-geïnduceerde expressieruis.
  4. Kloon de VNp-sequentietag op de amino-terminal van het fusie-eiwit. Zorg ervoor dat de affiniteitstags, proteassplitsingssequenties, enz., En het eiwit van belang zich aan de carboxylzijde van de VNp-tag bevinden. Het wordt aanbevolen om de VNp te scheiden van het stroomafwaartse peptide met een flexibel linkergebied, zoals twee of drie herhalingen van een -G-G-S-G- polypeptidesequentie (figuur 1).
    OPMERKING: Gebruik plasmiden met een antibioticaselectie die zich niet richt op peptidoglycaan, wat het celoppervlak verzwakt en de blaasjesopbrengst vermindert. Kanamycine en chlooramfenicol (zie tabel met materialen) waren de voorkeursantibiotica die voor deze studie werden gebruikt.

2. Bacteriële celkweek en eiwitinductie

OPMERKING: Bacteriestammen die meestal in dit protocol worden gebruikt, zijn Escherichia coli BL21 (DE3) of W3110. E. coli-cellen worden gekweekt in lysogene bouillon (LB) (10 g/L trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L gistextract) of geweldige bouillon (TB) (12 g/L trypton; 24 g/L gistextract; 4 ml/l 10% glycerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, zouten afzonderlijk geautoclaveerd) media (zie materiaaltabel). Voorbeeldafbeeldingen van elke stap van de eiwitinductie en het daaropvolgende isolatie- en zuiveringsproces zijn weergegeven in figuur 2.

  1. Kweek 5 ml LB-starters van verse bacteriële transformaties bij 37 °C tot verzadiging en gebruik ze om 25 ml tbc te enten in een erlenmeyer van 500 ml, allemaal met de juiste antibioticaselectie.
  2. De oppervlakte:volumeverhouding is een belangrijke factor bij het optimaliseren van dit systeem. Gebruik een zo groot mogelijke volumekolf (bijv. 5 l kolf met 1 l cultuur; gebruik voor optimalisatieruns 25 ml media in een kolf van 500 ml).
  3. Incubeer de grotere schudkolfculturen in een incubator bij 37 °C met schudden bij 200 tpm (≥25 mm omslagworp) totdat een optische dichtheidswaarde van 600 nm (OD600) van 0,8-1,0 is bereikt.
    OPMERKING: Vesiculatie is optimaal wanneer cellen worden gekweekt bij 37 °C. Sommige recombinante eiwitten vereisen echter expressie bij lagere temperaturen. Als dit het geval is voor het eiwit van belang, moet de VNp6-tag worden gebruikt, omdat dit de export van blaasjes met een hoog rendement mogelijk maakt bij temperaturen tot 25 °C.
  4. Om recombinante eiwitexpressie van de T7-promotor te induceren, voegt u isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe tot een eindconcentratie van maximaal 20 μg / ml (84 μM) (zie materiaaltabel). De inductie van recombinante eiwitexpressie moet plaatsvinden in de late logfase (d.w.z. typisch OD600 van 0,8-1,0) voor de productie van blaasjes.
    OPMERKING: De lengte van de inductieperiode kan verschillen tussen eiwitten, waarbij sommige de maximale productie bereiken na 4 uur en andere 's nachts (18 uur). Tot op heden is maximale blaasjesexport verkregen in nachtculturen.

3. Recombinante vesikelisolatie

  1. Pellet de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g (4 °C) gedurende 20 minuten.
  2. Om vesikelbevattende media te steriliseren voor langdurige opslag, voert u de geklaarde kweekmedia door een steriel en reinigingsmiddelvrij 0,45 μm polyethersulfon (PES) filter (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Om de uitsluiting van levensvatbare cellen van het vesikelbevattende filtraat te testen, plaat op LB-agar en incubeer 's nachts bij 37 °C.
  3. Om blaasjes in een kleiner volume te concentreren, voert u de steriele blaasjesbevattende media door een steriel en reinigingsmiddelvrij 0,1 μm gemengde cellulose-esters (MCE) -filter (zie materiaaltabel).
  4. Was het membraan voorzichtig met 0,5-1 ml steriele PBS met behulp van een celschraper of plastic strooier om voorzichtig blaasjes van het membraan te verwijderen. Breng over in een verse microfugebuis.
    OPMERKING: Gezuiverde blaasjes kunnen worden bewaard in steriele media of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °C. Er zijn voorbeelden van recombinante eiwitten die gedurende 6 maanden in deze blaasjes zijn opgeslagen, op deze manier, zonder verlies van enzymatische activiteit.

4. Oplosbare eiwitafgifte uit geïsoleerde blaasjes

  1. Zodra eiwitbevattende blaasjes zijn geïsoleerd in de steriele media / buffer, onderwerpt u vesiculaire lipidemembranen aan ultrasoonapparaat met behulp van een geschikt schema voor het apparaat (bijv. 6x 20 s aan en uit cycli) en centrifugeert u gedurende 20 minuten bij 39.000 x g (4 ° C) om blaasjesresten te verwijderen.
    OPMERKING: Osmotische shock of behandeling met reinigingsmiddelen kan worden gebruikt als alternatief om de blaasjes open te breken, maar er moet rekening worden gehouden met de impact op de eiwitfunctionaliteit en / of downstream-toepassing.
  2. Als VNp-fusie cytosolisch blijft en niet in de media vrijkomt, isoleer het eiwit dan met behulp van standaardprotocollen (bijv. Resuspendeer de celpellets in 5 ml van een geschikte extractiebuffer (20 mM tris, 500 mM NaCl), soniceer en verwijder het celafval door centrifugatie).

5. Bepaling van de eiwitconcentratie

  1. Bepaal de concentratie van eiwitten door geldensitometrieanalyse van drievoudige monsters1. Voer naast runderserumalbumine (BSA) laadnormen uit op coomassie-gekleurde natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gels. Scan en analyseer de gels met behulp van de juiste software (bijv. Afbeelding J; zie Materiaaltabel).

6. Visualisatie van blaasjesvorming en geïsoleerde blaasjes door fluorescentiemicroscopie

OPMERKING: Als de cellen fluorescerend gelabelde VNp-fusie of membraanmarkers bevatten, kan live cell imaging worden gebruikt om de vorming van blaasjes te volgen. Als alternatief kunnen fluorescerende lipidekleurstoffen worden gebruikt om blaasjes te visualiseren om de productie en zuivering te bevestigen.

  1. Celmontage
    1. Induceer VNp-fusie-expressie gedurende enkele uren voordat u deze op de afdekplaat monteert.
    2. Agarose pad-methode (figuur 3A-C): pipetteer de cellen op een dunne (<1 mm), cirkelvormige LB-agarose (2%) pad die zich heeft kunnen vormen en op een schone glasplaat is geplaatst. Laat de cellen bezinken en balanceren en plaats een coverslip van 50 mm x 25 mm op de pad en cellen. Houd de coverslip op zijn plaats met afstandhouders en plakband.
    3. Polyethyleenimine (PEI) methode (figuur 3D-F): verdeel 20 μL van 0,05% PEI (in dH2O) op een dekplaat met een pipetpunt en laat 3-5 minuten binden aan glas zonder te laten drogen. Voeg 50 μL celkweek toe en laat 5-10 minuten staan om er zeker van te zijn dat bacteriën zich hebben geassocieerd met het PEI-gecoate oppervlak4. Was de coverslip met 100 μL media voordat u deze op de dia plaatst en houd deze op zijn plaats met afstandhouders en plakband.
  2. Montageblaasjes
    1. Pipet gezuiverde blaasjes op een dunne (<1 mm), ronde LB-agarose (2%) pad dat is toegestaan om te vormen en te zetten op een schone glazen dia. Zodra de vloeistof is opgedroogd, plaatst u een afdekplaat van 50 mm x 25 mm op de pad en blaasjes. Houd de coverslip op zijn plaats met afstandhouders en plakband.
    2. De fluorescerende lipidekleurstof FM4-64 is in staat om membranen5 te kleuren en kan daarom worden gebruikt om blaasjes te visualiseren. Voeg FM4-64 (zie materiaaltabel) toe aan gezuiverde blaasjes in een eindconcentratie van 2 μM (uit een voorraad van 2 mM opgelost in dimethylsulfoxide [DMSO]) en beeld na een incubatie van 10 minuten. Dit is vooral handig voor het identificeren van blaasjes met niet-fluorescerend gelabelde ladingen5.
    3. Spoel de coverslips af met dezelfde media die worden gebruikt om de waargenomen cellen te kweken.
      OPMERKING: Sommige complexe media (bijv. TB) kunnen autofluorescentie vertonen, wat kan leiden tot een teveel aan achtergrondsignaal.
  3. Beeldblaasjes
    OPMERKING: Voorbeeldmicroscopiebeelden van VNp-recombinante blaasjes zijn te zien in figuur 4.
    1. Monteer de dia op een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel) met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief en laat 2-3 minuten staan om het monster te laten bezinken en de temperatuur in evenwicht te brengen.
      OPMERKING: Alle beelden van levende cellen voor elk monster moeten binnen 30 minuten na montage van cellen op dekstroken worden voltooid om de impact van fototoxiciteit en anaerobe stress te minimaliseren. Om deze reden hebben single-plane afbeeldingen de voorkeur boven z-stacks.
    2. Gebruik geschikte lichtbronnen (bijv. light emitting diode [LED] of halogeenlamp; zie materiaaltabel) en filtercombinaties voor de gebruikte fluorescerende eiwitten / kleurstof(fen)6.
    3. Gebruik een hoge vergroting (d.w.z. 100x of 150x) en een hoog numeriek diafragma (d.w.z. NA ≥1.4) lens voor het in beeld brengen van de microbiële cellen en blaasjes.
    4. Bepaal de minimale lichtintensiteit die nodig is om fluorescentiesignalen van cellen en / of blaasjes te visualiseren. Dit kan enige aanpassing van de belichtings- en versterkingsinstellingen voor de gebruikte camera vereisen.
      OPMERKING: Typische belichtingstijden van de huidige complementaire metaaloxide halfgeleider (CMOS) camera's variëren tussen 50-200 ms, afhankelijk van het beeldvormingssysteem.
    5. Voor afbeeldingen met één frame gebruikt u gemiddelde van drie afbeeldingen om hardwareafhankelijke willekeurige achtergrondruis te verminderen.
    6. Voor time-lapse-beeldvorming moet u rekening houden met 3-5 minuten tussen afzonderlijke frames.
      OPMERKING: Afhankelijk van de microscoopopstelling moet de focus mogelijk met tussenpozen worden aangepast tijdens langere time-lapse-experimenten.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BL21 DE3 E. coli met de VNp6-mNeongreen expressieconstructie werden gekweekt tot de laatlogfase (figuur 2A). VNp6-mNeongreen expressie werd geïnduceerd door de toevoeging van IPTG aan de cultuur (20 μg/ml of 84 μM eindconcentratie), die vervolgens 's nachts bij 37 °C werd laten groeien met krachtig schudden (200 rpm, ≥25 mm orbitale worp). De volgende ochtend vertoonde de cultuur mNeongreen fluorescentie7 (figuur 2B), die zichtbaar bleef in de media na het verwijderen van bacteriële cellen door centrifugatie (figuur 2C). De aanwezigheid van VNp-mNeongreen binnen de cultuur- en geclearde cultuurmedia werd bevestigd door SDS-PAGE (figuur 2D). De mNeongreen-bevattende blaasjes werden geïsoleerd op een 0,1 μm MCE-filter (figuur 2E) en geresuspendeerd in PBS (figuur 2F). De gezuiverde blaasjes werden vervolgens gemonteerd op een agarose pad (figuur 3A-C) en in beeld gebracht met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie (figuur 4A). De aanwezigheid van blaasjesmembranen werd bevestigd met behulp van de lipofiele fluorescerende kleurstof FM4-64 (figuur 4B). De E. coli-cellen die het binnenmembraaneiwit CydB tot expressie brengen, gefuseerd met mNeongreen (groen) en VNp6-mCherry2 (magenta)8, vertonen blaasjesproductie en ladinginbrenging in levende bacteriële cellen (figuur 4C). Figuur 4A,B werd vastgelegd met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop, terwijl figuur 4C werd verkregen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), met behulp van eerder beschreven methoden 9,10.

figure-results-1
Figuur 1: Samenvatting van VNp-technologie van het ontwerpen van een kloonstrategie tot de zuivering en opslag van extracellulaire blaasjes. (A) Schema van een typisch VNp-fusie-eiwit. VNp op het NH2-eindpunt, gevolgd door een flexibele linker en een geschikte combinatie van affiniteits- en fluorescentietags (Tag1, Tag 2, proteasesplitsingsplaats [bijv. TEV]) en eiwit van belang. B) Schematisch schema met een samenvatting van het protocol voor de expressie en zuivering van met recombinante eiwitten gevulde membraanblaasjes van E. coli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Stadia van productie en zuivering van VNp6-mNg-blaasjes. Culturen van E. coli-cellen die de VNp-mNeongreen-expressie bevatten, construeren in blauw licht vóór (A) of na (B) IPTG-geïnduceerde expressie van het fusie-eiwit. De cellen van (B) werden verwijderd door centrifugatie, waardoor VNp-mNeongreen gevulde blaasjes in de media (C) achterbleven. (D) Equivalente monsters van A, B en C werden geanalyseerd door SDS-PAGE en coomassie-kleuring. De blaasjes werden geïsoleerd op een filter van 0,1 μm (E) en vervolgens weggespoeld tot een geschikt buffervolume (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Celmontageprocedure voor het afbeelden van blaasjes en vesikelproductie. (A-C) De agarosepadmethode en (D-F) de PEI-methode voor het monteren van E. coli-cellen op de coverslip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Microscopiebeelden van VNp recombinante blaasjes. Groene (A) en rode (B) emissiebeelden van verschillende velden van FM4-64 gelabeld VNp6-mNeongreen-bevattende blaasjes gemonteerd op een agarose pad. (C) Beeldvorming van E. coli-cellen die het binnenmembraaneiwit CydB tot expressie brengen dat is gefuseerd met mNeongreen (groen) en VNp6-mCherry2 (magenta) toont de productie van blaasjes en het inbrengen van lading in levende bacteriële cellen. (A,B) werden in beeld gebracht met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop, terwijl (C) werd verkregen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM). Schaalstaven: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De amino-terminale peptide-gelabelde methode voor de productie van recombinante eiwitten zoals hierboven beschreven, is een eenvoudig proces, dat consequent grote hoeveelheden eiwit oplevert die efficiënt kunnen worden geïsoleerd en / of maandenlang kunnen worden opgeslagen.

Het is belangrijk om de belangrijkste stappen in het protocol te markeren die nodig zijn voor een optimaal gebruik van dit systeem. Ten eerste moet de VNp-tag1 zich op het N-eindpunt bevinden, gevolgd door het eiwit van belang en eventuele geschikte tags. Het is ook belangrijk om het gebruik van antibiotica te vermijden die zich richten op de peptidoglycaanlaag, zoals ampicilline.

In termen van groeiomstandigheden zijn rijke media (bijv. LB- of TB-media) en een hoge oppervlakte:volumeverhouding noodzakelijk om de blaasjesproductie te maximaliseren. De optimale temperatuur voor de productie van extracellulaire blaasjes is 37 °C, maar de voorwaarden die typisch vereist zijn voor de expressie van het eiwit van belang moeten ook worden overwogen. Voor lagere inductietemperaturen moet VNp6 worden gebruikt. Cruciaal is dat inductie van de T7-promotor moet worden bereikt met niet meer dan 20 μg / ml (84 μM) IPTG zodra de cellen een OD600 van 0,8-1,0 bereiken. Eiwitten die met behulp van het systeem tot expressie worden gebracht, bereiken de maximale blaasjesproductie na 4 uur of na inductie gedurende de nacht.

Ondanks de eenvoud van dit protocol, vereist het optimalisatie. VNp-variantfusie, expressietemperaturen en inductietijdsperioden kunnen verschillen, afhankelijk van het eiwit van belang. Bovendien is er behoefte aan het optimaliseren van de zuivering en daaropvolgende concentratie van extracellulaire blaasjes uit de media. De huidige procedure is niet schaalbaar en kan tijdrovend zijn. Dit zijn de beperkingen van deze methodologie.

De VNp-technologie heeft veel voordelen ten opzichte van traditionele methoden2. Het maakt de vesiculaire export van diverse eiwitten mogelijk, waarbij de maximale grootte die tot nu toe met succes is uitgedrukt 175 kDa is voor blaasjes die intern blijven en 85 kDa voor blaasjes die worden geëxporteerd. Bovendien kan deze technologie de opbrengst van recombinante eiwitten met een reeks fysieke eigenschappen en activiteiten aanzienlijk verhogen. Geëxporteerde blaasjes die het eiwit van belang bevatten, kunnen worden geïsoleerd door eenvoudige filtratie uit de vooraf gezuiverde media en kunnen vervolgens gedurende enkele maanden in steriele kweekmedia of buffer bij 4 °C worden bewaard.

De toepassingen voor dit systeem zijn divers, van ontdekkingswetenschap tot toegepaste biotechnologie en geneeskunde (bijvoorbeeld door de productie van functionele therapieën)3. Het gemak van productie, downstream verwerking en hoge opbrengst zijn allemaal aantrekkelijke kwaliteiten in deze gebieden en vooral in de industrie.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken diverse Twitter-gebruikers die vragen hebben gesteld over het protocol dat wordt gepresenteerd in het artikel dat de VNp-technologie beschrijft. Figuur 1A is gegenereerd met behulp van pictogrammen uit flaticon.com. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Kent en financiering van de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB / T008 / 768 / 1 en BB / S005544 / 1).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AmpicillinMelford69-52-3
ChloramfenicolAcros Organics (Thermofisher Scientific)56-75-7
E. coli BL21 (DE3)Lab StockN/A
E. coli DH10βLab StockN/A
Filters voor microscoopChroma
FM4-64Molecular Probes (Invitrogen)T-3166Opgelost in DMSO, stockconcentratie 2 mM
ImageJOpen SourceGedownload van: https://imagej.net/ij/index.html
Inverteer microscoopOlympus
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Melford367-93-1
Kanamycin sulfaatGibco (Thermofisher Scientific)11815-024
LED-lichtbron voor microscoopCairn Research Ltd
Lysogeniciteitsbouillon (LB) / LB-agarLab StockN/A10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Gistextract (1,5 g/L agar)
Metamorph-beeldvormingssoftwareMolecular Devices
MF-Millipore-membraanfilter (0,1 µm, MCE)MerckVCWP04700
Millipore Express PLUS-membraanfilter (0,45 µm, PES)MerckHPWP04700
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)Lab StockN/A
Plasmiden die expressie mogelijk maken van eiwit van belang met verschillende VNp-aminoterminale fusies Addgenehttps://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Broth (TB)Lab StockN/A12 g/L Tryptone; 24 g/L Gistextract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396(2023).
  2. Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32(2011).
  3. Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139(2019).
  4. Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
  6. Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
  7. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  8. Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257(2017).
  9. Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183(2019).
  10. Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Recombinante prote nevesikelsE coli expressievesikelproductieprote ne exportvesikelzuiveringfluorescentiemicroscopiegestructureerde illuminatiemicroscopiepeptide taggingprote neopslagdownstreamverwerking

Gerelateerde artikelen