Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65530

⸱

2 februari 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Cell Biology and Functional Genomics, 2Departments of Pediatrics, Naomi Berrie Diabetes Center, Obstetrics and Gynecology, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University Irving Medical Center, Columbia University, 3Department of Diabetes, Imperial College Healthcare NHS Trust, 4Faculté de Médicine, Université de Montréal, 5Lee Kong Chian Imperial Medical School, Nanyang Technological University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) kunnen differentiëren tot elk soort cel, waardoor ze een uitstekende alternatieve bron zijn van menselijke pancreas-β-cellen. hPSC's kunnen embryonale stamcellen (hESC's) zijn die zijn afgeleid van de blastocyst of geïnduceerde pluripotente cellen (hiPSC's) die rechtstreeks uit somatische cellen worden gegenereerd met behulp van een herprogrammeringsproces. Hier wordt een op video gebaseerd protocol gepresenteerd om de optimale kweek- en doorgangsomstandigheden voor hPSC's te schetsen, voorafgaand aan hun differentiatie en daaropvolgende generatie van insulineproducerende pancreascellen. Deze methodologie volgt het zesfasenproces voor β-cel gerichte differentiatie, waarbij hPSC's differentiëren in definitief endoderm (DE), primitieve darmbuis, achterste voordarmlot, pancreasvoorlopercellen, endocriene voorlopercellen van de pancreas en uiteindelijk pancreas-β-cellen. Het is opmerkelijk dat deze differentiatiemethode een periode van 27 dagen nodig heeft om menselijke pancreas-β-cellen te genereren. Het potentieel van insulinesecretie werd geëvalueerd door middel van twee experimenten, waaronder immunokleuring en glucosegestimuleerde insulinesecretie.

Inleiding

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) hebben het unieke vermogen om te differentiëren in verschillende celtypen, waardoor ze een levensvatbaar alternatief zijn voor menselijke pancreas-β-cellen. Deze hPSC's zijn onderverdeeld in twee typen: embryonale stamcellen (hESC's), afgeleid van de blastocyst2, en geïnduceerde pluripotente cellen (hiPSC's), gegenereerd door somatische cellen direct te herprogrammeren3. De ontwikkeling van technieken om hPSC's te differentiëren in β-cellen, heeft belangrijke implicaties voor zowel fundamenteel onderzoek als de klinische praktijk 1,4. Diabetes mellitus is een chronische ziekte die wereldwijd >400 miljoen mensen treft en het gevolg is van het onvermogen van het lichaam om glycemie te reguleren als gevolg van een storing of verlies van pancreas-β-cellen5. De beperkte beschikbaarheid van eilandjescellen van de alvleesklier voor transplantatie heeft de ontwikkeling van celvervangende therapieën voor diabetes belemmerd 2,4,6,7. Het vermogen om glucose-responsieve insuline-afscheidende cellen te genereren met behulp van hPSC's dient als een nuttig cellulair model voor het bestuderen van de ontwikkeling en functie van menselijke eilandjes. Het kan ook worden gebruikt om potentiële therapeutische kandidaten voor diabetesbehandeling in een gecontroleerde omgeving te testen. Bovendien hebben hPSC's het potentieel om eilandjescellen van de alvleesklier te produceren die genetisch identiek zijn aan de patiënt, waardoor het risico op immuunafstoting na transplantatie wordt verminderd 2,4,7.

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de verfijning van hPSC-kweek- en differentiatieprotocollen, wat heeft geresulteerd in een verhoogde efficiëntie en reproduceerbaarheid van het differentiatieproces voor het genereren van pancreas-β-cellen 8,9.

Het volgende protocol schetst de essentiële stadia van gerichte differentiatie van pancreas-β-cellen. Het gaat om de regulatie van specifieke celsignaleringsroutes op verschillende tijdstippen. Het is gebaseerd op het protocol ontwikkeld door Sui L. et al.10 (2018) voor het genereren van hPSC's in pancreas-β-cellen. Het protocol is aangepast aan recente updates van Sui L. et al.11 (2021), aangezien het laatste onderzoek het belang benadrukt van het gebruik van behandeling met aphidicolin (APH) om de differentiatie van β-cellen te verbeteren. Het huidige protocol omvat de toevoeging van APH aan het medium tijdens de latere stadia van het proces. Bovendien zijn er in de vroege stadia van differentiatie wijzigingen aangebracht in de samenstelling van het medium ten opzichte van het oorspronkelijke protocol. Een opmerkelijke verandering is de toevoeging van Keratinocyte Growth Factor (KGF) op dag 6 en doorgaan tot dag 8. De keratinocytgroeifactor (KGF) wordt geïntroduceerd van dag 6 tot dag 8, wat enigszins afwijkt van het oorspronkelijke protocol10, waar KGF niet was opgenomen in het stadium 4-medium.

De eerste en essentiële stap in de generatie van β-celachtige cellen is de gerichte differentiatie van hPSC's in definitief endoderm (DE), een primitieve kiemlaag die aanleiding geeft tot de epitheelbekleding van verschillende organen, waaronder de alvleesklier. Na de vorming van DE ondergaan de cellen differentiatie in de primitieve darmbuis, gevolgd door de specificatie van het achterste lot van de voordarm. De achterste voordarm ontwikkelt zich vervolgens tot voorlopercellen van de alvleesklier, die het potentieel hebben om te differentiëren in alle celtypen van de alvleesklier, inclusief de endocriene en exocriene cellen. De volgende fase in het proces omvat de endocriene voorlopercellen van de pancreas die aanleiding geven tot de hormoonafscheidende cellen die worden aangetroffen in de eilandjes van Langerhans. Uiteindelijk bereikt het differentiatieproces zijn laatste fase door volledig functionele pancreas-β-celachtige cellen te produceren 9,10. Het is belangrijk op te merken dat dit proces complex is en vaak optimalisatie van de kweekomstandigheden vereist, zoals specifieke groeifactoren en extracellulaire matrixcomponenten, om de efficiëntie en specificiteit van differentiatie te verbeteren 9,10. Bovendien is het in vitro genereren van functionele β-celachtige cellen uit hPSC's nog steeds een grote uitdaging. Lopend onderzoek richt zich op het verbeteren van differentiatieprotocollen en het verbeteren van de rijping en functie van de resulterende β-cellen9.

In dit protocol is het gebruik van zachte celdissociatie tijdens de kweek en passage van hPSC's essentieel om de levensvatbaarheid en pluripotentie van de cel te behouden, waardoor de efficiëntie van differentiatie in pancreas-β-cellen aanzienlijk wordt verbeterd. Bovendien is elk fasespecifiek medium zorgvuldig geoptimaliseerd volgens het protocol dat is ontwikkeld door Sui L. et al.10 om een hoge opbrengst van insuline-afscheidende cellen te bevorderen in clusters die sterk lijken op het menselijke eilandje.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alvorens met differentiatie te beginnen, wordt aanbevolen om het vereiste aantal eilandachtige organoïden voor experimentele doeleinden te bepalen. In een plaat met 6 putjes bestaat een enkele put met meer dan 80% confluentie doorgaans uit 2-2,3 miljoen hPSC's. Hoewel een nauwkeurige voorspelling een uitdaging is vanwege variaties in hPSC-lijnen en differentiatie-efficiëntie, is een ruwe schatting 1,5 keer het aantal initiële putten. Een effectief gerichte differentiatie levert gewoonlijk 1,6 tot 2 miljoen cellen per putje op in platen met zes putjes, die alle cellen binnen de clusters omvatten in plaats van uitsluitend insulineproducerende cellen. Voor een cluster van 50 μm kan het worden geschat op ongeveer 10.000 cellen. Tabel 1 geeft een samenvatting van de mediasamenstelling die wordt gebruikt voor elke dag/fase van gerichte differentiatie bovenop de stamcelmatrix en het medium, samen met de glucosegestimuleerde insulinesecretiebuffer.

1. Passerende menselijke pluripotente stamcellen voorafgaande differentiatie in 6 putplaten

OPMERKING: Het op de juiste manier passeren van menselijke stamcellen voorafgaand aan differentiatie in β-celachtige cellen is een cruciale stap bij het opzetten van het experimentele proces. Een onjuiste doorgang, verdunning of het aantal aanhechtingscellen kan de differentiatie-efficiëntie en getrouwheid in gevaar brengen.

  1. Bereid stamcelkweekmedium, coating- en dissociatieoplossingen (zoals gespecificeerd in tabel 1).
  2. Smeer 1-2 uur voor het passeren een plaat met zes putjes in met een koudcoatingoplossing (1 ml per putje) en incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
  3. Verwarm een hoeveelheid stamcelkweekmedium gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (15-25 °C).
  4. Zuig het stamcelmedium op en voeg 1 ml calcium/magnesiumvrije D-PBS toe.
  5. Herhaal stap 1.4. tweemaal.
    OPMERKING: D-PBS wordt toegevoegd om de cellen te wassen en het vorige medium en verbindingen te verwijderen. Het is belangrijk op te merken dat er geen specifiek tijdsbestek nodig is voor de wasstappen, aangezien blootstelling aan D-PBS de hPSC's niet schaadt, waardoor celbreuk of krimp veroorzaakt door osmose wordt voorkomen.
  6. Zuig D-PBS op, voeg 500 μL dissociatieoplossing toe voor elk putje en laat het 2-5 minuten bij kamertemperatuur (15 - 25 °C) staan.
  7. Terwijl de cellen dissociëren, zuigt u de coatingoplossing van de nieuwe plaat met 6 putjes op en voegt u 1-2 ml calcium/magnesiumvrije D-PBS toe aan elk putje.
  8. Controleer regelmatig het dissociatieproces onder de omgekeerde microscoop.
  9. Zuig de dissociatieoplossing op wanneer 80 - 90% van de cellen afgerond is maar nog steeds hecht.
  10. Voeg 1 ml van het stamcelmedium toe dat 10 μM ROCK-remmer bevat.
  11. Verzamel de gedissocieerde cellen in een conische buis van 15 ml met behulp van 1.000 μl steriel gefilterde pipetpunten en een P1000-pipet.
  12. Tritureer de celsuspensie langzaam op en neer in de pipet met een steriele pipetgefilterde punt van 1.000 μl om de kolonies te breken, maar niet meer dan 10 keer.
  13. Voeg 1 ml van het stamcelmedium met ROCK-remmer toe om de resterende hPSC's los te maken en breng de celsuspensie over naar hetzelfde conische buisje van 15 ml (1.10).
  14. Zuig de D-PBS op uit de nieuw gecoate plaat en voeg onmiddellijk de celsuspensie uit de conische buis van 15 ml toe. Om een optimale celgroei te garanderen, zaait u een bereik van 2 x 105- 1 x 106 levensvatbare cellen per put bij gebruik van een plaat met 6 putjes (1 op 10 tot 1 op 50 splitsingen).
    OPMERKING: Voor de volumeberekening moet elk putje van een plaat met 6 putjes 2 ml stamcelmedium met ROCK-remmer bevatten.
  15. Beweeg de plaat snel heen en weer en 5 - 10 keer heen en weer.
  16. Plaats de plaat gedurende 24 uur op 37 °C, 5% CO2 -incubator.
  17. Vervang de volgende dag door een vers stamcelmedium zonder ROCK-remmer en vervolgens om de 2 dagen totdat de samenvloeiing van hPSC's 80 - 95% heeft bereikt.

2. Van menselijke stamcellen afgeleide β-cellen gerichte differentiatie

OPMERKING: De hPSC's kunnen worden gebruikt voor het directe differentiatieproces in pancreas-β-cellen wanneer 80-95% confluentie is bereikt.

  1. Dag -1: Passaging van de cellen Dag -1 van differentiatie:
    1. Smeer 1-2 uur voor het passeren een plaat met 6 putjes in met een koudcoatingoplossing in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
    2. Volg stap 1.1 tot en met 1.10 en ga verder met het tellen van cellen.
    3. Vul 10 μL van het celmengsel, voeg een gelijk volume Trypan Blue toe en meng voorzichtig.
    4. Bereken de celconcentratie. Gebruik 0,8 × 106 cellen/ml - 1,0 x 106 cellen/ml stamcelmedium met 10 μM ROCK-remmer om de gecoate plaat met 6 putjes te bekleden met 2 ml media per putje.
    5. Beweeg de plaat snel heen en weer, drie keer heen en weer.
    6. Plaats de plaat in een incubator van 37 °C, 5% CO2 . Beweeg de plaat snel heen en weer en weer 10 keer heen en weer. Incubeer de plaat vervolgens gedurende 4 uur.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de maximale bevestiging en de gelijkmatige verdeling van de cellen de cellen niet verstoren door de plaat te verplaatsen zodra deze in de couveuse is geplaatst. Open en sluit de couveuse heel voorzichtig.
    7. Zet de fles basaal medium voor dag 0 tot 4 op 4 °C om het een nacht te ontdooien.
  2. Dag 0
    OPMERKING: De hPSC's moeten voor 80 - 95% confluent zijn, start het differentiatieproces naar definitief endoderm niet onder die confluentie.
    1. Ontdooi op ijs zowel het basale medium voor dag 0 tot 4 als supplementen (zie Tabel met materialen).
    2. Bereid in twee conische buisjes alleen het benodigde volume voor gebruik op dag 1 (2 ml per putje van een plaat met 6 putjes), en verdubbel in een apart buisje het volume voor dag 2,5 tot 4 (2 x 2 ml per putje van een plaat met 6 putjes). Bewaar de dag 2,5 tot dag 4 medium bij 4 °C.
    3. Verwarm een hoeveelheid van het benodigde volume van het medium dag 1 en wasmedium 1 gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C.
    4. Zuig het stamcelmedium op en voeg 2 ml wasmedium 1 toe.
      OPMERKING: Het wasmedium dat in het protocol wordt gebruikt, bestaat uit het basale medium dat specifiek is voor elke dag/fase, aangevuld met 1% antibiotica. De wasstappen van het protocol voor directe differentiatie omvatten alleen de toevoeging van het aangewezen wasmedium (aangeduid als "wasmedium 1 of 2", Materiaaltabel) en de daaropvolgende afzuiging, volgens de beschreven procedure 2.2.4. Het is belangrijk om te vermelden dat er geen specifiek tijdsbestek is aangegeven voor deze wasstappen.
    5. Zuig wasmedium 1 op en voeg onmiddellijk 2 ml van het Day 1 medium toe aan de zijkant van het putje.
    6. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
  3. Dag 1
    1. Verwarm een hoeveelheid van het benodigde volume van dag 2,5 tot 4 medium voor in een waterbad van 37 °C gedurende 5 minuten.
    2. Zuig het medium van dag 1 op en voeg onmiddellijk 2 ml van het medium van dag 2,5 tot 4 toe aan de zijkant van het putje. Was de cellen niet.
    3. Plaats de plaat terug op 37 °C en 5% CO2 gedurende 36 uur.
  4. Dag 2,5 tot 4
    1. Verwarm een aliquot van het resterende volume van de dag 2,5 tot 4 medium voor in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min.
    2. Zuig het medium op en voeg onmiddellijk 2 ml vers bereide dag 2,5 tot 4 medium toe aan de zijkant van het putje.
    3. Plaats de plaat terug op 37 °C en 5% CO2 gedurende 36 uur.
  5. Dag 4
    OPMERKING: In dit stadium is de expressie van de definitieve endodermmarkers maximaal en kunnen cellen primitieve darmbuisdifferentiatie initiëren.
    1. Bereid een aliquot van het benodigde volume van het primitieve darmmedium van dag 4 (2 ml per putje van een bord met zes putjes) en verwarm het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (15 °C -25 °C).
    2. Zuig dag 2,5 tot 4 medium op en voeg 2 ml wasmedium 1 toe.
    3. Zuig het wasmedium 1 op en voeg onmiddellijk 2 ml van de primitieve darmfase van dag 4 toe aan de zijkant van het putje.
    4. Plaats de plaat terug op 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
  6. Dag 6 t/m 8
    OPMERKING: In dit stadium initiëren de cellen verdere differentiatie op het lot van de achterste voordarm.
    1. Bereid het benodigde volume van dag 6 tot 8 achterste voordarmmedium (2 ml per putje van een bord met 6 wells) en verwarm het medium op kamertemperatuur (15 °C -25 °C) gedurende 20 min.
    2. Zuig het medium van dag 4 op en voeg onmiddellijk 2 ml van het medium van dag 6 tot 8 aan de zijkant van het putje toe.
    3. Plaats de plaat gedurende 48 uur op een incubator van 37 °C met 5% CO2 .
  7. Dag 8 t/m 12
    OPMERKING: De cellen zijn klaar om de differentiatie van voorlopers van de alvleesklier te ondergaan.
    1. Bereid het benodigde volume van dag 8 tot 12 pancreasvoorlopers stadium medium (2 ml per putje van een bord met 6 wells) en verwarm het medium op kamertemperatuur (15 °C -25 °C) gedurende 20 min.
    2. Aspireer dag 6 tot 8 medium en voeg onmiddellijk 2 ml van dag 6 tot 8 achterste voordarmmedium toe aan de zijkant van het putje.
    3. Plaats de plaat gedurende 48 uur in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 .
  8. Dag 12: Uitvoeren van de clustering stap
    OPMERKING: In dit stadium vormen de cellen een dichte monolaag en worden ze overgezet naar 3D-celkweek om clusters te vormen. Deze stap is cruciaal voor de differentiatie om de structurele gelijkenis van β-achtige cellen met inheemse menselijke eilandjes te verbeteren, maar verbetert ook hun functionele gelijkenis op zowel cellulair als clusterniveau11 (Figuur 1).
    1. Behandel een plaat met 6 putjes met microwells van 400 μm (zoals gespecificeerd in de materiaaltabel: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiation, dag 12) met 2 ml antikleefstofspoeloplossing bij kamertemperatuur (15 °C - 25 °C).
      OPMERKING: De microwell voorkomt dat cellen zich hechten aan de bodem van de put en vergemakkelijkt de mechanische vorming van 3D-clusters.
    2. Centrifugeerplaat op 1.300 x g gedurende 5 min.
    3. Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen onder een omgekeerde microscoop. Als er geen luchtbellen worden waargenomen, zuig dan de anti-kleefstofspoeloplossing op en voeg onmiddellijk 2 ml wasmedium 2 toe (Tabel met materialen).
    4. Herhaal stap 1.8.3. tweemaal.
    5. Bereid het benodigde volume van het clustermedium voor en verwarm het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (15 -25 °C). Zorg ervoor dat twee putjes van een plaat met 6 putjes in een putje van de 400 μm microwells 6-wells plaat gaan met 4 ml van het clustermedium.
    6. Aspireer het voorlopermedium van de alvleesklier op en voeg dissociatiebuffer toe (0,5 ml per putje).
    7. Incubeer bij kamertemperatuur (15 °C - 25 °C) gedurende 2-5 min. Controleer regelmatig het dissociatieproces onder een omgekeerde microscoop en aspireer de dissociatiebuffer wanneer de meeste cellen afgerond zijn maar nog steeds hechten.
    8. Zuig de dissociatiebuffer op en voeg onmiddellijk 1 ml clustermedium toe aan elk putje.
    9. Dissocieer cellen door zes keer zachtjes op en neer te pipetteren met behulp van een P1000-pipet en filtertips van 1.000 μl.
    10. Breng de cellen en het clustermediummengsel over in een conische buis van 50 ml.
    11. Voeg 1 ml van het clustermedium toe om alle resterende cellen te verzamelen.
    12. Voeg het clustermedium toe aan het totale benodigde volume, zodat elk putje van de microwellsplaat 4 ml mengselclustermedium/cellen bevat.
    13. Zuig het wasmedium 2 op uit de microwells-plaat met 6 putjes en breng de celsuspensie over. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
  9. Dag 13: Omgaan met de cellen na het clusteren en veranderen van hun media vanaf dag 13.
    OPMERKING: Clusters zijn zeer gevoelig en moeten zorgvuldig worden behandeld om hun integriteit en levensvatbaarheid in de volgende dagen te garanderen. Daarom is het van cruciaal belang om de clusters nauwlettend in de gaten te houden tijdens de periode na de clustering na dag 12. Regelmatige evaluatie en aanpassingen zijn essentieel om succesvolle resultaten in het experimentele proces te bevorderen.
    1. Bereid het benodigde volume van dag 13 medium (2 ml per putje van een plaat met 6 putjes) en in een aparte conische buis van 50 ml voor dag 15 tot 20 pancreas endocrien voorlopermedium.
    2. Verzamel langzaam clusters van de microwells-plaat met 6 putjes in een conische buis van 50 ml met behulp van een p1000-pipet en 1.000 μl gefilterde tips.
    3. Voeg 1 ml dag13 medium toe om de resterende clusters op te vangen en breng de clusters over in de buis.
    4. Laat de cellen gedurende 5 minuten op natuurlijke wijze onder de zwaartekracht op de bodem van de conische buis uitharden.
    5. Zuig zoveel mogelijk supernatans uit de buis zonder de celclusters te verstoren. De pipetpunten mogen de clusters niet raken of opzuigen, maar alleen het supernatans.
    6. Voeg het benodigde volume van dag 13-medium toe volgens het volgende: 1 putje microwells 6-wellsplaat gaat in drie putjes van een low-attachment 6-wells-plaat (2 ml media per putje).
    7. Pipeteer voorzichtig op en neer en vermijd het opzuigen van clusters.
    8. Breng de suspensie over naar een plaat met een zeer lage hechting van 6 putjes.
    9. Beweeg de plaat snel heen en weer, zes keer heen en weer.
    10. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C.
    11. Voer de mediumwijzigingen uit in alle volgende stappen tot het einde van de differentiatie zoals beschreven in deze paragraaf 2.9.
  10. Dag 15 tot 20
    1. Schakel elke 48 uur over op endocriene voorlopercelmedium van de pancreas tot dag 21 van differentiatie door de celsuspensie op te vangen in een conische buis van 50 ml en de stappen 2.9.4 tot 2.9.10 te volgen voor dag 13.
  11. Dag 21 t/m 27
    OPMERKING: In dit stadium differentiëren clusters op pancreas-β-cellen.
    1. Bereid pancreas- β celstadium medium voor.
    2. Vervang het medium om de dag zoals beschreven voor dag 15 tot 21.
      OPMERKING: Na dag 25 kunnen de eilandachtige organoïden een analyse ondergaan om te bevestigen dat ze volledig functioneel zijn.

3. Kleuring van pancreas-β-celclusters

OPMERKING: Voer deze stap uit om de functionele beoordeling van clusters na differentiatie te bestuderen

  1. Verzamel vijf tot tien clusters in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml aan het einde van de differentiatie.
  2. Fixeer de celclusters met 200 μL 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 1 ml PBS toe aan de clusters en verwijder de PBS met een pipetpunt van 1.000 μl zonder de clusters te verstoren.
  4. Voeg 200 μL 30% sucrose toe aan de trossen en incubeer een nacht bij 4 °C.
  5. Breng de clusters over naar een cryomal, verwijder extra sucrose, voeg een druppel O.C.T. medium toe en meng de clusters met O.C.T. medium.
  6. Vries de cryomal in op droogijs en bewaar bij -80 °C.
  7. Snijd secties van 5 μm uit het bevroren blok op microscoopglaasjes met behulp van een microtoom/of cryostaat.
  8. Bewaar glaasjes bij -80 °C in de vriezer tot ze vlekken vertonen.
  9. Haal de glaasjes op de dag van het kleuren uit de vriezer van -80 °C.
  10. Verwijder voorzichtig het ijs rond de secties van de cryomold.
  11. Omcirkel celclusters op objectglaasjes met een hydrofobe pen.
  12. Rehydrateer de glaasjes gedurende 15 minuten in een glaasjeskleurpot met PBS.
  13. Voeg koude methanol toe aan de glaasjeskleurpot en plaats de pot met glaasjes gedurende 10 minuten op -20 °C.
  14. Dompel dia's onder in een PBS-pot.
  15. Herhaal stap 3.14 drie keer.
    NOTITIE: Gebruik deze methode voor alle volgende wasstappen.
  16. Verwijder PBS van de objectglaasjes en dek onmiddellijk af met 100 μL blokkeringsoplossing met 2-5% BSA in PBS-T.
  17. Voeg blokkeeroplossing toe aan elk glaasje en dek af met paraffinefolie.
  18. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (15 -25 °C).
  19. Verdun de primaire antilichamen in de blokkerende oplossing met behulp van de verhoudingen in de sectie Reagentia en oplossingen.
  20. Verwijder de blokkerende oplossing van de objectglaasjes.
  21. Voeg onmiddellijk verdunde antilichamen toe en bedek de objectglaasjes met parafilm om te voorkomen dat het objectglaasje uitdroogt.
  22. Incubeer een nacht bij 4 °C.
  23. Was de objectglaasjes de volgende dag 3 - 5 keer met PBS-T.
  24. Bereid verdunde secundaire antilichamen en DNA-kleuring voor.
  25. Verwijder overtollige PBS-T van de objectglaasjes.
  26. Voeg verdunde secundaire antilichamen en DNA-kleuring toe. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (15 -25 °C).
  27. Was de glaasjes 3 - 5 keer met PBS-T.
  28. Verwijder eventuele vloeistof van de glaasjes.
  29. Voeg een druppel histologie-montagemedium toe aan elke sectie.
  30. Bedek de dia met een glazen afdekking.
  31. Maak foto's van gekleurde objectglaasjes met een fluorescerende microscoop.

4. GSIS (glucose-gestimuleerde insulinesecretietest)

  1. Bereid drie verschillende oplossingen voor: KREBS-oplossing met lage glucose, KREBS-oplossing met hoge glucose en KREBS-oplossing met lage glucose met KCl.
  2. Verwarm alle oplossingen in een waterbad van 37 °C.
  3. Selecteer zorgvuldig ongeveer 10 - 15 clusters van vergelijkbare grootte met behulp van een pipetpunt van 1000 μl en breng ze over in een buisje van 1,5 ml samen met een kleine hoeveelheid gedifferentieerd medium om uitdroging van de clusters te voorkomen.
    NOTITIE: De clusters moeten met het blote oog zichtbaar zijn, maar als dat niet het geval is, plaatst u de plaat met gedifferentieerde clusters onder een omgekeerde microscoop om de clusters te selecteren en over te brengen naar een buisje van 1.5 ml.
  4. Plaats de buis met clusters en medium op een buizenrek en wacht tot de clusters naar de bodem van de buis zijn gezakt.
  5. Zuig het supernatans langzaam op met een pipet van 200 μl en voeg 200 μl KREBS-oplossing met lage glucose toe.
  6. Incubeer de eilandjes gedurende 1 uur bij 37 °C in de lage-glucoseoplossing.
    OPMERKING: Om een nauwkeurige beoordeling van het aantal clusters en de consistentie in experimenten te garanderen, is het raadzaam om tijdens de overdracht te controleren op de aanwezigheid van alle clusters in de oplossing, aangezien deze de neiging hebben zich aan de buis te hechten.
  7. Haal de buis uit de incubator en zuig langzaam 200 μL KREBS-oplossing op zonder clusters op te zuigen.
  8. Voeg 200 μl KREBS-oplossing met lage glucose toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  9. Zuig het volume van 200 μl KREBS-oplossing met lage glucose op in een buis van 500 μl en bewaar deze onmiddellijk bij -80 °C voor insulinemetingen. Herhaal dit voor afzonderlijke behandelingen.
  10. Om de clusters te wassen, voegt u 200 μL KREBS-oplossing zonder glucose toe aan het buisje met de clusters. Laat de clusters naar de bodem van de buis zakken en verwijder voorzichtig het supernatans zonder de clusters te verstoren.
  11. Voeg 200 μl KREBS-oplossing met een hoog glucosegehalte toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  12. Zuig 200 μL KREBS met een hoge glucose op in een buis van 500 μL en bewaar deze onmiddellijk bij -80 °C voor insulinemeting. Herhaal dit voor afzonderlijke behandelingen.
  13. Om de clusters te wassen, voegt u 200 μL KREBS-oplossing zonder glucose toe aan het buisje met de clusters. Laat de clusters naar de bodem van de buis zakken en verwijder voorzichtig het supernatans zonder de clusters te verstoren.
  14. Voeg 200 μL KCl KREBS-oplossing toe en herhaal dit voor afzonderlijke behandelingen.
  15. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  16. Zuig 200 μL KCl KREBS-oplossing op in een buis van 500 μl en bewaar deze onmiddellijk bij -80 °C voor insulinemetingen. Herhaal dit voor andere behandelingen.
  17. Voeg 50 μL ultrapuur water toe en ga verder met het meten van het totale insulinegehalte.
  18. Voeg 150 μL zure ethanoloplossing toe aan de buis met eilandjes en ultrapuur water.
  19. Bewaar de monsters 's nachts (12 - 15 uur) bij 4 °C.
  20. De volgende dag, draai elk monster.
  21. Voer sonicatie uit met een elektrische sonicator die gedurende 1 s op 20% vermogen is ingesteld om volledige lysis van het eilandjesweefsel te garanderen.
    OPMERKING: Herhaal stap 4.21 totdat er geen clusters meer zichtbaar zijn.
  22. Centrifugeer alle monsters gedurende 10.000 × g gedurende 10 minuten en bewaar de supernatant.
  23. Meet de DNA-concentratie met behulp van een nanodruppelspectrofotometer, die vervolgens kan worden gebruikt om insulinemetingen te normaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, biedt een zeer efficiënte aanpak voor het onderscheiden van β-achtige cellen van hPSC's10. Dit proces maakt gebruik van een 2D-kweeksysteem dat gemakkelijk schaalbaar is, waardoor het kan worden gebruikt in verschillende experimentele omgevingen, zoals leerdifferentiatie, kleinere projecten en laboratoria, en pilottests om het potentieel van een iPSC-lijn voor differentiatie te beoordelen.

Het is essentieel om de functio...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De succesvolle differentiatie van hPSC's in pancreas-β-cellen hangt af van het optimaliseren van alle aspecten van routinematige kweek en passage van de geselecteerde hPSC's. Dit houdt onder meer in dat ervoor moet worden gezorgd dat de cellijn een normaal karyotype heeft, negatief is voor mycoplasma-infectie en vrij is van plasmide- of virale vectorgenomen. Bovendien is het bij het gebruik van hiPSC's belangrijk om te voorkomen dat de vroegste passage, die nog wordt geherprogrammeerd, wordt gebruikt voor proefexperiment...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Ines Cherkaoui werd ondersteund door een Diabetes UK studentship (BDA 18/0005934) aan GAR, die ook de Wellcome Trust bedankt voor een Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC voor een programmasubsidie (MR/R022259/1), Diabetes UK voor projectsubsidie (BDA16/0005485), CRCHUM voor startfondsen, Innovation Canada voor een John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) voor een projectsubsidie, en CIHR, JDRF voor een teamsubsidie (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion en Dr. Harry Leitch voor hun hulp bij het genereren en kweken van menselijke hiPSC's, de NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid-faciliteit, Londen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016Voor wasmedium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 in koud DMEM/F-12-medium om een uiteindelijke verdunning van 1:100 te verkrijgen.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036Voor wasmedium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Ontdooi het StemFlex-supplement een nacht bij 4°C, breng eventueel overgebleven vloeistof van de supplementfles over naar StemFlex-basismedium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

Referenties

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  4. Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
  5. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
  6. Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
  7. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  8. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
  9. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
  10. Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68(2018).
  11. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).
  12. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  13. Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
  14. Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
  15. Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Pancreatische bètacellenbètaceldifferentiatiedefinitief endodermpancreatische progenitorenglucosegestimuleerde insulinesecretieimmunofluorescentie-imagingcelpassageROCK-remmer
Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.