Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65589

⸱

12 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In dit artikel

Samenvatting

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Samenvatting

Histon-eiwitten zijn zeer overvloedig aanwezig en geconserveerd onder eukaryoten en spelen een grote rol bij genregulatie als gevolg van structuren die bekend staan als posttranslationele modificaties (PTM's). Door de positie en aard van elke PTM of elk patroon van PTM's te identificeren met betrekking tot externe of genetische factoren, kan deze informatie statistisch worden gecorreleerd met biologische reacties zoals DNA-transcriptie, replicatie of reparatie. In dit werk wordt een high-throughput analytisch protocol beschreven voor de detectie van histon-PTM's uit biologische monsters. Het gebruik van complementaire vloeistofchromatografie, spectrometrie voor de mobiliteit van ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) maakt het mogelijk om de biologisch meest relevante modificaties in één enkele analyse te scheiden en PTM-toe te wijzen. De beschreven aanpak maakt gebruik van recente ontwikkelingen op het gebied van afhankelijke data-acquisitie (DDA) met behulp van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en door botsingen geïnduceerde dissociatie. Histone PTM's worden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatiepatroon.

Inleiding

In eukaryote cellen wordt DNA verpakt als chromatine in functionele eenheden die nucleosomen worden genoemd. Deze eenheden zijn samengesteld uit een octameer van vier kernhistonen (twee elk van H2A, H2B, H3 en H4)1,2,3,4. Histonen behoren tot de meest voorkomende en best geconserveerde eiwitten in eukaryoten, die grotendeels verantwoordelijk zijn voorgenregulatie5. Histon posttranslationele modificaties (PTM's) spelen een grote rol bij de regulatie van chromatinedynamiek en voeren verschillende biologische processen uit, zoals DNA-transcriptie, replicatie en reparatie6. PTM's komen voornamelijk voor op het toegankelijke oppervlak van de N-terminale gebieden van histonen die in contact staan met DNA 3,7. Staart- en kernmodificaties beïnvloeden echter de chromatinestructuur, veranderen internucleosoominteracties en rekruteren specifieke eiwitten 3,8.

Een huidige uitdaging tijdens proteomics op basis van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) is de potentiële co-elutie van interessante analyten. In het geval van data-afhankelijke analyses (DDA) vertaalt dit zich in het potentiële verlies van verschillende precursorionen tijdens het MS/MS-acquisitieproces9. Time-of-flight (ToF)-instrumenten verwerven spectra met een zeer hoge frequentievan 9,10 (tot tientallen kHz)11; dit maakt ze in staat om snel de totale precursorionen in een complex monster (MS1) te scannen, waardoor ze een optimale gevoeligheid en MS/MS-sequentiesnelheden (tot 100 Hz)9 beloven en ideaal zijn voor biologische monsteranalyse10. Desalniettemin wordt de gevoeligheid die beschikbaar is bij deze hoge scansnelheden beperkt door de MS/MS-snelheid9. De toevoeging van trapped ion mobility spectrometry (TIMS) in combinatie met een orthogonale quadrupole time-of-flight (qToF) massaspectrometer werd gebruikt om deze beperkingen te verminderen. In TIMS worden alle voorloperionen in tandem geaccumuleerd en geëlueerd als functie van hun mobiliteit, in plaats van enkele voorlopermassa's te selecteren met een quadrupool9. Parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (PASEF) maakt honderden MS/MS-gebeurtenissen per seconde mogelijk zonder verlies van gevoeligheid9.

Het hoofddoel van dit werk was om de recente ontwikkelingen van DDA te laten zien met behulp van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID). Histone PTM's werden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijden (RT's), mobiliteit en fragmentatiepatronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Histon-monsters werden geëxtraheerd met behulp van een methode die is aangepast aan Bhanu et al. (2020)12.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Oogsten van gekweekte cellen
    1. Wanneer cellen voor 80% samenvloeien, zorg er dan voor dat ze levensvatbaar zijn met behulp van trypanblauwe uitsluiting.
      OPMERKING: Voor deze experimenten werd een HeLa S3-cellijn gebruikt, maar deze methode kan op alle gekweekte cellen worden toegepast.
    2. Zuig het medium op en breng vervolgens 5 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan op elke plaat.
    3. Draai de plaat(en) rond om alle resterende media te spoelen, zuig vervolgens PBS op en breng 5 ml 1x PBS aan.
    4. Scheid de cellen voorzichtig van de plaat door ze te schrapen met een wegwerpcelheffer.
    5. Breng elke celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
    6. Pelleteer de cellen door ze gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 800 x g .
    7. Zuig de PBS op uit de celkorrel.
    8. Ga verder met histonextractie.
      NOTITIE: Vries de celpellet snel in vloeibare stikstof in als deze niet onmiddellijk kan worden verwerkt. Bewaar de pellets bij -80 °C tot ze klaar zijn om verder te gaan.
  2. Histon-extractie
    1. Schat het volume van elke celkorrel en markeer de meniscus met een permanente marker.
    2. Bereid voldoende nucleaire isolatiebuffer (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 en 250 mM sucrose) voor alle monsters. Als er in de loop van de tijd veel monsters moeten worden verwerkt, kunt u de buffer in bulk maken en gedurende maximaal 6 maanden bij 2-8 °C bewaren, of aliquot en voor onbepaalde tijd invriezen bij -15 °C tot -25 °C door alleen de hoeveelheid te ontdooien die nodig is voor elke extractie.
      NOTITIE: De buffer moet vrij blijven tijdens opslag. Als de buffer er op enig moment troebel of anderszins abnormaal uitziet, gooi deze dan weg en bereid een nieuwe buffer voor.
    3. Bereid 50 keer het volume van de celpellets wasbuffer en voeg als volgt remmers toe (ongeveer 10 ml wasbuffer per 2 monsters).
      1. Om 10 ml wasbuffer te bereiden, mengt u 10 ml NIB, 30 μl 200 mM 4-(2-aminoethyl)benzeensulfonylfluoridehydrochloride [AEBSF], 10 μL 1 M dithiothreitol [DTT], 20 μL 5 μM microcystine, 20 μL 5 M natriumbutyraat.
    4. Verwijder 1/5 van de wasbuffer om de lysisbuffer voor te bereiden (1/5 volume van de wasbuffer, 0,3% NP-40 of NP-40 alternatief).
      NOTITIE: Gebruik Triton-X 100 niet in plaats van NP-40 of NP-40 alternatief, omdat dit te schurend kan zijn voor bepaalde celtypes.
    5. Was de celpellet grondig door deze in 5 kolommen wasbuffer te suspenderen en gedurende 5 minuten bij 4 °C te centrifugeren op 800 x g . Voer deze stap twee keer uit, waarbij u het supernatans tussen de wasbeurten opzuigt en weggooit.
    6. Zorg ervoor dat het volume van de celpellet nog steeds is gemarkeerd met een permanente marker. Resuspenderen in 10 volumes lysisbuffer.
    7. Pipet-meng elke pellet grondig om te resuspenderen en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten op ijs.
    8. Centrifugeer na 15 minuten bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    9. Aspireer en gooi de supernatant weg.
      NOTITIE: De pellet moet worden verkleind tot ≤ 1/2 van de oorspronkelijke pelletgrootte (zoals aangegeven door de markeringslijn). Als de pellet niet voldoende is ingekookt, herhaalt u de lysisprocedure en neemt u een zachte homogenisatiestap op met behulp van een stamper om de cellen open te breken.
    10. Zodra de lysis is voltooid, resuspendeert u de pellet in 500 μL wasbuffer en centrifugeert u vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 800 x g . Zuig het supernatant op en gooi het weg, en herhaal de wasstap nogmaals om alle sporen van NP-40 te verwijderen.
      OPMERKING: Op dit punt bestaat de pellet uit chromatine, dat histonen bevat.
    11. Resuspendeer de pellet in 5 delen (van de oorspronkelijke celpelletgrootte) van 0,4 N H2SO4.
    12. Incubeer gedurende 2 uur in een koelruimte of koelkast met behulp van een roerwerk.
    13. Centrifugeer het (de) monster(s) na 2 uur bij 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant niet weg.
    14. Breng het supernatans over in nieuwe buisjes en verhoog 100% trichloorazijnzuur (TCA) tot 1/3 van het volume van de inhoud (de uiteindelijke TCA-concentratie zal ongeveer 20% zijn).
    15. Keer de buis voorzichtig om en merk op dat de heldere, kleurloze oplossing wit en/of troebel wordt, wat wijst op eiwitneerslag.
      OPMERKING: Voor oplossingen met lage histonconcentraties is de eiwitneerslag mogelijk niet onmiddellijk merkbaar, maar het neerslag moet zichtbaar zijn na de nachtelijke incubatie.
    16. Incubeer 's nachts (12-18 uur) ongestoord bij 4 °C om de histon-eiwitten volledig neer te slaan.
    17. De volgende dag centrifugeren bij 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    18. Zuig het supernatant op en zorg ervoor dat u de zijkanten van het buisje niet aanraakt met de pipetpunt. In dit stadium worden de histonen voornamelijk als een film rond de zijkanten van de buis(en) afgezet.
    19. Voeg 500 μL ijskoude aceton + 0,1% HCl (zure aceton) toe aan elk buisje met behulp van een glazen pasteurpipet en keer de buis(jes) vervolgens voorzichtig een paar keer om. Schik de monsters in volgorde (1, 2, 3, enz.) terwijl u dit doet, aangezien elke afwijkende aceton de markeringen op de buizen kan verwijderen. Centrifugeer op 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer het supernatant voorzichtig.
    20. Herhaal deze spoelstap met 500 μL ijskoude 100% aceton, ook met een glazen Pasteurpipet. Centrifugeer op 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer het supernatant voorzichtig.
    21. Laat de tubes open drogen bij kamertemperatuur totdat de resterende aceton is verdampt.
    22. Als het droog is, voeg je 100 μL water van massaspectrometrie (MS) toe aan elke buis. Gebruik deze druppel om alle kanten van de container schoon te vegen om de hele histonfilm opnieuw te suspenderen. Doe dit door de druppel op de zijkant van de buis te pipetteren en deze tijdens het pipetteren op en neer te draaien of de helft van de 100 μL te doseren en de punt te gebruiken om het rondom te roeren. Een combinatie van beide methoden werkt het beste. Histonen zijn gemakkelijk oplosbaar in water en zullen in de oplossing zitten.
    23. Na het resuspenderen van alle monsters, als er nog witte vaste stof over is, sonicaat dan gedurende 5 minuten in een bad bij kamertemperatuur.
    24. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng de heldere oplossing over in verse tubes. Gooi alle resterende onoplosbare pellets weg.
    25. Voer een SDS-PAGE uit onder reducerende omstandigheden om te controleren of de extractie schoon is.
      OPMERKING: Gels kunnen worden gebruikt met elke geschikte concentratie polyacrylamide, zolang het eiwitten kan differentiëren in het bereik van 10-20 kDa. Zie de materiaaltabel voor de gels die in dit protocol worden gebruikt.
    26. Voer een eiwitconcentratietest uit (d.w.z. Bradford of BCA) om de totale eiwitconcentratie te bepalen.
  3. Chemische derivatisering (propionylering) van de lysineresiduen
    1. Breng 20 μg histonen (bepaald door de eiwittest) over in een schone buis. Droog dit monster tot <5 μl met behulp van een vacuümconcentrator en resuspendeer vervolgens met 20 μl 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH4CO3) (~1 μg/μl-oplossing). Pas de pH indien nodig aan op ~8 met behulp van ammoniumhydroxide.
      LET OP: Gebruik geen ammoniumhydroxide (NH4OH) om te resuspenderen, alleen om de pH indien nodig aan te passen. Anders zullen eiwitten denatureren en neerslaan.
      OPMERKING: Om de pH te controleren met minimaal monsterverlies, gebruikt u een pipetpunt om het monster in te dompelen en op een pH-strip te deppen. Deze testprocedure zal nuttig zijn tijdens de resterende stappen van de monstervoorbereiding.
    2. Bereid het propionyleringsreagens voor door propionzuuranhydride toe te voegen aan acetonitril (ACN) in een verhouding van 1:3 (v/v) (d.w.z. om 40 μL reagens te maken, combineer 10 μL propionzuuranhydride met 30 μL ACN).
      OPMERKING: Traditioneel worden methanol of isopropanol gebruikt bij de bereiding van een propionyleringsreagens. Aangezien propionylering een amidevormingsreactie is, is een niet-protonisch oplosmiddel, zoals acetonitril, nodig om ongewenste bijproducten en reacties, zoals methylpropionylester, die het gevolg zijn van het gebruik van methanol, te voorkomen. Bereid alleen voldoende propionyleringsreagens voor maximaal 4 monsters tegelijk, zodat het reagens vers blijft. Gebruik het reagens binnen 1-2 minuten na bereiding. Terwijl het reagens zit, zal het propionzuuranhydride reageren met omgevingsvocht en zal azijnzuur zich beginnen te vormen, wat de effectiviteit van het reagens kan veranderen en de pH van de histonoplossing kan veranderen zodra het reagens is toegevoegd.
    3. Voeg propionyleringsreagens toe aan elk monster in een 1:4 (v/v) (d.w.z. voeg voor 20 μL histonen 5 μL propionyleringsreagens toe).
    4. Voeg snel 1:5 (v/v) NH4OH toe (d.w.z. voeg 4 μL toe voor 20 μL histonoplossing) om de pH van de oplossing te herstellen tot ~8. Als de pH nog steeds te laag is, voeg dan 1-2 μL NH4OH per keer toe tot een pH van 8 is bereikt. Doorgaans is een verhouding van 1:5 (v/v) voldoende.
    5. Incubeer de monsters ongestoord gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Herhaal de propionyleringsreactie voor niet meer dan 3-4 monsters per batch propionyleringsreagens om minimale zuurvorming te garanderen.
    7. Herhaal de stappen 1.3.2-1.3.5 van de propionyleringsprocedure. Een tweede propionyleringsronde zorgt ervoor dat >95% van de beschikbare lysines wordt gederivatiseerd.
    8. Droog de monsters tot <5 μL met behulp van een vacuümconcentrator. Hierdoor verdampt elk niet-gereageerd propionyleringsreagens, zure producten en ammoniakgas dat vrijkomt uit de NH4OH. Als de monsters volledig uitdrogen, is dit prima, omdat er geen significante monsterverliezen optreden.
      NOTITIE: Vervang de lucht in de propionzuuranhydridefles met argongas voordat u deze opbergt om de vorming van azijnzuur te voorkomen als gevolg van contact met omgevingsvocht dat in de fles achterblijft.
  4. Proteolytische vertering met trypsine
    1. Resuspendeer histonen in 100 mM NH4HCO3 om een volume van 20 μL te bereiken, waarbij een optimale concentratie van 1 μg/μL wordt bereikt.
      OPMERKING: Monsteroplossingen met concentraties lager dan 1 μg/μL zullen resulteren in een verminderde trypsine-efficiëntie.
    2. Voeg trypsine toe aan histonmonsters in een verhouding van 1:10 (gew./gewicht) (d.w.z. voeg 2 μL 1 μg/μL-oplossing trypsine toe aan 20 μg histonen).
    3. Incubeer reacties bij 37 °C gedurende 6-8 uur. U kunt ook een nacht (12-18 uur) bij kamertemperatuur incuberen.
    4. Stop de spijsvertering door minimaal 1 uur in te vriezen bij -80 °C.
      OPMERKING: Gebruik geen zuur om de verteringsreactie te doven, omdat dit op dit punt in de procedure een ongewenste daling van de pH zal veroorzaken. Het monster kan bij -80 °C worden bewaard totdat het klaar is om verder te gaan (tussenstoppunt).
  5. Chemische derivatisatie (propionylering) van peptide N-terminals
    1. Droog de monsters tot <5 μL met behulp van een vacuümconcentrator.
    2. Resuspendeer de monsters tot 20 μL (1 μg/μL) met behulp van 100 mM NH4HCO3.
    3. Herhaal de propionylering zoals eerder (stap 1.3).
      OPMERKING: Het is normaal dat de monsters in deze stap langer nodig hebben om te drogen vanwege een hogere verhouding waterig: organische fase.
  6. Monster ontzouten met stage-tips
    1. Resuspendeer of verdun monsters met 50 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA.
    2. Gebruik een 11-G-monsterboor om 5 schijvenC18-materiaal uit een vastefase-extractieschijf te ponsen (pons alle 5 schijven voordat u ze naar de pipetpunt overbrengt). Plaats de schijven en zorg ervoor dat ze stevig en gelijkmatig aan de onderkant van een pipetpunt van 200 μl zijn geklemd (Figuur 1).
      OPMERKING: Gebruik een boor van 15 G als u meer dan 25 μg monster ontzoutt via een enkele trapstip.
    3. Gebruik een centrifuge-adapter om de stage-tips op hun plaats te houden in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml of 2 ml.
      NOTITIE: Gebruik voor de volgende centrifugeerstappen een langzame omwenteling (400-500 x g) bij 4 °C, gedurende 1-2 minuten per keer; de oplosmiddelen gaan normaal gesproken in minder dan 1 minuut door de hars, afhankelijk van hoe strak het C18-materiaal in de uiteinden is verpakt.
    4. Spoel de hars af door te centrifugeren met 50 μL 100% acetonitril om hetC18-materiaal te activeren en mogelijke verontreinigingen te verwijderen.
      OPMERKING: Het kan gemakkelijker zijn om oplossingen op de objectiscooppunten te plaatsen met behulp van gel-ladende pipetpunten. Zodra het C18-materiaal is geactiveerd, is het belangrijk om de hars niet te laten uitdrogen tijdens de duur van de ontziltingsprocedure.
    5. Breng het schijfmateriaal in evenwicht met 80 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA door centrifugeren.
    6. Verzuur het monster tot pH 4 of lager met ijsazijn. Controleer de pH met pH-strips zoals voorheen om monsterverlies tot een minimum te beperken.
    7. Laad het hele monster op de harsschijf door langzaam te centrifugeren.
    8. Was het monster met 80 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA door centrifugeren.
    9. Eluer het monster in een schoon buisje van 1,5 ml door 70 μl 75% acetonitril en 0,5% azijnzuur langzaam te centrifugeren. Extra centrifugatietijd kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het volledige monstervolume uit de punt van de trap wordt geëlueerd. Het is niet erg als de hars uitdroogt met de extra centrifugeertijd, omdat het niet langer nodig is na de elutie van het monster.
    10. Droog elk monster volledig in een vacuümconcentrator.
      OPMERKING: Monster(s) kunnen worden bewaard bij -80 °C totdat ze klaar zijn om verder te gaan (tussentijds stoppunt).
    11. Voor LC-MS/MS-analyse reconstitueert u de monsters in een volume oplosmiddel A (0,1% mierenzuur) uit het vloeistofchromatografieprotocol (LC) dat de uiteindelijke concentratie van 0,4 μg/μl oplevert (d.w.z. 20 μg histonen oplossen in 50 μl oplosmiddel A).

2. TIMS-software-interface

  1. Selecteer het tabblad Instrument en schakel over naar Bedienen (controleer of de naam van het instrument groen wordt gemarkeerd) (Figuur 2).
  2. Controleer de TIMS-parameters (Afbeelding 2).
  3. Controleer de MS-instellingen (scannen beginnen, scannen beëindigen, ionenpolariteit, scanmodus) (Figuur 2).
  4. Controleer de TIMS-instellingen (modus, mobiliteitsstart, mobiliteitseinde, aanlooptijd, accumulatietijd, inschakelduur, aanloopsnelheid, MS-snelheid, MS-middeling en automatische kalibratie) (Figuur 2).
  5. Ga naar het tabblad Bron en activeer de spuitoptie (Hamilton 500 μL) alleen voor de TuneMix-kalibratiestap (Figuur 3)13.
  6. Ga naar het tabblad Kalibratie , klik op m/z, selecteer Kalibratiemodus en kies de modus (meestal Enhanced Q), zoom (+0.01%) STD Dev (0.24) en klik op Kalibreren; wanneer een score van 100% is behaald, accepteer dan (Figuur 4).
  7. Ga naar het tabblad mobiliteit en herhaal het kalibratieproces (lineaire modus, over het algemeen), detectiebereik (+5%), breedte (0.1 Da), STD Dev (0.1855) en klik vervolgens op kalibreren; wanneer u een score ≥ 98,5% krijgt, accepteert u (Figuur 5).
  8. Ga naar de methode en selecteer de methode die u wilt gebruiken; voor dit voorbeeld is Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl geselecteerd (Afbeelding 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

  1. Gebruik de typische nESI-bedrijfsomstandigheden: capillaire spanning van 4500 V, offset van de eindplaat van 800 V, druk van de vernevelaar van 3,0 bar, droog gas van 10,0 l/min, droge verwarming van 200 °C en injectiedebiet van 50 μl/min.
  2. Gebruik de typische MS-instellingen: 6 eV botsingsenergie, 1200 Vpp botsings-RF, 75 μs overdrachtstijd, 5 μs prepulsopslag.
  3. Bepaal de drijfgasstroom aan de hand van het drukverschil tussen de ingangstrechter P1 en de uittrederechter P2. Parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (PASEF) vindt plaats in de TIMS-cel, waarbij alle precursorionen tegelijkertijd worden geaccumuleerd in plaats van afzonderlijk. Precursorionen komen dan vrij in smalle ionenpieken versus de normaal veel bredere pieken (ongeveer 50 keer korter), waardoor de signaal-ruisverhouding toeneemt terwijl co-eluerende peptiden nog steeds worden gescheiden via mobiliteit14.
  4. Ontwikkel een LC-TIMS-ToF MS/MS-methode voor het analyseren van proteolytische histonpeptiden. Koppel een high-performance vloeistofchromatograaf (HPLC) uitgerust met een C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) kolom aan een commercieel TIMS-TOF MS-instrument met gepatenteerde PASEF-technologie.
    OPMERKING: Deze kolomgrootte is vastgesteld om een goede scheiding te bieden bij zowel hoge als lage pH voor peptidemengsels, op basis van eerder gepubliceerde werken 15,16,17.
    1. Stel het injectievolume in op 20 μl (8 μg) monster en een stroomsnelheid van 0,4 ml/min.
    2. Voer een niet-lineaire LC-gradiënt van 60 minuten uit met water met 0,1% mierenzuur (oplosmiddel A) en acetonitril met 0,1% mierenzuur (oplosmiddel B). Stel de helling in: 10% B gedurende 2,7 min, dan naar 20% B in 5,3 min, 28% B in 4 min, 35% B in nog eens 18 min, naar 40% B in 13 min, en 100% B in nog eens 2 min. Nadat je 100% B 5 minuten hebt vastgehouden, verlaag je de concentratie tot 10% B in 5 minuten en houd je deze de laatste 5 minuten vast.
  5. Controleer de monsterelutie van de HPLC in de TIMS-TOF via nano-elektrospray-ionisatie (nESI) in positieve ionisatiemodus.

4. Data-analyse

  1. Identificeer de peptidesequenties en modificatieplaatsen.
    1. Maak een theoretische lijst van peptiden met behulp van ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] onder de MS-digest tool.
      1. Voer een theoretische digest uit waarbij rekening wordt gehouden met de omstandigheden van de digest (gebruikt enzym), de soorten PTM's waarnaar wordt gezocht (bijv. mono-, di- of trimethylering), het groottebereik van de peptiden waarnaar wordt gezocht, evenals het massadetectiebereik en het potentiële aantal gemiste splitsingen.
  2. Analyseer de verkregen gegevens handmatig op basis van theoretische peptiden (Figuur 6)12.
    1. Zoeken naar de massa's bij verschillende ladingstoestanden (+1 tot +4) voor elk theoretisch peptide wordt gezocht.
    2. Na de eerste identificatie van elke m/z, selecteert u de piek en bevestigt u de MS/MS met behulp van een theoretische lijst van fragmentatie-ionen op basis van de peptidesequentie, inclusief PTM's.
      OPMERKING: Als de mobiliteit van het geïdentificeerde peptide eerder bekend was, wordt dit ook bevestigd.
  3. Bereken de relatieve abundanties van verschillende PTM's en rapporteer elke modificatie als een percentage van de gespecificeerde peptidesequentie.
    1. De relatieve abundantie van elke gedetecteerde PTM wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
      Relatieve abundantie = Oppervlakte van PTM/Totale oppervlakte van niet-gemodificeerde en PTM's voor een bepaald peptide

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een bottom-up proteomische workflow (figuur 7) omvat doorgaans het volgende: extractie van het doeleiwit of de doeleiwitten uit een ruw monster, gevolgd door het kwantificeren van de concentratie van het eiwit of de eiwitten, en vervolgens fractionering, meestal door middel van gelelektroforese of vloeistofchromatografie. Na fractionering worden de eiwitten verteerd met behulp van een proteolytisch enzym (vaak trypsine), en ten slotte massaspectrometrische analyse van de resulterende peptide...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Histonen zijn basiseiwitten die de chromatinestructuur reguleren door interactie met DNA in de vorm van octameren die bestaan uit de vier kernhistonen (twee H2A, H2B, H3 en H4)20. Histonen bevatten talrijke lysine- en arginineresiduen, die gemakkelijk kunnen worden gemodificeerd, wat leidt tot uitgebreide PTM's die de chromatinechemie veranderen door de histonfunctie te beïnvloeden of door zich te binden aan andere cellulaire eiwitten21. PTM's kunnen biologische reacties ui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Melvin A. Park en Matthew Willetts zijn werknemers van Bruker Daltonics Inc., de fabrikant van het timsTOF-instrument.

Dankbetuigingen

Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder subsidienr. HRD-1547798 en subsidienr. HRD-2111661. Deze NSF-beurzen werden toegekend aan de Florida International University als onderdeel van het Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST)-programma. Dit is bijdrage nummer 1672 van het Institute of Environment, een vooraanstaand programma aan de Florida International University. Aanvullende steun werd verleend door het National Institute of Health onder subsidienr. R21AI135469 aan Francisco Fernandez-Lima en Grant No. R01HD106051 aan Benjamin A. Garcia, evenals door de National Science Foundation onder subsidienr. CHE-2127882 aan Benjamin A. Garcia. De auteurs willen graag de aanvankelijke steun van Dr. Mario Gomez Hernandez tijdens de eerste methode-ontwikkelingen erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-282-300Gebruik deze buizen voor de eenvoudige en veilige verwerking van monstervolumes tot 1,5 mL
10 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, niet-gefilterd, gestapeld
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS zonder Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Conische buizenCorning352196Falcon Conische Centrifugebuizen
200 µL Gel-Loading Pipette TipsThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL, nonsterile, niet gefilterd, gestapelde tips
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Voorgemengde eiwitmonster buffer voor SDS-PAGE
50 mL Conische buizenCorning352070Falcon Conische Centrifugebuizen
96-well flat bottom plateThermo Fisher Scientific12565501
96-well plate, V-Bottom 600 µLAxygenP-DW-500-C-S
AcetonSigma Aldrich179124ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitril (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitril met 0,1% Formaldehydezuur (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF hydrochloride, 98%
Ammoniumbicarbonaat, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammoniumhydroxide oplossing, NH4OHSigma AldrichAX1303Voldoet aan ACS-specificaties, voldoet aan reagent specificaties voor testen USP/NF-monografieën GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC kolomWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4,6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma AldrichA7906Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calciumchloride, CaCl2Sigma AldrichC4901Watervrij, poeder, ≥97%
Celldissociatie bufferThermo Fisher Scientific13151014
Keramische scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2,0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Disposable Cell LiftersThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Cell Lifters; Wegwerp lifters verwijderen snel cellagen
Disposable Pellet PestlesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspendeer eiwit en DNA pelletjes of vermaal zacht weefsel in microcentrifugebuizen
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formaldehydezuur (FA)Sigma Aldrich695076ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillair 75 µm ID x 363 µm OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Glacial AzijnzuurThermo Fisher ScientificA38SAzijnzuur, Glacial (Gecertificeerde ACS), Fisher Chemical
Glas Pasteur PipettenSigma AldrichBR747725-1000EA
Hoge Prestatie Vloeistof Chromatograaf ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Zoutzuur, HClSigma Aldrich258148ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 µm Koolstof 150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep cartridgeThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Kalibratie Standaard, voor ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesiumchloride, MgCl2Sigma AldrichM8266Watervrij, ≥98%
Methanol, voor HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima voor HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifugebuis AdaptersGL Sciences501021514
MicrocystineThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS monster vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientificmodel: ND3300
Stikstof (N2)AirgasNI UHP300

Referenties

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245(2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756(2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138(2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619(2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60(2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Posttranslationele modificatiesscheiding van peptide-isomerennano-electrosprayionisatieProtein Prospectorbotsingsgeïnduceerde dissociatieepigenetische variatieanalyse
Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.