Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Summary

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Abstract

Histon-eiwitten zijn zeer overvloedig aanwezig en geconserveerd onder eukaryoten en spelen een grote rol bij genregulatie als gevolg van structuren die bekend staan als posttranslationele modificaties (PTM's). Door de positie en aard van elke PTM of elk patroon van PTM's te identificeren met betrekking tot externe of genetische factoren, kan deze informatie statistisch worden gecorreleerd met biologische reacties zoals DNA-transcriptie, replicatie of reparatie. In dit werk wordt een high-throughput analytisch protocol beschreven voor de detectie van histon-PTM's uit biologische monsters. Het gebruik van complementaire vloeistofchromatografie, spectrometrie voor de mobiliteit van ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) maakt het mogelijk om de biologisch meest relevante modificaties in één enkele analyse te scheiden en PTM-toe te wijzen. De beschreven aanpak maakt gebruik van recente ontwikkelingen op het gebied van afhankelijke data-acquisitie (DDA) met behulp van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en door botsingen geïnduceerde dissociatie. Histone PTM's worden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatiepatroon.

Introduction

In eukaryote cellen wordt DNA verpakt als chromatine in functionele eenheden die nucleosomen worden genoemd. Deze eenheden zijn samengesteld uit een octameer van vier kernhistonen (twee elk van H2A, H2B, H3 en H4)1,2,3,4. Histonen behoren tot de meest voorkomende en best geconserveerde eiwitten in eukaryoten, die grotendeels verantwoordelijk zijn voor^{genregulatie5}. Histon posttranslationele modificaties (PTM's) spelen een grote rol bij de regulatie van chromatinedynamiek en voeren verschillende biologische processen uit, zoals DNA-transcriptie, replicatie en reparatie⁶. PTM's komen voornamelijk voor op het toegankelijke oppervlak van de N-terminale gebieden van histonen die in contact staan met DNA ^3,7. Staart- en kernmodificaties beïnvloeden echter de chromatinestructuur, veranderen internucleosoominteracties en rekruteren specifieke eiwitten ^3,8.

Een huidige uitdaging tijdens proteomics op basis van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) is de potentiële co-elutie van interessante analyten. In het geval van data-afhankelijke analyses (DDA) vertaalt dit zich in het potentiële verlies van verschillende precursorionen tijdens het MS/MS-acquisitieproces⁹. Time-of-flight (ToF)-instrumenten verwerven spectra met een zeer hoge frequentie^{van 9,10} (tot tientallen kHz)¹¹; dit maakt ze in staat om snel de totale precursorionen in een complex monster (MS1) te scannen, waardoor ze een optimale gevoeligheid en MS/MS-sequentiesnelheden (tot 100 Hz)⁹ beloven en ideaal zijn voor biologische monsteranalyse¹⁰. Desalniettemin wordt de gevoeligheid die beschikbaar is bij deze hoge scansnelheden beperkt door de MS/MS-snelheid⁹. De toevoeging van trapped ion mobility spectrometry (TIMS) in combinatie met een orthogonale quadrupole time-of-flight (qToF) massaspectrometer werd gebruikt om deze beperkingen te verminderen. In TIMS worden alle voorloperionen in tandem geaccumuleerd en geëlueerd als functie van hun mobiliteit, in plaats van enkele voorlopermassa's te selecteren met een quadrupool⁹. Parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (PASEF) maakt honderden MS/MS-gebeurtenissen per seconde mogelijk zonder verlies van gevoeligheid⁹.

Het hoofddoel van dit werk was om de recente ontwikkelingen van DDA te laten zien met behulp van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID). Histone PTM's werden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijden (RT's), mobiliteit en fragmentatiepatronen.

Protocol

OPMERKING: Histon-monsters werden geëxtraheerd met behulp van een methode die is aangepast aan Bhanu et al. (2020)¹².

1. Voorbereiding van het monster

1. Oogsten van gekweekte cellen
   1. Wanneer cellen voor 80% samenvloeien, zorg er dan voor dat ze levensvatbaar zijn met behulp van trypanblauwe uitsluiting.
      OPMERKING: Voor deze experimenten werd een HeLa S3-cellijn gebruikt, maar deze methode kan op alle gekweekte cellen worden toegepast.
   2. Zuig het medium op en breng vervolgens 5 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan op elke plaat.
   3. Draai de plaat(en) rond om alle resterende media te spoelen, zuig vervolgens PBS op en breng 5 ml 1x PBS aan.
   4. Scheid de cellen voorzichtig van de plaat door ze te schrapen met een wegwerpcelheffer.
   5. Breng elke celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
   6. Pelleteer de cellen door ze gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 800 x g .
   7. Zuig de PBS op uit de celkorrel.
   8. Ga verder met histonextractie.
      NOTITIE: Vries de celpellet snel in vloeibare stikstof in als deze niet onmiddellijk kan worden verwerkt. Bewaar de pellets bij -80 °C tot ze klaar zijn om verder te gaan.
2. Histon-extractie
   1. Schat het volume van elke celkorrel en markeer de meniscus met een permanente marker.
   2. Bereid voldoende nucleaire isolatiebuffer (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ en 250 mM sucrose) voor alle monsters. Als er in de loop van de tijd veel monsters moeten worden verwerkt, kunt u de buffer in bulk maken en gedurende maximaal 6 maanden bij 2-8 °C bewaren, of aliquot en voor onbepaalde tijd invriezen bij -15 °C tot -25 °C door alleen de hoeveelheid te ontdooien die nodig is voor elke extractie.
      NOTITIE: De buffer moet vrij blijven tijdens opslag. Als de buffer er op enig moment troebel of anderszins abnormaal uitziet, gooi deze dan weg en bereid een nieuwe buffer voor.
   3. Bereid 50 keer het volume van de celpellets wasbuffer en voeg als volgt remmers toe (ongeveer 10 ml wasbuffer per 2 monsters).
      1. Om 10 ml wasbuffer te bereiden, mengt u 10 ml NIB, 30 μl 200 mM 4-(2-aminoethyl)benzeensulfonylfluoridehydrochloride [AEBSF], 10 μL 1 M dithiothreitol [DTT], 20 μL 5 μM microcystine, 20 μL 5 M natriumbutyraat.
   4. Verwijder 1/5 van de wasbuffer om de lysisbuffer voor te bereiden (1/5 volume van de wasbuffer, 0,3% NP-40 of NP-40 alternatief).
      NOTITIE: Gebruik Triton-X 100 niet in plaats van NP-40 of NP-40 alternatief, omdat dit te schurend kan zijn voor bepaalde celtypes.
   5. Was de celpellet grondig door deze in 5 kolommen wasbuffer te suspenderen en gedurende 5 minuten bij 4 °C te centrifugeren op 800 x g . Voer deze stap twee keer uit, waarbij u het supernatans tussen de wasbeurten opzuigt en weggooit.
   6. Zorg ervoor dat het volume van de celpellet nog steeds is gemarkeerd met een permanente marker. Resuspenderen in 10 volumes lysisbuffer.
   7. Pipet-meng elke pellet grondig om te resuspenderen en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten op ijs.
   8. Centrifugeer na 15 minuten bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   9. Aspireer en gooi de supernatant weg.
      NOTITIE: De pellet moet worden verkleind tot ≤ ¹/₂ van de oorspronkelijke pelletgrootte (zoals aangegeven door de markeringslijn). Als de pellet niet voldoende is ingekookt, herhaalt u de lysisprocedure en neemt u een zachte homogenisatiestap op met behulp van een stamper om de cellen open te breken.
   10. Zodra de lysis is voltooid, resuspendeert u de pellet in 500 μL wasbuffer en centrifugeert u vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 800 x g . Zuig het supernatant op en gooi het weg, en herhaal de wasstap nogmaals om alle sporen van NP-40 te verwijderen.
       OPMERKING: Op dit punt bestaat de pellet uit chromatine, dat histonen bevat.
   11. Resuspendeer de pellet in 5 delen (van de oorspronkelijke celpelletgrootte) van 0,4 N H₂SO₄.
   12. Incubeer gedurende 2 uur in een koelruimte of koelkast met behulp van een roerwerk.
   13. Centrifugeer het (de) monster(s) na 2 uur bij 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant niet weg.
   14. Breng het supernatans over in nieuwe buisjes en verhoog 100% trichloorazijnzuur (TCA) tot 1/3 van het volume van de inhoud (de uiteindelijke TCA-concentratie zal ongeveer 20% zijn).
   15. Keer de buis voorzichtig om en merk op dat de heldere, kleurloze oplossing wit en/of troebel wordt, wat wijst op eiwitneerslag.
       OPMERKING: Voor oplossingen met lage histonconcentraties is de eiwitneerslag mogelijk niet onmiddellijk merkbaar, maar het neerslag moet zichtbaar zijn na de nachtelijke incubatie.
   16. Incubeer 's nachts (12-18 uur) ongestoord bij 4 °C om de histon-eiwitten volledig neer te slaan.
   17. De volgende dag centrifugeren bij 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   18. Zuig het supernatant op en zorg ervoor dat u de zijkanten van het buisje niet aanraakt met de pipetpunt. In dit stadium worden de histonen voornamelijk als een film rond de zijkanten van de buis(en) afgezet.
   19. Voeg 500 μL ijskoude aceton + 0,1% HCl (zure aceton) toe aan elk buisje met behulp van een glazen pasteurpipet en keer de buis(jes) vervolgens voorzichtig een paar keer om. Schik de monsters in volgorde (1, 2, 3, enz.) terwijl u dit doet, aangezien elke afwijkende aceton de markeringen op de buizen kan verwijderen. Centrifugeer op 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer het supernatant voorzichtig.
   20. Herhaal deze spoelstap met 500 μL ijskoude 100% aceton, ook met een glazen Pasteurpipet. Centrifugeer op 3400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer het supernatant voorzichtig.
   21. Laat de tubes open drogen bij kamertemperatuur totdat de resterende aceton is verdampt.
   22. Als het droog is, voeg je 100 μL water van massaspectrometrie (MS) toe aan elke buis. Gebruik deze druppel om alle kanten van de container schoon te vegen om de hele histonfilm opnieuw te suspenderen. Doe dit door de druppel op de zijkant van de buis te pipetteren en deze tijdens het pipetteren op en neer te draaien of de helft van de 100 μL te doseren en de punt te gebruiken om het rondom te roeren. Een combinatie van beide methoden werkt het beste. Histonen zijn gemakkelijk oplosbaar in water en zullen in de oplossing zitten.
   23. Na het resuspenderen van alle monsters, als er nog witte vaste stof over is, sonicaat dan gedurende 5 minuten in een bad bij kamertemperatuur.
   24. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng de heldere oplossing over in verse tubes. Gooi alle resterende onoplosbare pellets weg.
   25. Voer een SDS-PAGE uit onder reducerende omstandigheden om te controleren of de extractie schoon is.
       OPMERKING: Gels kunnen worden gebruikt met elke geschikte concentratie polyacrylamide, zolang het eiwitten kan differentiëren in het bereik van 10-20 kDa. Zie de materiaaltabel voor de gels die in dit protocol worden gebruikt.
   26. Voer een eiwitconcentratietest uit (d.w.z. Bradford of BCA) om de totale eiwitconcentratie te bepalen.
3. Chemische derivatisering (propionylering) van de lysineresiduen
   1. Breng 20 μg histonen (bepaald door de eiwittest) over in een schone buis. Droog dit monster tot <5 μl met behulp van een vacuümconcentrator en resuspendeer vervolgens met 20 μl 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH₄CO₃) (~1 μg/μl-oplossing). Pas de pH indien nodig aan op ~8 met behulp van ammoniumhydroxide.
      LET OP: Gebruik geen ammoniumhydroxide (NH₄OH) om te resuspenderen, alleen om de pH indien nodig aan te passen. Anders zullen eiwitten denatureren en neerslaan.
      OPMERKING: Om de pH te controleren met minimaal monsterverlies, gebruikt u een pipetpunt om het monster in te dompelen en op een pH-strip te deppen. Deze testprocedure zal nuttig zijn tijdens de resterende stappen van de monstervoorbereiding.
   2. Bereid het propionyleringsreagens voor door propionzuuranhydride toe te voegen aan acetonitril (ACN) in een verhouding van 1:3 (v/v) (d.w.z. om 40 μL reagens te maken, combineer 10 μL propionzuuranhydride met 30 μL ACN).
      OPMERKING: Traditioneel worden methanol of isopropanol gebruikt bij de bereiding van een propionyleringsreagens. Aangezien propionylering een amidevormingsreactie is, is een niet-protonisch oplosmiddel, zoals acetonitril, nodig om ongewenste bijproducten en reacties, zoals methylpropionylester, die het gevolg zijn van het gebruik van methanol, te voorkomen. Bereid alleen voldoende propionyleringsreagens voor maximaal 4 monsters tegelijk, zodat het reagens vers blijft. Gebruik het reagens binnen 1-2 minuten na bereiding. Terwijl het reagens zit, zal het propionzuuranhydride reageren met omgevingsvocht en zal azijnzuur zich beginnen te vormen, wat de effectiviteit van het reagens kan veranderen en de pH van de histonoplossing kan veranderen zodra het reagens is toegevoegd.
   3. Voeg propionyleringsreagens toe aan elk monster in een 1:4 (v/v) (d.w.z. voeg voor 20 μL histonen 5 μL propionyleringsreagens toe).
   4. Voeg snel 1:5 (v/v) NH₄OH toe (d.w.z. voeg 4 μL toe voor 20 μL histonoplossing) om de pH van de oplossing te herstellen tot ~8. Als de pH nog steeds te laag is, voeg dan 1-2 μL NH₄OH per keer toe tot een pH van 8 is bereikt. Doorgaans is een verhouding van 1:5 (v/v) voldoende.
   5. Incubeer de monsters ongestoord gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Herhaal de propionyleringsreactie voor niet meer dan 3-4 monsters per batch propionyleringsreagens om minimale zuurvorming te garanderen.
   7. Herhaal de stappen 1.3.2-1.3.5 van de propionyleringsprocedure. Een tweede propionyleringsronde zorgt ervoor dat >95% van de beschikbare lysines wordt gederivatiseerd.
   8. Droog de monsters tot <5 μL met behulp van een vacuümconcentrator. Hierdoor verdampt elk niet-gereageerd propionyleringsreagens, zure producten en ammoniakgas dat vrijkomt uit de NH₄OH. Als de monsters volledig uitdrogen, is dit prima, omdat er geen significante monsterverliezen optreden.
      NOTITIE: Vervang de lucht in de propionzuuranhydridefles met argongas voordat u deze opbergt om de vorming van azijnzuur te voorkomen als gevolg van contact met omgevingsvocht dat in de fles achterblijft.
4. Proteolytische vertering met trypsine
   1. Resuspendeer histonen in 100 mM NH₄HCO₃ om een volume van 20 μL te bereiken, waarbij een optimale concentratie van 1 μg/μL wordt bereikt.
      OPMERKING: Monsteroplossingen met concentraties lager dan 1 μg/μL zullen resulteren in een verminderde trypsine-efficiëntie.
   2. Voeg trypsine toe aan histonmonsters in een verhouding van 1:10 (gew./gewicht) (d.w.z. voeg 2 μL 1 μg/μL-oplossing trypsine toe aan 20 μg histonen).
   3. Incubeer reacties bij 37 °C gedurende 6-8 uur. U kunt ook een nacht (12-18 uur) bij kamertemperatuur incuberen.
   4. Stop de spijsvertering door minimaal 1 uur in te vriezen bij -80 °C.
      OPMERKING: Gebruik geen zuur om de verteringsreactie te doven, omdat dit op dit punt in de procedure een ongewenste daling van de pH zal veroorzaken. Het monster kan bij -80 °C worden bewaard totdat het klaar is om verder te gaan (tussenstoppunt).
5. Chemische derivatisatie (propionylering) van peptide N-terminals
   1. Droog de monsters tot <5 μL met behulp van een vacuümconcentrator.
   2. Resuspendeer de monsters tot 20 μL (1 μg/μL) met behulp van 100 mM NH₄HCO₃.
   3. Herhaal de propionylering zoals eerder (stap 1.3).
      OPMERKING: Het is normaal dat de monsters in deze stap langer nodig hebben om te drogen vanwege een hogere verhouding waterig: organische fase.
6. Monster ontzouten met stage-tips
   1. Resuspendeer of verdun monsters met 50 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA.
   2. Gebruik een 11-G-monsterboor om 5 schijven_{C18-materiaal} uit een vastefase-extractieschijf te ponsen (pons alle 5 schijven voordat u ze naar de pipetpunt overbrengt). Plaats de schijven en zorg ervoor dat ze stevig en gelijkmatig aan de onderkant van een pipetpunt van 200 μl zijn geklemd (Figuur 1).
      OPMERKING: Gebruik een boor van 15 G als u meer dan 25 μg monster ontzoutt via een enkele trapstip.
   3. Gebruik een centrifuge-adapter om de stage-tips op hun plaats te houden in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml of 2 ml.
      NOTITIE: Gebruik voor de volgende centrifugeerstappen een langzame omwenteling (400-500 x g) bij 4 °C, gedurende 1-2 minuten per keer; de oplosmiddelen gaan normaal gesproken in minder dan 1 minuut door de hars, afhankelijk van hoe strak het C_18-materiaal in de uiteinden is verpakt.
   4. Spoel de hars af door te centrifugeren met 50 μL 100% acetonitril om het_{C18-materiaal} te activeren en mogelijke verontreinigingen te verwijderen.
      OPMERKING: Het kan gemakkelijker zijn om oplossingen op de objectiscooppunten te plaatsen met behulp van gel-ladende pipetpunten. Zodra het C_18-materiaal is geactiveerd, is het belangrijk om de hars niet te laten uitdrogen tijdens de duur van de ontziltingsprocedure.
   5. Breng het schijfmateriaal in evenwicht met 80 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA door centrifugeren.
   6. Verzuur het monster tot pH 4 of lager met ijsazijn. Controleer de pH met pH-strips zoals voorheen om monsterverlies tot een minimum te beperken.
   7. Laad het hele monster op de harsschijf door langzaam te centrifugeren.
   8. Was het monster met 80 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA door centrifugeren.
   9. Eluer het monster in een schoon buisje van 1,5 ml door 70 μl 75% acetonitril en 0,5% azijnzuur langzaam te centrifugeren. Extra centrifugatietijd kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het volledige monstervolume uit de punt van de trap wordt geëlueerd. Het is niet erg als de hars uitdroogt met de extra centrifugeertijd, omdat het niet langer nodig is na de elutie van het monster.
   10. Droog elk monster volledig in een vacuümconcentrator.
       OPMERKING: Monster(s) kunnen worden bewaard bij -80 °C totdat ze klaar zijn om verder te gaan (tussentijds stoppunt).
   11. Voor LC-MS/MS-analyse reconstitueert u de monsters in een volume oplosmiddel A (0,1% mierenzuur) uit het vloeistofchromatografieprotocol (LC) dat de uiteindelijke concentratie van 0,4 μg/μl oplevert (d.w.z. 20 μg histonen oplossen in 50 μl oplosmiddel A).

2. TIMS-software-interface

1. Selecteer het tabblad Instrument en schakel over naar Bedienen (controleer of de naam van het instrument groen wordt gemarkeerd) (Figuur 2).
2. Controleer de TIMS-parameters (Afbeelding 2).
3. Controleer de MS-instellingen (scannen beginnen, scannen beëindigen, ionenpolariteit, scanmodus) (Figuur 2).
4. Controleer de TIMS-instellingen (modus, mobiliteitsstart, mobiliteitseinde, aanlooptijd, accumulatietijd, inschakelduur, aanloopsnelheid, MS-snelheid, MS-middeling en automatische kalibratie) (Figuur 2).
5. Ga naar het tabblad Bron en activeer de spuitoptie (Hamilton 500 μL) alleen voor de TuneMix-kalibratiestap (Figuur 3)¹³.
6. Ga naar het tabblad Kalibratie , klik op m/z, selecteer Kalibratiemodus en kies de modus (meestal Enhanced Q), zoom (+0.01%) STD Dev (0.24) en klik op Kalibreren; wanneer een score van 100% is behaald, accepteer dan (Figuur 4).
7. Ga naar het tabblad mobiliteit en herhaal het kalibratieproces (lineaire modus, over het algemeen), detectiebereik (+5%), breedte (0.1 Da), STD Dev (0.1855) en klik vervolgens op kalibreren; wanneer u een score ≥ 98,5% krijgt, accepteert u (Figuur 5).
8. Ga naar de methode en selecteer de methode die u wilt gebruiken; voor dit voorbeeld is Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl geselecteerd (Afbeelding 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

1. Gebruik de typische nESI-bedrijfsomstandigheden: capillaire spanning van 4500 V, offset van de eindplaat van 800 V, druk van de vernevelaar van 3,0 bar, droog gas van 10,0 l/min, droge verwarming van 200 °C en injectiedebiet van 50 μl/min.
2. Gebruik de typische MS-instellingen: 6 eV botsingsenergie, 1200 Vpp botsings-RF, 75 μs overdrachtstijd, 5 μs prepulsopslag.
3. Bepaal de drijfgasstroom aan de hand van het drukverschil tussen de ingangstrechter P1 en de uittrederechter P2. Parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (PASEF) vindt plaats in de TIMS-cel, waarbij alle precursorionen tegelijkertijd worden geaccumuleerd in plaats van afzonderlijk. Precursorionen komen dan vrij in smalle ionenpieken versus de normaal veel bredere pieken (ongeveer 50 keer korter), waardoor de signaal-ruisverhouding toeneemt terwijl co-eluerende peptiden nog steeds worden gescheiden via mobiliteit¹⁴.
4. Ontwikkel een LC-TIMS-ToF MS/MS-methode voor het analyseren van proteolytische histonpeptiden. Koppel een high-performance vloeistofchromatograaf (HPLC) uitgerust met een C₁₈ (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) kolom aan een commercieel TIMS-TOF MS-instrument met gepatenteerde PASEF-technologie.
   OPMERKING: Deze kolomgrootte is vastgesteld om een goede scheiding te bieden bij zowel hoge als lage pH voor peptidemengsels, op basis van eerder gepubliceerde werken 15,16,17.
   1. Stel het injectievolume in op 20 μl (8 μg) monster en een stroomsnelheid van 0,4 ml/min.
   2. Voer een niet-lineaire LC-gradiënt van 60 minuten uit met water met 0,1% mierenzuur (oplosmiddel A) en acetonitril met 0,1% mierenzuur (oplosmiddel B). Stel de helling in: 10% B gedurende 2,7 min, dan naar 20% B in 5,3 min, 28% B in 4 min, 35% B in nog eens 18 min, naar 40% B in 13 min, en 100% B in nog eens 2 min. Nadat je 100% B 5 minuten hebt vastgehouden, verlaag je de concentratie tot 10% B in 5 minuten en houd je deze de laatste 5 minuten vast.
5. Controleer de monsterelutie van de HPLC in de TIMS-TOF via nano-elektrospray-ionisatie (nESI) in positieve ionisatiemodus.

4. Data-analyse

1. Identificeer de peptidesequenties en modificatieplaatsen.
   1. Maak een theoretische lijst van peptiden met behulp van ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] onder de MS-digest tool.
      1. Voer een theoretische digest uit waarbij rekening wordt gehouden met de omstandigheden van de digest (gebruikt enzym), de soorten PTM's waarnaar wordt gezocht (bijv. mono-, di- of trimethylering), het groottebereik van de peptiden waarnaar wordt gezocht, evenals het massadetectiebereik en het potentiële aantal gemiste splitsingen.
2. Analyseer de verkregen gegevens handmatig op basis van theoretische peptiden (Figuur 6)¹².
   1. Zoeken naar de massa's bij verschillende ladingstoestanden (+1 tot +4) voor elk theoretisch peptide wordt gezocht.
   2. Na de eerste identificatie van elke m/z, selecteert u de piek en bevestigt u de MS/MS met behulp van een theoretische lijst van fragmentatie-ionen op basis van de peptidesequentie, inclusief PTM's.
      OPMERKING: Als de mobiliteit van het geïdentificeerde peptide eerder bekend was, wordt dit ook bevestigd.
3. Bereken de relatieve abundanties van verschillende PTM's en rapporteer elke modificatie als een percentage van de gespecificeerde peptidesequentie.
   1. De relatieve abundantie van elke gedetecteerde PTM wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
      Relatieve abundantie = Oppervlakte van PTM/Totale oppervlakte van niet-gemodificeerde en PTM's voor een bepaald peptide

Results

Een bottom-up proteomische workflow (figuur 7) omvat doorgaans het volgende: extractie van het doeleiwit of de doeleiwitten uit een ruw monster, gevolgd door het kwantificeren van de concentratie van het eiwit of de eiwitten, en vervolgens fractionering, meestal door middel van gelelektroforese of vloeistofchromatografie. Na fractionering worden de eiwitten verteerd met behulp van een proteolytisch enzym (vaak trypsine), en ten slotte massaspectrometrische analyse van de resulterende peptiden en eiwitidentificatie met behulp van een gevestigde database¹⁸. Sequentie-informatie wordt afgeleid van precursorionen binnen het aangegeven massa-tot-ladingsbereik (m/z), die worden onderworpen aan door botsingen geïnduceerde dissociatie (CID), waardoor fragmentatiepatronen worden geproduceerd die moeten worden geïdentificeerd en gesequenced met behulp van een database¹⁹ (figuur 8).

Voor dit werk was het hoofddoel het ontwikkelen en toepassen van een LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA-methode volgens de stappen die eerder in het protocolgedeelte zijn beschreven. Het bepalen van de positionaliteit van posttranslationele modificaties op isomere en isobare peptiden heeft een bijzondere uitdaging opgeleverd met betrekking tot identificatie en spectruminterpretatie. In deze studie werden recombinante humane histonstandaarden en HeLa S3-cellen als monsters gebruikt.

Histon PTM-analyse van menselijke histonstandaarden via ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS leverde middelgrote tot grote peptiden op (3-30 aminozuren lang) gedetecteerd met maar liefst 5 ladingen per peptide. De propionyleringsprocedure was succesvol in het produceren van langere, meer informatieve peptiden dan die gewoonlijk worden geproduceerd door tryptische spijsvertering. Na gegevensanalyse werden peptiden geïdentificeerd in verschillende gemodificeerde toestanden. Als voordeel onderscheidde de op TIMS gebaseerde methode enkele positionele isomere peptiden met dezelfde PTM's. Twee isomere soorten kunnen elkaar bijvoorbeeld overlappen in retentietijd en m/z; de twee signalen kunnen echter worden gescheiden in het mobiliteitsdomein (figuur 9).

De overeenkomstige fragmentatiespectra voor de peptiden in figuur 9 werden geannoteerd door proteomische analysesoftware met behulp van de juiste FASTA-bestanden. In figuur 9A is het niet-gemodificeerde peptide te zien met drie propionyl (+56,03) groepen (op de N-terminal, lysine 18 en lysine 23). In figuur 9B wordt het peptide waargenomen met een acetylgroep (+42,02) op lysine 18 en twee propionylgroepen (één op het N-uiteinde en één op lysine 23). Ten slotte wordt in figuur 9C het peptide gezien met een acetylering waargenomen op lysine 23 en twee propionylgroepen (op de N-terminal en lysine 18). Zoals eerder gepubliceerd, kan het PASEF-voordeel worden gebruikt om de sequencingsnelheid en -gevoeligheid te verhogen door herhaaldelijk op hetzelfde kenmerk te richten⁹. Hierdoor kan de gebruiker meer structurele informatie verkrijgen uit biologische monsters. In dit geval wordt dit toegepast op het type en de positie van PTM's die op elke histon voorkomen.

Posttranslationele modificatieanalyse kan ook visueel worden weergegeven als een sequentiedekkingsplot, zoals te zien is in figuur 10. In figuur 10A vertoont de histon H3-standaard, die voorafgaand aan de spijsvertering is gepropionyleerd, langere peptiden dan anders het geval zou zijn geweest, aangegeven door de blauwe lijnen. Histonen geëxtraheerd uit HeLa S3-cellen werden op dezelfde manier verwerkt, zoals weergegeven in figuur 10B. Er werden verschillende PTM's aangegeven, waaronder veel verschillende patronen op dezelfde aminozuurposities. Dit is te verwachten van biologische monsters. Merk op dat de paar grijze lijnen in figuur 10B peptiden aanduiden die dubbelzinnig werden geïdentificeerd vanwege het ontbreken van een MS² als gevolg van de lage intensiteit.

Figuur 1: Schematische weergave en productie van de stagetips. (A-G) Stap-voor-stap handleiding voor de vervaardiging van een C18-silica schijftraptip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gegevensverwerking: 20210804 gepropionyleerde standaard histonen Mix_QC peptide. Voordat u begint met het verwerken van de gegevens, moet u ervoor zorgen dat u de theoretische lijst van mogelijke ladingstoestanden en hun fragmentaties (1550.9013; 775.9543; 517.6386; enz.) opstelt om die waarden uit het basispiekchromatogram (BPC + Alle MS) te extraheren. Zorg er na het extraheren van elk peptide voor dat het eruitziet als de analyselijst in de afbeelding. De piek 775.9543 werd als voorbeeld gekozen. Aan de rechterkant van de figuur zijn drie grafieken weergegeven: de eerste komt overeen met het chromatogram (intensiteits- vs. tijdgrafiek), de tweede met het mobilogram en de derde met het massaspectrum inclusief PASEF-fragmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: timsControl protocol stappen 1-4. De figuur toont de eerste vier stappen van de timsControl-procedure. Klik linksboven op de knop Instrument om de verbinding tussen het instrument en de software in en uit te schakelen. Alvorens een taak uit te voeren, moet men ervoor zorgen dat de software zich in de bedrijfsmodus bevindt. Controleer ten slotte of de TIMS-parameters correct zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Bronparameters. In dit geval werd spuit Hamilton 500 μL alleen gebruikt voor TuneMix. Controleer of de andere parameters correct blijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Kalibratie van de massa tot lading (m/z). Selecteer Kalibreren totdat een score van 100% is behaald in de kalibratiemodus linksonder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Mobiliteitskalibratie. Selecteer Kalibreren totdat een score van ten minste 98,5% is behaald in de kalibratiemodus linksonder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Typische bottom-up proteomics workflow. Stapsgewijs van de bottom-up procedures van monstervoorbereiding tot identificatie⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Retentietijd, isotopenpatroon en H3 18-26 mobiliteitsprofielen. (A) niet-gemodificeerd gepropionyleerd, (B) K23Ac-peptide gepropionyleerd in de andere twee posities, en (C) K18Ac gepropionyleerd in de andere twee posities. Let op de voordelen van de mobiliteitsscheiding voor het geval van de structurele isomeren die worden weergegeven in panelen B en C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Voorbeeld van MS/MS-fragmentatiepeptidesequencing met behulp van PASEF. Fragmentspectra werden verkregen uit proteomische analysesoftware voor het H3-peptide met aminozuurposities 18-26. (A) niet-gemodificeerd gepropionyleerd, (B) K23Ac-peptide gepropionyleerd in de andere twee posities, en (C) K18Ac gepropionyleerd in de andere twee posities. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Voorbeeld van een samenvatting van de visuele histon PTM-analyse. Resultaten van waargenomen peptiden en PTM's van (A) een H3-standaard en (B) H3 van HeLa S3-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Standaard en HeLa S3 peptide LC-TIMS-ToF MS/MS kenmerken. Doel- en waargenomen peptidelijst, inclusief experimentele eigenschappen (d.w.z. retentietijd, m/z, 1/K_o en LC-piekgebieden). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Histonen zijn basiseiwitten die de chromatinestructuur reguleren door interactie met DNA in de vorm van octameren die bestaan uit de vier kernhistonen (twee H2A, H2B, H3 en H4)²⁰. Histonen bevatten talrijke lysine- en arginineresiduen, die gemakkelijk kunnen worden gemodificeerd, wat leidt tot uitgebreide PTM's die de chromatinechemie veranderen door de histonfunctie te beïnvloeden of door zich te binden aan andere cellulaire eiwitten²¹. PTM's kunnen biologische reacties uitlokken door samen te werken, waarbij specifieke groepen PTM's zijn gemeld bij verschillende ziekten, met name verschillende soorten kanker^.

Wanneer DNA-schade op cellulair niveau wordt herkend, wordt dit onmiddellijk gevolgd door de werking van een complexe signaalcascade waarbij laesies worden gemarkeerd, gevolgd door de coördinatie van de voortgang van de celcyclus en activering van de vereiste herstelpaden. Bovendien induceert DNA-schade verschillende modificaties, zoals acetyl- en methyladducten, die de rekrutering van eiwitten vergemakkelijken²³. De grote verscheidenheid aan PTM's die betrokken zijn bij DNA-laesies leidt tot de vraag hoe deze moleculaire mechanismen hun coëxistentie reguleren en wat het functionele belang is van het verdedigen van de integriteit van het genoom door middel van een uiterst complex geïntegreerd netwerk. Lysine-9-trimethylering van histon H3 (H3K9me3) is bijvoorbeeld in verband gebracht met verschillende pathologieën bij verschillende ziekten²⁴. Om redenen als deze is het noodzakelijk om instrumentele analytische methodologieën te ontwikkelen die de volledige karakterisering van deze modificaties op cellulair niveau mogelijk maken²³.

Analyse van de HeLa S3-histonextracties met behulp van handmatige data-analysesoftware en proteomische analysesoftware onthulde PTM's, waaronder acetylering (+42,01 Da), methylpropionylering (+70,04 Da), dimethylering (+28,03 Da) en trimethylering (+42,05) voor verschillende histon-eiwitten. Bovendien was de op PASEF gebaseerde MS/MS-methode in staat om enkele positionele isomere peptiden met dezelfde PTM's te differentiëren.

In de inleiding worden kort de voordelen beschreven van het koppelen van LC-TIMS-ToF MS/MS in de studie van PTM's om de recente ontwikkelingen van DDA te laten zien met behulp van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en botsingsgeïnduceerde dissociatie. Het belangrijkste idee is om een methodologie vast te stellen die het mogelijk maakt om signalen van verschillende peptiden op te lossen en die tot nu toe niet door klassieke technieken kon worden opgelost. Het derivatiseringsproces met behulp van propionzuuranhydride voorkomt de splitsing van lysine C-terminals door trypsine, waardoor langere, meer informatieve peptiden worden gegenereerd. Peptiden met dezelfde m/z en retentietijd konden worden geïdentificeerd aan de hand van hun fragmentatiepatronen, maar er werd ook gezien dat sommige van deze soorten in het mobiliteitsdomein konden worden gescheiden met behulp van deze LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS-methode.

Om dit beter te begrijpen, geeft figuur 8 drie hoofdkenmerken van elk molecuul weer, waardoor de identificatie van een verbinding mogelijk is, of het nu gaat om intacte eiwitten, lipiden of peptiden (in dit geval histon H3 18-26), om maar een paar voorbeelden te noemen. Deze kenmerken omvatten de retentietijd (min) van een verbinding in de chromatografische kolom, de massa-ladingsverhouding (m/z) van elke verbinding en de mobiliteit (1/K_o) die deze verbindingen vertonen wanneer ze interageren met het drijfgas. In figuur 8A is aangetoond dat het niet-gemodificeerde H3-peptide 18-26 een RT heeft van 28,15 min en dat het twee banden in zijn mobiliteitsspectrum vertoont, wat aangeeft dat het ten minste twee conformaties heeft, een resultaat waarvan wordt vermoed dat het het gevolg is van de twee lysines (18 en 23) die zijn gepropionyleerd volgens het eerder beschreven protocol. De volgende spectra (Figuur 8B,C) tonen hetzelfde peptide (H3 18-26) maar variëren de positie van de acetyleringsgroep (42,02) tussen B, K18Ac en C, K23Ac. Deze twee isomeren (K18Ac en K23Ac) zijn geïdentificeerd door middel van het mobilogram, omdat ze verschillende ruimtelijke verdelingen vertonen, wat resulteert in verschillende interacties met het gas in de TIMS-cel. Het belang van deze methode ligt in de mogelijkheid om de verschillende PTM's die in verband zijn gebracht met verschillende ziekten door bijvoorbeeld DNA-schade te identificeren en in meer detail te bestuderen.

Wanneer fragmentatiegegevens schaars zijn, is het identificeren van een modificatie bij een specifiek residu een uitdaging, omdat twee of meer ongelijksoortige modificaties tegelijkertijd kunnen optreden bij (of in de buurt van) dezelfde residuen en kunnen worden opgevat als een enkele modificatie²⁵. Dit kan worden opgelost door ervoor te zorgen dat het niet-gemodificeerde peptide is geïdentificeerd, met name door een standaard te gebruiken om de aanwezigheid van een enkele modificatie te bevestigen of te ontkennen in plaats van meerdere modificaties (tabel 1).

Om overmatige verontreiniging of extracties van onzuivere histonen te voorkomen, is het belangrijk om voor gebruik de kwaliteit van de reagentia te controleren. Als de NIB-bufferoplossing bijvoorbeeld in bulk wordt opgeslagen en gebruikt, zorg er dan voor dat de oplossing helder is en dat er geen sprake is van troebelheid of abnormale presentatie. Troebelheid kan het gevolg zijn van bacteriegroei, die monsters zou besmetten en zou kunnen resulteren in een mengsel van histonen en bacteriële eiwitten. Daarnaast wordt aanbevolen om nieuwe kalibratiecurven voor tests op te stellen, zoals de BCA- of Bradford-test die wordt gebruikt om de eiwitconcentratie te bepalen, om ervoor te zorgen dat het eiwit dat voor de kalibratiecurve wordt gebruikt, niet verloopt of wordt afgebroken.

Deze methode kan worden uitgebreid naar andere soorten cellen of organismen, bijvoorbeeld muggen. In het geval van gehele of gedeeltelijke organismen is de keuze van een passend aantal organismen bijzonder belangrijk om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke histonconcentratie geschikt is voor analyse.

Als algemene richtlijn voor het onderhoud van massaspectrometers moet de voorkant ook periodiek worden schoongemaakt om ophoping op het instrument en verontreiniging tussen runs te voorkomen. Deze reiniging moet het gordijn, de openingsplaat en de quadrupool omvatten, indien nodig.

Over het algemeen is het bij gebruik van een LC noodzakelijk om rekening te houden met het wekelijks bereiden van nieuwe mobiele fase(n) met behulp van oplosmiddelen van MS-kwaliteit. Het is een goede gewoonte om speciale pipetten en glaswerk te bewaren voor mobiele fasevoorbereiding en om de LC-leidingen te ontluchten wanneer er nieuwe oplossingen op het systeem worden geplaatst. Bescherm- en scheidingskolommen moeten gewoonlijk worden vervangen om de 100-200 injecties en 500-1500 injecties, respectievelijk²⁶. Zorg ervoor dat u blanco's injecteert voor en na het uitvoeren van een batch monsters. Als er een groot aantal monsters binnen een bepaalde batch is, kan men ook overwegen om met verschillende tussenpozen binnen de batch een blanco uit te voeren.

Het protocol biedt een op PASEF gebaseerde DDA-workflow voor het detecteren van histon-PTM's en differentiatie van isobare en isomere soorten op basis van ionenmobiliteit.

Dit protocol vereist een uitgebreide monstervoorbereiding en er moet rekening worden gehouden met de totale voorbereidingstijd van het experimentele monster. Gemiddeld duurt het 2-3 werkdagen om het monstervoorbereidingsprotocol te voltooien. Bovendien kunnen verschillen tussen laboratoria en instrumentversies van invloed zijn op de algehele gevoeligheid van de analyse.

Zeer weinig proteomische data-analysesoftware is geschikt geacht voor gebruik bij het analyseren van histonen via bottom-up methoden zonder handmatige aanpassing of correctie 27,28,29. De resultaten moeten (althans in het begin) worden bevestigd met behulp van handmatige analyse, wat ook tijdrovend is. Als analytische software wordt gebruikt, moet deze beschikken over MS/MS-annotatiemogelijkheden, die over het algemeen gemakkelijk te bevestigen of te verwerpen zijn.

Het is ook vermeldenswaard dat het onmogelijk is om isomeren te scheiden door middel van massaspectrometrie, tenzij een TIMS-cel wordt ingebracht en mobiliteitswaarden worden gebruikt; zo kunnen de posities van histonmodificaties worden bepaald met behulp van fragmentatiepatronen (PASEF).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Gebruik deze buizen voor de eenvoudige en veilige verwerking van monstervolumes tot 1,5 mL
10 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, niet-gefilterd, gestapeld
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS zonder Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Conische buizen	Corning	352196	Falcon Conische Centrifugebuizen
200 µL Gel-Loading Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL, nonsterile, niet gefilterd, gestapelde tips
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Voorgemengde eiwitmonster buffer voor SDS-PAGE
50 mL Conische buizen	Corning	352070	Falcon Conische Centrifugebuizen
96-well flat bottom plate	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-well plate, V-Bottom 600 µL	Axygen	P-DW-500-C-S
Aceton	Sigma Aldrich	179124	ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitril (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitril met 0,1% Formaldehydezuur (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF hydrochloride, 98%
Ammoniumbicarbonaat, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammoniumhydroxide oplossing, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Voldoet aan ACS-specificaties, voldoet aan reagent specificaties voor testen USP/NF-monografieën GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC kolom	Waters	186003625	XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4,6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calciumchloride, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Watervrij, poeder, ≥97%
Celldissociatie buffer	Thermo Fisher Scientific	13151014
Keramische scoring wafer	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2,0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
Disposable Cell Lifters	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand Cell Lifters; Wegwerp lifters verwijderen snel cellagen
Disposable Pellet Pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspendeer eiwit en DNA pelletjes of vermaal zacht weefsel in microcentrifugebuizen
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Formaldehydezuur (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillair 75 µm ID x 363 µm OD	(Molex (Polymicro)	TSP075375
Glacial Azijnzuur	Thermo Fisher Scientific	A38S	Azijnzuur, Glacial (Gecertificeerde ACS), Fisher Chemical
Glas Pasteur Pipetten	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
Hoge Prestatie Vloeistof Chromatograaf	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Zoutzuur, HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 µm Koolstof 150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep cartridge	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Kalibratie Standaard, voor ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Magnesiumchloride, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Watervrij, ≥98%
Methanol, voor HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima voor HPLC, Fisher Chemical
Microcentrifugebuis Adapters	GL Sciences	501021514
Microcystine	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS monster vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Parts	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	model: ND3300
Stikstof (N2)	Airgas	NI UHP300