Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65771

⸱

13 oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We hebben verschillende protocollen ontwikkeld om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te induceren bij kikkervisjes van Xenopus laevis . Deze modellen bieden de mogelijkheid om retinale regeneratiemechanismen te bestuderen.

Samenvatting

Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid. Van de vele therapeutische strategieën die worden onderzocht, is het stimuleren van zelfherstel onlangs bijzonder aantrekkelijk gebleken. Een cellulaire bron van belang voor herstel van het netvlies is de Müller-gliacel, die stamcelpotentieel en een buitengewoon regeneratief vermogen in anamniotes herbergt. Dit potentieel is echter zeer beperkt bij zoogdieren. Het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het netvlies in diermodellen met regeneratieve vermogens zou inzicht moeten geven in hoe het latente vermogen van Müller-cellen van zoogdieren om het netvlies te regenereren kan worden ontsloten. Dit is een belangrijke stap voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën in de regeneratieve geneeskunde. Om dit doel te bereiken, ontwikkelden we verschillende paradigma's voor netvliesbeschadiging in Xenopus: een mechanisch netvliesletsel, een transgene lijn die nitroreductase-gemedieerde voorwaardelijke ablatie van fotoreceptoren mogelijk maakt, een retinitis pigmentosa-model op basis van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , en een cytotoxisch model aangedreven door intraoculaire CoCl2-injecties . Door hun voor- en nadelen te benadrukken, beschrijven we hier deze reeks protocollen die verschillende degeneratieve aandoeningen genereren en de studie van retinale regeneratie bij Xenopus mogelijk maken.

Inleiding

Miljoenen mensen over de hele wereld lijden aan verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies die leiden tot blindheid, zoals retinitis pigmentosa, diabetische retinopathie of leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). Tot op heden blijven deze aandoeningen grotendeels onbehandelbaar. De huidige therapeutische benaderingen die worden geëvalueerd, omvatten gentherapie, cel- of weefseltransplantaties, neuroprotectieve behandelingen, optogenetica en protheses. Een andere opkomende strategie is gebaseerd op zelfregeneratie door de activering van endogene cellen met stamcelpotentieel. Müller-gliacellen, het belangrijkste gliaceltype van het netvlies, behoren tot de cellulaire bronnen die in deze context van belang zijn. Bij letsel kunnen ze dedifferentiëren, prolifereren en neuronen genereren 1,2,3. Hoewel dit proces zeer effectief is bij zebravissen of Xenopus, is het grotendeels inefficiënt bij zoogdieren.

Desalniettemin is aangetoond dat geschikte behandelingen met mitogene eiwitten of overexpressie van verschillende factoren de terugkeer van de Müller-gliacelcyclus van zoogdieren kunnen induceren en, in sommige gevallen, hun daaropvolgende neurogenese-verbintenis kunnen veroorzaken 1,2,3,4,5. Dit blijft echter grotendeels onvoldoende voor behandelingen. Daarom is het vergroten van onze kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan regeneratie noodzakelijk om moleculen te identificeren die in staat zijn om de eigenschappen van Müller-stamcellen efficiënt om te zetten in nieuwe cellulaire therapeutische strategieën.

Met dit doel voor ogen ontwikkelden we verschillende letselparadigma's in Xenopus die retinale celdegeneratie veroorzaken. Hier presenteren we (1) een mechanisch netvliesletsel dat niet specifiek is voor het celtype, (2) een voorwaardelijk en omkeerbaar celablatiemodel met behulp van het NTR-MTZ-systeem dat zich richt op staafcellen, (3) een CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , een model van retinitis pigmentosa dat progressieve staafceldegeneratie veroorzaakt, en (4) een CoCl2-geïnduceerd cytotoxisch model dat, afhankelijk van de dosis, zich specifiek op kegeltjes kan richten of kan leiden tot bredere degeneratie van retinale cellen. We belichten de bijzonderheden, voor- en nadelen van elk paradigma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierverzorging en dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, onder de institutionele licentie A91272108. De onderzoeksprotocollen werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging CEEA #59 en kregen toestemming van de Direction Départementale de la Protection des Populations onder het referentienummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 en APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en reagentia die in deze protocollen worden gebruikt.

1. Mechanisch netvliesletsel

OPMERKING: Het hier beschreven letselparadigmaprotocol bestaat uit een mechanische retinale punctie van een kikkervisje vanaf stadium 45. Het richt zich daarom niet op een bepaald type netvliescel, maar beschadigt de hele dikte van het netvlies op de prikplaats.

  1. Bereiding van de verdoving voor kikkervisjes
    1. Bereid een 10% stockoplossing van benzocaïne. Voeg voor een totaal volume van 10 ml 1 g benzocaïne, 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en 8 ml propyleenglycol toe. Bewaar de stockoplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
    2. Bereid 0,005% benzocaïne-oplossing op het moment van gebruik door 25 μL 10% benzocaïne-stockoplossing toe te voegen aan 50 ml kikkervisjeskweekwater (gefilterd en gedechloreerd leidingwater). Goed mengen.
      OPMERKING: De concentratie benzocaïne is bijzonder laag omdat kikkervisjes zeer gevoelig zijn voor anesthesie in vergelijking met volwassenen.
  2. Pin voorbereiding
    1. Bevestig een steriele pin met een diameter van 0.2 mm aan een gesteriliseerde pinhouder (Figuur 1A).
  3. Kikkervisje anesthesie
    1. Gebruik een schepnet om kikkervisjes in hun aquarium te vangen. Breng ze over in een nieuwe tank met de 0,005% benzocaïne-oplossing. Wacht een paar minuten tot de kikkervisjes niet meer reageren op prikkels (tikken op de tank of direct contact).
      NOTITIE: Meerdere kikkervisjes kunnen tegelijkertijd worden verdoofd, maar de tijd die in de verdovingsoplossing wordt doorgebracht, moet minder dan 30 minuten zijn.
  4. Netvliespunctie
    1. Gebruik een lepel om een kikkervisje te vangen en leg het voorzichtig op een kleine petrischaal (55 mm diameter) met daarin een natte tissue. Plaats het kikkervisje met de dorsale kant naar boven in het midden van de petrischaal.
    2. Prik onder een stereomicroscoop in het netvlies door de pin voorzichtig aan de dorsale zijde van het oog in te brengen, totdat deze door het netvlies gaat (Figuur 1A). Als er meerdere porren nodig zijn, herhaal deze procedure dan op verschillende plaatsen. Nadat u het rechteroog hebt doorboord, draait u de petrischaal 180° om het linkeroog te doorboren.
    3. Breng het tadvisje over in een grote bak met 1 L kweekwater door de petrischaal voorzichtig onder te dompelen. Houd de kikkervisjes in de gaten totdat ze volledig wakker zijn.

2. Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem

Het protocol heeft tot doel specifieke staafcelablatie te induceren in de Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) transgene lijn6, beschikbaar bij de zoötechnische dienst van TEFOR Paris-Saclay, waar het Franse Xenopus resource center is gevestigd. Dit chemogenetische systeem maakt gebruik van de capaciteit van het nitroreductase (NTR)-enzym om de prodrug metronidazol (MTZ) om te zetten in een cytotoxisch DNA-verknopingsmiddel, om specifiek NTR-expressiestaafjes te ablateren (Figuur 1B). Twee gedetailleerde protocollen om Tg(rho:GFP-NTR) of Tg(rho:NTR) transgene dieren te maken en degeneratie te induceren zijn eerder gepubliceerd 7,8. Hier beschrijven we eenvoudig de inductie van retinale degeneratie en hoe het degeneratieproces in vivo kan worden gevolgd.

  1. Bereiding van metronidazol-oplossing
    1. Bereid 10 mM MTZ-oplossing op het moment van gebruik door 1,67 g MTZ-poeder op te lossen in een donkere fles in 1 l kikkervisjeskweekwater met 0,1% DMSO, met behulp van een magnetische roerstaaf en een magnetisch roerwerk.
      LET OP: MTZ is lichtgevoelig. Volledige oplossing kan tot 10 minuten duren.
  2. Het genereren van transgene kikkervisjes door natuurlijke paring van de Tg(rho:GFP-NTR) lijn
    OPMERKING: Aangezien transgene mannetjes een kostbaar ras vertegenwoordigen, geven we er de voorkeur aan om embryo's te genereren via natuurlijke paring om het mannetje niet op te offeren en herhaaldelijk te gebruiken.
    1. Toediening van hormonen
      1. Injecteer 600 I.E. humaan choriongonadotrofinehormoon (hCG) met naalden van 25 G in de dorsale lymfezak van Xenopus laevis wildtype vrouwtjes. Injecteer transgene mannetjes met 100-200 IE hCG in de dorsale lymfezak. Gebruik voor het live monitoren van staafdegeneratie (stap 2.4) albino Xenopus in plaats van gepigmenteerde, om fluorescentievariaties in het oog van de gegenereerde transgene kikkervisjes beter te visualiseren.
        OPMERKING: Xenopus-vrouwtjes kunnen 1 tot 7 dagen voor de geplande eisprong worden geprimed met 50 IE hCG, maar dit is optioneel.
    2. Paring en eicelverzameling
      1. Onmiddellijk na de hCG-injectie een Tg(rho:GFP-NTR) transgeen mannetje samen met een met hCG geïnjecteerd vrouwtje bij 20 °C in een tank doen tot de volgende dag. Gebruik een groot volume (minimaal 10 L) en voeg kleine voorwerpen toe waar de eieren zich aan kunnen hechten, zodat de eieren niet worden beschadigd door de bewegingen van de volwassenen. De volgende dag, wanneer de kikkers niet meer in amplexus zijn, haalt u de volwassenen uit de tank en verzamelt u embryo's.
    3. Opfok van embryo's en kikkervisjes
      1. Stadium embryo's en kikkervisjes volgens de normale tabel van de ontwikkeling van Xenopus 9.
      2. Kweek embryo's in een tank gevuld met water voor het kweken van kikkervisjes. Voer vanaf stadium 45 kikkervisjes met bakvoer in poedervorm en voorzie het water van zuurstof met een bubbler. Voeg indien nodig dagelijks water toe om de verdamping te compenseren en ververs het hele tankwater wekelijks.
        OPMERKING: Als alternatief is het ook mogelijk om twee keer per week 50% van het volume te vervangen. Een gedetailleerd protocol is te vinden in10.
    4. Transgene embryo's sorteren
      1. Sorteer en selecteer transgene embryo's vanaf stadium 37/38 onder een fluorescentie-stereomicroscoop door GFP direct te visualiseren (Figuur 1C).
  3. Kikkervisje MTZ behandeling
    1. Breng Tg(rho:GFP-NTR) transgene kikkervisjes over in een tank met 10 mM MTZ-oplossing en kweek ze gedurende 1 week bij 20 °C in het donker. Gebruik transgene broers en zussen die zijn grootgebracht in kikkervisjeskweekwater met 0,1% DMSO als controle.
    2. Vervang de MTZ en de controlevloeistof om de dag tijdens de behandelingsperiode. Voer de kikkervisjes zoals gewoonlijk tijdens de MTZ-behandeling.
    3. Voor individuele fluorescentiebewaking (stap 2.4) plaatst u elk kikkervisje vanaf stap 2.3.1 in een kleine container met 30 ml MTZ of controlevloeistof.
      OPMERKING: MTZ-behandeling kan op elk moment worden uitgevoerd vanaf stadium 45.
  4. Live monitoring van staafdegeneratie
    OPMERKING: De progressieve degeneratie van de staven kan in realtime worden gevolgd. Voer daarom stap 2.4.1 uit. tot en met 2.4.4. voor de MTZ-behandeling en daarna regelmatig na de behandeling.
    1. Volg stap 1.1 en 1.3 voor de bereiding van respectievelijk de verdoving en de kikkervisjesanesthesie.
    2. Gebruik een lepel om een kikkervisje te vangen en leg het voorzichtig op een natte tissue in een kleine petrischaal (diameter 55 mm). Observeer de GFP-fluorescentie onder een fluorescerende stereomicroscoop (excitatiegolflengte = 488 nm en emissiegolflengte = 509 nm) en maak foto's van het oog. Een verminderde fluorescentie-intensiteit weerspiegelt de degradatie van staafjes.
      OPMERKING: Om kwantitatieve vergelijkingen te maken, moeten dezelfde instellingen worden aangehouden voor het afbeelden van alle kikkervisjes.
    3. Breng het afgebeelde kikkervisje over naar een grote tank met 1 L kweekwater door de petrischaal voorzichtig onder te dompelen. Houd de kikkervisjes in de gaten totdat ze volledig wakker zijn.
    4. Vergelijk de fluorescentie-intensiteit tussen MTZ-behandelde en controlekikkervisogen om de werkzaamheid van het degeneratieproces te bewaken en te beoordelen.

3. Rodceldegeneratie door CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out

OPMERKING: Dit protocol is opgesteld om een model van retinitis pigmentosa in Xenopus laevis te genereren door specifieke staafceldegeneratie te induceren met behulp van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out. Het % insertie-deletie (indels) in F0 wordt gegeven in11 en is ~75%. Zo'n CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out kan ook worden uitgevoerd in Xenopus tropicalis-kikkervisjes 11.

  1. Bereiding van oplossingen en reagentia
    1. crRNA en tracrRNA bestellen
      1. Koop het synthetische CRISPR-RNA (crRNA) dat zich richt op het rodopsine (rho)-gen en het standaard transactiverende crRNA (tracrRNA). Het crRNA is samengesteld uit een rho-doelwitspecifiek gebied (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) en een ander (GUUUUAGAGCUAUGCU) dat hybridiseert met het tracrRNA.
    2. crRNA: tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
      1. Resuspendeer crRNA en tracrRNA bij 100 μM in de nucleasevrije duplexbuffer.
      2. Bereid het gRNA-duplex voor door 3 μL 100 μM rho crRNA, 3 μL 100 μM tracrRNA en 94 μL duplexbuffer te mengen. De uiteindelijke concentraties zijn 36 ng/μL rho crRNA en 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Gloei de oligo's door ze 5 minuten op 95 °C te verwarmen en langzaam af te koelen tot kamertemperatuur. Maak aliquots en bewaar ze bij -20 °C.
    3. CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex (d.w.z. gRNA duplex/Cas9-eiwit)
      1. Bereid op het moment van gebruik het mengsel van rho-gRNA-duplex en het Cas9-eiwit. Voeg voor 20 μL 10 μL van de rho-gRNA-duplexoplossing, 2 μL Cas9-eiwit (voorraad van 5 mg/ml), 2 μL fluoresceïnelysine-dextran (voorraad van 10 mg/ml) en 6 μL RNasevrij water toe.
      2. Om het ribonucleoproteïnecomplex te vormen, incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
      3. Meng voor 20 μL van de controleoplossing 2 μL Cas9-eiwit, 2 μL fluoresceïnelysinedextran en 16 μL RNasevrij water.
    4. Voorbereiding van 10x, 1x en 0,1x MBS-oplossingen
      1. Bereid de zoutoplossing van Modified Barth (10x MBS) door 11,92 g HEPES, 51,43 g natriumchloride (NaCl), 0,75 g kaliumchloride (KCl), 2,1 g natriumbicarbonaat (NaHCO3) en 2,46 g magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4, 7 H2O) toe te voegen aan 800 ml type II water. Pas de pH aan naar 7,8 met 30% natriumhydroxide (NaOH). Voeg type II water toe tot het volume 1 L is en steriliseer door middel van autoclaveren. Bewaren bij kamertemperatuur.
      2. Bereid 1 l 1x MBS-oplossing door 100 ml 10x MBS-zoutoplossing en 7 ml 0,1 M calciumchloridedihydraat (CaCl 2, 2H2O) te verdunnen in water van type II. Bewaren bij kamertemperatuur.
      3. Bereid 0,1x MBS-oplossing door 1x MBS-oplossing te verdunnen in type II water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    5. Benzocaïne-oplossing voor volwassenen
      1. Bereid 0,05% benzocaïne-oplossing door 5 ml 10% benzocaïne-stockoplossing (zie stap 1.1.1.) toe te voegen aan 1 l kikkervisjeskweekwater. Goed mengen.
        NOTITIE: Bewaar deze oplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie. Breng de oplossing op kamertemperatuur voordat u het op dieren gebruikt.
    6. L-cysteïne-oplossing
      1. Bereid de dejellying-oplossing op het moment van gebruik door 2 g L-cysteïnezoutmonohydraat toe te voegen aan 100 ml 0,1x MBS-oplossing. Pas de pH aan naar 7,8 met 30% NaOH.
    7. Polysucrose-oplossing
      1. Bereid de dichte polysucrose-oplossing door 3 g polysucrose toe te voegen aan 100 ml 0,1x MBS-oplossing. Bewaar deze oplossing enkele weken bij 4 °C.
  2. In-vitrofertilisatie en dejellying
    OPMERKING: Meer details over Xenopus in-vitrofertilisatie zijn te vinden in een gedetailleerd speciaal protocol in12.
    1. Toediening van hormonen aan Xenopus laevis-vrouwtjes om de eisprong op te wekken
      1. Injecteer ongeveer 15 uur voor het oogsten van de eicel 600 I.E. hCG in de dorsale lymfezak van het vrouwtje en houd dit een nacht bij 18 °C.
    2. Testis dissectie
      1. Euthanaseer het Xenopus-mannetje met een dodelijke dosis 0,05% benzocaïne-oplossing gedurende 10-15 minuten. Als aanvullende euthanasiemethode snijdt u de wervelkolom direct achter de schedel door met een scherpe en stevige schaar. Open de buikholte met een dissectieschaar, knip de teelballen uit en knip eventueel aangehecht vet en haarvaten weg. Plaats elke testis onmiddellijk op ijs in 1 ml 1x MBS.
    3. Voorbereiding van het sperma
      1. Plet een testis met een stamper voor microcentrifugebuisjes en verdun de suspensie in een buisje van 15 ml met 9 ml 1x MBS. Voeg 10 μg/ml gentamicine toe aan de tweede testisbuis en houd deze een paar dagen op 4 °C voor verdere bevruchtingsexperimenten.
    4. In-vitrofertilisatie
      1. Masseer zachtjes de rug van het met hormoon geïnjecteerde vrouwtje en vang de eicellen op in een petrischaal (diameter 100 mm). Verspreid een paar druppels van de sperma-oplossing over de eicellen. Wacht 5 minuten en bedek ze met 0.1x MBS. Wacht 10 minuten voordat u verder gaat met dejellyen.
    5. Bevruchte eicel dejellying
      1. Vervang de 0.1x MBS-oplossing door de dejellying-oplossing om de geleilaag van de bevruchte eieren te verwijderen (~5 min). Spoel de embryo's 5-6 keer grondig af met 0,1x MBS en plaats ze over in een nieuwe petrischaal van 100 mm gevuld met 0,1x MBS.
  3. Voorbereiding van het micro-injectiesysteem
    1. Slijp glazen capillairen met een micropipettrekker13.
    2. Vul een geslepen capillair met 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex of de controleoplossing met behulp van een microloader-tip en plaats het capillair in de microinjectorhandler.
    3. Breek bij de hoogste vergroting van een stereomicroscoop de capillaire punt af met een fijne pincet en pas de injectietijd (~400 ms) aan om een uitwerpvolume van 10 nL per puls te verkrijgen. Stel de uitwerpdruk in op ongeveer 40 PSI.
  4. Embryo-micro-injectie in één celstadium met het CRISPR-Cas9-ribonucleoproteïnecomplex
    1. Plaats de embryo's in het eencellige stadium op een rooster (1 mm nylonweefsel) dat is vastgelijmd in een petrischaal van 100 mm gevuld met 3% polysucrose-oplossing (figuur 1D).
    2. Injecteer met behulp van de microinjector en onder een stereomicroscoop 10 nL van het CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex (wat overeenkomt met 500 pg gRNA duplex + 5 ng Cas9-eiwit per embryo) of controleoplossing op het niveau van de dierlijke pool, in het corticale gebied, net onder het cytoplasmatische membraan.
      OPMERKING: De fluoresceïne lysine dextran in de oplossing maakt het mogelijk om de geïnjecteerde embryo's vervolgens te sorteren.
    3. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een nieuwe petrischaal van 100 mm met een schone polysaccharose-oplossing en plaats ze bij 21 °C.
    4. Sorteer op de eerste dag regelmatig de goed ontwikkelde embryo's en vervang de polysucrose-oplossing ongeveer 5 uur na micro-injectie door 0,1x MBS.
    5. Wacht 24 uur na injectie om goed geïnjecteerde rho-crispante embryo's te sorteren en te selecteren onder een fluorescerende stereomicroscoop door fluoresceïne lysine-dextran te visualiseren (Figuur 1E).
      OPMERKING: Hoe eerder de micro-injectie na de bevruchting, hoe effectiever de knock-out.
  5. Opfok van embryo's en kikkervisjes
    1. Kweek rho crispante embryo's in 0,1x MBS in petrischaaltjes tot stadium 37/38. Verwijder dagelijks dode embryo's en vervang de 0.1x MBS-oplossing. Kweek vanaf stadium 37/38 embryo's in een bak gevuld met kikkervisjeskweekwater en ga vanaf stadium 45 te werk zoals in stap 2.2.3.

4. Degeneratie van netvliescellen door cytotoxische intraoculaire CoCl 2-injecties

OPMERKING: Dit protocol is opgesteld om netvliesceldegeneratie te induceren door intraoculaire injecties van kobaltchloride (CoCl2) in Xenopus laevis-kikkervisjes . Afhankelijk van de dosis kan het een kegelspecifieke degeneratie of een bredere degeneratieveroorzaken14. We gebruiken dit protocol bij Xenopus laevis kikkervisjes vanaf stadium 48 jaar. Het kan ook worden gebruikt in Xenopus tropicalis kikkervisjes.

  1. Bereiding van buffer en reagentia
    1. Bereid 0,005% benzocaïne-oplossing op het moment van gebruik zoals in stap 1.1.
    2. Bereid 100 mM CoCl2 stockoplossing door 118,5 mg toe te voegen aan 5 ml 0,1x MBS (zie stap 3.1.4 voor de bereiding van 0,1x MBS). Bewaar deze voorraadoplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
      LET OP: CoCl2 is geclassificeerd als een giftige verbinding voor het leven van mens en dier. Volg zorgvuldig de instructies voor hantering, opslag en afvalverwijdering op het veiligheidsinformatieblad.
    3. Voor kegelspecifieke degeneratie bereidt u op het moment van gebruik een 10 mM CoCl2-oplossing uit de 100 mM stockoplossing verdund in 0,1x MBS. Voor bredere degeneratie van netvliescellen bereidt u een 25 mM CoCl2-oplossing voor.
  2. Voorbereiding van het injectiesysteem
    1. Slijp glazen capillairen met een micropipettrekker 13.
    2. Vul een geslepen capillair met 2-10 μL 10 of 25 mM CoCl2-oplossing of de controlevloeistof (0,1x MBS) met behulp van een microloader-tip en plaats het capillair in de micro-injectorhandler.
    3. Breek bij de hoogste vergroting van een stereomicroscoop de capillaire punt af met een fijne pincet en pas de injectietijd aan (ongeveer 100 ms) om een uitwerpvolume van 15-40 nL per puls te verkrijgen. Stel de uitwerpdruk in op ~40 PSI.
      OPMERKING: De grootte van de druppel moet worden aangepast aan het stadium van de kikkervisjes en de grootte van hun oog. In de stadia 48-49 is de druppelgrootte bijvoorbeeld ~15-20 nL, terwijl deze 30-40 nL is in de stadia 52-56. Visueel is de grootte van de druppel iets groter dan de lensmaat.
  3. CoCl2 intraoculaire injecties
    1. Gebruik een schepnet om kikkervisjes in hun aquarium te vangen. Breng ze over naar 50 ml 0,005% benzocaïne-oplossing. Wacht een paar minuten tot de kikkervisjes niet meer reageren op de prikkels.
      OPMERKING: Meerdere kikkervisjes kunnen tegelijkertijd worden verdoofd, maar de tijd die in de verdoving wordt doorgebracht, moet minder dan 30 minuten zijn.
    2. Vang met een lepel een kikkervisje op en leg het voorzichtig in een kleine petrischaal (55 mm diameter) met daarin een natte tissue. Plaats het kikkervisje met de dorsale kant naar boven in het midden van de petrischaal (Figuur 1F,G).
    3. Gebruik de microinjector onder een stereomicroscoop om de CoCl2-oplossing intraoculair te injecteren. Steek het capillair voorzichtig in het oog over de lens. Wanneer de capillaire punt zich in het oog bevindt, werpt u twee druppels per oog uit. Draai na het injecteren van het rechteroog de petrischaal handmatig 180° om het linkeroog te injecteren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de injectie in het oog wordt uitgevoerd, dus na elke uitwerping van de oplossing moet een lichte zwelling van het oog worden gezien. Het kikkervisje moet zo min mogelijk buiten het water blijven. De injectie van beide ogen duurt minder dan 1 minuut.
    4. Breng het geïnjecteerde kikkervisje over in een grote tank met 1 L kweekwater door het voorzichtig onder te dompelen in de petrischaal (figuur 1H). Houd de kikkervisjes in de gaten totdat ze volledig wakker zijn.

5. Kleuring om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te beoordelen

  1. Kikkervisfixatie en uitdroging
    1. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing door 100 ml 32% PFA-oplossing te verdunnen tot 700 ml 1x PBS. Pas de pH aan naar 7,4 met NaOH. Aliquot deze stockoplossing en bewaar deze gedurende enkele maanden bij -20 °C.
    2. Euthanaseer de kikkervisjes in 0,01% benzocaïne en breng ze over in een injectieflacon met 4% PFA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met roeren of een nacht bij 4 °C. Spoel 3 x 5 min in 1x PBS.
    3. Kikkervisjes geleidelijk uitdrogen door opeenvolgende incubaties van 30 minuten in 70% en 95% ethanol (verdund in type II-water), gevolgd door nog drie incubaties van 1 uur in 100% ethanol. Bewaar de kikkervisjes bij deze stap bij -20 °C of breng ze een nacht direct over op 100% butanol voor verdere stappen.
  2. Paraffine secties
    1. Vervang 100% butanol door gesmolten paraffine gedurende 2 uur bij 62 °C. Vervang de paraffine gedurende 2 x 2 uur extra incubaties bij 62 °C.
    2. Breng kikkerviskoppen over in wegwerpvormen voor paraffine en oriënteer ze zo dat hun ogen goed zijn uitgelijnd en laat de paraffine vervolgens uitharden. Bewaar de blokken bij kamertemperatuur.
    3. Knip de overtollige paraffine af en monteer het blok met de ingebedde kikkervisje(s) op de microtoomsteun.
    4. Verdeel het blok met een microtoom met de juiste dikte (10-12 μm). Breng de linten over met secties op een objectglaasje dat eerder is bedekt met 3% glycerine-albumine (verdund in water).
    5. Plaats het glaasje een paar minuten op een diawarmer op 42 °C en verwijder daarna het teveel aan glycerinealbumine. Laat de glaasjes een nacht drogen in een oven van 37 °C.
    6. Dewax door de glaasjes 2 x 15 min onder te dompelen in een Coplin-pot gevuld met 100% xyleen. Rehydrateer de secties met gesorteerde ethanolreeksen: 100% tweemaal, 70%, 50% (verdund in type II water), ~5 min elk, gevolgd door 2 x 5 min in water.
  3. Etikettering van immunofluorescentie
    1. Bereid 100 mM natriumcitraat (CiNa) stockoplossing door 29,4 g natriumcitraattrinatriumzoutdihydraat (C6H, 5 Na,3, O7,2H,2O) toe te voegen aan 1 l water van type II; pas de pH aan tot 6 met zoutzuur (HCl). Steriliseer door middel van autoclaveren en bewaar enkele maanden bij kamertemperatuur. Bereid de ontmaskeringsoplossing op het moment van gebruik door 25 ml 100 mM CiNa-voorraadoplossing toe te voegen aan 225 ml type II-water. Voeg 125 μL Tween-20 toe en meng goed (eindconcentratie is 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
    2. Bereid Hoechst stockoplossing in een dosis van 10 mg/ml door 100 mg bisBenzimide H 33258 toe te voegen aan 10 ml water type I. Bewaar deze stockoplossing enkele maanden bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie. Bereid de Hoechst-oplossing in een verhouding van 7,5 μg/ml door 300 μl Hoechst-stockoplossing toe te voegen aan 400 ml 1x PBS.
      NOTITIE: Deze oplossing kan tot 10 keer worden gebruikt en ongeveer 6 maanden worden bewaard bij 4 °C, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
    3. Voer na het ontwaxen van secties antigeenextractie uit door de secties gedurende 9 minuten in de ontmaskeringsoplossing te koken. Laat de oplossing 20 minuten afkoelen.
    4. Spoel één keer in type II water en één keer in 1x PBS. Leg de objectglaasjes plat in een vochtige kamer en voeg 400-600 μL blokkeringsoplossing per glaasje toe (antilichaamverdunningsmiddel + 0,2% Triton X100) gedurende 30 min.
    5. Vervang de blokkerende oplossing door 200 μL per glaasje van het primaire antilichaam verdund in de blokkerende oplossing. Gebruik een dekglaasje om de oplossing over de secties te verdelen, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer een nacht bij 4 °C in een vochtige kamer.
    6. Doe de glaasjes in een Coplin-pot en spoel ze 3 x 10 min in 1x PBS aangevuld met 0,1 % Triton X100. Leg de objectglaasjes plat, voeg 400 μL per glaasje van het secundaire antilichaam verdund in blokkeringsoplossing toe en laat 2 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer staan.
    7. Breng de glaasjes over in een Coplin-pot en spoel ze 3 x 5 min met 1x PBS aangevuld met 0,1% Triton X100.
    8. Celkernen 10 minuten tegenkleuren met de Hoechst-oplossing en 3 x 5 minuten spoelen met 1x PBS.
    9. Plaats dekglaasjes over de objectglaasjes in een waterig montagemedium dat speciaal is ontworpen om de fluorescentie te behouden. Laat de glaasjes 1 uur drogen bij kamertemperatuur en bewaar ze bij 4 °C.
    10. Breng de objectglaasjes in beeld met een fluorescentiemicroscoop.
  4. Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) om schade aan het netvlies te beoordelen
    OPMERKING: In plaats van een bepaald celtype te labelen door middel van immunokleuring, kan de algemene histologie van het netvlies worden beoordeeld met H&E-kleuring.
    1. Voer na het verwijderen van secties nucleïnezuuretikettering uit door objectglaasjes gedurende 2 minuten onder te dompelen in hematoxyline-oplossing. Goed afspoelen met kraanwater.
    2. Voer cytoplasma-etikettering uit door objectglaasjes gedurende 1 minuut onder te dompelen in 1% eosine-oplossing. Spoel snel af met water.
      LET OP: Eosine is zeer goed oplosbaar; Als de glijbanen te lang in het water blijven liggen, verdwijnt alle kleurstof.
    3. Spoel 2 x 5 min in 100% ethanol en 2 x 5 min in xyleen.
    4. Plaats onder de motorkap dekglaasjes over de geleiders in 4-5 druppels van een montagemedium. Laat de objectglaasjes drogen onder een kap en fotografeer ze de volgende dag met een microscoop.
  5. Detectie van apoptotische cellen
    1. Volg na het ontwaxen van secties (zie rubriek 5.2.6) het protocol van de fabrikant van de kit om apoptotische DNA-fragmentatie te detecteren.
    2. Voer de kleuring van de kernen uit door objectglaasjes onder te dompelen in de Hoechst-oplossing (zie punt 5.3.8) en monteer met een waterig montagemedium dat speciaal is ontworpen om de fluorescentie te behouden. Laat de glaasjes 1 uur drogen bij kamertemperatuur en bewaar ze bij 4 °C.
    3. Breng de objectglaasjes in beeld met een fluorescentiemicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Mechanisch netvliesletsel
Retinale secties van kikkervisjes die onderhevig zijn aan de mechanische verwonding beschreven in protocolsectie 1 tonen aan dat de retinale laesie alle lagen van het weefsel omvat, terwijl het beperkt blijft tot de punctieplaats (Figuur 2A,B).

Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem
De ogen van verdoofde Tg(rho:GFP-NTR) transgene kikkervisjes die...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor- en nadelen van verschillende paradigma's voor netvliesbeschadiging bij Xenopus-kikkervisjes

Mechanisch netvliesletsel
Verschillende chirurgische verwondingen van het neurale netvlies zijn ontwikkeld bij Xenopus-kikkervisjes. Het neurale netvlies kan ofwel volledig worden verwijderd15,16 of slechts gedeeltelijk worden weggesneden 16,17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan M.P. van de Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) en UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in samenwerking met ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-Propanediol (propylène glycol)Sigma-Aldrich398039
Absolute ethanol ≥99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)Cell signaling9661SDilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
Benzocaine Sigma-AldrichE1501Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%VWR chemicals20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluent AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Electronic Rotary MicrotomeThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% aqueousRAL Diagnostics312740
Fluorescein lysine dextran  Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescent stereomicroscopeOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Glycerin albumin acc. MalloryDiapathE0012Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
Human chorionic gonadotropin hormoneMSD Animal HealthChorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Use at 10 mM
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Mounting medium, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µmSefar06-1000/44
Paraffin histowax without DMSOHistolab00403
Paraformaldehyde solution (32%)Electron Microscopy SciencesEM-15714-SUse at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsEpredia2219
PestleVWR431-0094
Petri Dish 100 mmCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 mmCorning GosselinBP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Powdered fry food : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Scissors dissectionFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost 

Referenties

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Retinale regeneratieMüller-gliacellenmechanische retinale beschadigingfotoreceptorablatieCRISPR rhodopsine-knock-outkobaltchloride-injectiefluorescent stereomicroscoopretinale degeneratie
Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.