Methodenartikel

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65778

⸱

13 oktober 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis is een van de meest gebruikte muizenmodellen van multiple sclerose. In het huidige protocol worden C57BL/6J-muizen van beide geslachten geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide, wat voornamelijk resulteert in oplopende parese van de staart en ledematen. Hier bespreken we het protocol van EAE-inductie en -evaluatie.

Samenvatting

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast. Het wordt gekenmerkt door een verschillende prevalentie bij de geslachten, die meer vrouwen dan mannen treft, en verschillende uitkomsten, met agressievere vormen bij mannen dan bij vrouwen. Bovendien is MS zeer heterogeen in termen van klinische aspecten, radiologische en pathologische kenmerken. Het is dus noodzakelijk om gebruik te maken van experimentele diermodellen die het mogelijk maken om zoveel mogelijk aspecten van de pathologie te onderzoeken. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) vertegenwoordigt een van de meest gebruikte modellen van MS bij muizen, waarbij verschillende ziektekenmerken worden gemodelleerd, van de activering van het immuunsysteem tot schade aan het CZS. Hier beschrijven we een protocol voor de inductie van EAE in zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6J-muizen met behulp van myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55) immunisatie, wat leidt tot de ontwikkeling van een chronische vorm van de ziekte. We rapporteren ook de evaluatie van de dagelijkse klinische score en motorische prestaties van deze muizen gedurende 28 dagen na immunisatie (28 dpi). Ten slotte illustreren we enkele fundamentele histologische analyses op het niveau van het CZS, met de nadruk op het ruggenmerg als de primaire plaats van door de ziekte veroorzaakte schade.

Inleiding

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast. Het toont de aanwezigheid van perivasculaire infiltratie van ontstekingscellen, demyelinisatie, axonaal verlies en gliose1. De etiologie ervan blijft onbekend, en de klinische aspecten, radiografische en pathologische kenmerken suggereren een opmerkelijke heterogeniteit in de ziekte.

Vanwege de onbekende etiologie en complexiteit is er op dit moment geen enkel diermodel dat alle klinische en radiologische kenmerken recapituleert die worden vertoond bij menselijke MS 3,4. Er worden echter verschillende diermodellen gebruikt om verschillende aspecten van MS 3,4 te bestuderen. In deze modellen is het ontstaan van de ziekte doorgaans extreem kunstmatig en verschilt het tijdsbestek van het begin van klinische symptomen tussen mensen en muizen. Bij mensen zijn de pathofysiologische processen die ten grondslag liggen aan de ziekte bijvoorbeeld jarenlang onopgemerkt gebleven vóór het begin van klinische manifestaties. Omgekeerd kunnen de onderzoekers symptomen in diermodellen detecteren binnen enkele weken of zelfs dagen na MS-inductie4.

Drie basisdiermodellen produceren de kenmerken van demyelinisatie die kenmerkend zijn voor MS: modellen die door het virus worden geïnduceerd (bijv. Theiler's muizenencefalomyelitisvirus), modellen die worden geïnduceerd door toxische stoffen (bijv. cuprizon, lysolecithine) en de verschillende varianten van experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE)5. Elk model helpt bij het bestuderen van enkele specifieke facetten van de ziekte, maar geen enkel model repliceert alle kenmerken van MS6. Het is dus van cruciaal belang om het juiste model te kiezen, rekening houdend met de specifieke experimentele behoeften en de wetenschappelijke vragen die moeten worden beantwoord.

Dankzij immunisatieprocedures tegen myeline-afgeleide antigenen wordt EAE geïnduceerd door een auto-immuunrespons op CZS-componenten bij gevoelige muizen op te wekken. De wisselwerking tussen een breed scala aan immunopathologische en neuropathologische mechanismen veroorzaakt de ontwikkeling van de belangrijkste pathologische kenmerken van MS (d.w.z. ontsteking, demyelinisatie, axonaal verlies en gliose) bij de geïmmuniseerde muizen 7,8. Muizen beginnen klinische symptomen te vertonen rond de tweede week na immunisatie en vertonen over het algemeen oplopende verlamming van de staart tot de ledemaat en voorpoot. De klinische score (d.w.z. kwantificering van de accumulatie van ziektegerelateerde tekorten) wordt over het algemeen beoordeeld met behulp van een 5-puntsschaal7.

Actieve immunisatie met eiwit of peptide of passieve overdracht van encefalitogene T-cellen kan worden gebruikt om EAE te induceren bij muizen met verschillende genetische achtergronden (bijv. SJL/J, C57BL/6 en niet-zwaarlijvig-diabetische (NOD) muizen). Myeline-proteolipide-eiwit (PLP), myeline-basisch eiwit (MBP) en myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG) zijn voorbeelden van zelf-CZS-eiwitten waaruit gewoonlijk immunogenen worden geproduceerd. Met name SJL/J-muizen geïmmuniseerd met het immunodominante epitoop van PLP (PLP139−151) ontwikkelen een relapsing-remitting (RR) ziekteverloop, terwijl C57BL/6J-muizen geïmmuniseerd met het immunodominante MOG35-55-peptide EAE vanchronische aard vertonen1. Ondanks enkele beperkingen, zoals het verstrekken van zeer weinig informatie over de progressie van MS, de rol van B-cellen in de ziekte, de inside-out-mechanismen of moeilijkheden bij het bestuderen van remyelinisatie, hebben de EAE-modellen enorm bijgedragen aan het begrip van auto-immuun- en neuro-inflammatoire processen, waardoor de kennis op het gebied van MS is toegenomen en zo de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor deze ziekte mogelijk is geworden. 6. okt.

In het huidige werk hebben we ons gericht op een bepaalde vorm van actieve EAE, de myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55)-geïnduceerde vorm 9,10,11,12. De MOG35-55-geïnduceerde EAE modelleert een chronische vorm van MS. Na immunisatie ondergaan de muizen een asymptomatische fase binnen de eerste week na immunisatie, waarna de ziekte meestal optreedt tijdens de tweede week na immunisatie, terwijl tussen de derde en vierde week na immunisatie de ziekte chronisch wordt, zonder mogelijkheid tot volledig herstel van de geaccumuleerde tekorten 7,8,13. Interessant is dat er geen verschillen tussen mannen en vrouwen worden waargenomen in incidentie, begin van de ziekte, verloop of progressie in de meeste onderzoeken die in de literatuur aanwezigzijn14, ook al vergelijken minder onderzoeken de ziekte bij mannen en vrouwen.

Bij mensen daarentegen is bekend dat deze parameters sterk seksueel dimorf zijn2. MS treft meer vrouwen dan mannen; Mannen ontwikkelen echter over het algemeen een agressievere vorm van de ziekte. Dit bewijs heeft een essentiële, maar ook complexe, rol van de gonadale hormonen gesuggereerd15; Desalniettemin blijven de rol en het werkingsmechanisme van geslachtshormonen in de pathologie onduidelijk. Bovendien ondersteunen gegevens van diermodellen het idee dat zowel oestrogenen als androgenen op een geslachtsspecifieke manier positieve effecten uitoefenen op verschillende delen van de pathologie16,17.

Sommige studies suggereren ook neuroprotectieve, promyeliniserende en ontstekingsremmende effecten van progesteron18 en, hoewel bewijs bij MS-patiënten schaars is18, kunnen neuroactieve steroïden (d.w.z. de novo gesynthetiseerde steroïden door het zenuwstelsel, zoals pregnenolon, tetrahydroprogesteron en dihydroprogesteron) ook het pathologische beloop beïnvloeden19. Gezamenlijk ondersteunen deze gegevens het idee dat geslachtshormonen die zowel perifeer als in het CZS worden geproduceerd, een belangrijke en geslachtsspecifieke rol spelen bij het ontstaan en de progressie van de ziekte. Daarom dringen we in dit werk aan op het verzamelen van afzonderlijke gegevens van zowel mannelijke als vrouwelijke dieren.

Vanuit histopathologisch oogpunt dient de witte stof van het ruggenmerg als de belangrijkste plaats van CZS-letsel in dit model, dat wordt gekenmerkt door multifocale, confluente regio's van mononucleaire inflammatoire infiltratie en demyelinisatie8. Bij het beschrijven van dit protocol voor de inductie van MOG35-55-geïnduceerde EAE in C57BL/6J-muizen, zullen we dus rekening houden met de uitkomst van de ziekte bij de twee geslachten en enkele histopathologische inzichten geven met betrekking tot het ruggenmerg.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De verzorging en behandeling van de dieren in het kader van dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Unie van 22september 2010 (2010/63/UE); alle procedures die in deze studie zijn gerapporteerd, zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (407/2018-PR) en door de ethische commissie van de Universiteit van Turijn (projectnr. 360384). We raden aan om het experimentele ontwerp te conformeren aan de ARRIVE-richtlijnen die oorspronkelijk zijn gepubliceerd door Kilkenny et al. in 201020. Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat de benodigde materialen beschikbaar zijn (zie Tabel met materialen). Steriliseer al het glaswerk en keukengerei dat wordt gebruikt voor de bereiding van de MOG35-55-emulsie in een autoclaaf. Een samenvatting van de experimentele procedures is weergegeven in figuur 1.

1. Bereiding van MOG35-55 emulsie

OPMERKING: Om de emulsie te bereiden, zijn MOG35-55, onvolledig Freud's adjuvans (IFA), Mycobacterium Tuberculosis stam H37Ra (MT) en fysiologische oplossing vereist (zie Tabel met materialen).

LET OP: Door hitte gedode MT kan de aangeboren immuunrespons stimuleren. Vermijd inademing, inslikken en contact met huid en ogen met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en weeg MT in een afgedekte bovenweger onder de motorkap.

OplossingCompositieNotities
2 mg/ml MOG35-55 peptide-oplossingGevriesdroogd MOG35-55-peptide verdund in fysiologische oplossing met een concentratie van 2 mg/mlBewaar de reeds verdunde oplossing bij -80 °C.
5 μg/ml PT-oplossingGevriesdroogde PT verdund in fysiologische oplossing in een concentratie van 5 μg/ml.Bewaar de reeds verdunde oplossing bij -80 °C.
EmulsieHet totale volume emulsie dat nodig is voor elke muis die moet worden geïmmuniseerd, is 300 μL als volgt verdeeld:Om wisselingen of besmetting te voorkomen, bereidt u de emulsie op de dag van de immunisatie.
200 μg/muis MOG35-55 , d.w.z. 100 μL MOG35-55 2 mg/ml oplossing.
50 μL fysiologische oplossing
150 μL IFA
4 mg/ml MT, d.w.z. 1,2 mg/muis
Fysiologische oplossingNatriumchloride 0,9% verdund in gedestilleerd water.

Tabel 1: Samenstelling van de oplossingen die worden gebruikt voor de immunisatieprocedure.

  1. Bereid de oplossing in een glazen bekerglas, voeg eerst de vloeibare component toe en tenslotte de MT.
    OPMERKING: Het totale volume emulsie dat nodig is voor elke muis die moet worden geïmmuniseerd, is 300 μL, gedeeld zoals aangegeven in tabel 1. De emulsie is erg stroperig en dik, dus tijdens de bereidings- en injectieprocedure kan er wat verlies optreden, vooral bij het bereiden van de oplossing voor een paar muizen. We raden aan om het uiteindelijke volume van de emulsie dat nodig is te berekenen door het aantal te immuniseren muizen met ten minste 1,5-2-voudig te overschatten.
  2. Plaats het bekerglas in ijs en gebruik de glazen spuit met een naald van 18 G om de oplossing te emulgeren.
    OPMERKING: De emulsie kan ook met andere strategieën worden bereid, bijvoorbeeld door de twee luchtvrije glazen spuiten te verbinden met een driewegkraan en de oplossing te mengen door de zuigers heen en weer te duwen21,22.
  3. Emulgeer de oplossing gedurende ten minste 15 minuten; Over het algemeen is 30 minuten emulgeren voldoende. Om de kwaliteit van de emulsie te controleren, voegt u een druppel emulsie toe in een transparante container gevuld met water: als de druppel zijn structuur behoudt en intact blijft, is de emulsie klaar.
  4. Plaats de emulsie direct in de spuiten van 1 ml die voor de immunisatie zullen worden gebruikt en bewaar deze tot gebruik bij +4 °C om de dikte van de emulsie te behouden en veranderingen of besmettingen te voorkomen.

2. Selectie en immunisatie van dieren

  1. Dierlijke selectie
    1. Selecteer volwassen C57BL/6J-muizen van beide geslachten op een leeftijd van 8-10 weken met een optimaal lichaamsgewicht van ~20 g. Zorg ervoor dat u muizen van dezelfde leeftijd en geslacht selecteert voor verschillende experimentele groepen, omdat de gevoeligheid voor ziekten kan variëren met leeftijd en geslacht.
      OPMERKING: Muizen moeten op de dag van immunisatie een vergelijkbaar lichaamsgewicht hebben, omdat de huidige procedure is geoptimaliseerd voor een bepaald lichaamsgewichtbereik (17-25 g).
    2. Huisvest dieren van hetzelfde geslacht in groepen (n = 4-5/kooi) om sociaal isolement te voorkomen in standaardomstandigheden in muizenkooien van 45 cm x 25 cm x 15 cm polypropyleen bij 22 ± 2 °C, onder 12:12 licht/donkercyclus (lichten aan om 08:00 uur). Zorg voor voedsel en water ad libitum.
      OPMERKING: Om de potentiële variabiliteit van het ziekteverloop bij de geïmmuniseerde dieren verder te beperken, stellen we uiteindelijk ook voor om voldoende experimentele groepen te vormen. Er zijn ook studies 8,23 die de timing van immunisatie beschrijven als een aandoening die de variatie in EAE-uitkomst bepaalt. Daarom raden we aan om de immunisatie bij alle dieren ongeveer op hetzelfde uur uit te voeren, bij voorkeur tijdens de lichturen van de dagelijkse licht/donker-cyclus23. Om stress te beperken, verdient het de voorkeur om de dieren vóór de dag van immunisatie te manipuleren en ze te markeren om ze gemakkelijk te identificeren voor dagelijkse evaluatie, bijvoorbeeld oorknippen of taggen.
  2. De immunisatieprocedure
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de procedure wordt uitgevoerd door een ervaren onderzoeker om stress voor dieren te minimaliseren en immunisatie te optimaliseren. Voordat u met de immunisatie begint, selecteert u de anesthesiemethode in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele dierenverzorging en ethische commissie. Ons laboratorium maakt gebruik van korte anesthesie met isofluraan.
    1. Verdoof de muis: 4% isofluraan voor anesthesie-inductie en 1,5-2% isofluraan voor anesthesieonderhoud. Wacht tot de anesthesie effectief is en gebruik een teenknijp in de voor- en voorvoet om het niveau van anesthesie te beoordelen. Om uitdroging van de ogen te voorkomen terwijl de muis onder narcose is, gebruikt u een door dierenartsen goedgekeurde oogzalf.
    2. PT intraveneuze injectie in de laterale caudale ader: sluit de staart van de muis voorzichtig af met een ethanoloplossing, die werkt als een vaatverwijdend, om de aderen weer te geven. Concentreer u op een van de twee laterale aders van de staart en injecteer met een injectiespuit van 0,5 ml met een naald van 30 g 500 ng PT (d.w.z. 100 μl PT verdund in fysiologische oplossing in een concentratie van 5 μg/ml).
    3. Subcutane injectie van MOG35-55-emulsie : voer met behulp van de spuit van 1 ml met een naald van 26 G drie subcutane injecties van de eerder bereide emulsie uit: twee onder het rostrale deel van de flanken en één aan de basis van de staart. Het volume van de emulsie die op elke plaats wordt geïnjecteerd, is 100 μL, voor een totaal volume van 300 μL emulsie dat in elke muis wordt geïnjecteerd.
      OPMERKING: De dag van immunisatie wordt geregistreerd als dag 0 na immunisatie (dpi); 48 uur later (d.w.z. bij 2 dpi) is het noodzakelijk om nog een intraveneuze injectie van PT uit te voeren die gelijk is aan de eerder uitgevoerde injectie. Het is mogelijk om de injectie zonder verdoving uit te voeren met behulp van een muisbeschermer. De hier beschreven procedure heeft tot doel het anesthetiseren van de muizen tijdens de immunisatieprocedure te induceren en te handhaven om mogelijk ongemak en bewegingen van de dieren of risico's voor zowel muizen als onderzoekers te voorkomen. Er zijn dus geen chirurgische ingrepen. Om de experimentele processen te optimaliseren, is het echter belangrijk om tijdens deze stappen de juiste steriele omstandigheden te handhaven en de toestand van de muis na deze procedures te controleren.
    4. Om te controleren of de muis is hersteld van de injecties, plaatst u hem na de procedures in een schone kooi en wacht u tot hij weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. Nadat de muis volledig is hersteld, plaatst u hem terug in de thuiskooi met andere dieren.

3. Follow-up van EAE

  1. Lichaamsgewicht en voedselinname
    1. Controleer dagelijks het lichaamsgewicht van de dieren met behulp van een elektronische bovenweger, omdat de afname van het lichaamsgewicht een indicator is voor ziekteprogressie.
      LET OP: Deze daling mag niet hoger zijn dan een bepaald percentage, volgens de richtlijnen van de institutionele en ethische commissie voor dierenverzorging. Gewoonlijk, als een dier meer dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht verliest (d.w.z. het gewicht geregistreerd bij 0 dpi), moet het worden opgeofferd als de toepassing van het humane eindpunt. De euthanasiemethoden omvatten diepe onomkeerbare anesthesie voor inhalatie (bijv. 5% isofluraan) gevolgd door onthoofding.
    2. Bewaak de voedselinname (FI) - het voedsel dat een dier op een dag eet (g∙day-1∙animal-1), weeg de hoeveelheid voedsel in de specifieke container minstens één keer per week en verdeel de hoeveelheid gegeten voedsel voor de verstreken dagen over twee opeenvolgende metingen en het aantal dieren dat in de kooi aanwezig is.
      OPMERKING: Met deze meting kan de gemiddelde voedselinname worden geschat. Vanwege het verschijnen en de opeenstapeling van klinische ziekteverschijnselen, waarbij de ledematen verlamd raken, raden we aan om wat gedrenkt voedsel op de bodem van de kooi te leggen wanneer de dieren niet in staat zijn om stevig op hun achterpoten te staan en de voedselcontainer of de waterfles te bereiken. Om de voedselinname tijdens de follow-up periode zo nauwkeurig mogelijk te beoordelen, hebben we ook het drooggewicht van dit voer gemeten voordat we het nat maakten voor de muizen.
  2. Evaluatie van de oestrische cycliciteit tijdens EAE
    1. Controleer de oestrische cyclus gedurende ten minste twee cycli en evalueer de vaginale cytologie-uitstrijkjes zoals beschreven door McLean et al.24. Classificeer de fase van de oestrische cyclus op basis van de aanwezigheid van drie primaire celtypen - kernepitheelcellen, verhoornde plaveiselepitheelcellen en leukocyten - in de vaginale uitstrijkjes, als volgt:
      1. Classificeer als pro-oestrus op basis van een bijna exclusieve aanwezigheid van clusters van ronde, goed gevormde kernepitheelcellen.
      2. Classificeer als oestrus op basis van de overheersende aanwezigheid van dicht opeengepakte clusters van verhoornde plaveiselepitheelcellen.
      3. Classificeren als metestrus op basis van de overheersende aanwezigheid van kleine, donker gekleurde leukocyten en de geringe aanwezigheid van verhoornde plaveiselepitheelcellen.
      4. Classificeer als diestrus op basis van de zeer overheersende aanwezigheid van kleine, donker gekleurde leukocyten en zeldzame verhoornde plaveiselepitheelcellen, samen met het mogelijke verschijnen van kernvormige epitheelcellen.
        OPMERKING: Bij het evalueren van de ziekte bij beide geslachten is het belangrijk om de variabiliteit bij vrouwen als gevolg van de oestrische cyclus te controleren. We stellen voor om ons te concentreren op de evaluatie van de oestrische cyclus, vooral tussen de eerste en de tweede week na immunisatie (d.w.z. tijdens de acute fase van de EAE). Eerder is aangetoond dat de immunisatieprocedure de meest uitgesproken veranderingen van de oestrische cyclus binnen deze faseveroorzaakt 25. Bovendien is het belangrijk om te bedenken dat het uitvoeren van het uitstrijkje wanneer het dier een hoge klinische score bereikt (vooral >3) moeilijk is vanwege de posterieure parese en het gebrek aan tonus in de achterpoten.
  3. Klinische score
    1. Laat een geblindeerde onderzoeker dagelijks de klinische score van de dieren beoordelen. Ken aan elk dier een score toe van 0 tot 5 (zie tabel 2) om het ziekteverloop26 te evalueren zoals beschreven door Racke7.
      OPMERKING: Net als bij de afname van het lichaamsgewicht, is ook een humaan eindpunt nodig voor de toename van klinische scores, volgens de richtlijnen van de institutionele en ethische commissie voor dierenverzorging. Over het algemeen geldt dat als een dier niet langer in staat is zichzelf autonoom te voeden (dit gebeurt meestal wanneer een dier ten minste de score van 4 bereikt, volgens de schaal die we gebruiken), het moet worden opgeofferd als de toepassing van het humane eindpunt.
  4. Evaluatie van de motorprestaties door middel van rotarod-test
    OPMERKING: Evaluatie van de EAE-progressie wordt meestal uitgevoerd door dagelijks de klinische score toe te kennen, wat wordt gedaan door een volledig getrainde geblindeerde onderzoeker. Het zou echter nuttig kunnen zijn om het te flankeren met een meer kwantitatieve en objectieve evaluatie van de progressie van de ziekte. In een eerdere studie26 werd de rotarod-test gebruikt om de motorische prestaties van de geïmmuniseerde dieren te meten. Zoals beschreven door van den Berg et al.27, kan de evaluatie van de motorische prestaties door de rotarod-test de klinische scorebeoordeling ondersteunen om een meer kwantitatieve en nauwkeurige klinische evaluatie van het ziekteverloop te hebben. Voor een uitgebreide beschrijving, zie van den Berg et al.27.
    1. Laat de muizen dagelijks rotarod-sessies ondergaan, vanaf 1 dpi tot het offer (d.w.z. 28 dpi). Elke sessie bestaat uit een enkele sessie van 300 s waarin de hengelsnelheid lineair moet worden verhoogd van 4 naar 40 tpm.
    2. Registreer de score van het dier. Wanneer de muis niet in staat is om zijn evenwicht te bewaren en van het apparaat valt, valt hij op de grond en activeert een sensor, en de tijd(en) worden geregistreerd. De prestaties worden dus gescoord als latency to fall(s).

GraadKlinisch tekenBeschrijving
0GezondGeen waargenomen klinisch symptoom. Het dier vertoont een normale toon en beweging van de staart. Hij loopt zonder te struikelen.
0.5Verstoorde poortHet dier struikelt tijdens het lopen op een grill.
1Slappe staartWanneer het dier aan de basis van de staart wordt opgepakt, gaat de staart hangen (slappe staart).
1.5Slappe staart en verminderde poortHet dier heeft een slappe staart en struikelt tijdens het lopen op een grill.
2AtaxieHet dier heeft moeite met opstaan als het eenmaal op zijn rug is gedraaid.
2.5Ataxie en parese van de achterpotenHet dier kan niet opstaan als het eenmaal op zijn rug is gedraaid en het verliest de toon van een van zijn achterpoten.
3Verlamming van de achterpotenHet dier verliest de tonus van beide achterpoten.
3.5Verlamming van de achterpoten en/of parese van de voorpotenHet dier verliest de tonus van beide achterpoten en een deel van de voorpoten. In feite vertoont het een verlies van kracht in de greep van de voorpoten.
4Tetra pareseHet dier verliest volledig de tonus van zijn ledematen.
4.5Tetraparese en verlaagde lichaamstemperatuurHet dier verliest volledig de tonus van zijn ledematen en vertoont een daling van de lichaamstemperatuur (het is koud).
5Stervend of doodHet dier is stervende (het reageert niet op een stimulus) of dood.

Tabel 2: Klinisch scoresysteem dat wordt gebruikt om EAE-progressie te beoordelen.

4. Evaluatie van EAE-geïnduceerde histopathologische symptomen op het niveau van het ruggenmerg

OPMERKING: Hier beschrijven we kort de procedure om de dieren te offeren en het ruggenmerg te verzamelen om histopathologische analyse uit te voeren; Voor een gedetailleerde beschrijving, zie deze referenties 10,26,28,29.

  1. Fixatie en weefselbemonstering
    OPMERKING: Voor een gedetailleerde beschrijving, zie deze referenties 10,26.
    1. Offeren van de dieren bij 28 dpi tijdens de chronische fase van de ziekte.
      1. Verdoof de muizen door diepe onomkeerbare anesthesie (intraperitoneale injectie van Zolazepam en Tiletamine 80 mg/kg / Xylazine 10 mg/kg).
      2. Transcardieel doordrenken de muizen met een zoutoplossing, gevolgd door een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing.
        NOTITIE: Let op bij het gebruik van PFA: aangezien het giftig is, vermijd inademing, inslikken en contact met huid en ogen met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Weeg het poeder, bereid de oplossing voor en voer de perfusie uit onder de kap.
    2. Verwijder het ruggenmerg van de wervelkolom30.
    3. Bewaar het ruggenmerg gedurende 24 uur in een 4% PFA-oplossing.
    4. Voer meerdere wasbeurten uit in 0,01 M zoutfosfaatbuffer (PBS).
    5. Veranker het ruggenmerg in paraffineblokken30.
  2. Histologische procedures
    OPMERKING: Voor een gedetailleerde beschrijving, zie Montarolo et al.10.
    1. Gebruik een microtoom om 10 μm dikke dwarse ruggenmergsecties door te snijden en verzamel ze op met gelatine beklede glaasjes. Oriënteer het doorsnijvlak zodat het overeenkomt met de tekeningen die overeenkomen met de dwarsdoorsneden van de ruggenmergatlas van de muis31.
    2. Voer de deparaffinisatie van de secties32 uit.
    3. Kleur de sectie met hematoxyline en eosine32.
    4. Dehydrateer de secties32.
    5. Bedek de secties met een montagemedium en laat ze drogen bij kamertemperatuur onder een chemische kap.
      OPMERKING: Hematoxyline-Eosine-kleuring maakt de detectie mogelijk van de aanwezigheid van de perivasculaire inflammatoire infiltraten (PvII's)26, wat wordt beoordeeld als een teken van de ziekte28.
  3. Kwantitatieve analyse van ruggenmergsecties
    1. Maak beelden van de gekleurde delen met een optische microscoop die is aangesloten op een digitale camera met een 20x objectief29.
    2. Analyseer het verkregen beeld om het aantal PvII's te verkrijgen, uitgedrukt als het aantal infiltraten per mm2.
      OPMERKING: Voor de analyse van de verkregen beelden is het handig om gebruik te maken van beeldanalysesoftware. Neuropathologische bevindingen die in dit werk worden gepresenteerd, worden gekwantificeerd in 10 volledige dwarsdoorsneden van het ruggenmerg per muis (n = 8/groep) die representatief zijn voor het hele ruggenmergniveau.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

EAE-follow-up na immunisatie
Dit werd beoordeeld zoals hieronder beschreven.

Lichaamsgewicht en voedselinname
De tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) (geslacht en tijd als onafhankelijke variabelen) laat een afname zien van het BW van EAE-dieren van beide geslachten, vooral in de tweede week na inductie (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figuur 2A). Het seksuele dimorfisme in BW blijft echter altijd b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het MOG35-55-geïnduceerde EAE-protocol dat we beschreven leidde tot de ontwikkeling van een chronische vorm van MS in C57BL/6J-muizen 7,8,13. In deze representatieve resultaten rapporteerden we dat de dieren van beide geslachten die de immunisatieprocedure ondergingen, een chronische vorm van de ziekte ontwikkelden (d.w.z. ze herstellen niet volledig na het begin van de ziekte, ze accumuleren tekorten en behouden een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR-project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 en 2023-2027 aan Afdeling Neurowetenschappen Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Italië. BB was fellow van INFRA-P, regio Piemonte (n.378-35) (2022-2023) en PRIN 2020 - 20203AMKTW. Wij danken Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) voor de steun. De publicatiekosten zijn ondersteund door de vriendelijke donatie van Distretto Rotaract 2031, en in het bijzonder Rotaract Club Torino Nord-Est. Wij danken Elaine Miller voor het proeflezen van ons manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm naald voor de glazen spuit TerumoTER-HYP-18G-112-PIN
Digitale camera aangesloten op de optische microscoopNIKON DS-U1 digitale camera
Elektronische precisiebalansMerckMod. Kern-440-47N, resolutie 0,1 g
Eosine YSigma-AldrichHT110216
Glazen spuitpijpje “ultra asept” 10 mlSacco System L003465
Glazen artikelen (dwz, becker om de emulsie voor te bereiden)VWR213-1170, 213-1172
Hematoxylinen (Mayer’s)Sigma-AldrichMHS32Filter voor gebruik. 
BeeldanalysesoftwareFiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)Sigma-AldrichF5506Bewaar op +4 °C. 
IsofluraanWellona PharmaDit medicijn wordt gebruikt als inhalatieanesthesie.
Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J muizenJackson Laboratory, EnvigoLeeftijd 8-10 weken, optimaal lichaamsgewicht van ~20 g. 
MicrotoomLeica HistoCore BIOCUT R
Montagemedium Merck107961
Muis RotarodUgo Basile #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), stam H37Ra Difco Laboratories Inc. 231141Bewaar op +4 °C.
Myeline oligodendrocyte glycoproteïne peptide 35-55 (MOG35-55)EspikemEPK1Bewaar op -80 °C verdund (2 mg/mL) in fysiologische oplossing; bereid het op de dag van de immunisatie voor om zo veel mogelijk veranderingen of besmettingen te voorkomen. 
Optische microscoopNIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127Bewaar op +4 °C eenmaal verdund (4%) in fosfaatbuffer. 
Pertussis toxine (PT)Duotech PT.181Bewaar op -80°C verdund (concentratie 5 µg/mL) in fysiologische oplossing 
Fysiologische oplossing (natriumchloride 0,9%-oplossing)B. EurospitalA 032182038Bewaar op +4 °C eenmaal geopend.
Fosfaatbuffer met zout (PBS)Thermo ScientificJ61196.AP
Software voor beeldacquisitie NIS-Element AR 2.10
Spuiten U-100 0,5 ml met 30 G x 5/16” (0,30 x 8 mm) in vaste naald NiproSYMS-0.5U100-3008B-EC
Spuiten U-100 1 ml met 26G x ½” (0,45 x 12,7 mm) in naaldPIC20,71,26,03,00,354
Vetzalf voor ogenLacrilube, Lacrigel Europhta
XylazinRompunDit mengsel van geneesmiddel wordt gebruikt als injecteerbare anesthesie en sedativum. 
Zolazepam en TiletamineZoletil  100Dit medicijn wordt gebruikt als injecteerbare anesthesie, sedativum, spierverslapper en pijnstiller

Referenties

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185(2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791(2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831(2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151(2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058(2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833(2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412(2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778(2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4(2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084(2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50(2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924(2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Trefwoorden

Multiple Sclerose modelMOG 35 55 immunisatiesekseverschillen MSC57BL 6J muizenbeoordeling van de klinische scorerotarod testneuro inflammatoire processenhistologie van het ruggenmergdemyeliniserende ziekte

Gerelateerde artikelen