Methodenartikel

Geoptimaliseerde kernisolatie van verse en diepgevroren solide tumormonsters voor multioomsequencing

DOI:

10.3791/65831

⸱

13 oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multioomsequencing, die same-cell/paired single-cell RNA levert en de test voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-sequencing) gegevens, vertegenwoordigt een doorbraak in ons vermogen om tumorcelheterogeniteit te onderscheiden - een primaire focus van translationeel kankeronderzoek op dit moment. De kwaliteit van de sequentiegegevens die met behulp van deze geavanceerde modaliteit worden verkregen, is echter sterk afhankelijk van de kwaliteit van het invoermateriaal.

De verteringsomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd om de celopbrengst te maximaliseren zonder in te boeten aan kwaliteit. Dit is vooral een uitdaging in de context van solide tumoren met dichte desmoplastische matrices die voorzichtig moeten worden afgebroken voor celafgifte. Vers geïsoleerde cellen uit solide tumorweefsel zijn kwetsbaarder dan cellen die uit cellijnen zijn geïsoleerd. Aangezien de geïsoleerde celtypen heterogeen zijn, moeten bovendien omstandigheden worden gekozen om de totale celpopulatie te ondersteunen.

Ten slotte moeten de nucleaire isolatieomstandigheden worden geoptimaliseerd op basis van deze kwaliteiten in termen van lysistijden en soorten/verhoudingen van reagens. In dit artikel beschrijven we onze ervaring met nucleaire isolatie voor het 10x Genomics multioom sequencing platform uit solide tumorspecimens. We geven aanbevelingen voor weefselvertering, opslag van eencellige suspensies (indien gewenst) en nucleaire isolatie en beoordeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naarmate onze kennis van tumorbiologie groeit, is ook het belang van het analyseren van heterogene cellen in de micro-omgeving van de tumor toegenomen 1,2. De mogelijkheid om single-cell RNA en de test voor transposase-toegankelijk chromatine te verwerven met sequencing (ATAC-sequencing) gegevens van dezelfde cel op een gepaarde cel-manier (multioomsequencing) biedt een aanzienlijke vooruitgang in de richting van dit doel 3,4. Deze experimenten zijn echter duur en tijdrovend en de kwaliteit en impact van de verkregen gegevens zijn sterk afhankelijk van de kwaliteit van de experimentele omstandigheden en materialen. Gestandaardiseerde protocollen voor het isoleren van kernen zijn gepubliceerd 5,6. Verse en heterogene weefsels vereisen protocoloptimalisatie, aangezien vers geïsoleerde cellen uit solide tumormonsters kwetsbaarder zijn dan cellen die uit cellijnen zijn geïsoleerd.

Een andere overweging is dat voor solide tumoren chirurgische monsters vaak pas laat op de dag beschikbaar zijn in de operatiekamer. Als zodanig is het over het algemeen niet haalbaar om rechtstreeks van monsterverwerving naar kernvangst te gaan zonder een cryopreservatiestap. Onze ervaring is dat het invriezen van een eencellige suspensie kernen van de hoogste kwaliteit oplevert (in plaats van snel ingevroren heel weefsel of andere vormen van bewaring). Dit geldt met name voor enzymatische weefseltypen met een hoog RNase-gehalte, zoals de alvleesklier.

Weefselverteringsomstandigheden moeten ook worden ontworpen om de celopbrengst te maximaliseren zonder in te boeten aan kwaliteit7. In de context van solide tumortypes met dichte desmoplastische matrices8, moet de extracellulaire matrix voorzichtig worden afgebroken voor celafgifte. Bovendien, omdat de geïsoleerde celtypen heterogeen zijn, moeten de omstandigheden worden aangepast om de totale celpopulatie te ondersteunen. Monsters van menselijke alvleesklierkanker (ductaal adenocarcinoom van de pancreas) worden gebruikt in het beschreven protocol. Alvleesklierkanker vertegenwoordigt een zeer desmoplastisch tumortype, dat relatief kleverig weefsel en cellen voorspelt. Bovendien, aangezien pancreastumorspecimens die beschikbaar zijn voor onderzoek ook relatief klein zijn, worden inspanningen geleverd om de hoeveelheid gevangen cellen te maximaliseren.

Isolatie van kernen vereist de meeste optimalisatie in termen van cellyseomstandigheden en timing, evenals reagenstypen en -verhoudingen. Ook het hanteren van de kernen tijdens de isolatie vereist grote zorgvuldigheid. In dit artikel beschrijven we onze ervaring met het optimaliseren van nucleaire isolatie voor het 10x Genomics multioom-sequencingplatform uit solide tumorweefsel (Figuur 1). We geven aanbevelingen voor weefselvertering, cryopreservatie van eencellige suspensies (indien gewenst) en nucleaire isolatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monsters van menselijke alvleesklierkanker (ductaal adenocarcinoom van de pancreas) werden in ons laboratorium verkregen volgens een door de IRB goedgekeurd protocol. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten voor weefselafname. Weefsel werd van de operatiekamer naar het laboratorium getransporteerd en vervolgens als volgt verwerkt.

1. Weefseldissociatie (spijsvertering)

  1. Bereid de digestbuffer voor (zie tabel met materialen).
  2. Verkrijg het weefsel van belang zo snel mogelijk na excisie van de tumor en transporteer het monster in quenchbuffer (DMEM F-12 met ~5% foetaal runderserum) of 1x PBS op ijs.
  3. Hak het weefsel fijn met een schone pincet en schaar in 3-5 ml Digest Buffer in een petrischaal van 90 mm (Figuur 2A).
  4. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis van 50 ml en dissocieer in ~10 ml Digest Buffer gedurende 30 minuten bij 37 °C met behulp van een waterbad met schudfunctie of een droog roerwerk.
  5. Haal uit het roerwerk en blus af met ~20 ml blusmiddel. Filtreer de oplossing door een celzeef van 100 μm in een schone conische buis.
  6. Verzamel eventueel achtergebleven vast weefsel uit de zeef (hak indien nodig de resterende stukjes weefsel opnieuw) en plaats het in ~10 ml verse Digest Buffer gedurende nog eens 30 minuten bij 37 °C met roeren. Herhaal dit totdat al het tumorweefsel is gedissocieerd.
  7. Poolcelsuspensie aliquots en filtreert door een celzeef van 70 μm, gevolgd door een celzeef van 40 μm in een schone conische buis op ijs.
  8. Centrifugeer in pelletcellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer vervolgens het supernatant.

2. Cryopreservatie

  1. Spoel de cellen door de pellet te resuspenderen in 1 ml 1x PBS.
  2. Breng de celsuspensie (~1-10 miljoen cellen/buis voor optimale bevriezing) over in een cryovial van 1,5 ml op ijs.
  3. Centrifugeer tot pelletcellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer vervolgens het supernatant.
  4. Resuspendeer de cellen in 1 ml Bambanker-oplossing, breng ze over naar een cryovial van 1,5 of 2 ml (figuur 2B) en vries ze in met behulp van een vriescontainer met een koelsnelheid van -1 °C/min (met 100% isopropylalcohol) bij -80 °C, of breng ze over op vloeibare stikstof als langdurige opslag van het monster wordt verwacht.

3. Isolatie van kernen

  1. Ontdooi de cryovial van de celsuspensie snel en plaats deze op nat ijs.
  2. Breng de ontdooide celsuspensie over in een microcentrifugebuisje van 2 ml en vul de injectieflacon bij met 2 ml oplossing met 1x PBS om de cellen te spoelen.
  3. Verkrijg een handmatige celtelling met behulp van een hemocytometer om zowel de kwantiteit als de kwaliteit van de cellen te beoordelen (Figuur 2C).
  4. Centrifugeer in pelletcellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer het supernatans vervolgens voorzichtig met behulp van steeds kleinere pipetpunten om een droge pellet achter te laten en deze op ijs te houden.
    1. Gebruik een zwenkbakrotor voor alle centrifugeerstappen. Voor een maximale celopbrengst plaatst u de buisjes in de centrifuge met het scharnier naar buiten gericht en decanteert u vervolgens met de pipetpunt naar de andere kant van het buisje gericht (Figuur 2D).
      OPMERKING: Gebruik voor het decanteren van het supernatant steeds kleinere pipetpunten om vloeistof te verwijderen om verstoring van de pellet te beperken en tegelijkertijd het volume van de gedecanteerde vloeistof te maximaliseren. Deze strategie is vooral nuttig later in het protocol na de extractie van de kernen, omdat de kernpellet over het algemeen niet zichtbaar is.
  5. Bereid 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer en Wash Buffer (Figuur 3A) voor volgens het gepubliceerde protocol met de volgende wijzigingen (zie Tabel 1, Tabel met materialen):
    NOTITIE: Plaats de Digitonin voor gebruik op een verwarmingsblok bij 65 °C om het neerslag op te lossen (Figuur 3B). Dit duurt meestal ongeveer 10 minuten.
  6. Bereid de 0,1x cellysebuffer voor door 100 μl 1x cellysebuffer en 900 μl cellyseverdunningsbuffer te combineren, pipetteer voorzichtig om te mengen en leg het op ijs.
  7. Resuspendeer de celpellet in 100 μL gekoelde 0,1x Cell Lysis Buffer en pipetteer voorzichtig om 5x te mengen.
  8. Incubeer gedurende 3 minuten op ijs (Figuur 3C).
  9. Voeg 1 ml gekoelde wasbuffer toe en pipetteer op en neer om 5x voorzichtig te mengen.
  10. Centrifugeer om de kernen te pelleteren bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, decanteer het supernatans voorzichtig tot een droge pellet en bewaar op ijs.
    OPMERKING: Als het aantal startcellen laag is (100.000-200.000 cellen), voer dan de cellyse- en wasstappen uit in een PCR-buis van 200 μL in plaats van een microcentrifugebuis van 2 ml om het oppervlak van de buis te verkleinen en verliezen te minimaliseren. Pas in dit geval het volume van de wasbuffer aan om plaats te bieden aan het kleinere slangvolume.
  11. Herhaal stap 3.9-3.10 2x voor een totaal van drie wasbeurten.
  12. Tel de kernen handmatig met behulp van een hemocytometerglaasje onder de microscoop. Gebruik desgewenst trypanblauwe kleurstof om contrast te bieden voor het bekijken van de kernen en om kernen te onderscheiden van niet-gelyseerde cellen.
  13. Bereid de 1x Nuclei Buffer voor volgens het gepubliceerde protocol: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNaseremmer in nucleasevrij water en bewaar op ijs (zie Materiaaltabel).
  14. Resuspendeer de kernpellet in 1x Nuclei Buffer op basis van doelgericht kernherstel.
    OPMERKING: Als de concentratie hoog genoeg is, streef dan naar een gerichte terugwinning van 10.000 of iets hoger in deze stap (3.230-8.060 kernen/μl) bij het bepalen van het startresuspensievolume, gezien het verwachte volumeverlies van 25 μl en de afname van de concentratie met 20% bij filtering (stap 3.15).
  15. Haal het geresuspendeerde kernvolume voorzichtig door een 40 μm pipetpuntcelzeef en plaats de kernen op ijs (figuur 3D).
  16. Tel de kernen (Figuur 4A-C). Verdun de uiteindelijke oplossing indien nodig verder met Nuclei Buffer.
  17. Transporteer de kernen op ijs en ga onmiddellijk verder met het vastleggen van kernen volgens gepubliceerde protocollen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit solide tumormonsters van patiënten voor multioomsequencing (Figuur 1), werd het tumorweefsel gedissocieerd en werd een eencellige suspensie gecryopreserveerd (Figuur 2A-D). De celsuspensie werd vervolgens ontdooid op het moment van de geplande multioomvangst. Het afvangen van kernen werd uitgevoerd met geoptimaliseerde lysisbufferreagentia en timing om zowel de kwaliteit als de opbren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontwarren van de heterogene celpopulaties die aanwezig zijn in de micro-omgeving van de tumor is een actief aandachtsgebied in de kankerbiologie. Evenzo bestaan complexe weefsels in goedaardige pathologieën zoals wondgenezing en fibrose. Multioomsequencing is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel dat het mogelijk maakt om gepaarde scRNA- en ATAC-seq-gegevens van dezelfde cel te verkrijgen. Dit protocol beschrijft de isolatie van kernen, wat optimalisatie vereist bij het verwerken van verse, kwetsbare, kleine...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag de Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), in het bijzonder Dhananjay Wagh en John Coller, en 10x Genomics bedanken voor hun hulp bij het optimaliseren van onze experimenten. We willen ook Drs. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser en Byrne Lee bedanken voor hun hulp bij het verwerven van patiëntenspecimens. We willen Art en Elaine Taylor, de Rantz Foundation en Warren en Judy Kaplan bedanken voor hun genereuze steun aan onze onderzoeksinspanningen. Financieringsbronnen zijn onder meer NIH-subsidies 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (MTL), 1R01GM136659 (MTL), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), de Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), het Gunn/Olivier Fund, het California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation en het Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sequencing werd verkregen met behulp van machines die waren gekocht met NIH-fondsen (S10OD025212, S10OD018220 en 1S10OD01058001A1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers  ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)10x Genomics2000153/2000207
Bambanker Wako, Fisher ScientiticNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
Calcium ChlorideSigma Aldrich499609
Collagenase (Collagenase Type IV)ThermoFisher17104019
DigitoninThermo FisherBN2006
DNase IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12Thermo Fisher11320082
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solutionSigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit 
NaClSigma Aldrich59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container ThermoFisher5100-0001
Nonident P40 SubstituteSigma Aldrich74385
Poloxamer 188SigmaP5556
Rnase inhibitor Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20Thermo Fisher85113

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).
  2. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  3. Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
  4. Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
  5. Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  6. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  7. Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815(2020).
  8. Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911(2018).
  9. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  10. Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
  11. Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
  12. Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA sequencing van enkelcellenATAC sequencingweefseldigestiecellysebufferbeoordeling met hemocytometerpancreastumorcryopreservatie

Gerelateerde artikelen