Methodenartikel

cryopreservatie van menselijke embryonale stamcel-afgeleide retinale pigmentepitheelcellen in het optimale stadium

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65888

⸱

3 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2National Clinical Research Center for Eye Diseases, 3Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Clinical Specialty, 5Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, 6Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, 7Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, 8Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de efficiënte cryopreservatie van van menselijke stamcellen afgeleide retinale pigmentepitheelcellen.

Samenvatting

Retinale pigmentepitheelcellen (RPE) afgeleid van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) zijn superieure celbronnen voor celvervangingstherapie bij personen met degeneratieve aandoeningen van het netvlies; Studies naar de stabiele en veilige opslag van deze therapeutische cellen zijn echter schaars. Zeer variabele cellevensvatbaarheid en functioneel herstel van RPE-cellen na cryopreservatie zijn de meest voorkomende problemen. In het huidige protocol hebben we gestreefd naar het beste celherstelpercentage na ontdooien door de optimale celfase voor invriezen te selecteren op basis van de oorspronkelijke experimentele omstandigheden. Cellen werden ingevroren in de exponentiële fase die werd bepaald met behulp van de 5-ethynyl-2′-deoxyuridine-etiketteringstest, die de levensvatbaarheid van de cel en het herstelpercentage na ontdooien verbeterde. Kort na het ontdooien werden stabiele en functionele cellen verkregen, onafhankelijk van een lang differentiatieproces. De hier beschreven methoden maken het eenvoudig, efficiënt en goedkoop bewaren en ontdooien van hESC-afgeleide RPE-cellen mogelijk. Hoewel dit protocol zich richt op RPE-cellen, kan deze bevriezingsstrategie worden toegepast op veel andere soorten gedifferentieerde cellen.

Inleiding

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een gepigmenteerde monolaag van cellen die nodig is voor het behoud van de goede werking van het netvlies1. RPE-disfunctie en overlijden zijn nauw verbonden met veel degeneratieve ziekten van het netvlies, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa en de ziekte van Stargardt 2,3. RPE-substitutietherapie is een van de meest veelbelovende behandelingsregimes voor deze ziekten 4,5,6,7. Een stabiele aanvoer van donor-RPE-cellen is van vitaal belang voor celtherapie. Van menselijke embryonale stamcellen (hESC) afgeleide RPE-cellen zijn een ideale celbron voor celtherapie omdat ze de functie van primaire RPE-cellen nabootsen en een theoretisch onbeperkte voorraad kunnen produceren8. Het differentiatieproces is echter moeizaam en de houdbaarheid van de verkregen RPE-cellen is relatief kort vanwege de daaropvolgende epitheliale-mesenchymale overgang (EMT). Daarom is de cryopreservatie van hESC-afgeleide RPE-cellen een onmisbare stap die nodig is voor langdurige opslag en on-demand distributie9.

Door cryopreservatie geïnduceerde cellulaire schade kan onbedoeld de therapeutische werkzaamheid in gevaar brengen10,11. Daarom hebben recente studies over cryopreservatie voorgesteld dat optimale cryogene opslagcondities moeten worden bepaald bij het ontwerpen van celtherapieën12. Succesvolle cryopreservatie garandeert efficiënt celherstel, hoge levensvatbaarheid en herstel van de celfunctie na de vries-dooicyclus. Eerdere studies naar de cryopreservatie van de aanhangende monolagen van zoogdiercellen hebben echter zeer variabele (35%-95%) overlevingspercentages gerapporteerd na ontdooiing 13,14,15. Veel factoren hebben een aanzienlijke invloed op de resultaten van cryopreservatie, vooral tijdens de vriesfase16,17. Recent onderzoek toonde aan dat RPE-cellen die op verschillende tijdstippen waren ingevroren, een gevarieerd herstel vertoonden na ontdooien17. Voor zover wij weten, ontbreken studies naar de bepaling van het optimale invriestijdvenster voor van stamcellen afgeleide RPE-cellen. In verschillende onderzoeken werden de cellen in verschillende stadia ingevroren: sommige cellen werden ingevroren kort na het passeren of vóór samenvloeiing of pigmentatie 8,15,18, terwijl andere op andere tijdstippen werden ingevroren 9,19,20,21. Bovendien is er geen duidelijk bewijs of de fase of het stadium van RPE-cellen die worden gebruikt voor cryopreservatie de RPE-functie na ontdooien beïnvloedt. In onze vorige studie hebben we voor het eerst aangetoond dat de exponentiële fase van celgroei (P2D5) de beste fase is voor de cryopreservatie van hESC-afgeleide RPE-cellen in termen van cellevensvatbaarheid en het herstel van cellulaire eigenschappen enfuncties17.

De hier vastgestelde methode is gericht op het cryopreservatie van hESC-afgeleide RPE in een optimaal stadium om het beste behoud te bereiken in termen van cellevensvatbaarheid en -functie na ontdooiing. Met behulp van de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) labeltest om de exponentiële fase van DNA-synthese vóór cryopreservatie te detecteren, vertoonden ontdooide RPE-cellen >80% levensvatbaarheid en hechtingspercentage, RPE-specifieke genexpressie, gepolariseerde celmorfologie, secretie van pigmentepitheelafgeleide factoren, passende transepitheliale resistentie en fagocytisch vermogen 8,17,22. Hoewel dit protocol zich richt op hESC-afgeleide RPE-cellen en niet alle therapeutische cellen even gecryopreserveerd zijn, kan de strategie van bevriezing in de exponentiële fase worden toegepast op veel andere therapeutische cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cel dissociatie

  1. Onderhoud RPE-cellen zoals eerder beschreven 17,22.
    OPMERKING: Alle cellen worden gekweekt bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende de duur van de protocollen.
  2. Bereid de benodigde hoeveelheid PBS en kweekmedium voor in een waterbad van 37 ° C en plaats het celdissociatiereagens op kamertemperatuur.
  3. Gooi de kweekoplossing weg en was de platen twee keer met 1 ml voorverwarmde PBS per putje.
  4. Voeg 1 ml van het celdissociatiereagens toe aan de platen met 6 putjes en verteer de cellen bij 37 °C gedurende 15 minuten. Observeer na incubatie de cellen die krimpen en glanzen aan de randen onder een microscoop om de beëindiging van de spijsvertering te bevestigen.
    OPMERKING: Dissociatie op basis van trypsine wordt niet aanbevolen omdat het een lage levensvatbaarheid van de cellen geeft.
  5. Pipeteer 10x voorzichtig op en neer met een pipet van 1 ml om de cellen te dissociëren en verdun de celsuspensie met voorverwarmd kweekmedium (zonder Y-27632) in een verhouding van 1:10. Centrifugeer de cellen vervolgens 3 minuten bij kamertemperatuur bij 250 × g.
  6. Giet het supernatans na het centrifugeren snel uit, suspendeer de celpellet voorzichtig in 2 ml van het kweekmedium en resuspendeer de cellen 10-15x met een pipet.
  7. Filtreer de celsuspensie met een celzeef van 40 μm om een eencellige suspensie te verkrijgen en bereken het aantal cellen.
    OPMERKING: Een eencellige suspensie is essentieel voor nauwkeurige celtelling en uniforme celzaaidichtheid na ontdooien.

2. Bepaling van het optimale celstadium voor cryopreservatie

OPMERKING: Omdat de celtoestand varieert tussen differentiatiemethoden en cellijnen, moet de exponentiële fase van RPE-cellen die in verschillende laboratoria worden gekweekt, worden bepaald voordat ze worden ingevroren.

  1. Ontdooi een injectieflacon met basaalmembraanmatrixoplossing een nacht op ijs bij 4 °C. Verdun de matrix tot 12 ml koude DMEM/F-12 en meng goed. Voeg één dekglaasje per putje toe en smeer elk putje van een plaat met 24 putjes in met 0,25 ml van de verdunde oplossing. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C voor gebruik en zuig de coatingoplossing op net voordat de cellen worden geplateerd.
    OPMERKING: Instructies voor het aliquot-volume zijn partijspecifiek op basis van de eiwitconcentratie en zijn te vinden in het productspecificatieblad.
  2. Zaai de RPE-enkelvoudige cellen uit stap 1.7 op de met matrix beklede dekglaasjes van het basale membraan met een dichtheid van 105/cm2 in 1 ml kweekmedium. Ververs het kweekmedium elke 2-3 dagen.
  3. Op aangegeven tijdstippen (1, 3, 5, 7 en 11 dagen na passage) incubeer RPE-cellen met 10 μM EdU in het medium gedurende 24 uur. Fixeer, permeabiliseer en kleurig de cellen met de reactiecocktail zoals beschreven in de handleiding om opgenomen EdU te detecteren.
  4. Leg beelden vast van vijf willekeurige velden onder een fluorescentiemicroscoop en bereken het percentage EdU-positieve cellen. Plot de bijbehorende EdU-positieve verhoudingstijdcurven om een groeicurve te genereren. Bepaal vervolgens het bevriezingsvenster of de exponentiële fase voor elke cellijn op basis van de groeicurve.
    OPMERKING: Herstelde zeshoekige celmorfologie geeft aan dat cellen de exponentiële fase verlaten.

3. Cryopreservatie

  1. Volg de stappen 1.1 tot en met 1.7, behalve dat de verteringstijd afneemt tot 5 minuten, centrifugeer de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 250 × g.
  2. Gooi het supernatans weg door het na het centrifugeren snel te gieten en suspendeer de celpellet voorzichtig in het cryopreservatiemedium tot een dichtheid van 2 ×10 6 cellen/ml en breng 1 ml van de celsuspensie over in cryogene injectieflacons van 1,2 ml.
  3. Plaats de cryogene injectieflacons onmiddellijk in een vriescontainer, vries ze een nacht in bij -80 °C om een afkoelsnelheid van -1 °C/min te bereiken en breng de flacons vervolgens over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

4. Ontdooien

  1. Verwarm het kweekmedium in een waterbad van 37 °C en vul 10 ml voorverwarmd kweekmedium in een buis van 15 ml.
  2. Ontdooi snel de cryogene flacons die rechtstreeks uit de opslag van vloeibare stikstof zijn gehaald met behulp van een geautomatiseerd ontdooisysteem.
  3. Druppel 0,5-1 ml voorverwarmd kweekmedium in de cryogene injectieflacon om ervoor te zorgen dat de bevroren cellen zich geleidelijk aanpassen aan de nieuwe omgeving. Breng vervolgens 1,5-2 ml van de celsuspensie over naar 10 ml van het kweekmedium in een buisje van 15 ml en centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Gooi het supernatans weg door het na het centrifugeren snel te gieten, resuspendeer de pellet in 2 ml voorverwarmd kweekmedium en tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer om de herstel- en overlevingspercentages te bepalen met behulp van standaard trypanblauwe uitsluiting (0,4% trypanblauwe vlek).
  5. Kweek de cellen op met een basaalmembraanmatrix beklede oppervlakken met een dichtheid van 105 levensvatbare cellen/cm2 in een kweekmedium aangevuld met Y-27632 (eindconcentratie: 10 μM). Verwijder Y-27632 na 24 uur.
  6. Om de hechtingssnelheid te bepalen, dissocieert u de cellen opnieuw en telt u het aantal cellen 24 uur na het ontdooien.

5. Validatie van de optimale invriesfase

  1. Om de optimale invriesfase te valideren die in stap 2.4 is bepaald, ontdooit u RPE-cellen die op verschillende tijdstippen zijn ingevroren en kweekt u ze gedurende 28 dagen. Oogst de cellen voor qPCR- en immunokleuringsanalyse om de expressie van RPE-markers te evalueren, zoals eerder beschreven17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier werden hESC-afgeleide RPE-cellen op P1D35 gepasseerd en gezaaid met een dichtheid van 105/cm2. Binnen een week na het zaaien gingen de karakteristieke zeshoekige morfologie en pigmentatie verloren tijdens de vertragingsfase (ongeveer 2 dagen). RPE-cellen namen geleidelijk de zeshoekige morfologie weer aan in de exponentiële fase (ongeveer 5 dagen, figuur 1A) en gingen de vertragingsfase (ongeveer 6 dagen) in met een meer veelhoekige morfologie. Als de celkweek nog ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de huidige studie wordt een succesvol vries-dooiprotocol voor hESC-afgeleide RPE-cellen voor onderzoek en klinische behoeften beschreven. In tegenstelling tot de onsterfelijke RPE-cellijn, ARPE-19, zijn RPE-cellen met het juiste karakteristieke epitheelfenotype en functie, zoals stamcel-afgeleide RPE-cellen, gevoeliger voor cryopreservatie. Minder dan 32% van de cellen bleef 24 uur na het ontdooien achter als ze niet goed bewaard bleven17. Cryopreservatie timing is een kritische parameter. Een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81970816) aan Mei Jiang; de National Natural Science Foundation of China (82201223) aan Xinyue Zhu; en het actieplan voor wetenschappelijke en technologische innovatie van de Shanghai Science and Technology Commission (2014090067000) aan Haiyun Liu.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40 μm Cell strainerCorning431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 DyeThermo Fisher ScientificC10337
Cryo freezing containerNalgene5100-0001
CryoStor CS10Biolife Solutions07930cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
GenxinSelcellYB050050cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cellsprovided by Wicell, USAH9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified MatrixCorning354277basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing SystemBioLife SolutionsAST-601
Trypan Blue solution 0.4%SigmaT8154
TryPLE SelectThermo Fisher Scientific12563029cell dissociation reagent
XVIVO-10 mediumLonzaBEBP04-743QRPE culture medium
Y-27632SelleckS1049

Referenties

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease. American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).
  3. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).
  4. Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration. Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).
  5. Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).
  6. Da Cruz,, L,, et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  7. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  8. Buchholz, D. E., et al. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).
  9. Li, Q. -Y., et al. Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases. Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).
  10. Francois, M., et al. Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing. Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).
  11. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties. Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).
  12. Ekpo, M. D., et al. Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper. Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).
  13. Bailey, T. L., et al. Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells. Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).
  14. Okumura, N., et al. Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells. PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).
  15. Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).
  16. Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use. Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).
  17. Zhang, T., et al. Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).
  18. Leach, L. L., et al. Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).
  19. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  20. Brandl, C., et al. In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).
  21. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).
  22. Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).
  23. Marcantonini, G., et al. Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin. Molecules. 27 (10), 3254(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Menselijke embryonale stamcellencryopreservatie van celleninvriezen in de exponenti le fasecelvervangende therapieEdU proliferatieassaycelviabiliteitcelherstelpercentageontdooien van cellencelbanken

Gerelateerde artikelen