Method Article

Een efficiënte en snelle methode voor het labelen en analyseren van muizenglomeruli

DOI:

10.3791/65973

⸱

February 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een gebruiksvriendelijke, complete en eenvoudige reeks methoden om glomeruli uit CUBIC-gezuiverde muizennieren te labelen en te analyseren. Gegevens zoals het aantal en het volume van de glomerulus kunnen eenvoudig en betrouwbaar worden verkregen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) of gewone confocale microscopie en software zoals Imaris.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De glomeruli zijn fundamentele eenheden in de nier; Daarom is het bestuderen van de glomeruli cruciaal voor het begrijpen van de nierfunctie en pathologie. Biologische beeldvorming biedt intuïtieve informatie; Het is dus van groot belang om de glomeruli te labelen en te observeren. De glomeruli-waarnemingsmethoden die momenteel worden gebruikt, vereisen echter gecompliceerde bewerkingen en de resultaten kunnen labeldetails of driedimensionale (3D) informatie verliezen. De heldere, onbelemmerde hersenbeeldvormingscocktails en computationele analyse (CUBIC) weefselopruimingstechnologie is op grote schaal gebruikt in nieronderzoek, waardoor een nauwkeurigere detectie en een diepere detectiediepte mogelijk is. We ontdekten dat glomeruli van muizen snel en effectief kunnen worden geëtiketteerd door staartaderinjectie van FITC-Dextran met een gemiddeld molecuulgewicht, gevolgd door de CUBIC-opruimingsmethode. De geklaarde muizennier kan worden gescand door een lichtbladmicroscoop (of een confocale microscoop wanneer gesneden) om driedimensionale beeldstapels van alle glomeruli in de hele nier te verkrijgen. Verwerkt met de juiste software kunnen de glomeruli-signalen eenvoudig worden gedigitaliseerd en verder worden geanalyseerd om het aantal, het volume en de frequentie van de glomeruli te meten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het aantal en het volume van glomeruli zijn erg belangrijk voor de diagnose en behandeling van verschillende nierziekten 1,2,3,4,5. De gouden standaard voor het schatten van glomeruli-getallen is de combinatie van fysieke dissector en fractionator. Deze methode vereist echter speciale reagentia en apparatuur, waardoor het traag en duuris 6,7,8,9. Biopsie levert een schat aan informatie op, maar uiteraard is deze methode alleen geschikt voor ruwe schattingen10,11. Medische beeldvormingstechnologieën, waaronder magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), computertomografie (CT) en röntgenfoto's, worden ook veel gebruikt bij glomerulaire detectie 12,13,14,15, maar dergelijke technologieën vereisen omvangrijke instrumenten. Nieuwe methoden, zoals matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometer16 of de thick and thin section-methode17, zijn ook gebruikt bij glomerulaire detectie, hoewel ze vervelend en moeizaam blijven.

Met behulp van transparantietechnologieën is het mogelijk om diepere diepten waar te nemen en rijkere en completere informatie te verkrijgen uit dikke weefsels of zelfs hele organen 18,19,20,21,22,23. Daarom worden transparantietechnologieën op grote schaal gebruikt in nieronderzoek24. De observatie en detectie van glomeruli in de gezuiverde nieren zijn ook betrokken. Deze gepubliceerde artikelen verwezen echter slechts kort naar glomerulaire detectie25 of gebruikten moeilijk te bereiken etiketteringsmethoden zoals transgene dieren26, zelfgeproduceerde kleurstoffen13 of incubatie van antilichamen met hoge concentratie27 om de glomeruli te labelen. Bovendien, hoewel studies glomeruli in gezuiverde nieren hadden geanalyseerd, waren de analyses altijd beperkt13 of vertrouwden ze op analysealgoritmen die door de auteurs zelf waren opgesteld26.

We hebben eerder een handigere manier gedemonstreerd om de glomeruli in de nieren van muizen te labelen. Door Imaris te gebruiken, ontdekten we dat het aantal, de frequentie en het volume van glomeruli snel konden worden verkregen. Daarom presenteren we hier een meer toegankelijke, uitgebreide en vereenvoudigde reeks methoden om de glomeruli van muizennieren te labelen en te analyseren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volwassen C57BL/6 muizen (6 weken oud, 25-30 g) werden in dit onderzoek gebruikt. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale voorschriften voor dierenwelzijn en experimentele ethiek. De studie werd goedgekeurd door het West China Hospital van de Sichuan University Biomedical Research Ethics Committee.

1. Glomeruli-etikettering en weefselvoorbereiding

  1. Glomeruli etikettering
    1. Los FITC-dextran (10 mg) op in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1:1 (1 mg: 1 ml) om de werkende sondeoplossing te bereiden.
      OPMERKING: De werkoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
    2. Plaats de C57-muis in een muisstaartaderfixator. Maak het gaasje nat met heet water, wikkel het gaasje om het middelste deel van de muizenstaart en verwarm de staart gedurende 1 minuut.
    3. Veeg de muizenstaart af met 75% ethanol totdat de linker- en rechterstaartaders zichtbaar zijn.
    4. Zuig 100 μL van de werkende sondeoplossing op met een insulinespuit van 1 ml en injecteer de oplossing langzaam in de staartader van de muis.
    5. Laat de sondeoplossing na injectie gedurende 30 minuten circuleren. Laat de muizen vrij bewegen in hun kooien.
    6. Zodra voldoende circulatie is bereikt, verdooft u de muizen diep door intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (1%, 60-80 μg/kg).
  2. Nierbemonstering en fixatie
    1. Bevestig de verdoofde muizen in rugligging aan de anatomische plaat. Zet hun poten vast met medische tape.
    2. Euthanaseer de muizen na de voorbereiding van de huid met een dodelijke dosis natriumpentobarbital (1%, 10 mg/kg).
    3. Maak een incisie in de buik in de middellijn om de buikholte bloot te leggen.
    4. Onthul de nieren en verwijder ze met een scalpel en schaar in de zuurkast. Verwijder voorzichtig de nierenvelop.
    5. Verzamel de nieren en fixeer ze een nacht in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C.
    6. Was de monsters driemaal 1 uur met PBS en schud ze op kamertemperatuur (RT).
    7. Bereid de nier voor op microscopie.
      1. Snijd de nier in plakjes voor confocale microscopie: Snijd de nier in plakjes van 1 mm dik met behulp van de hersenmatrix (1 mm staal, 40-75 g) om de plakdikte te standaardiseren. Breng de plakjes over in 4% PFA en zet de fixatie een nacht voort bij 4 °C.
      2. Hele nier voor light-sheet microscopie: Fixeer de nieren in 4% PFA bij 4 °C gedurende 48 uur.

2. Opruimen

  1. Bereiding van reagens
    1. Bereid het CUBIC-L-reagens door 10% (gew./gew.) N-butyldiethanolamine, 10% (gew./gew.) Triton X-100 en 80% ddH2O te mengen.
    2. Bereid het CUBIC-R-reagens door 45% (gew./gew.), 30% (gew./gew.), 30% (gew./gew.), 0,5% (vol/vol) N-butyldiethanolamine en 24,5% ddH2O te mengen. Zorg ervoor dat de oplossing een pH van 9,6-9,8 en een brekingsindex (RI) van 1,522 heeft.
      OPMERKING: CUBIC-L wordt gebruikt voor delipidatie en CUBIC-R wordt gebruikt voor het matchen van de brekingsindex.
  2. Clearing-procedure
    1. Verzamel de niermonsters in een centrifugebuis van 50 ml en verwijder ze vervolgens in CUBIC-L met schudden bij 60 tpm bij 37 °C. Vervang CUBIC-L elke 4 uur (voor nierplakjes) of elke 24 uur (voor een hele nier) totdat een bevredigende optische transparantie is bereikt.
      OPMERKING: Dit proces duurt 1 dag voor nierplakjes en 5 dagen voor een hele nier.
    2. Was de monsters driemaal in PBS met zacht schudden bij RT gedurende elk 1 uur.
    3. Breng CUBIC-R aan op de monsters, schud de monsters gedurende 6 uur bij 37 °C, 60 rpm.
    4. Observeer de geklaarde monsters direct of bewaar ze gedurende 1 week in zwarte buisjes gevuld met CUBIC-R bij RT.

3. Beeldacquisitie

  1. Confocale beeldvorming
    NOTITIE: Beeld de gesneden niermonsters af met confocale microscopie (lenzen: een Plan Apo λ 4×/0.2 N1-objectief of een Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1-objectief). Leg grote afbeeldingen vast (bijv. 6052 μm x 6052 μm voor de nierschijf) met z-stacks.
    1. Schakel de confocale microscoop in de volgende volgorde in: laservermogen, confocale bedieningsschakelaar, computer, microscoop en confocale hardware. Schakel na het uitvoeren van de zelftest de confocale software in.
    2. Selecteer de juiste lens. Verwijder het monster uit het CUBIC-R-reagens, plaats het in de confocale schaal en dek het af om te voorkomen dat het CUBIC-R-reagens uitdroogt.
    3. Verplaats het monster naar het midden van het gezichtsveld en pas het brandpuntsvlak aan totdat het scherp is.
    4. Pas 3D-reconstructie (stap 3.1.4.1) en grote beeldreconstructie (stappen 3.1.4.2-3.1.4.3) toe.
      1. 3D-reconstructie (confocaal): Draai het zoomvlak in één richting totdat er geen fluorescentie meer zichtbaar is; Deze positie wordt gedefinieerd als de top. Verander vervolgens het zoomvlak in de tegenovergestelde richting totdat er geen fluorescentie meer zichtbaar is; Deze positie wordt gedefinieerd als de onderkant. Klik op de knop Uitvoeren in de rechterbenedenhoek van het dialoogvenster om het scannen te starten.
      2. Reconstructie van grote afbeelding (confocaal): Verplaats het gezichtsveld naar het midden van het voorbeeld en stel de huidige positie in als middelpunt. Selecteer een gezichtsveld van 2 x 2.
      3. Selecteer in de multifunctionele ND-interface de Z-stapel om grote afbeeldingen te reconstrueren en verschillende opties in het paneel in te stellen. Druk vervolgens op de knop Knop uitvoeren om het scannen te starten.
  2. Lichtblad fluorescentiemicroscopie (LSFM) beeldvorming
    OPMERKING: Beeld de hele nieren af met een lichtblad fluorescentiemicroscoop (lens: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529) objectief).
    1. Monster bevestigen (LSFM):
      1. Lijm de transparante nier op de monsterbevestigingsadapter en wacht tot de nier stevig vastzit.
      2. Week de nier in de monsterbak en duw de monsterbak in het microscoopsysteem. Sluit het luik.
    2. Observeren en scannen (LSFM):
      1. Verplaats het monster in de interface Lokaliseren naar een geschikte waarnemingspositie. Schakel over naar de acquisitie-interface , stel het optische pad in, selecteer 488 nm laser, LBF 405/488/561/640, optisch splitsingsfilterblok SBS LP 490, selecteer Camera 2 en verander de pseudo-kleur in groen.
      2. Vul de eerder opgenomen waarde voor de Z-offset links/rechts in het submenu Kanaal in. Selecteer de kleinste zoom (0,36) en verfijn deze voor maximale helderheid.
    3. Zoek de X\Y-grens en het Z-bereik van het hele orgel. Pas de laserintensiteit en belichtingstijd aan (bij voorkeur minder dan 10 ms) en klik op Uitvoeren om te starten.
    4. Als het weefsel te groot is, voegt u twee of meer afbeeldingen samen met het samenvoegen van afbeeldingen. Open het vastgelegde bestand met behulp van de microscopiesoftware (hier ZEISS ZEN 3.7). Selecteer Processing > Method > Stitching > Method Parameter > Apply to complete, image stitching.

4. Gegevensverwerking en kwantificering

OPMERKING: Verwerk de afbeeldingsstapels met Imaris-software (beeldanalyse), gebruik de functie Surface om de glomeruli te labelen en analyse uit te voeren.

  1. Graaf van glomeruli
    1. Importeer grote afbeeldingen (confocale microscopie) of samengevoegde afbeeldingen (light-sheet microscopie) in de beeldanalysesoftware.
    2. Open de bestanden in de beeldanalysesoftware. Klik op de knop Surface om een nieuwe Surface te maken. Volg de gids linksonder in het scherm.
      1. Klik op de knop Volgende (pijl naar rechts) zonder iets aan te vinken.
      2. Vink het vakje voor de optie Vloeiend aan en voer een correct nummer in (bijvoorbeeld 14.5) om de details van de Surface te bepalen. Selecteer Achtergrondaftrekking in Drempelwaarden en vul het vak met de geschatte gemiddelde diameter van de glomeruli. Klik op de knop Volgende .
      3. Pas indien nodig aan en klik op de knop Volgende . Selecteer het juiste bereik en klik op de knop Volgende om een Surface te maken.
    3. Klik op Filteren en vervolgens op de knop Toevoegen om bolvormigheid toe te voegen om niet-bolvormige objecten uit te filteren. Klik op de knop Dupliceren om dit nieuwe oppervlak te kopiëren.
    4. Klik op de knop 'Statistieken ' en klik vervolgens op de knop 'Totaal '. de software presenteert het aantal glomeruli als het totale aantal oppervlakte.
  2. Volume van glomeruli
    1. Maak een oppervlak van de glomeruli zoals hierboven.
    2. Wanneer de Surface is voltooid, klikt u op de knop Selecteren om de doelobjecten te selecteren en het volume van elk object weer te geven. Klik op de knop Opslaan en exporteer statistieken naar een spreadsheet voor verdere analyse.
  3. Volume van de plak of hele nier
    1. Importeer grote afbeeldingen (confocale microscopie) of samengevoegde afbeeldingen (light-sheet microscopie) in de beeldanalysesoftware.
    2. Open bestanden in de beeldanalysesoftware. Klik op de knop Surface om een nieuwe Surface te maken. Volg de gids linksonder in het scherm.
      1. Klik op de knop Volgende (pijl naar rechts) zonder aan te vinken.
      2. Vink het vakje voor de optie Glad aan en voer een correct getal in (bijvoorbeeld 50) om de details van het oppervlak te bepalen. Selecteer Absolute intensiteit in Drempelwaarde. Klik op de knop Volgende .
      3. Pas het oppervlak aan totdat het het hele weefsel bedekt en klik op de knop Volgende . Klik op de knop Volgende om de Surface te maken.
    3. Klik op de knop Selecteren om het oppervlak van het hele weefsel te selecteren en het volume van het weefsel weer te geven. Klik op de knop Opslaan om statistieken naar een spreadsheet te exporteren.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie biedt een eenvoudige en efficiënte methode voor het labelen en analyseren van de glomeruli in de nieren van muizen.

Glomeruli (bloedvaten) kunnen goed worden geëtiketteerd door intravasculair geïnjecteerd FITC-Dextran. Na het klaringsproces werd de nier transparant (Figuur 1A) en konden de glomeruli duidelijk worden waargenomen met behulp van lichtbladmicroscopie (Figuur 1B) of confocale microscopie (Figuur 1C). Confocale microscopie heeft een beperkte scandiepte, dus nieren moeten in plakjes van ongeveer 1 mm dik worden gesneden. Als een light-sheet microscoop wordt gebruikt, kan de hele nier direct worden gescand.

Met de duidelijke signalen was het gemakkelijk om het aantal glomeruli te tellen. De etikettering was zelfs zo effectief dat de glomeruli met het blote oog konden worden geteld. Het volume van glomeruli kon ook direct worden gemeten. Natuurlijk heeft software zoals Imaris dit proces enorm versneld. Met behulp van de oppervlaktefunctie kunnen alle glomeruli in een nierplak (Figuur 2), in een hele nier (Figuur 3) of in een strook (Figuur 4) worden geselecteerd en kan het aantal en het volume van de glomeruli direct worden verkregen (Figuur 2C, Figuur 3C, Figuur 4C). Het volume van het geselecteerde gebied kan ook worden gemeten (Figuur 2B, Figuur 3B, Figuur 4B), zodat de volumeverhouding en frequentie van de glomeruli in een bepaald gebied of in de hele nier kunnen worden berekend (Figuur 2D, Figuur 3D, Figuur 4D). Een deel van de nier kan worden geselecteerd om berekeningen uit te voeren in specifieke regio's. We presenteerden een strip die lijkt op een biopsie. Het aantal, het volume en de frequentie van de glomeruli in de strip konden ook gemakkelijk worden verkregen (figuur 4).

Zoals uit de figuren blijkt, zijn de resultaten van deze studie (N = aantal, F = frequentie, V = volume, V(a) = gemiddeld volume, V(t) = totaal volume):

Nglomeruli in plak = 1128, Nglomeruli in hele nier = 14006, Fglomerulair in plak = 65 per mm3, Fglomerulair in hele nier = 105 per mm3, Vtotaal glomeruli in plakje/V-plak = 2,24%, Vtotaal glomeruli in hele nier/Vnier = 5,54%, V(a)glomeruli in plak = 373654 μm3, V(a)glomeruli in hele nier = 521627 μm3, V(t)glomeruli in plak = 421481724 μm3, V(t)glomeruli in de hele nier = 7305386256 μm3 (Figuur 2D, Figuur 3D).

Nglomeruli in band = 63, Fglomeruli in band = 72 per mm3, Vtotale glomeruli in band/V-strook = 2,23%, V(a)glomeruli in band = 307698 μm3, V(t)glomeruli in band = 19384977 μm3 (figuur 4D).

figure-results-1
Figuur 1: Transparantie van nierweefsel en FITC-dextran-gelabelde glomeruli. (A) Nier voor en na transparantiebehandeling. (B) Het beeld van een hele nier gescand met LSFM. (C) Het beeld van een plakje nier gescand met de confocale microscoop (links: 4x, rechts: 10x). schaalbalk = 300 μm (4x, confocaal); schaalbalk = 100 μm (10x, confocaal).; schaalbalk = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Glomeruli werden gelabeld met FITC-Dextran. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De functie Oppervlak toegepast op de confocale gescande nierschijf. (A) Het oppervlak van de plak en alle glomeruli worden gemaakt. Roze = glomeruli, blauw = uit Oppervlak van de nierschijf, groen = origineel label van vaten (glomeruli en enkele grote vaten). Schaalbalk = 300 μm. (B) Wanneer het oppervlak van de plak (links) of de glomeruli (rechts) zijn geselecteerd (geselecteerde objecten worden geel), kunnen gegevens direct worden verkregen (gestippeld vak markeert waar het de gegevens toont). (C) Het aantal, het volume van elke afzonderlijke glomerulus en het volume van de totale glomeruli kunnen rechtstreeks worden verkregen, evenals het volume van de schijf. (D) Geëxporteerde gegevens kunnen verder worden geanalyseerd, zodat de berekening, zoals het gemiddelde volume van de glomeruli en de volumeverhouding van glomeruli en het geselecteerde gebied, kan worden uitgewerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De functie Oppervlak toegepast op de LSFM gescande hele nier. (A) Oppervlak van de hele nier en alle glomeruli worden gecreëerd. Roze = glomeruli, blauw = uit Oppervlakte van de hele nier, groen = origineel label van vaten (glomeruli en enkele grote vaten). Schaalbalk =1000 μm. (B) Wanneer het oppervlak van de nier (links) of de glomeruli (rechts) zijn geselecteerd (geselecteerde objecten zouden geel worden), kunnen gegevens direct worden verkregen (gestippeld vak markeert waar het de gegevens toont). (C) Het aantal, het volume van elke afzonderlijke glomerulus en het aantal van de glomeruli konden direct worden verkregen, evenals het volume van de nier. (D) Geëxporteerde gegevens kunnen verder worden geanalyseerd, zodat de berekening, zoals het gemiddelde volume van glomeruli en de volumeverhouding van glomeruli en de hele nier, kan worden uitgewerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: De functie Oppervlak toegepast op de geselecteerde nierstrip. (A) Oppervlak van de strip en alle glomeruli worden gecreëerd. Roze = glomeruli, blauw = uit Oppervlak van de nierstrip, groen = origineel label van vaten (glomeruli en enkele grote vaten). Schaalbalk =150 μm. (B) Wanneer het oppervlak van de strook (links) of de glomeruli (rechts) zijn geselecteerd (geselecteerde objecten worden geel), kunnen gegevens direct worden verkregen (gestippeld vak markeert waar het de gegevens weergeeft). (C) Het aantal, het volume van elke afzonderlijke glomerulus en het volume van de totale glomeruli konden rechtstreeks worden verkregen, evenals het volume van de strook. (D) Geëxporteerde gegevens kunnen verder worden geanalyseerd, zodat de berekening, zoals het gemiddelde volume van de glomeruli en de volumeverhouding van glomeruli en het geselecteerde gebied, kan worden uitgewerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselreinigingstechnologieën kunnen worden ingedeeld in 3 of 4 groepen 29,30,31. Organische weefselzuivering op basis van oplosmiddelen (bijv. DISCO en PEGASOS), weefselreiniging op basis van water (bijv. CUBIC) en weefselopruiming met hydrogel (bijv. CLARITY) zijn allemaal toegepast bij het opruimen van nieren 25,26,28,32. CUBIC, zoals we hebben aangetoond, werkt het beste wanneer de glomeruli (vaten) zijn gelabeld met FITC-Dextran. Bovendien heeft CUBIC een relatief handiger bedieningsproces en zijn er niet meer nodig dan gewone microscopisch kleine lenzen27, omdat de verwerkte monsters niet in organische reagentia hoeven te worden gedrenkt33. Verschillende clearingmethoden en tanklabelmethoden hebben echter hun eigen voor- en nadelen; Onderzoekers moeten mogelijk experimenteren met verschillende benaderingen om aan hun specifieke behoeften te voldoen.

Eerdere studies merkten op dat de glomeruli in gezuiverde nieren konden worden geëtiketteerd wanneer bloedvaten in de nieren werden gelabeld met 13,25,26,28. Een grondige verklaring voor dit fenomeen moet nog verder worden onderzocht, maar daaruit kan worden afgeleid dat een goede labelmethode voor het vasculaire systeem ook effectief de glomeruli labelt. Op basis van de experimentele resultaten raden we de intravasculaire injectie van FITC-Dextran met een gemiddeld molecuulgewicht (zoals 150 kDa) aan. Omdat etikettering echter afhankelijk is van de bloedcirculatie, kan deze methode er niet in slagen de glomeruli te labelen wanneer ze geen bloedsomloop hebben.

LSFM maakt grootschalige weefselobservatie mogelijk, waardoor het geschikter is voor de detectie van glomeruli van de hele nier. Het is echter mogelijk dat niet in elk laboratorium microscopen met lichtvellen beschikbaar zijn. Daarom bieden we een alternatieve set protocollen met behulp van gewone confocale microscopen. Hoewel de nier in meerdere secties moet worden gesneden, is het mogelijk om gegevens te verkrijgen zoals het aantal en het volume van glomeruli in de hele nier. Bovendien levert confocale microscopie een kleinere hoeveelheid gegevens op, wat gegevensverwerkingsvriendelijker is.

Imaris zorgt voor directe data-output. Er moet echter voor worden gezorgd dat het analoge signaal nauw aansluit bij het origineel. Bovendien kan het lang duren voordat de software grote bestanden verwerkt, wat frustrerend kan zijn. Zolang de glomeruli duidelijk kunnen worden gelabeld en gevisualiseerd, is er meer dan één unieke oplossing voor data-analyse. Onderzoekers van verschillende laboratoria konden aan de slag met hun eigen vertrouwde software en programmeertalen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82204951) en Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% PFABiosharp7007171800Fixation reaagen
502 Glue Deli7146For fixing the kidney to the sample fixing adapter 
AntipyrineAladdinA110660Clearing reagent
Brain MatrixRWD Life Science1mm 40-75Tissue slicing
Confocal microscopyNikonA1plusImage acquisition
FITC-DextranSigma-AldrichFD150SLabeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy ZeissLight sheet 7 Image acquisition
MiceEnsiweierAdult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) 
N-ButyldiethanolamineAladdinB299095Clearing reagent
NicotinamideAladdinN105042Clearing reagent
Pentobarbital NatriumsalzSigma-AldrichP3761
Tail vein fixatorJINUOTAIJNT-FS35Fix the mouse for vail injection
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Clearing reagent

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).">Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).">Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).">Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).">Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).">Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).">Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).">Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).">Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).">Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).">Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).">Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).">Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).">Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).
  14. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).">Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).">Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).">Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).">Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).">Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).">Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).">Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).
  21. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).">Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).">Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).">Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).">Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008(2022).">Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008(2022).
  26. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).">Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).">Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).">Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).
  29. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).">Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).">Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).">Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).">Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).">Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse GlomeruliGlomeruli LabelingKidney ImagingCUBIC Tissue ClearingFITC Dextran LabelingLight Sheet MicroscopyConfocal MicroscopyThree Dimensional ImagingImage Analysis SoftwareGlomeruli Quantification

Related Articles