Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66060

⸱

3 mei 2024

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Samenvatting

Ultrakorte zelfassemblerende peptiden (SAP's) kunnen spontaan nanovezels vormen die lijken op de extracellulaire matrix. Deze vezels maken de vorming van hydrogels mogelijk die biocompatibel, biologisch afbreekbaar en niet-immunogeen zijn. We hebben eerder bewezen dat SAP's, wanneer ze worden gebiofunctionaliseerd met van eiwitten afgeleide motieven, de extracellulaire matrixkenmerken kunnen nabootsen die de vorming van colorectale organoïden ondersteunen. Deze biofunctionele peptidehydrogels behouden de mechanische eigenschappen, afstembaarheid en printbaarheid van het oorspronkelijke ouderpeptide, terwijl ze aanwijzingen bevatten die cel-matrixinteracties mogelijk maken om de celadhesie te vergroten. Dit artikel presenteert de protocollen die nodig zijn om de effecten van verschillende biofunctionele peptidehydrogels op celadhesie en lumenvorming te evalueren en te karakteriseren met behulp van een adenocarcinoomkankercellijn die in staat is om op kosteneffectieve wijze organoïden van colorectale kanker te vormen. Deze protocollen zullen helpen bij het evalueren van biofunctionele peptide-hydrogeleffecten op celadhesie en luminale vorming met behulp van immunokleuring en fluorescentiebeeldanalyse. De cellijn die in deze studie is gebruikt, is eerder gebruikt voor het genereren van organoïden in van dieren afkomstige matrices.

Inleiding

In de afgelopen jaren zijn zelfassemblerende peptiden (SAP's) naar voren gekomen als veelbelovende biomaterialen voor weefselmanipulatietoepassingen. SAP's bezitten unieke eigenschappen, waaronder spontane vorming van nanovezels, biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en niet-immunogeniciteit, waardoor ze aantrekkelijke kandidaten zijn voor de ontwikkeling vansteigers1. SAP's zijn eerder gebruikt in combinatie met verschillende soorten cellen, en met name gerapporteerde ultrakorte SAP's hebben de inkapseling van stamcellen vergemakkelijkt terwijl ze hun pluripotentie gedurende langere perioden van meer dan 30 passages omvatten en met een minimale incidentie van chromosomale afwijkingen 2,3,4. Het aanpassen van SAP's voor hun gebruik in organoïdecultuur vormde dus een rationele volgende stap.

Organoïden zijn complexe driedimensionale structuren die ontstaan uit enkele pluripotente cellen. Deze structuren geven aanleiding tot verschillende celtypen, die zichzelf vervolgens organiseren om de ontwikkelingsprocessen van embryonale en weefselgroei in vitro te repliceren 5. Dit innovatieve raamwerk is uitgegroeid tot een formidabel hulpmiddel voor in-vitro-onderzoeken, waarbij de genetische, fenotypische en gedragskenmerken die kenmerkend zijn voor in vivo organen efficiënt wordenbehouden. Desalniettemin is een belangrijk obstakel bij de overgang van tafel naar bed van op organoïden gebaseerde bevindingen de noodzaak van reproduceerbaarheid7. Deze variatie in resultaten wordt voornamelijk toegeschreven aan de moeilijkheid om menselijke pluripotente stamcellen volledig te differentiëren in gespecialiseerde cellijnen, verergerd door de afwezigheid van authentieke weefselarchitectuur en de inherente complexiteit die wordt aangetroffen in organoïde modellen. Gezien de toenemende populariteit van op stamcellen en organoïden gebaseerde studies8, is er een geëscaleerde vraag naar biomaterialen met dynamische mechanische eigenschappen en integrine-achtige hechtingsplaatsen of steigers met gecontroleerde afbreekbaarheid 7,9. Deze kenmerken kunnen effectief worden afgestemd door het strategische gebruik van biofunctionele SAP's.

SAP's zijn korte sequenties van aminozuren met het inherente vermogen om zich spontaan te organiseren tot goed gedefinieerde structuren10. Deze peptiden bevatten vaak afwisselend hydrofobe en hydrofiele residuen, die hun zelfassemblage aansturen door middel van niet-covalente interacties, waaronder waterstofbruggen, elektrostatische interacties en hydrofobe effecten11,12. Het zelfassemblageproces van deze peptiden wordt voornamelijk gedreven door de noodzaak om de vrije energie van het systeem te minimaliseren. In een waterige omgeving hebben de hydrofobe residuen de neiging om samen te clusteren om hun blootstelling aan water te minimaliseren, terwijl de hydrofiele residuen interageren met de omringende watermoleculen. Dit fenomeen leidt tot de vorming van verschillende nanostructuren. In dit geval vormen ultrakorte zelfassemblerende peptiden nanovezels met kenmerken die afhankelijk zijn van de peptidesequentie en omgevingsomstandigheden 2,12,13,14,15,16. Deze peptiden nemen een β-turn conformatie aan, waarbij individuele peptidestrengen parallel of antiparallel aan elkaar worden uitgelijnd, gestabiliseerd door waterstofbruggen (Figuur 1). De aanwezigheid van positieve ionen versnelt de zelfassemblageprocessen die leiden tot de vorming van nanovezels.

Van peptide-nanovezels is vastgesteld dat ze een aangeboren vermogen hebben om aanzienlijke hoeveelheden water vast te houden. Deze eigenschap vergemakkelijkt de aanmaak van een hydrogel, die zich vervolgens manifesteert als een biocompatibele en biologisch afbreekbare driedimensionale ruimte die bevorderlijk is voor cellulaire proliferatie en groei. Deze zelfassemblerende peptide-nanovezels bootsen op ingewikkelde wijze de topografische kenmerken na die inherent zijn aan de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) -omgeving1. Deze gelijkenis geeft cellen een omgeving die hun fysiologische habitat imiteert, waardoor optimale cellulaire activiteiten verder worden bevorderd17. Bovendien maakt de veelzijdigheid die inherent is aan deze peptiden een aanzienlijke mate van afstembaarheid mogelijk4. Een dergelijk aanpassingsvermogen maakt veranderingen mogelijk in de eigenschappen van de matrix, zoals stijfheid, geleringskinetiek en porositeit. Deze aanpassingen worden bereikt door modificaties in de peptidesequentie. Bijgevolg zijn zelfassemblerende peptiden (SAP's) naar voren gekomen als cruciale componenten in de hedendaagse biomateriaalwetenschap, die op grote schaal worden gebruikt als steigers voor weefselregeneratie en cellulaire cultuur13,17.

Een van de cruciale voordelen van zelfassemblerende peptiden is hun vermogen om gemakkelijk op moleculair niveau te worden gesynthetiseerd en gemodificeerd. Dit voordeel maakt het mogelijk om specifieke functionele groepen of bioactieve motieven in de peptidesequentie op te nemen, waardoor peptiden met op maat gemaakte eigenschappen en functionaliteiten kunnen worden ontworpen 18,19,20 (Figuur 1B). Biofunctionaliseerde SAP's kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen om de ECM na te bootsen en differentiatie te bevorderen met behulp van het RGD-peptide19,21. Van peptide Ben-IKVAV is ook gemeld dat het de expressie van neuronale-specifieke markers aanzienlijk verhoogt vanwege de ligandspecifieke motiety22. Deze peptiden kunnen ook worden gemanipuleerd om bioactieve moleculen weer te geven, zoals integrine-bindende peptiden, om de overleving van cellen te verbeteren23. Ten slotte zijn andere biofunctionaliseerde SAP's ontwikkeld om angiogenese te bevorderen door de IKVAV- en YIGSR-motieven in hun structuren op te nemen24.

Biofunctionaliseerde SAP's die in een eerdere publicatie zijn gerapporteerd, laten zien dat zelfassemblage verder kan worden gemodificeerd door het naïeve peptide op te nemen waaruit de gebiofunctionaliseerde SAP is afgeleid25. Deze SAP-mengsels kunnen ook een breed scala aan SAP-formuleringen leveren die variëren in hun biochemische activiteit en fysisch-chemische eigenschappen. Het amfifiele peptide IIFK is bijvoorbeeld een ultrakorte SAP die bestand is tegen biofunctionalisatie met verschillende motieven, geïllustreerd door de integratie van het IKVAV-motief (Figuur 1B). Beide peptiden kunnen nanovezels vormen, zowel alleen als gecombineerd. Elke formulering resulteert in hydrogels met verschillende fysische eigenschappen (Figuur 2)

Vanwege het uitgebreide scala aan mogelijke permutaties en alternatieven die worden verkregen uit de biofunctionalisering van SAP's, is er echter behoefte aan een snelle en kosteneffectieve optie voor het testen van organoïden. Een kandidaat voor zo'n intensieve en kosteneffectieve organoïde-evaluatie is de SW1222-cellijn, afgeleid van humaan colorectaal adenocarcinoom26,27. SW1222-cellen bezitten kenmerken die hun aggregatie tot 3D-structuren die lijken op organoïden mogelijk maken, waardoor ze een ideaal model zijn voor het bestuderen van weefselontwikkeling en toepassingen in regeneratieve geneeskunde. Van SW1222-cellen is vastgesteld dat ze in staat zijn organoïden te genereren vanwege hun intrinsieke overexpressie van het LGR5-gen 27. De creatie van organoïden uit individuele LGR5+-stamcellen is al eerder overtuigend aangetoond, evenals de neiging van SW1222-cellen om morfologische kenmerken van een organoïde van colorectale kanker te bereiken28.

In dit methodedocument presenteren we gedetailleerde protocollen voor het evalueren en karakteriseren van de effecten van verschillende biofunctionele peptiden op celadhesie en lumenvorming met behulp van SW1222-cellen (Figuur 3). Door stapsgewijze procedures en beeldvormende analysemethoden aan te bieden, hopen we waardevolle inzichten te bieden in de biofabricage van organoïden en de evaluatie van simplistische SAP-matrices voor organoïdencultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Buffer en voorbereiding van de oplossing

OPMERKING: Alle vermelde concentraties zijn eindconcentraties.

  1. Voeg foetaal runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine toe in een eindconcentratie van respectievelijk 10% en 1% om Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) te bereiden. Maximaal 1 maand in het donker bewaren bij 4 °C.
  2. Meng MgCl2 (3 mM), sucrose (300 mM) en Triton X-100 (0,5%) in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) om de permeabilisatiebuffer voor te bereiden. Bewaar deze oplossing maximaal 2 maanden bij 4 °C.
  3. Combineer runderserumalbumine (BSA, 1%), glycine (0,3 M) en Tween-20 (0,1%) in PBS om een blokkerende buffer te bereiden. Bewaar deze oplossing maximaal 2 maanden bij 4 °C.
  4. Verdun 10x tot 2x PBS met ultrapuur water onder steriele omstandigheden. Bewaar deze oplossing langer dan 6 maanden bij kamertemperatuur.
  5. Steriliseer 3 mg van het peptidepoeder onder ultraviolet licht gedurende 30 minuten. Voeg 500 μL ultrapuur water toe om op te lossen met behulp van een vortexmixer.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie moet tweemaal de doelconcentratie zijn, d.w.z. 6 mg/ml, aangezien de concentratie van 1x 3 mg/ml zal zijn.

2. Colorectale kanker organoïde fabricage van SW1222 in peptide

  1. Ontdooi een aliquot een nacht bij 4 °C en bewaar het in ijs tot het nodig is om de matrixregeling in de kelder voor te bereiden.
  2. Plaats een druppel van 10 μL van 2x peptideoplossing in het midden van elk putje in een plaat met 24 putjes. Laat de plaat 10 minuten op kamertemperatuur incuberen. U kunt ook 8-10 druppels per putje deponeren in een plaat met 6 putjes.
    OPMERKING: Monsters die bedoeld zijn om te worden gebruikt in confocale en elektronenmicroscopie zijn toegankelijker om te manipuleren als ze op een steriel dekglaasje worden gezaaid.
  3. Voeg 10 μL van 2x PBS toe. Meng de PBS-oplossing voorzichtig met behulp van de tip. Laat de gels minstens 20 minuten stabiliseren en zorg ervoor dat de druppels bijna intact blijven.
    OPMERKING: Het doel van PBS-toevoeging en voorzichtig mengen is om de integriteit van de druppel te behouden en te voorkomen dat de hydrogel zich in een laag verspreidt.
  4. Maak SW1222-cellen los met 0,125% trypsine-EDTA-oplossing (5 ml). Incubeer de cellen met trypsine bij 37 °C gedurende 5-10 minuten totdat ze loskomen van de kolf. Tik niet op de kolf om celklontering te voorkomen.
  5. Voeg 5 ml compleet medium toe om de trypsine te inactiveren. Filtreer de celsuspensie met behulp van een celzeef van 30 μm. U kunt ook een injectiespuit met een naald van 25 G gebruiken om de aggregaten te verstoren.
  6. Bereid een celsuspensie van 0,4 × 106 cellen/ml en injecteer 2 μl van de celsuspensie in elke peptidedruppel met behulp van een micropipet van 10 μl.
  7. Incubeer de druppels gedurende 30 minuten bij 37 °C, 5% CO2. Voeg na incubatie 0,5 ml bijgevuld medium toe aan elk putje.
  8. Bereid tijdens het wachten de controle van de basale membraanmatrix voor door de hoofdvoorraad (8-12 mg/ml, afhankelijk van de partij) te verdunnen tot een eindconcentratie van 3 mg/ml met behulp van het bijgevulde medium. Voeg cellen toe aan deze oplossing (800 cellen per 25 μL).
    NOTITIE: De manipulatie van het basale membraan moet te allen tijde op ijs worden uitgevoerd. De tips moeten worden afgespoeld in ijskoude PBS voordat ze de hydrogel aanraken. Anders vindt polymerisatie plaats in de uiteinden.
  9. Plaat 20 μL druppeltjes van de basaalmembraanoplossing in elk putje. Laat de druppels geleren door ze 20 minuten bij 37 °C te laten incuberen. Nadat het materiaal is gegeleerd, voegt u 0,5 ml volledig medium toe.
  10. Vervang het medium elke 3-4 dagen. Observeer de cellen die zich al op dag 4 organiseren en signalen van lumenvorming vertonen.
  11. Beeldcellen in helderveld op dag 1, dag 4 en dag 7 om de groei van organoïden te evalueren.

3. Levensvatbaarheid en proliferatie

  1. Bereid drie black-well-platen voor voor de levensvatbaarheidstest en drie black-well-platen voor de proliferatietest. Voeg 25 μL 2x peptideoplossing per putje toe en gelaat met hetzelfde volume van 2x PBS. Zaai de cellen zoals hierboven beschreven.
  2. Bereid drie putjes voor voor elke formulering van peptidehydrogel die als blanco's in de proliferatieplaat moeten worden gebruikt. Zaai hier geen cellen op.
  3. Verwijder het medium van de plaat van de levensvatbaarheidsput en was met 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  4. Verdun Calceïne-AM en ethidiumhomodimeer tot 8 μM uit de levensvatbaarheids-/cytotoxiciteitskit voor zoogdiercellen (zie Materiaaltabel) in dezelfde tegen licht beschermde conische buis. Om 2 ml van deze oplossing te bereiden op 2 ml PBS in een tegen licht beschermde conische buis, voegt u 4 μl van de Calcein-AM-bouillonoplossing en 8 μl van de Ethidiumhomodimeer-1-bouillonoplossing toe.
  5. Voeg de in stap 3.4 bereide calceïne/ethidiumhomodimeeroplossing toe aan de plaat met 96 putjes. Voeg 100 μL per putje toe. Beschermen tegen licht en 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  6. Was 3 x 5 min met 1x PBS. Afbeelding van minimaal drie velden (midden, boven, onder) bij gebruik van een 4x objectief of minimaal vijf velden (midden, linksboven, rechtsboven, linksonder, rechtsonder) bij gebruik van een 10x en 20x objectief onder een fluorescentiemicroscoop.
  7. Verwijder het medium van de plaat van de proliferatieput om een eindvolume van 90 μl te garanderen.
  8. Voeg 10 μL Alamar Blue-oplossing toe (zie Materiaaltabel) om een eindconcentratie van 10% te bereiken.
  9. Beschermen tegen licht en 2-4 uur incuberen bij 37 °C, 5% CO2
  10. Gebruik een putplaatlezer om fluorescentie (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) of absorptie (570 nm) te meten. Neem het gemiddelde van de waarden die zijn verkregen voor de lege plekken en trek ze af van de waarden van elk putje dat cellen bevat.
  11. Bereken proliferatiewaarden door het gemiddelde te nemen van het signaal van elke voorwaarde en het gemiddelde van hun respectievelijke lege plekken af te trekken. Maak grafieken door een geïndexeerde boxplot te genereren van het relatieve absorptie-/fluorescentiesignaal versus de tijd.

4. Hechtingstest van cellen aan matrix

  1. Bereid 100 μL peptidehydrogels in twee onafhankelijke platen met 96 putjes.
  2. Zaai 20.000 cellen in elk putje en voeg 100 μL medium toe. Incubeer de platen gedurende 90 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
  3. Neem na incubatie slechts één plaat en resuspendeer het medium voorzichtig met een P200-micropipet gedurende 20-30 s. Pas op dat u de hydrogel niet verstoort door de punt van de gel te houden. Als alternatief, als de mechanische eigenschappen van de hydrogel dit toelaten (G' > 8.000 Pa), tik dan op de vier zijden van de putplaat met behulp van een bewegende vortex.
    OPMERKING: Door de media opnieuw te suspenderen (of met de vortex op de putplaat te tikken) worden zowel niet-aangehechte cellen als cellen met een zwakke hechting aan het oppervlak van de matrix verwijderd. De cellulaire aanhechting vindt binnen 90 minuten plaats, hoewel de sterkte van deze aanhechting zal variëren afhankelijk van de specifieke peptidehydrogels en hun hechtende en bindende eigenschappen. Het is bekend dat colorectale organoïdegroei de voorkeur geniet in matrices met stijfheidswaarden van minder dan 2.000 Pa. Omdat de hydrogels die in dit protocol worden gepresenteerd zacht en broos zijn, maken we er een punt van om zachte mechanische belasting te gebruiken.
  4. Verwijder 100 μL medium van beide putplaten en voeg één keer wassen toe met 1x PBS.
  5. Bereid een DAPI-oplossing van 1 μg/ml. Voeg 100 μL van de DAPI-oplossing toe aan alle putjes en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Beeld een representatief aantal velden onder een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen worden verkregen met hetzelfde objectief om de pixel/afstandsverhouding constant te houden.
    OPMERKING: Afbeelding negen velden voor een 10x objectief of 15 velden met een 20x objectief.
  7. Laad de fluorescentiebeelden op beeldanalysesoftware (bijv. ImageJ) en analyseer de deeltjes op alle afbeeldingen.
    1. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Type en klik op 8-bits.
    2. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Aanpassen en klik op Helderheid/Contrast. Klik op de Auto-knop | Toepassen.
    3. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Aanpassen en klik op Drempelwaarde. Klik op de knop Auto en sluit het venster.
    4. Klik in het menu Analyseren op Deeltjes analyseren. Vink de optie aan om samen te vatten en klik op OK.
    5. Plaats in het venster Overzicht de muisaanwijzer op het menu Bestand en klik op Opslaan om de overzichtswaarden op te slaan.
  8. Exporteer de resultaten voor alle afbeeldingen naar standaard statistieksoftware.
  9. Bereken het percentage van het gebied dat voor en na stress door cellen wordt bedekt. Maak een geïndexeerde boxplot van het percentage van de oppervlakte tegen elke voorwaarde.

5. Immunokleuring van organoïden in peptide hydrogel

  1. Zaad 800 cellen in druppeltjes peptidehydrogel van 20 μl gedurende 4 dagen, zoals beschreven in stap 2.1-2.10.
  2. Verwijder op dag 4 het medium en was elk putje 2x met 1x PBS.
  3. Voeg 400 μL van een 4% formaldehyde-oplossing toe. Incubeer de putplaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de formaldehyde-oplossing met een P1000 en was één keer met 1x PBS.
  5. Voeg 1 ml permeabilisatiebuffer toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder de permeabilisatiebuffer met een P1000 en was één keer met 1x PBS.
  7. Voeg 0,5 ml blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Verwijder de blokkeerbuffer met een P1000 en was met 1x PBS.
  9. Verdun het primaire antilichaam in de blokkeerbuffer volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Voeg 200 μL toe aan twee putjes.
  10. Incubeer een nacht bij 4 °C.
  11. Verwijder de kleuroplossing met een P200 en was één keer met 1x PBS.
  12. Verdun het secundaire antilichaam in de blokkeerbuffer, volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Voeg het falloidineconjugaat toe in een verhouding van 1:40 aan de secundaire antilichaamoplossing.
  13. Bescherm tegen licht en incubeer niet langer dan 3 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de kleuroplossing met een P200 en was één keer met 1x PBS.
  14. Bereid een DAPI-oplossing van 1 μg/ml in de blokkeerbuffer. Voeg 300 μL van de DAPI-oplossing toe aan elk putje.
  15. Bescherm tegen licht en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  16. Verwijder de kleuroplossing met een P200 en was één keer met 1x PBS.
  17. Beschermen tegen licht en tot 7 dagen bewaren bij 4 °C.

6. Beeldvorming en beeldanalyse van organoïden in matrix

  1. Beeld de gekleurde monsters met een epifluorescentiemicroscoop op 10x. Gebruik alleen de falloidine- en DAPI-kanalen.
  2. Open de Cellopose software en druk op ctrl + L om een afbeelding te laden. Aangezien de software toegang heeft tot alle bestanden op de locatie van de geselecteerde afbeelding, moet u ervoor zorgen dat u alle fluorescentiebeelden op de exacte locatie opslaat zonder submappen te hebben.
  3. Typ de gemiddelde diameter van de kolonies in het deelvenster Segmentatie en klik op ENTER.
  4. Selecteer een aangepast model voor colonorganoïden en klik op de knop Model uitvoeren .
    OPMERKING: Hier raden we aan om twee vanaf nul modellen te gebruiken in Cellpose2.029,30
  5. Druk op ctrl + s om de maskers op te slaan als een .npy-bestand.
  6. Gebruik de pijlen op het toetsenbord om door de afbeeldingen van de map te bladeren en voer het model voor colonorganoïden uit op alle afbeeldingen in de map.
  7. Maak een kopie van de map en herhaal stap 6.2-6.6 met behulp van een model voor het lumen van de dikke darmorganoïde.
  8. Open ImageJ en klik op Plugin | Macro's | Rennen... om het imagej_roi_converter.py bestand dat beschikbaar is op de Cellpose Github-site uit te voeren en wacht tot er een venster verschijnt.
  9. Selecteer het eerste bestand uit de organoïdemap van de dikke darm en klik op Openen.
  10. Selecteer het bestand seg.npy dat overeenkomt met het eerste bestand en klik op Openen.
    OPMERKING: ImageJ zet de maskers om in interessante gebieden en overlapt ze met de bijbehorende fluorescentiebeelden.
  11. Klik op Alles selecteren in het venster ROI Manager en klik op Meten.
  12. Klik op Bestand | Opslaan als... in het venster Resultaten en sla de resultaten op.
    OPMERKING: Dit resulteert in een .csv bestand met alle vormeigenschappen van elke kolonie in het veld.
  13. Herhaal stap 6.8-6.12 voor dezelfde afbeelding in de map voor colon organoïde lumen.
  14. Laad OriginPro en druk op ctrl + 3 om de Import Wizard te openen. Klik op de knop met de drie puntjes en selecteer beide .csv bestanden die overeenkomen met organoïde- en lumenvormeigenschappen voor dezelfde afbeelding.
  15. Kopieer en plak de resultaten van de lumenvormeigenschappen in één kolom naast de resultaten van de kolonie om ervoor te zorgen dat elke lumenmeting wordt gekoppeld aan de respectieve kolonie.
  16. Verdeel in een nieuwe kolom de gebieden van het lumen en de kolonie om het relatieve lumengebied van de bevattende kolonie te verkrijgen.
  17. Selecteer de kolom die overeenkomt met de rondheid van elke kolonie en het lumengebied. Klik op Plot | Basis 2D | Verspreiden.
  18. Klik met de rechtermuisknop op het plotvenster en selecteer Plotdetails. Klik op het tabblad Zwaartepunt (PRO) en vink de opties aan: Zwaartepunt weergeven voor subset, Verbinden met gegevenspunten en Ellips weergeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Eerst evalueerden we de cellen die gedurende 7 dagen in een plaat met 24 putjes werden gekweekt met behulp van helderveldbeeldvorming. We identificeerden kleine clusters van cellen die zich in de loop van de week tot organoïden verzamelden, zoals te zien is in figuur 4. Een gecontroleerde scanmethode kan de beweeglijkheid van de cellen en de organoïden tussen verschillende dagen volgen. Over het algemeen keken we naar de evolutie van de morfologie van de cellen gedurende de hele week. Van SW...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het enorme potentieel van SAP's in biomedisch onderzoek wordt onderstreept door hun kneedbaarheid en aanpassingsvermogen door biofunctionalisatie. Met zo'n uitgebreid scala aan permutaties ontstaat de uitdaging om efficiënt te testen en de meest veelbelovende configuraties te bepalen voor specifieke toepassingen, vooral in organoïdenonderzoek. Een snelle, kosteneffectieve oplossing is van het grootste belang. De SW1222-cellijn, afgeleid van humaan colorectaal adenocarcinoom, komt naar voren als een cruciale kandidaat voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology. De auteurs erkennen KAUST's Seed Fund Grant en KAUST's Innovation Fund toegekend door KAUST's Innovation and Economic Development. De auteurs willen de Bioscience and Imaging Core Labs van KAUST bedanken voor hun ondersteuning van de biologische karakterisering en microscopie-analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBSGibco14190144
6-well plate, tissue culture treatedCorning07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesiumGibco70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906
24-well plate, tissue culture treatedCorning09-761-146
96-well black plate, tissue culture treatedCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonalAbcamab40839Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonalAbcamab16505Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonalAbcamab190085Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAObtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633Invitrogen35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsInvitrogenL3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red freeCorning356255Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Round Cover Slip, 10 mm diameterVWR631-0170
Scanning Electron MicroscopeThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μm strainerSysmex04-004-2326
sucroseSigma-AldrichS1888
SW1222 cell lineECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure waterInvitrogen10977015

Referenties

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Zelfassemblerende peptidenpeptidehydrogelorganoïdkweekbiofunctionaliserende hydrogelsimmunokleuringanalysefluorescentiemicroscopie3D-bioprintenImageJ-analyse
Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.