Methodenartikel

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66193

⸱

22 december 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education and Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Samenvatting

Residente CD34+ vasculaire wand-residente stam- en voorlopercellen (VW-SC's) worden steeds meer erkend voor hun cruciale rol bij het reguleren van vasculair letsel en herstel. Het opzetten van een stabiele en efficiënte methode om functionele muizen CD34+ VW-SC's te kweken is essentieel voor verder onderzoek naar de mechanismen die betrokken zijn bij de proliferatie, migratie en differentiatie van deze cellen onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. De beschreven methode combineert magnetische parelscreening en flowcytometrie om primair gekweekte CD34+ VW-SC's te zuiveren. De gezuiverde cellen worden vervolgens functioneel geïdentificeerd door middel van immunofluorescentiekleuring en Ca2+- beeldvorming. In het kort worden vasculaire cellen uit de adventitia van de aorta van de muizen en de mesenteriale slagader verkregen door aanhechting van weefselblokkades, gevolgd door subculturatie tot het bereiken van een celgetal van ten minste 1 ×10 7. Vervolgens worden CD34+ VW-SC's gezuiverd met behulp van magnetische parelsortering en flowcytometrie. Identificatie van CD34+ VW-SC's omvat cellulaire immunofluorescentiekleuring, terwijl functionele multipotentie wordt bepaald door cellen bloot te stellen aan een specifiek kweekmedium voor gerichte differentiatie. Bovendien wordt de functionele interne Ca2+- afgifte en externe Ca2+ -invoer beoordeeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar beeldvormingswerkstation in Fura-2/AM-geladen cellen die zijn blootgesteld aan ATP, cafeïne of thapsigargin (TG). Deze methode biedt een stabiele en efficiënte techniek voor het isoleren, kweken en identificeren van CD34+ -stamcellen die in de vaatwand wonen, en biedt de mogelijkheid voor in-vitrostudies naar de regulerende mechanismen van VW-SC's en de screening van gerichte geneesmiddelen.

Inleiding

De vaatwand speelt een cruciale rol bij de vasculaire ontwikkeling, homeostatische regulatie en de progressie van vaatziekten. In de afgelopen jaren hebben talrijke onderzoeken de aanwezigheid van verschillende stamcellijnen in slagaders aan het licht gebracht. In 2004 rapporteerde de groep van professor Qingbo Xu voor het eerst het bestaan van vasculaire stam-/voorlopercellen in de periferie van de volwassen vaatwand, die CD34, Sca-1, c-kit en Flk-11 tot expressie brengen. Deze vasculaire stamcellen vertonen multidirectionele differentiatie en proliferatiepotentieel. Onder normale omstandigheden blijven ze relatief rustig; Wanneer ze echter door specifieke factoren worden geactiveerd, kunnen ze differentiëren in gladde spiercellen, endotheelcellen en fibroblasten. Als alternatief kunnen ze de perivasculaire matrix en de vorming van microvaten reguleren door middel van paracriene effecten om het herstel of de hermodellering van gewonde bloedvaten te bevorderen 2,3,4,5,6. Onlangs werd vastgesteld dat residente CD34+-stamcellen in de vaatwand een rol spelen bij de regeneratie van endotheelcellen na letsel aan de voerdraad van de dijbeenslagader2. Bijgevolg zijn de isolatie en kwantificering van CD34+ VW-SC's en het onderzoek van de biologische basiskenmerken van CD34+ stamcellen cruciaal voor het verder bestuderen van de signaalroutes die betrokken zijn bij de regulatie van CD34+ VW-SC's.

Er zijn momenteel verschillende methoden voor celscheiding beschikbaar, waaronder technieken die zijn gebaseerd op celcultuurkenmerken of fysische eigenschappen van cellen, zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie, wat resulteert in gesorteerde cellen met veel niet-doelcellen en een relatief lage zuiverheid 7,8,9,10,11,12 . Een andere veelgebruikte techniek is fluorescentie/magnetisch geassisteerde celsortering. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een complex systeem met hoge technische eisen, en het is relatief duur, tijdrovend en beïnvloedt mogelijk de activiteit van gesorteerde cellen 13,14. Magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) is echter efficiënter en handiger, met een hoog herstelpercentage en celactiviteit en minder impact op downstream-toepassingen8. Daarom hebben we in dit protocol MACS toegepast om CD34+ VW-SC's te zuiveren en de cellen verder te identificeren door middel van flowcytometrie. Het opzetten van op MACS gebaseerde isolatiemethoden voor het bestuderen van vaatwandstamcellen zou van onschatbare waarde zijn. Ten eerste maakt het experimenteel genetisch en celbiologisch onderzoek mogelijk. Ten tweede maakt efficiënte isolatie en kweek van stamcellen in de vaatwand systematische beoordeling en screening van signaalfactoren die stamcelfuncties reguleren mogelijk. Ten derde zorgt de identificatie van cruciale fenotypes in stamcellen voor een belangrijke 'kwaliteitscontrole' bij het beoordelen van de celstatus. Het identificeren van zuiveringsmethoden zou dus nuttig kunnen zijn voor vergelijkbare toepassingen als analoge stamcellen die zijn afgeleid van vaten.

Dit rapport biedt een gedetailleerde demonstratie van een stabiele en betrouwbare methode voor de kweek van CD34+ VW-SC's, inclusief celidentificatie en functionele beoordeling uitgevoerd door flowcytometrie, immunofluorescentiekleuring en Ca2+ -signaleringsmeting. Deze studie biedt een basis voor verder diepgaand onderzoek naar de functie van CD34+ VW-SC's en hun regulerende mechanismen bij fysiologische en pathologische aandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd en de dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen voor het beheer en gebruik van proefdieren in China. Het onderzoek hield zich strikt aan de ethische eisen van dierproeven, met goedkeuring van de Ethische Commissie voor Dieren (Goedkeuringsnummer: SWMU2020664). Acht weken oude gezonde C57BL/6-muizen van beide geslachten, met een gewicht tussen 18-20 g, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden gehuisvest in het Laboratory Animal Center van de Southwest Medical University (SWMU).

1. Weefselblokcultuur van adventitie uit de aorta en mesenteriale slagaders

  1. Isolatie van CD34+ VW-SC's voor bewoners
    1. Verdoof twee muizen met 3% isofluraan inhalatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig adequate anesthesie door in de tenen te knijpen. Plaats de muis op zijn rug met medische tape en spray 70% ethanol ontsmettingsmiddel om de vacht van de muis te desinfecteren. Open de borst- en buikholte met behulp van een steriele oogheelkundige schaar en tang om het hart en de darmen bloot te leggen. Na het ontleden van de geïsoleerde aorta en mesenteriale slagaders, speldt u de aorta en het mesenteriale bed in een petrischaal met siliciumelastomeer en gevuld met een fysiologische zoutoplossing. Ontleed met een andere set gesteriliseerde scharen en tangen snel het vet rond de aorta en mesenteriale slagaders.
    2. Breng de ontlede weefsels over in een petrischaal van 6 cm met 1% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing (zie materiaaltabel). Breng na twee keer spoelen de slagaders over naar een weefselkweekkap onder een stereomicroscoop.
    3. Snijd de slagaders in de lengterichting door en gebruik een fijne pincet om de buitenste laag van de aorta en de eerste tak van de mesenteriale slagaders af te pellen. Breng de buitenste lagen over in een petrischaal van 3,5 cm met 0,1-0,2 ml kweekmedium (zie Materiaaltabel). Snijd de buitenste lagen in kleine stukjes (ongeveer 1 mm3).
    4. Breng de weefselstukjes over in een met gelatine beklede T25-kolf en zorg voor een gelijkmatige verdeling over de bodem van de kolf. Houd een matige afstand tussen de weefselstukken om het kruipen en de groei van cellen te vergemakkelijken. Plaats de kolf gedurende 3 uur verticaal in een broedstoven (37 °C, 5% CO2) zodat de weefselblokjes aan de bodem van de kolf kunnen hechten.
    5. Voeg na 3 uur 5 ml DMEM hoog glucosegroeimedium toe om de weefselblokken onder te dompelen. Oriënteer de T25-kolf horizontaal. Bewaak de celmigratie rond weefselblokkades door een microscoop met tussenpozen van 3 dagen.
      OPMERKING: Het medium moet 20% foetaal runderserum, 0,2% leukemieremmende factor (LIF), 0,2 mM β-Mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine bevatten (zie materiaaltabel). Foetaal runderserum ondersteunt de celproliferatie, terwijl LIF en β-Mercaptoethanol de celdifferentiatie belemmeren 7,8.
    6. Wanneer cellen in de T25-kolf ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, passeer en kweek ze dan in een of twee T75-kolven. Subcultuur van de cellen over vijf passages om een goede groei en gezondheid te garanderen.
  2. Magnetische scheiding van residente CD34+ stamcellen
    1. Wanneer de cellen in een of twee T75-kolven 80% samenvloeiing bereiken, dissocieert u de cellen met trypsine en resuspendeert u ze in 1 ml sorteerbuffer (2 mM EDTA en 0,5% FBS). Bepaal het celnummer (kolf 107/T75) en centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur).
    2. Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de celpellet in 98 μl sorteerbuffer per 107 totale cellen. Voeg 2 μL CD34-antilichaam toe (zie materiaaltabel). Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij 4°C in het donker met af en toe schudden.
    3. Was de cellen door 2 ml sorteerbuffer toe te voegen en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatans voorzichtig en volledig en resuspendeer de cellen in 80 μL sorteerbuffer.
    5. Voeg 20 μL Anti-FITC MicroBeads (per 107 cellen in totaal, zie Materiaaltabel) toe aan de buffer. Meng goed door herhaaldelijk pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker met intermitterend schudden.
    6. Was de cellen twee keer door 2 ml buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g om de cellen opnieuw te pelleteren. Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de cellen in 1 ml buffer.
    7. Plaats een MS-kolom binnen het magnetische veld van een geschikte scheider en zorg ervoor dat er een verzamelbuis (bijv. een centrifugebuis van 15 ml) onder de MS-kolom wordt geplaatst om de gescheiden componenten op te vangen. (zie Tabel met materialen). Spoel de kolom af met een buffer van 500 μL en wacht tot deze volledig is doorgelopen.
    8. Laad de celsuspensie in de kolom en verzamel de doorstroom met niet-gelabelde cellen in de buis van 15 ml.
    9. Verwijder de kolom uit de separator en plaats deze op een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Breng 500 μL buffer in de kolom en spoel vervolgens onmiddellijk de magnetisch gelabelde cellen weg door de zuiger in de kolom te duwen.
    10. Om de zuiverheid van CD34+- cellen te verbeteren, kan de geëlueerde fractie worden verrijkt met behulp van een tweede MS-kolom. Herhaal het scheidingsproces zoals hierboven vermeld. Beoordeel de zuiverheid van de gesorteerde cellen via flowcytometrie.
      OPMERKING: Doorgaans worden 10%-20% CD34+ -cellen verkregen, met ongeveer 70%-80% negatieve cellen en ongeveer 10% verlies als gevolg van kleurings- en centrifugeprocedures.
    11. Om de zuiverheid van vasculaire wand CD34+ stamcellen verder te bevestigen, identificeert u de gesorteerde cellen door middel van flowcytometrie. De huidige studie toonde een zuiverheid van meer dan 90%.

2. Celidentificatie door immunofluorescentie

  1. Zaadcellen op dekglaasjes (diameter 8 mm) voorgecoat met 0,04% gelatine.
  2. Wanneer de cellen ongeveer 60%-70% samenvloeiing bereiken, spoel dan twee keer met PBS en fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
  3. Was de cellen gedurende 3 minuten (3 keer) met PBS en permeabiliseer de cellen met 0,2% Triton X-100 (in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was de cellen met PBS gedurende 3 minuten (3 keer) en blokkeer de niet-specifieke binding van de antilichamen met 5% ezelserum (in PBS) gedurende 1 uur.
  5. Verwijder de blokkeerbuffer door elk dekglaasje met een pincet op de rand te houden en op een vel pluisvrije doekjes te laten lopen.
  6. Incubeer de cellen in 100 keer verdunde primaire antilichamen (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, zie materiaaltabel) in 1% BSA (in PBS) 's nachts bij 4 °C.
  7. Decanteer de oplossing en was de cellen gedurende 3 minuten (3 keer) met PBS. Incubeer de cellen met Alexa Fluor 488 gelabeld secundair antilichaam (1:200 in 1% BSA) (zie materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  8. Voer DAPI-tegenkleuring uit door DAPI-stockoplossing te verdunnen tot 0,5 μg/ml in PBS en cellen gedurende 5 minuten te incuberen.
  9. Spoel af met PBS en dicht de dekglaasjes af met antifade-reagens. Leg beelden vast onder de confocale laserscanmicroscoop.

3. Geïnduceerde differentiatie en karakterisering van CD34+ VW-SC's

  1. Zaad CD34+ stamcellen met een geschikte dichtheid (40%-50% confluentie) op respectievelijk dekglaasjes en 6-putjes platen.
  2. Induceer endotheelcel-georiënteerde differentiatie van CD34+ -cellen door cellen te kweken in endotheelcelkweekmedium EBM-2 (zie materiaaltabel) gedurende 1 week.
  3. Induceer fibroblastcel-georiënteerde differentiatie van CD34+ -cellen door cellen te kweken in fibroblastcelkweekmedium FM-2 (zie materiaaltabel) gedurende 3 dagen.
  4. Onderwerp de ongedifferentieerde en gedifferentieerde cellen aan immunofluorescentiekleuring (zoals vermeld in stap 2) bij laserexcitatie van 488 nm en een 40x objectief. Detecteer de expressie van endotheelcelmarkers (CD31, VWF) en fibroblastcelmarkers (PDGFRα, Vimentin) (zie Materiaaltabel).
  5. Dissocieer de cellen met trypsine en verkrijg de celkorrel door centrifugeren (300 x g, 5 min, kamertemperatuur). Resuspendeer de cellen met 100 μL sorteerbuffer. Pre-incubeer de celsuspensie met gezuiverd anti-muis CD16/CD32 mAb (1 μg) (zie materiaaltabel) bij 4 °C gedurende 5 min.
  6. Voeg 2 μL PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoklonaal Antilichaam APC (2 μL, 1:50) en CD140a (PDGFRa) Monoklonaal Antilichaam FITC (2 μL, 1:50) rechtstreeks toe aan gepre-geïncubeerde cellen in aanwezigheid van Mouse Fc Block en verder incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten.
  7. Was de cellen twee keer door 2 ml buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten (kamertemperatuur) bij 300 x g om de cellen opnieuw te pelleteren. Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de cellen in 300 μL buffer. Plaats flowbuizen met gekleurde cellen in een koelbox, klaar voor flowcytometrie.

4. Detectie van intracellulaire Ca2+ signalering in vasculaire CD34+ stamcellen

  1. Zaadcellen op dekglaasjes 10 uur voor experimenten met een dichtheid tot 70% confluentie.
  2. Haal de dekglaasjes eruit en bevestig ze op de bodem van een aangepaste kamer met vaseline.
  3. Was de dekglaasjes eenmaal met PBS, vervang ze door Fura-2/AM (5 μM) in Tyrode-oplossing (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,2 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,4 mM) (zie Materiaaltabel) en incubeer de cellen gedurende 30 minuten in het donker.
  4. Verwijder de kleurstof door deze gedurende 10 minuten te behandelen met de oplossing van Tyrode om fura-2/AM ontestering mogelijk te maken.
  5. Monteer de kamer op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een breedveldbeeldvormingssysteem met een monochromator en een CCD-camera (zie Materiaaltabel).
  6. Open het hoofdvenster, ga naar het dialoogvenster Grab-instellingen en de camerapagina en druk op de live-knop voor livebeeldweergave.
  7. Kies het fluorescentiebeeldtype, stel de lusherhalingstijden van 340 nm/380 nm, het beeldformaat en de belichtingstijd van de camera in op 380 nm en 340 nm om een optimale beeldhelderheid te bereiken.
  8. Maak enkele snapshots en teken verschillende lijnen uit de vrije hand om de cellen met verschillende kleuren te omcirkelen en vooraf Region of Interests (ROI's) te definiëren, waarbij de achtergrond wordt aangegeven als ROI 0.
  9. Bewerk een reeds ingesloten protocol opnieuw in de werkruimteweergave en maak een nieuwe werkruimte.
  10. Voer het protocol uit en de "Fluorescentie 340 nm div Fluorescentie 380 nm (Live Kinetic)" geeft de online kinetische grafiek weer.
  11. In de numerieke weergave is een spreadsheet zichtbaar met kolommen met grijswaardenwaarden en bijbehorende tijdinformatie. Exporteer de spreadsheetgegevens met behulp van het klembord.
  12. Bereken F340 nm/F380 nm met vermelding van intracellulaire Ca2+ veranderingen na aftrek van de achtergrondfluorescentie (ROI 0).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie en zuivering van CD34+ VW-SC's
Hoge zuiverheid van CD34+ VW-SC's wordt verkregen uit de adventitie van de aorta en mesenteriale slagader van de muis door weefselaanhechting en magnetische microbead-sortering. Het percentage CD34+- cellen in de vaatwand is over het algemeen 10%-30%. Flowcytometrie bevestigt dat de zuiverheid van CD34+- cellen verkregen door magnetische parelsortering meer dan 90% is (Figuur 1A). Cellulai...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie biedt een snelle en handige methode voor het verkrijgen van functionele CD34+ VW-SC's uit de aorta en mesenteriale slagaders van muizen. CD34+ VW-SC's die met deze methode worden verkregen, hebben proliferatieve activiteit en multidirectionele differentiatie-eigenschappen. Trifosfaatinositol 1,4,5-trisfosfaatreceptoren (IP3R's), ryanodinereceptoren (RyR's) en in de winkel bediende calciumkanalen mediëren de afgifte en binnenkomst van Ca2+ in CD34+ VW-SC's...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82070502, 31972909, 32171099), het Sichuan Science and Technology Program van de provincie Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). De auteurs willen Qingbo Xu van de Universiteit van Zhejiang bedanken voor zijn hulp bij de celkweek, en de auteurs erkennen de wetenschappelijke en technische hulp van het flowcytometrieplatform in de Southwest Medical University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2% gelatine-oplossingSigmaG1393
Anti-CD31 antilichaamR&DAF3628
Anti-CD34 antilichaamAbcamab81289
Anti-c-kit antilichaamCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 antilichaamAbcamab24313
Anti-Ki67 antilichaamCST34330
Anti-PDGFRα antilichaamAbcamab131591
Anti-Sca- 1 antilichaamInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoklonaal Antilichaam (APA5), FITCeBioscience  Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoklonaal Antilichaam (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Antilichaam, anti-muis, FITC, REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
celkweekkapJIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD SW-CJ-2FD
Centrifuge  CENCE  L530
CO2 incubators            Thermofisher Scientific4111
Confocal laserscanningmicroscoop Zeiss zeiss 980  
DMEM Hoge Glucose MediumATCC30-2002
EBM-2 kweekmediumLonzaCC-3162
FACSMelody  BD Biosciences
FACSMelody™ Systeem BD
Fetaal bovien serumMilliporeES-009-C
FM-2 kweekmediumScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 488 Thermofisher Scientific   A32731
Leukemie remmend factorMilliporeLIF2010
Microscoop OlympusIX71
MiniMACS   StartkitMiltenyi Biotec130-090-312
Penicilline-Streptomycine-Amfotericine B OplossingBeyotimeC0224
Gezuiverd Rat Anti-Muis CD16/CD32 (Muis BD Fc Blok)BD Pharmingen553141
Stereo Microscoop OlympusSZX10 
TILLvisION 4.0 programma  T.I.L.L.Photonics GmbHpolychrome V 
VWF Monoklonaal Antilichaam (F8/86)Thermofisher Scientific MA5-14029
β-MercaptoethanolThermofisher Scientific21985023

Referenties

  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
  3. Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells. Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).
  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  5. Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. Roles of stem cells in vascular remodeling. Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).
  6. Zhang, L., et al. Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis. Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).
  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125(2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
  12. Qu, R., et al. The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).
  13. Flynn, J., Gorry, P. Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells. Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).
  14. Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies. Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).
  15. Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells. Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).
  16. Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells. Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).
  17. Kumar, P., Garg, N. Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures. Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).
  18. Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes. Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).
  19. Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration. PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).
  20. Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits. Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).
  21. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).
  22. Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration. Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).
  23. Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).
  24. Garcia-Carlos, C. A., et al. Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures. Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).
  25. Reggiani, C. Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CD34 positieve stamcellenvaatwandstamcellensorteren met magnetische beadsflowcytometrieimmunofluorescentiekleuringcalcium imagingweefselblokkweekendotheliale differentiatiefibroblastdifferentiatieisolatie van de muisaorta

Gerelateerde artikelen