Methodenartikel

Neuraal netvlies genereren uit menselijke pluripotente stamcellen

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66246

⸱

22 december 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerd 3D neuraal retina-inductiesysteem dat de hechting en fusie van retinale organoïden vermindert met een hoge herhaalbaarheid en efficiëntie.

Samenvatting

Retinopathie is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Het onderzoeken van de pathogenese is essentieel voor de vroege diagnose en tijdige behandeling van retinopathie. Helaas belemmeren ethische barrières het verzamelen van bewijs van mensen. Onlangs hebben talrijke onderzoeken aangetoond dat menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) kunnen worden gedifferentieerd in retinale organoïden (RO's) met behulp van verschillende inductieprotocollen, die een enorm potentieel hebben in retinopathie voor ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en op stamcellen gebaseerde therapieën. Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd inductieprotocol om neuraal netvlies (NR) te genereren dat de kans op vesiculatie en fusie aanzienlijk vermindert, waardoor het slagingspercentage van de productie tot dag 60 toeneemt. Op basis van het vermogen van PSC's om zichzelf te reorganiseren na dissociatie, in combinatie met bepaalde complementaire factoren, kan deze nieuwe methode specifiek NR-differentiatie stimuleren. Bovendien is de aanpak ongecompliceerd, kosteneffectief, vertoont het een opmerkelijke herhaalbaarheid en efficiëntie, biedt het bemoedigende vooruitzichten voor gepersonaliseerde modellen van netvliesaandoeningen en levert het een overvloedig celreservoir voor toepassingen zoals celtherapie, medicijnscreening en gentherapietesten.

Inleiding

Het oog dient als de primaire bron van informatie onder de menselijke zintuigen, waarbij het netvlies het belangrijkste visuele sensorische weefsel is in de ogen vanzoogdieren1. Retinopathie is een van de belangrijkste wereldwijde oorzaken van oogziekten, wat leidt totblindheid. Wereldwijd lijden ongeveer 2,85 miljoen mensen aan verschillende gradaties van slechtziendheid als gevolg van retinopathie3. Daarom is het onderzoeken van de pathogenese cruciaal voor een vroege diagnose en tijdige behandeling. De meeste onderzoeken naar retinopathie bij de mens hebben zich voornamelijk gericht op diermodellen 4,5,6. Het menselijk netvlies is echter een complex, meerlagig weefsel dat bestaat uit verschillende celtypen. Traditionele tweedimensionale (2D) celkweek- en diermodelsystemen slagen er doorgaans niet in om de normale spatiotemporele ontwikkeling en het geneesmiddelmetabolisme van het oorspronkelijke menselijke netvlies getrouw te recapituleren 7,8.

Onlangs zijn 3D-kweektechnieken geëvolueerd om weefselachtige organen te genereren uit pluripotente stamcellen (PSC's)9,10. Retinale organoïden (RO's) gegenereerd uit menselijke PSC's in een 3D-suspensiekweeksysteem bevatten niet alleen zeven retinale celtypen, maar vertonen ook een duidelijke gelaagde structuur die lijkt op het menselijke netvlies in vivo 11,12,13. Menselijke PSC-afgeleide RO's hebben aan populariteit gewonnen en zijn wijdverbreid beschikbaar en zijn momenteel de beste in vitro modellen voor het bestuderen van de ontwikkeling en ziekte van het menselijk netvlies14,15. In de afgelopen decennia hebben talloze onderzoekers aangetoond dat menselijke PSC's, waaronder embryonale stamcellen (ESC's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), kunnen differentiëren in RO's met behulp van verschillende inductieprotocollen. Deze vooruitgang heeft een enorm potentieel in retinopathie voor ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en op stamcellen gebaseerde therapieën 16,17,18.

Het genereren van neuraal netvlies (NR) uit menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) is echter een complex, omslachtig en tijdrovend proces. Bovendien kunnen batch-to-batch variaties in weefselorganoïden leiden tot een lagere reproduceerbaarheid van de resultaten19,20. Talrijke intrinsieke en extrinsieke factoren kunnen de opbrengst van retinale organoïden (RO's) beïnvloeden, zoals het aantal of de soort startcellen en het gebruik van transcriptiefactorenen verbindingen met kleine moleculen. Sinds de eerste menselijke RO werd gegenereerd door het Sasai-laboratorium11, zijn er in de loop der jaren meerdere wijzigingen voorgesteld om het gemak en de effectiviteit van het inductieproces te verbeteren 13,21,24,25. Helaas is er tot op heden geen gouden standaardprotocol opgesteld voor het genereren van RO's in alle laboratoria. Er is inderdaad een zekere mate van discrepantie in RO's als gevolg van verschillende inductiemethoden, evenals een grote variatie in de expressie van retinale markers en de robuustheid van hun structuur22,26. Deze problemen kunnen het verzamelen van monsters en de interpretatie van onderzoeksresultaten ernstig bemoeilijken. Daarom is een meer geconsolideerd en robuust differentiatieprotocol nodig om de efficiëntie te maximaliseren met minimale heterogeniteit van RO-generatie.

Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd inductieprotocol op basis van een combinatie van Kuwahara et al.12 en Döpper et al.27 met gedetailleerde instructies. De nieuwe methode vermindert de kans op vesiculatie en fusie van organoïden aanzienlijk, waardoor het slagingspercentage van het genereren van NR toeneemt. Deze ontwikkeling is veelbelovend voor ziektemodellering, medicijnscreening en celtherapietoepassingen voor netvliesaandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie van het Chinese PLA General Hospital. De WA09 (H9) ESC-lijn is verkregen van het WiCell Research Institute.

1. Kweekmedia en bereiding van reagens

  1. Humane ESC-kweekmedium en doorgangsoplossing
    1. Onderhoudsmedium (MM): Bereid 500 ml complete MM (basaal medium + 5x supplement; zie materiaaltabel) aseptisch voor. Ontdooi 5x bijvullen bij kamertemperatuur (RT) of 's nachts bij 2-8 °C. Voorverwarmen tot RT. Roer goed voor gebruik tot het supplement vrij is van troebelheid.
    2. 1% extracellulaire matrix (ECM): Gebruik een voorgekoelde pipetpunt en steriele buisjes om 200 μL ECM (zie Materiaaltabel) per buisje op ijs te doseren. Bewaar de tubes in een vriezer van -20 °C. Smelt ECM op ijs en verdun met voorgekoelde DMEM/F12 op 1:100.
    3. 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Om 500 ml 0,5 mM EDTA te bereiden, voegt u 500 μL 0,5 M EDTA en 0,9 g NaCl toe aan 500 ml 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) (zie Materiaaltabel). Meng grondig en bewaar bij 2-8 °C.
  2. Retinaal differentiatiemedium
    1. Groeifactorvrij chemisch gedefinieerd medium (gfCDM): Bereid de gfCDM voor door 45% Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX), 45% Ham's F12-GlutaMAX (F12-Glutamax), 10% knock-out serumvervanger (KSR), 1% cholesterollipidenconcentraat en 450 μM thioglycerol te combineren (zie materiaaltabel).
  3. Verbindingen met kleine moleculen
    1. Y-27632 2HCl: Voeg 50 mg Y-27632 poeder toe aan 3,122 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Doseer en bewaar Y-27632 (zie materiaaltabel) in een concentratie van 50 mM bij -80 °C gedurende 2 jaar, uit de buurt van licht. Verdun de bouillon 2.500 keer (20 μM) voor gebruik, overeenkomend met 0,4 μL Y-27632 per ml gfCDM.
    2. IWR1-endo: Voeg 2,4424 ml DMSO toe om 10 mg IWR1-endo op te lossen (zie materiaaltabel) om een voorraadoplossing van 10 mM te verkrijgen. Doseer aliquots en bewaar ze maximaal 2 jaar bij -80 °C. Voeg 0,3 μL 10 mM IWR1-endo per ml gfCDM toe voor de 3 μM-concentratie voor inductie.
    3. SB431542: Om 50 mM SB431542 te bereiden, voegt u 10 mg SB431542 (zie Materiaaltabel) toe aan 0,5203 ml DMSO en mengt u goed. Maximaal 2 jaar bewaren bij -80 °C in oplosmiddel. Voeg voor de bereiding van SB431542 met een werkconcentratie van 10 μM 2 μL van de 50 mM stockoplossing toe aan 10 ml gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: Los 5 mg LDN-193189 2HCl (zie materiaaltabel) op in 10,4297 ml DMSO om een voorraadoplossing van 1 mM te krijgen. Bewaren bij -20 °C of -80 °C (zoals aanbevolen door de fabrikant). Voeg 0,1 μL van de bouillon toe aan elke 10 ml gfCDM, wat resulteert in 100 nM LDN-193189 voor inductie.
    5. Recombinant humaan botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4): Reconstitueren bij 50-200 μg/ml in 4 mM HCl (zie materiaaltabel). Bewaren bij 2 °C tot 8 °C gedurende 1 maand of -20 °C gedurende 1 jaar na reconstitutie. Voer inductie van NR uit met behulp van 1.5 nM BMP4.
  4. NR-kweek op lange termijn medium
    1. Retinoïnezuur (RA): Meet 6 mg RA-poeder af (zie Materiaaltabel) en voeg toe aan 3,9941 ml DMSO. Bewaren in hoeveelheden van 5 mM bij −80 °C en binnen 3 maanden gebruiken. Om een werkconcentratie van 0,5 μM te bereiken, voegt u 10 μL van de mastermix toe aan 100 ml neuraal retinadifferentiatiemedium (NRDM). Voeg vlak voor gebruik toe.
      NOTITIE: Blijf uit de buurt van licht tijdens bereiding en opslag.
    2. Taurine: Voeg taurinepoeder (zie materiaaltabel) toe met een gewicht van 200 mg tot 7,9904 ml DMSO om een voorraadoplossing van 200 mM te verkrijgen. Afgeven en bewaren bij 2-8 °C. Een werkconcentratie van 0,1 mM taurine wordt bereikt door 50 μL van de stockoplossing per 100 ml NRDM toe te voegen.
    3. NRDM: Stel NRDM samen met DMEM/F12-GlutaMAX medium, 1% N2 supplement, 10% foetaal runderserum, 0,5 mM RA en 0,1 mM taurine (zie Materiaaltabel). Bewaren bij 2-8 °C gedurende maximaal 2 weken of 6 maanden bij -20 °C om de activiteit van de componenten te garanderen.
  5. Blokkeerbuffer: Verdun 1:9 met DPBS om een 10% werkoplossing te verkrijgen voor gebruik (zie Tabel met materialen). Bewaren bij -20 °C voor maximaal 5 jaar.
    NOTITIE: Voer alle andere procedures uit in een bioveiligheidskast van klasse II om de steriliteit te garanderen, behalve wegen. Als het toevoegen van gewogen reagentia tijdens het bereidingsproces nodig is, gebruik dan filters van 0,22 μm voor filtratie.

2. Kweken van H9-ESC's

  1. Ontdooien van H9-ESC's
    1. Voeg 1 ml 1% ECM toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes. Incubeer gedurende 1 uur in een incubator bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 .
      NOTITIE: Vermijd de toevoeging van ECM langs de putwanden, omdat dit aan het oppervlak kan blijven kleven.
    2. Neem een H9-ESC cryoviale voorraad uit de tank met vloeibare stikstof en schud deze snel gedurende 30 s in water van 37 °C.
      NOTITIE: Laat de injectieflacon niet volledig ontdooien.
    3. Verwijder de injectieflacon en steriliseer deze voorzichtig met 75% desinfecterende alcoholspray. Voeg de ontdooide H9-ESC uit de cryovial toe aan een buisje van 15 ml met 9 ml MM met 10 μM Y-27632.
    4. Centrifugeer het buisje bij 190 × g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder voorzichtig het grootste deel van het supernatans met een pipet van 1 ml en laat ongeveer 50 μl supernatans over om celverlies te voorkomen.
    5. Voeg 1 ml MM met 10 μM Y27632 toe aan het celsediment en resuspendeer het celsediment voorzichtig met een pipet van 1 ml door 5-10 keer op en neer te pipetteren.
    6. Verwijder de ECM-coating na 1 uur incubatie. Voeg 2 ml voorverwarmde MM met 10 μM Y-27632 toe aan elk putje.
    7. Doseer 0,5 ml celsuspensie per putje. Schud de plaat voorzichtig zijdelings om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen.
    8. Incubeer de plaat bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende ten minste 24 uur zonder deze aan te raken.
    9. Verander het medium dagelijks. Wanneer de kloondichtheid 70% en hoger bereikt, is passaging vereist.
  2. Passeren van H9-ESC's
    1. Bereid de ECM-gecoate plaat voor zoals hierboven beschreven (stap 2.1.1) en voeg 2 ml MM per putje toe.
    2. Verwijder het gebruikte medium van de platen met 6 putjes. Was elk putje twee keer met 1 ml DPBS.
    3. Was elk putje twee keer door langzaam 1 ml EDTA toe te voegen en 4-7 minuten te incuberen met 1 ml EDTA bij RT.
      NOTITIE: Onderzoek tijdens de incubatie de plaat met 6 putjes gedurende 3 minuten onder een microscoop. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap als de meeste cellen bijna loskomen van de schaal. Vermijd langdurige incubatie om de negatieve impact op de cellen te verminderen.
    4. Gooi EDTA weg en voeg 1 ml MM toe om de spijsvertering af te breken.
    5. Tik zachtjes op de putplaat totdat de meerderheid van de cellen is losgekomen.
    6. Breng de celsuspensie voorzichtig over in een centrifugebuisje van 15 ml met een pipet van 5 ml. Resuspendeer de H9-ESC-kolonies voorzichtig 3-5 keer op en neer om ze te mengen met een pasteurpitette. Breng 20-100 μL celsuspensie over in een nieuwe ECM-gecoate kweekschaal met 6 putjes en schud deze heen en weer.
    7. Wanneer de celdichtheid onder een microscoop als voldoende wordt waargenomen, incubeer de plaat dan gedurende ten minste 24 uur bij 37 °C onder 5% CO2 zonder deze aan te raken.
    8. Verander de media dagelijks. Bij een kloondichtheid van 70% en hoger is doorgang vereist.

3. Genereren van menselijke NR's

OPMERKING: Zodra de kolonies ongeveer 70% samenvloeiing hebben bereikt, kunnen ze worden gericht op differentiatie in retinale organoïden (RO's) met behulp van de procedurele stappen die in figuur 1 worden beschreven.

  1. Dag 0 - Vorming van het embryoïde lichaam (EB)
    1. Voeg na het wassen van de cellen met 2 ml DPBS 0,5 ml CDS (zie materiaaltabel) met 20 μM Y27632 toe aan het putje. Incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 -incubator.
      NOTITIE: Controleer onder een microscoop. Verkort de incubatietijd zoveel mogelijk om schadelijke effecten op de cellen te voorkomen.
    2. Breek de spijsvertering af door 3 ml MM met 20 μM Y27632 toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 190 × g en gooi het supernatant weg.
    3. Resuspendeer de celpellet in 1 ml gfCDM met 20 μM Y27632 en tel de cellen. Voeg het overeenkomstige volume voor 1,2 × 106 cellen (1,2 × 104 cellen per putje) toe aan 10 ml gfCDM, dat vooraf is opgenomen met 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 en 100 nM LDN-193189 (zie materiaaltabel).
    4. Voeg 100 μL celsuspensie toe aan elk putje van 96 V-bodem conische putjes. Plaats de plaat tot dag 6 in een bevochtigde 5% CO2 -incubator.
      NOTITIE: Verplaats de vaat gedurende ten minste 24 uur niet om de hechting van EB's te verbeteren.
  2. Dag 6 - Retina inductie
    1. Voeg op dag 6 10 ml gfCDM met 55 ng/ml BMP4 toe om een volledige verandering van kweekmedium op de EB's mogelijk te maken. Plaats het bord terug in de couveuse.
      NOTITIE: Pipetteer in de richting van de wanden van de conische put met 96 V-bodem om luchtbellen te voorkomen. Vermijd het gebruik van organoïden bij het verwisselen van het medium.
    2. Voer een half-medium wissel uit op dag 9, dag 12 en dag 15. Vervang de helft van het medium door verse gfCDM om de BMP4 geleidelijk te verdunnen.
  3. Dag 18 - Lange termijn NR cultuur
    1. Breng op dag 18 de gevormde EB's voorzichtig over in centrifugebuisjes van 15 ml met behulp van pasteurpipetten van 5 ml en spoel ze opnieuw voorzichtig met NRDM. Breng de EB's over naar platen met een lage adsorptie van 6 of 24 putjes (zie Materiaaltabel). Plaats het bord terug in de couveuse.
    2. Vervang het medium om de 3 dagen door verse NRDM.
      NOTITIE: Schakel het licht uit tijdens de mediumwissel omdat de RA lichtgevoelig is. Verwijder slecht gedifferentieerde organoïden en scheid aanhangende organoïden onder een microscoop.

4. Analyse van menselijke NR's

  1. Montage van de RO's
    1. Selecteer verschillende generaties H9-ESC's om drie batches RO's te induceren.
      OPMERKING: Drie platen van het aantal vormende NR's voor elk van de drie beoordeelde methoden (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 en de gewijzigde methode in de huidige studie) worden berekend om het slagingspercentage van de inductie te beoordelen. Inductie wordt als succesvol beschouwd als lichtmicroscopie de vorming van neuro-epitheliale structuren op dag 30 aantoont.
  2. Immunofluorescerende kleuring van RO's
    1. Breng 3-5 RO's over op buisjes van 1,5 ml. Pipetteer overtollig medium en was de RO's één keer met 1 ml DPBS bij RT. Laat de RO's zinken en verwijder voorzichtig de DPBS. Voeg 1 ml 4% paraformaldehyde (zie materiaaltabel) per tube van 1,5 ml toe en fixeer op 4 °C.
      OPMERKING: RO's op dag 6 en dag 18, fix 2 uur. Fix voor 12 uur op dag 30 en 14 uur op dag 60.
    2. Na fixatie uitdrogen met gradiëntalcohol. Laat de RO's elk 15 minuten staan in 50%, 60% en 70% alcohol, en vervolgens 10 minuten elk in 80%, 90%, 95%, 100% en 100% alcohol. Voeg vervolgens een 1:1 mix van 100% alcohol en xyleen toe gedurende 10 minuten, gevolgd door xyleen tweemaal gedurende 10 minuten elk.
    3. Plaats de RO's gedurende 40 minuten in metalen mallen gevuld met gesmolten paraplast (zie Tabel met materialen) en blus de mallen vervolgens op ijs om de RO's te fixeren. Plaats inbeddingsdozen in de mallen en vries ze een nacht in bij -20 °C. Maak vervolgens de inbeddingsdozen voorzichtig los. Bewaar ze ten slotte bij RT.
    4. Maak doorlopende secties (5 μm dikte) met een paraffinesnijder. Plakjes op hechtingsmicroscoopglaasjes bevestigen, drogen en bewaren bij RT.
    5. Voer dewaxing en rehydratie uit vóór antigeenherstel12,27.
    6. Voeg 10 ml 20x pH 6.0 citraatantigeenoplossing (zie materiaaltabel) toe aan 190 ml ddH2O (dubbel gedestilleerd H2O). Verwarm in een magnetron op hoge stand gedurende 4 minuten tot het kookt. Verwarm na het toevoegen van paraffinesecties de secties gedurende 20 minuten op lage modus om het antigeenherstel te voltooien.
    7. Laat paraffinesecties op natuurlijke wijze afkoelen in een geventileerde ruimte en plaats ze vervolgens in een vochtige kamer.
    8. Gebruik een pappen (zie Materiaaltabel) om de secties te schetsen. Incubeer met 0,2% Triton X-100 bij RT gedurende 30 minuten om de membranen te breken, gevolgd door het driemaal wassen van de objectglaasjes met TPBS, elk gedurende 5 minuten.
    9. Blok met 10% ezelinnenserum verdund in DPBS bij RT gedurende 1 uur in een vochtige kamer met 10 μL per kleurgebied.
    10. Voeg primaire antilichamen verdund in 10% ezelserum toe. Incubeer een nacht bij 4 °C in een vochtigheidskamer. Was monsters driemaal met TPBS gedurende elk 10 minuten om het ongebonden antilichaam te verwijderen.
      OPMERKING: Primaire antilichamen zijn als volgt: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubuline III (1: 250) en anti-NESTIN (1: 200) (zie Materiaaltabel).
    11. Incubeer met secundaire antilichamen verdund in DPBS gedurende 1 uur bij RT in een bevochtigde kamer. Herhaal de wasstap met TPBS drie keer gedurende 10 minuten.
      NOTITIE: In het donker bewaren om te voorkomen dat het fluorescerende secundaire antilichaam wordt gedoofd. Secundaire antilichamen zijn Alexa Fluor 488 geconjugeerd met ezel anti-muis IgG en Alexa Fluor 568 geconjugeerd met ezel anti-konijn IgG in een verdunning van 1:400 (zie Tabel met materialen).
    12. Incubeer met DPBS bevattende DAPI (1: 500; zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij RT in het donker. Was drie keer met TPBS gedurende elk 10 minuten.
    13. Laat een geschikte hoeveelheid antifluorescerende sealer (zie Materiaaltabel) op het glaasje vallen en dek af met afdekglaasjes.
    14. Visualiseer met behulp van een stroomachtige weefselcel kwantitatieve analysator (zie Tabel met materialen) of iets dergelijks.
    15. Bewaar objectglaasjes bij -20 °C in het donker na microscopische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een grafisch overzicht van het gewijzigde protocol is weergegeven in figuur 1. H9-ESC's werden gebruikt om RO's te genereren wanneer de cellen werden gekweekt tot een dichtheid van 70%-80%. Eencellige suspensies van H9-ESC's in 96 conische putten met V-bodem geaggregeerd op dag 1 en vormden goed omschreven, ronde EB's op dag 6. Naarmate de kweektijd toenam, nam het volume van de EB's geleidelijk toe. Op dag 30 werden neuro-epitheliale structuren duidelijk gevormd en verdikt tijdens langdurig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Menselijke RO's kunnen de ontwikkeling van het foetale netvlies ruimtelijk en temporeel recapituleren, en vroege RO's vertonen een hoge mate van gelijkenis met het foetale netvlies in gelijkwaardige ontwikkelingsstadia15. In termen van weefselmorfologie en moleculaire expressie weerspiegelt menselijke RO nauw de werkelijke groeistatus van het netvliesweefsel, wat enorme en ongekende mogelijkheden biedt op het gebied van ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en regeneratieve geneeskunde. Momen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.01 M TPBSServicebioG0002Washing slices
4% ParaformaldehydeServicebioG1101-500MLFix retinal organoids
5 mL Pasteur pipetteNEST Biotechnology318516Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakelitMS-9096VZ
Adhesion Microscope SlidesCITOTEST188105Fix slices
AggreWell mediumSTEMCELL Technologies5893Medium
Anhydrous ethanolSINOPHARM10009218Dehydrate 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Primary antibody
Antifade SolutionZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Primary antibody
Anti-NESTINSigmaN5413Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)BeyotimeAT809Primary antibody
Anti-PAX6Abcamab195045Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)STEMCELL Technologies7922Cell dissociation
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid ConcentrateGibco12531018250×
Citrate Antigen Retrieval SolutionServicebioG1202-250ML20×, pH 6.0
CS10STEMCELL Technologies1001061Cell Freezing Medium
DAPIRoche10236276001Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)BiosharpBL518A0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)Corning354277Coating plates
F12-GlutamaxGibco31765035Medium
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzerTissueGnosticsTissueFAXS PlusScan sections
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt-inhibitor
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well PlatesCorning3473
Low-adhesion 6-well PlatesCorning3471
Maintenance medium (MM)STEMCELL Technologies85850Medium
N2 supplementGibco17502048
Normal Donkey SerumSolarbioSL050Blocking buffer
ParaplastLeica39601006Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)GibcoC10010500BTWithout Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)R&D314-BPKey protein factor
Retinoic acidSigmaR2625Powder, keep out of light
SB431542SelleckchemS1067ALK5-inhibitor
SU5402SelleckchemS7667Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
TaurineSigmaT0625-10G
ThioglycerolSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Permeabilization
WA09 embryonic stem cell lineWiCell Research InstituteCell line
XyleneSINOPHARM10023418Dewaxing
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-inhibitor

Referenties

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022(2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286(2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047(2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39(2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478(2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinale organo denretinale differentiatieziekte modelleringdrugscreeningceltherapieretinale inductieembryo de lichamenBMP4 inductie

Gerelateerde artikelen