Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

4.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66460

⸱

9 februari 2024

 ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

In dit artikel

Samenvatting

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de productie en zuivering van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) door middel van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie, een serotype-agnostische methode om AAV te zuiveren die voor het eerst werd beschreven in 1999. rAAV-vectoren worden veel gebruikt in gentherapietoepassingen om transgenen af te leveren aan verschillende menselijke celtypen. In dit werk wordt het recombinante virus geproduceerd door transfectie van Expi293-cellen in suspensiecultuur met plasmiden die coderen voor de transgen-, vectorcapside- en adenovirale helpergenen. Iodixanol dichtheidsgradiëntcentrifugatie zuivert volledige AAV-deeltjes op basis van deeltjesdichtheid. Bovendien zijn er drie stappen opgenomen in deze nu alomtegenwoordige methodologie om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op neerslag als gevolg van besmettende eiwitten te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren, respectievelijk: precipitatie van virale deeltjes uit celmedia met behulp van een oplossing van polyethyleenglycol (PEG) en natriumchloride, de introductie van een tweede ronde van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie, en bufferuitwisseling via een centrifugaalfilter. Met behulp van deze methode is het mogelijk om consistent titers te bereiken in het bereik van 1012 virale deeltjes/ml met een uitzonderlijke zuiverheid voor in vivo gebruik.

Inleiding

Recombinante adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren zijn veelgebruikte hulpmiddelen voor de behandeling van genetische ziekten, waaronder spinale musculaire atrofie, retinale dystrofie en hemofilie A 1,2,3. rAAV-vectoren zijn zo gemanipuleerd dat ze geen virale genen hebben die aanwezig zijn in wildtype AAV4, een klein, niet-envelop icosahedraal virus met een lineair enkelstrengs DNA-genoom van 4,7 kb. AAV werd voor het eerst ontdekt in de jaren 1960 als een verontreiniging van adenoviruspreparaten. Ondanks de kleine capside-grootte, die de grootte van het transgen dat kan worden verpakt beperkt tot maximaal 4,9 kb exclusief ITR's6, is AAV nuttig voor transgenafgifte omdat het niet-pathogeen is bij mensen, expressie van transgen mogelijk maakt in veel delende en niet-delende celtypen en beperkte immunogene effecten heeft7.

Als leden van het geslacht dependoparvovirus is de productie van rAAV's afhankelijk van de expressie van helpergenen die aanwezig zijn in adenovirus of herpes simplex-virus8. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om rAAV te produceren, maar de productie in HEK293-cellen die zijn getransformeerd met de adenovirale E1A/E1B-helpergenen is de meest gevestigde methode die tegenwoordig wordt gebruikt. De algemene benadering van rAAV-productie begint met de transfectie van HEK293-cellen met drie plasmiden die het transgen bevatten in respectievelijk omgekeerde terminale herhalingen (ITR's), AAV-rep- en cap-genen en aanvullende adenovirale helpergenen. Tweeënzeventig uur na transfectie worden cellen geoogst en verwerkt om rAAV te zuiveren die het transgen bevat.

Bij de ontwikkeling van nieuwe rAAV-vectoren voor therapeutische doeleinden is een belangrijk doel het produceren van vectoren met een verhoogde transductie-efficiëntie. Een toename van de transductie-efficiëntie van doelcellen zou een verlaging van de noodzakelijke klinische dosis rAAV betekenen, waardoor de kans op nadelige immunogene effecten, variërend van antilichaam-gemedieerde neutralisatie tot acute toxiciteiten, wordt verkleind10,11. Om de transductie-efficiëntie van rAAV-vectoren te verbeteren, kunnen wijzigingen worden aangebracht in het verpakte genoom of in de capside. Haalbare methoden om de werkzaamheid van transductie af te stemmen via verpakt genoomontwerp zijn onder meer de integratie van sterke en weefselspecifieke promotors, doordachte selectie van mRNA-verwerkingselementen en optimalisatie van coderingssequenties om de translatie-efficiëntie te verbeteren12. Wijzigingen aan de capside worden aangebracht met als doel het tropisme voor menselijke doelceltypen te vergroten. Inspanningen om nieuwe rAAV-capsiden voor transgenafgifte te ontwikkelen, worden over het algemeen gekenmerkt door een focus op ofwel rationeel ontwerp van AAV-capsiden met specifieke mutaties gericht op specifieke celreceptoren, ofwel gerichte evolutie om capsiden met tropisme te identificeren voor specifieke celtypen uit combinatorische capsidebibliotheken met hoge complexiteit zonder zich te richten op één specifieke receptor (hoewel sommige groepen deze benaderingen combineren)13, 14,15. In de gerichte evolutiebenadering worden combinatorische capsidebibliotheken geconstrueerd met behulp van een bepaalde serotype-ruggengraat met gemuteerde variabele regio's aan de buitenkant van de capside16. Combinatorische capsidebibliotheken zijn vaak opgebouwd uit AAV-serotypen die niet van mensen afkomstig zijn, waardoor het risico op reeds bestaande immuniteit tijdens klinisch gebruik afneemt10. Daarom zijn zuiveringsmethoden die op elk serotype kunnen worden toegepast, ideaal om de noodzaak van serotype-specifieke optimalisatie voor de minder vaak gebruikte serotypen die als ruggengraat voor deze bibliotheken dienen, te elimineren.

Centrifugatie met de dichtheidsgradiënt van Iodixanol wordt gebruikt om hoge titers van rAAV met een hoge besmettelijkheid te zuiveren17. In dit protocol wordt rAAV geproduceerd in suspensiecelkweek om de hoeveelheid arbeid die nodig is om grote titers van AAV te produceren te verminderen. Er is ook een centrifugatiestap opgenomen om cellysaat te zuiveren om de aanwezigheid van verontreinigende eiwitten te verminderen en het risico op virusneerslag te verminderen. Dit protocol is een kosteneffectieve methode om preparaten met een hoge zuiverheid rAAV te produceren die geschikt zijn voor preklinisch gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De samenstelling van de oplossingen en buffers die in dit protocol worden gebruikt, is weergegeven in tabel 1.

OplossingCompositie
AAV-lysisbuffer1,2 ml 5 M NaCl-oplossing
2 ml van 1 M Tris-HCl pH 8,5-oplossing
80 uL 1 M MgCl2-oplossing
mQ water tot 40 ml
AAV-neerslagoplossing40 g PEG 8000
50 ml 5 M NaCl-oplossing
mQ water tot 100 ml
15% jodixanol fractie7,5 ml OptiPrep
3 ml 10x DPBS
6 ml 5 M NaCl-oplossing
30 uL 1 M MgCl2-oplossing
mQ tot 30 ml
25% jodixanol fractie12. 5 ml OptiPrep
3 ml 10x DPBS
30 uL 1 M MgCl2-oplossing
60 uL fenolrode oplossing
mQ tot 30 ml
40% jodixanolfractie33,3 ml OptiPrep
5 ml 10x DPBS
50 uL 1 M MgCl2-oplossing
mQ tot 50 ml
60% jodixanolfractie50 ml OptiPrep
100 uL fenolrode oplossing
AAV-bufferoplossing8 ml van 5 M NaCl
20 uL 10% Pluronic F-68
PBS tot 200 ml

Tabel 1: Samenstelling van de oplossing voor de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Drievoudige transfectie van Expi293-cellen

  1. Zaad Expi293-cellen (zie materiaaltabel) bij een aanvangsdichtheid van 5 x 105 levensvatbare cellen (vc)/ml.
  2. Laat de cellen incuberen bij 37 °C met 8% CO2 en een schudsnelheid van 125 omw/min tot ze een dichtheid van 3-5 x 106 vc/ml hebben bereikt. Bewaak de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van trypanblauwe uitsluiting met een geautomatiseerde celteller (zie Tabel met materialen).
  3. Wanneer cellen de gewenste celdichtheid bereiken, splitst u ze 1 tot 10 door nieuwe media toe te voegen, zodat hun totale volume tien keer zo groot is als hun oorspronkelijke volume. Breng indien nodig de cellen over in een grotere kolf. Keer terug naar de incubatie.
  4. Ga door met het uitbreiden van de cellen zoals beschreven in de stappen 1.2-1.3 totdat ze een dichtheid hebben bereikt van ten minste 2 x 106 vc/ml in 250 ml media in een kolf van 1 l.
  5. Verdun de cellen de dag voor de transfectie tot 2 x 106 vc/ml in 250 ml media en gooi overtollige cellen indien nodig weg. Incubeer de cellen een nacht.
  6. Centrifugeer op de dag van transfectie de helft van de cellen bij 58 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C. Resuspendeer de celpellet in hetzelfde volume (125 ml) vers medium. De levensvatbaarheid van de cel moet bijna 98% zijn.
  7. Bereid twee conische buizen van 50 ml voor. Label de ene "PEI" en de andere "DNA".
  8. Verdun in de conische buis met het label PEI 1,2 ml PEI (polyethyleenimine, zie materiaaltabel) tot een totaal volume van 12,5 ml in OptiMEM-media.
  9. Bereid in de conische buis met het label DNA een equimolaire oplossing van plasmide-DNA tot een totaal van 500 μg DNA in een totaal volume van 12,5 ml in OptiMEM-media.
  10. Voeg de DNA-oplossing toe aan de PEI-oplossing, keer meerdere keren om om grondig te combineren en laat 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de DNA-PEI-oplossing de volledige 10 minuten kan incuberen, zodat PEI geladen complexen met het DNA kan vormen.
  11. Nadat de DNA-PEI-oplossing gedurende 10 minuten is geïncubeerd, gebruikt u een serologische pipet om de DNA-PEImax-oplossing langzaam op de Expi293-cellen aan te brengen. Plaats de getransfecteerde cellen terug in de incubator en laat ze 72 uur incuberen (Figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: Expi293-cellen die GFP tot expressie brengen twee dagen na transfectie. Na transfectie met een plasmide dat een gen voor GFP bevat, brengen de Expi293-cellen tijdelijk eGFP tot expressie. De celmorfologie is rond. Het beeld is gemaakt met een belichtingstijd van 15 ms. Microscoopbeelden worden verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met epifluorescentieverlichting en een 10x/0,30 objectief. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. rAAV-vectorzuivering

  1. Breng de cellen na 72 uur in suspensie over in twee conische buizen van 250 ml en draai ze gedurende 10 minuten bij 4 °C rond bij 415 x g .
  2. Giet het bovendrijvende medium in een verse conische buis van 500 ml en bewaar bij 0 °C op ijs voor latere verwerking.
  3. Resuspendeer elke celpellet in 10 ml AAV-lysisbuffer (tabel 1). Bundel de twee lysaten samen in een van de buizen. Spoel de andere buis af met nog eens 5 ml AAV-lysisbuffer en voeg deze vervolgens toe aan de gepoolde lysaten. Vries in bij -70 °C.
    OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gepauzeerd. Bewaar het supernatans media bij -70 °C in plaats van op ijs.
  4. Voeg 1:4 volume AAV-neerslagoplossing toe aan de supernatans media uit stap 2.2. Keer meerdere keren om om grondig te mengen en incubeer bij 0 °C op ijs gedurende ten minste 2 uur of een nacht.
  5. Centrifugeer de geïncubeerde oplossing bij 3000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
  6. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met viraal neerslag in 5 ml AAV-lysisbuffer.
  7. Ontdooi het cellysaat bij 37 °C in een waterbad.
  8. Pool het virale neerslag met het cellysaat. Dit is het ruwe lysaat. Spoel de centrifugatiebuis die het virale neerslag bevatte met een extra 5 ml AAV-lysisbuffer en plas op met het ruwe lysaat.
  9. Vries het ruwe lysaat in tot -70 °C en ontdooi het bij 37 °C. Herhaal deze cyclus nog een keer.
    OPMERKING: Het ruwe lysaat mag niet langer op 37 °C worden bewaard dan nodig is om het te ontdooien.
  10. Eenmaal ontdooid voor de derde keer, onmiddellijk 4 μL benzonase toevoegen aan het ruwe lysaat, omkeren om te mengen en 30 minuten incuberen bij 37 °C.
  11. Centrifugeer het ruwe lysaat gedurende 10 minuten bij 650 x g bij 18 °C.
  12. Breng het supernatans over in een schone conische buis van 50 ml. Dit is het ruwe virus. Gooi de pellet weg.
  13. Centrifugeer het ruwe virus nog eens 30 minuten bij 3000 x g bij 18 °C om besmettende eiwitten te verwijderen.
  14. Breng het supernatans over in een schone conische buis van 50 ml. Dit is het opgehelderde virus.
    OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gepauzeerd. Bevries het geklaarde virus tot -70 °C.
  15. Stel de meerkanaals slangenpomp in met vier slangen (zie Materiaaltabel). Bevestig haarvaten aan beide uiteinden van elke buis.
  16. Plaats de capillairen aan de ingangszijde van de pomp in een bekerglas gevuld met gedeïoniseerd water. Plaats de capillairen aan de uitvoerzijde van de pomp in een lege beker. Laat de peristaltische pomp draaien op 25.0 tpm om de slang door te spoelen met gedeïoniseerd (DI) water.
  17. Wanneer de slangen grondig zijn doorgespoeld, maakt u de peristaltische slang leeg door de pomp te laten draaien totdat de slang alleen met lucht is gevuld. Leg alle haarvaten op een schoon, pluisvrij doekje.
  18. Plaats vier ultracentrifugebuisjes in een rek aan de uitgangszijde van de pomp.
  19. Gebruik een serologische pipet van 10 ml om voorzichtig 10 ml geklaard virus in elke ultracentrifugebuis te doseren. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen komen.
    OPMERKING: Het volume van het geklaarde virus in elk buisje kan indien nodig worden opgerekt tot maximaal 12 ml per buisje. Verlaag de hoeveelheid 60% jodixanol op de juiste manier in stap 2.25 hieronder.
  20. Het geklaarde virus wordt met behulp van de peristaltische pomp bedekt met jodixanolfracties (tabel 1) van de laagste dichtheid naar de hoogste dichtheid. De 15%-fractie wordt eerst toegevoegd, gevolgd door de 25%-fractie, de 40%-fractie en ten slotte de 60%-fractie. Breng 22 ml (5,5 ml per ultracentrifugebuisje) van de 15% jodixanolfractie over in een schoon conisch buisje van 50 ml. Plaats de capillairen aan de ingangszijde van de pomp in de slang en zorg ervoor dat alle capillairen de bodem van de slang raken.
  21. Start de pomp en laat de slang zich vullen met de jodixanolfractie. Wanneer de jodixanolfractie de uiteinden van de haarvaten aan de uitgangszijde van de pomp bereikt, stopt u de pomp.
  22. Steek een uitgangscapillair in elke ultracentrifugebuisjes met geklaard virus en zorg ervoor dat de haarvaten de bodem van elke ultracentrifugebuis raken.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat er geen lucht meer in de haarvaten zit. Iodixanol kan met iets verschillende snelheden door de peristaltische slang stromen, dus zorg ervoor dat elk afzonderlijk uitgangscapillair volledig is gevuld met jodixanol voordat u het in het geklaarde virus inbrengt. Het kan nodig zijn om de pomp meerdere keren te stoppen en te starten.
  23. Start de pomp en laat de ultracentrifugebuisjes zich vullen. Wanneer de laatste van de 15% fractie op het punt staat in de ingaande capillairen te worden opgenomen, stopt u de pomp. Het is van cruciaal belang dat er geen luchtbellen in de peristaltische slang komen.
    NOTITIE: Als er luchtbellen in de ingaande capillairen komen, kan de pomp kort in omgekeerde richting worden gedraaid om ze weer naar buiten te duwen.
  24. Breng 22 ml (5,5 ml per ultracentrifugebuisje) van de 25% jodixanolfractie over in de conische buis van 50 ml. Zorg ervoor dat alle haarvaten de onderkant van de slang raken en start de pomp. Wanneer de laatste van de 25% fractie op het punt staat in de ingaande capillairen te worden opgenomen, stopt u de pomp.
  25. Herhaal stap 2.24 met 20 ml (5 ml per ultracentrifugebuisje) van de 40% jodixanolfractie en vervolgens met 24 ml (6 ml per ultracentrifugebuisje) van de 60%-fractie.
  26. Als er nog ongevuld volume in de ultracentrifugebuis zit, blijf dan meer van de 60%-fractie toevoegen totdat de ultracentrifugebuisjes volledig gevuld zijn met vloeistof.
  27. Vul elke buis totdat het lysaat een koepel over de bovenkant maakt, maar niet uit de buis overloopt. Stop de pomp en verwijder voorzichtig elk capillair aan de uitgang, waarbij u ervoor zorgt dat u de jodixanolgradiënt niet verstoort.
  28. Sluit elke ultracentrifugebuis af met een afstandhouder en laad deze in een rotor van het type 70 Ti (zie Materiaaltabel).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de rotor goed is uitgebalanceerd. Probeer de ultracentrifuge niet te bedienen zonder de juiste training.
  29. Laad de rotor van het type 70 Ti in de ultracentrifuge en centrifugeer gedurende 1 uur bij 18 °C bij 489.000 x g .
  30. Na het centrifugeren ontlaadt u de rotor uit de ultracentrifuge. Gebruik een punttang om elke ultracentrifugebuis voorzichtig van de rotor te verwijderen en zorg ervoor dat u de jodixanolgradiënt niet verstoort.
  31. Gebruik een steunringstandaard met klem om één ultracentrifugebuis vast te zetten.
  32. Bevestig een naald van 20 GA aan een spuit van 5 ml en zet apart. Gebruik een pluisvrij doekje om de dop van de ultracentrifugebuis te verwijderen.
  33. Penetreer de wand van de ultracentrifugebuis met de naald ongeveer 3 mm onder de 40%-60% jodixanol-interface (Figuur 2).
  34. Zuig de interface en een deel van de 40%-fractie langzaam op. Vermijd het opzuigen van de bovenkant van de 40%-fractie, voor een totale afname van ongeveer 4 ml.
  35. Houd een vinger boven de open bovenkant van de ultracentrifugebuis, trek de spuit eruit en breng de aangezogen AAV-fractie over in een conische buis van 50 ml. Gooi de spuit weg in een naaldencontainer. Gooi de ultracentrifugebuis weg.
  36. Herhaal stap 2.31-2.35 voor elke ultracentrifugebuis.
  37. Verdun de aangezogen AAV-fractie ongeveer tweevoudig in AAV-lysisbuffer tot een volume van 40 ml.
  38. Spoel de peristaltische slang door zoals beschreven in de stappen 2.16-2.17.
    OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gepauzeerd. Bewaar de verdunde AAV-fractie een nacht bij 0 °C.
  39. Laad elk 20 ml van de verdunde AAV-fractie in twee nieuwe ultracentrifugebuisjes.
  40. Voor de tweede ronde van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt de verdunde AAV-fractie ondergelegd zoals hierboven beschreven met slechts 10 ml (5 ml per ultracentrifugebuis) van de 40%-fractie en 14 ml (7 ml per ultracentrifugebuis) van de 60%-fractie. Herhaal stap 2.29-2.36 voor ultracentrifugatie en aspiratie.
    NOTITIE: Voordat u de peristaltische pomp en slangen opbergt, spoelt u de slang uit met DI-water zoals beschreven in stappen 2.16-2.17.

figure-protocol-2
Figuur 2: Iodixanol-gradiënt met 40%-60% jodixanol-interface gelabeld. (A) Eerste gradiënt van jodixanol. Fenolrood wordt gebruikt in de fracties van 40% jodixanol en 60% jodixanol. Het ziet eruit als een andere kleur vanwege het verschil in pH tussen de twee fracties. De pijl geeft aan waar de spuit moet worden ingebracht om de rAAV-fractie te oogsten, net onder de 40%-60% jodixanol-interface. (B) Tweede gradiënt van jodixanol. In deze stap worden alleen de 40% en 60% jodixanolfracties gebruikt. De pijl geeft aan waar de spuit moet worden ingebracht om de rAAV-fractie te oogsten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bufferuitwisseling en virusconcentratie

  1. Na het verkrijgen van de AAV-fractie uit de tweede ronde van de centrifugatie met jodixanoldichtheidsgradiënt, verdunt u deze tweevoudig met AAV-bufferoplossing.
  2. Breng het centrifugaalfilter in evenwicht door 20 ml AAV-bufferoplossing toe te voegen aan de bovenkant van het filter. Centrifugeer het apparaat gedurende 5 minuten bij 3000 x g bij 18 °C en gooi de doorstroming weg.
  3. Voeg de verdunde AAV-fractie toe aan het centrifugaalfilter. Centrifugeer het apparaat gedurende 5 minuten bij 3000 x g bij 18 °C en gooi de doorstroming weg.
  4. Voeg 20 ml AAV-bufferoplossing toe aan de bovenkant van het filter. Centrifugeer het apparaat gedurende 5 minuten bij 3000 x g bij 18 °C en gooi de doorstroming weg.
    NOTITIE: Als het centrifugaalfiltermembraan verstopt raakt, waardoor de oplossing er inefficiënt doorheen stroomt, gebruik dan voorzichtig een P200-micropipet om de oplossing in de bovenkant van het filter op en neer te zuigen. Zorg ervoor dat u het filter niet aanraakt met de punt van de micropipet.
  5. Herhaal stap 3.4 nog twee keer.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de AAV niet te geconcentreerd is door ten minste 1 ml volume in de bovenkant van het filter te houden. Het kan nodig zijn om de centrifugatietijden aan te passen om overconcentratie te voorkomen. Als AAV overgeconcentreerd is, kan er neerslag optreden.
  6. Voor een laatste titer in het bereik van 1012 vg/ml, verlaagt u het virus tot een eindvolume van ongeveer 1 ml.
    OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte ruggengraat van het serotype en de verpakkingsefficiëntie van het virus, moet u het virus mogelijk in een kleiner volume concentreren.
  7. Gebruik een p1000-micropipet om de geconcentreerde AAV van de bovenkant van het centrifugaalfilter over te brengen naar een microcentrifugebuis. Gebruik een p200-micropipet om het centrifugaalfilter te wassen met 50 μL AAV-buffer om eventueel achtergebleven virus op te vangen en samen te voegen met de rest van de geconcentreerde AAV.
  8. Houd een aliquot van 2 μl van de geconcentreerde AAV opzij voor titeren. Zie aanvullende tabel 1 om ITR-primers te bekijken die kunnen worden gebruikt voor qPCR.
  9. Haal de geconcentreerde AAV door een spuitfilter van 0,2 μm om het te steriliseren.
    OPMERKING: Wanneer u een klein volume steriliseert, zorg er dan voor dat u een spuitfilter met een kleine diameter kiest om virusverlies tot een minimum te beperken. Het gebruik van een eiwitarm bindend filter met een kleine diameter zal resulteren in minimaal viraal verlies (gegevens niet getoond).
  10. De gesteriliseerde AAV kan onmiddellijk worden gebruikt om cellen te transduceren of worden bewaard bij 4 °C voor gebruik binnen vier weken. Het moet worden bewaard bij -70 °C voor opslag op langere termijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze methode kan worden gebruikt om titers van ten minste 1012 virale deeltjes per ml te verkrijgen. Een titer kan worden verkregen (figuur 3) door qPCR met behulp van de ITR-primers in aanvullende tabel 1, door ddPCR of door een andere titermethode. Suboptimale titers kunnen het gevolg zijn van het gebruik van een cap-gen dat codeert voor een capside met een slechte verpakkingsefficiëntie.

Een andere mogelijke bron van subopti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het zuiveringsprotocol met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt is de universele methode omdat het van toepassing is op alle AAV-mutante varianten, ongeacht hun receptorspecificiteit. Vroege methoden van AAV-zuivering waren gebaseerd op deeltjesdichtheid en omvatten isopycnische centrifugatie in CsCl en continue sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie19. Later werden serotype-specifieke benaderingen ontwikkeld, die gebruik maakten van monoklonale antilichamen gebonden aan Sepharose-kolommen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen onthullingen te melden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5810 R benchtop centrifugeEppendorf22625501
8-channel peristaltic pump Watson-Marlow020.3708.00A
Automated cell counter NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifugeBeckman Coulter369001
BenzonaseThermo Scientific88701
Biological safety cabinetLabconco322491101
CO2 incubator with shaker Set at 8% CO2 en 37 °C
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965250 mL
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965015 mL
Disposable micro-pipetsFisherbrand21-164-2GCapillaire
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscopeNikon
Expi293 Expression MediumGibcoA1435101
Expi293F cellsGibcoA14527
Filter tipsUSA Scientific1126-78101000 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-8810200 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-181020 µL
Filter tipsUSA Scientific1121-381010 µL
Hypodermic needlesTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lidVWR10146-184
JS-5.3 rotorBeckman Coulter368690
Magnesium chloride solution (1 M)Millipore SigmaM1028-100ML
Metal stand and clamp Fisherbrand05-769-6Q
Microcentrifuge tubesEppendorf226000281.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced-Serum MediumGibco31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)SerumwerkAXS-111454260% iodixanol solution
P1000 PipetGilsonF144059M
P2 PipetGilsonF144054M
P20 PipetGilsonF144056M
P200 PipetGilsonF144058M
Phenol red solutionSigma-AldrichP0290
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP4474
Pipet-Aid XP pipette controllerDrummond Scientific4-000-101
Plasmid pCapsidDe novo of Addgene, etc. N/AWe used pACGrh74. 
Plasmid pHelperAddgene112867
Plasmid pTransgeneDe novo of Addgene, etc. N/AWe used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)Mp Biomedicals92750049
Polyethylene glycol 8000Research Products InternationalP48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)PolysciencesNC1038561Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning431123500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning430776250 mL
Polypropylene Optiseal tubesBeckman Coulter361625
Serological pipettesAlkali ScientificSP250-B50 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP225-B25 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP210-B10 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP205-B5 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV10001 L
Shaker flasksFisherbrandPBV50-0500 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV250250 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV12-5125 mL
Sodium chloride solution (5 M)Fisher ScientificNC1752640
Sterile syringesFisherbrand14-955-4585 mL
Syringe filterMilliporeSLGV013SL0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)Kd MedicalRGE3363
Trypan blue solutionGibco15250061
Tube rack assemblyBeckman Coulter361646
Tube spacers (x4)Beckman Coulter361669
Tubing for peristaltic pumpFisher Scientific14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotorBeckman Coulter337922
Ultra low temperature freezerSet at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentratorSartoriusVS2041
Water bath Set at 37 °C

Referenties

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
  3. George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
  4. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  7. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
  8. Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
  9. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
  10. Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
  11. Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
  12. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  13. Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
  14. Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
  15. Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
  16. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
  17. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
  18. Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168(2023).
  19. Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
  20. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  21. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  22. Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  23. Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
  24. Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
  25. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  26. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  27. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
  28. Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
  29. Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7(2023).
  30. Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
  31. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  32. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  33. Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
  34. Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
  35. Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
  36. Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
  37. Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
  38. Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
  39. De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
  40. Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Iodixanol-gradiëntrecombinant AAVproductie van virale vectorengentherapiezuivering van virale deeltjesPEG-precipitatie
Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.