Postoperatief Ileus muizenmodel

Samenvatting

We beschrijven een muizenmodel van postoperatieve ileus gegenereerd via darmmanipulatie. De gastro-intestinale transitfunctie, pathologische veranderingen en activering van immuuncellen werden 24 uur na de operatie beoordeeld.

Samenvatting

De meeste patiënten ervaren postoperatieve ileus (POI) na de operatie, wat gepaard gaat met verhoogde morbiditeit, mortaliteit en ziekenhuisopnametijd. POI is een gevolg van mechanische schade tijdens de operatie, wat resulteert in verstoring van de beweeglijkheid in het maagdarmkanaal. De mechanismen van POI zijn gerelateerd aan afwijkende neuronale gevoeligheid, verminderde epitheliale barrièrefunctie en verhoogde lokale ontsteking. De details blijven echter raadselachtig. Daarom zijn experimentele muismodellen cruciaal voor het ophelderen van de pathofysiologie en het mechanisme van POI-letsel en voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Hier introduceren we een muizenmodel van POI gegenereerd via darmmanipulatie (IM) dat vergelijkbaar is met klinische chirurgie; Dit wordt bereikt door mechanische schade aan de dunne darm door de buik 1-3 keer te masseren met een wattenstaafje. IM vertraagde gastro-intestinale transit 24 uur na de operatie, zoals beoordeeld door FITC-dextrane maagsonde en fluorescentiedetectie van het segmentale spijsverteringskanaal. Bovendien werden weefselzwelling van de submucosa en infiltratie van immuuncellen onderzocht door middel van hematoxyline- en eosinekleuring en flowcytometrie. De juiste druk van de IM en een hyperemisch effect op de darm zijn van cruciaal belang voor de procedure. Dit muizenmodel van POI kan worden gebruikt om de mechanismen van darmbeschadiging en herstel na een buikoperatie te bestuderen.

Inleiding

Postoperatieve ileus (POI) is een syndroom dat een grote uitdaging vormt op het gebied van de menselijke gezondheid, met name bij de behandeling van patiënten die een buikoperatie ondergaan. Gekenmerkt door vertraagd herstel van gastro-intestinale motiliteit, draagt POI bij aan langdurig ziekenhuisverblijf en hogere kosten voor gezondheidszorg, maar er bestaat geen vastgestelde definitie, etiologie of behandeling¹. Recent onderzoek heeft licht geworpen op de cruciale rol van immuuncellen in de progressie van POI ^2,3,4, maar verder onderzoek is nodig om de onderliggende mechanismen die erbij betrokken zijn op te helderen.

In dit protocol introduceren we een muizenmodel van POI geïnduceerd door intra-abdominale chirurgie, dat de impact van abdominale chirurgie op het spijsverteringskanaal nauwkeurig nabootst. Ons doel was om een gestandaardiseerde methode te bieden voor het modelleren van POI bij muizen, waardoor onderzoekers de pathofysiologie ervan konden onderzoeken en nieuwe therapeutische interventies konden verkennen.

De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek ligt in de behoefte aan betrouwbare preklinische modellen om POI te bestuderen. Traditionele benaderingen voor het bestuderen van POI missen vaak translationele relevantie of slagen er niet in om het complexe samenspel van factoren die bijdragen aan de aandoening vast te leggen. Door een muizenmodel te introduceren dat het klinische scenario nauwkeurig repliceert, kunnen onderzoekers de mechanismen die ten grondslag liggen aan POI nauwkeuriger onderzoeken en potentiële therapeutische interventies testen in een gecontroleerde experimentele setting.

In vergelijking met alternatieve technieken biedt het muizenmodel van POI dat in dit protocol wordt gepresenteerd verschillende voordelen. In eerste instantie hebben we onze experimentele bevindingen geïntegreerd met recente ontwikkelingen om een gestandaardiseerd en reproduceerbaar protocol op te stellen voor het induceren van POI bij proefdieren. Dit protocol vergemakkelijkt een consistente beoordeling van de gastro-intestinale transitfunctie. Ten tweede maakte het gebruik van histologische kleuring en flowcytometrie het mogelijk om weefselzwelling, proliferatie en activering van immuuncellen te beoordelen, wat waardevolle inzichten opleverde in de ontstekingsprocessen die ten grondslag liggen aan POI⁵.

In de bredere context van de literatuur draagt het opstellen van een muizenmodel van POI bij aan het groeiende aantal onderzoeken dat gericht is op het begrijpen van de pathofysiologie van deze aandoening. Door de kloof tussen basiswetenschap en klinische praktijk te overbruggen, spelen preklinische modellen een cruciale rol bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor POI⁶. Bovendien verbetert de beschikbaarheid van gestandaardiseerde diermodellen de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van onderzoeksresultaten in verschillende laboratoria. Dit POI-model is echter gebaseerd op mechanische stimulatie tijdens de chirurgische ingreep. Andere vormen van stimulatie-geïnduceerde ileus zijn mogelijk niet geschikt voor dit model. Bovendien moeten onderzoekers rekening houden met factoren zoals dierenwelzijnsvoorschriften, ethische overwegingen en beschikbaarheid van middelen bij het plannen van experimenten met behulp van dit model.

Samenvattend betekent de introductie van een muizenmodel van POI een opmerkelijke vooruitgang in het preklinisch onderzoek naar deze slopende aandoening. Daarnaast hebben we H&E-kleuring en flowcytometrie gebruikt om weefselzwelling en de proliferatie en activering van immuuncellen te beoordelen. De ontwikkeling van een model voor nuttige nuttige gegevens bij muizen zou de ontdekking van nuttige gegevens bij muizen vergemakkelijken en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor nuttige gegevens bevorderen.

Protocol

Dierenverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guiding Principles in the Care and Use of Animals (China) en werden goedgekeurd door de Ethische Beoordelingscommissie van het Beijing Friendship Hospital (NR. 20-2056). Voor het onderzoek werden C57BL/6-muizen (8-12 weken oud) gebruikt.

1. Voorbereiding op een operatie

1. Vasten alle muizen gedurende 12 uur voorafgaand aan de geplande modellering om te voldoen aan de standaardisatie van experimentele omstandigheden (Figuur 1A).
2. Chirurgische instrumenten voorbereiden en steriliseren.
3. Bereid het verdovingsmiddel tribroomethanol en het verwarmingskussen voor. Bewaak het verwarmingskussen om oververhitting te voorkomen en houd het op een constante temperatuur (37,5 °C).

2. Anesthesie

1. Verdoof elke muis met tribroomethanol.
   1. Verdun tribroomethanol tot een oplossing van 20 mg/ml in een normale zoutoplossing. Dien 0,2 ml tribroomethanol werkoplossing toe per 10 g lichaamsgewicht via intraperitoneale injectie. Gebruik oogzalf op de ogen van muizen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
   2. Zorg ervoor dat muizen binnen 5 minuten volledig verdoofd zijn en 20 minuten verdoofd blijven.
2. Beoordeel de diepte van de anesthesie door het onvermogen van de muis om rechtop te blijven observeren en controleer op spierontspanning. Let op het verlies van vrijwillige beweging, knipperreflex en reactie op reflexstimulatie (teen of staart knijpen met stevige druk).
3. Beoordeel de ademhalingsfrequentie en het patroon van de muis door de beweging van de borstwand en buik te volgen. Zorg ervoor dat de ademhalingsfrequentie ~ 55-65 ademhalingen/min is onder optimale anesthesie.
4. Plaats de verdoofde muis op een plank en zet deze vast met tape.
5. Nadat de muizen volledig verdoofd waren, gebruikt u een elektrisch scheerapparaat om de haren uit de buik te verwijderen. Veeg na het scheren alle losse haren op de buik weg met een met zoutoplossing bevochtigd watje.
   OPMERKING: Zorg voor een goede ventilatie en het gebruik van een zuurkast of bioveiligheidskast bij het hanteren van tribroomethanol om blootstellingsrisico's te minimaliseren. Draag tijdens de procedure geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en laboratoriumjassen, om onbedoeld contact met chemicaliën en biologische materialen te voorkomen.

3. Operatie

1. Strek de ledematen volledig uit om de buik bloot te leggen. Zorg ervoor dat het hoofd van de muis zo is geplaatst dat de luchtweg vrij blijft (Figuur 1B).
2. Desinfecteer de huid van het operatiegebied twee keer met een watje gedrenkt in 75% alcohol. Gebruik na desinfectie een droog, steriel medisch gaasje om overtollig alcohol uit de buik te verwijderen. Dien lidocaïne (10 mg/kg, subcutaan) toe op de beoogde plaats voorafgaand aan de incisie.
3. Gebruik een steriel scalpel om een incisie in de huid te maken en til de rectus abdominis-spier in het midden van de buik op met een pincet.
   1. Maak een kleine incisie langs de mediane lijn van de rectus abdominis-spier en zorg ervoor dat letsel aan verschillende organen in de buik wordt voorkomen.
   2. Zorg ervoor dat het geschatte bereik van de incisie als volgt is. Zorg ervoor dat de bovenrand van de incisie 6-8 mm verwijderd is van de processus xiphoid van het borstbeen, de onderrand 6-8 mm van de uitwendige geslachtsorganen en de lengte van de incisie ~1 cm is.
4. Plaats een stuk steriel chirurgisch laken of steriel gaasje aan beide zijden van de incisie in de buik. Gebruik een hemostatische tang om het steriele gaasje aan de boven- en onderrand van de incisie te bevestigen, waardoor de incisie bloot komt te liggen (Figuur 1C).
   OPMERKING: In de schijngroep werd de incisie gedurende 5 minuten bedekt met nat gaas zonder enige chirurgische ingreep.
5. Bevestig het steriele laken of gaasje op de juiste manier en gebruik vervolgens twee wattenstaafjes die vooraf zijn bevochtigd met zoutoplossing om voorzichtig tegen beide zijden van de buikwand naast de incisie te drukken. Knijp een kleine hoeveelheid van de darmbuis door de incisie en leg deze bloot door deze op het steriele laken of gaasje te leggen (Figuur 1D).
6. Bevochtig twee steriele wattenstaafjes volledig met een normale zoutoplossing. Pak het darmweefsel voorzichtig vast met de bevochtigde wattenstaafjes en verwijder voorzichtig de dunne darm.
   1. Zoek het blinde darm en verwijder vervolgens de darm met de steriele wattenstaafjes tot 2 cm voor de maag om te voorkomen dat u de alvleesklier aanraakt. Verleng de darm vanaf het proximale uiteinde van het pancreato-duodenale ligament tot het distale uiteinde van het ileocecale gebied.
7. Oefen constante druk uit langs de gehele dunne darm van de proximale tot de distale uiteinden. Zorg ervoor dat er gedurende 5 minuten een gelijkmatige kracht wordt uitgeoefend totdat er kleine bloedende plekken op het darmoppervlak verschijnen (Figuur 1E).
8. Gebruik na 5 minuten voorbevochtigde steriele wattenstaafjes om alle dunne darm voorzichtig terug in de buikholte te plaatsen, volgens de normale fysiologische anatomische positie van de dunne darm.
9. Masseer de buik zachtjes over het steriele gaasje en de buikwand gedurende 3-5 s om ervoor te zorgen dat de darm wordt hersteld naar zijn natuurlijke anatomische positie en om kunstmatige mechanische darmobstructie of mesenteriale torsie na de operatie te voorkomen.
10. Injecteer 100 μL zoutoplossing in de buikholte om verloren vocht tijdens de operatie te vervangen en smeer het buikweefsel.
11. Sluit de buik met behulp van 6-0 chirurgische hechting en voer een tweelaagse sluiting uit bij de incisie in de buik. Begin met het sluiten van de spierlaag met continue hechtingen en zorg ervoor dat schade aan de buikorganen wordt voorkomen. Til de rectus abdominis-spier op tijdens het hechten (Figuur 1F).
12. Nadat u de rectus abdominis-spier volledig hebt gesloten, hecht u deze volledig met eenvoudige intermitterende hechtingen met behulp van een 6-0 chirurgische hechting. Houd een steeklengte van ~0,5 mm en een naaldafstand van ~2 mm aan.
13. Veeg na het sluiten van de incisie in de buik het gebied bij de incisie voorzichtig af met droog steriel medisch gaas om het droog en vrij te houden van bloed, weefselvloeistof of normale zoutoplossing.
14. Breng een kleine hoeveelheid medische incisielijm aan op en rond de incisie om splijten na de operatie te voorkomen.
15. Nadat de medische incisielijm volledig is opgedroogd, legt u de muizen op een papieren handdoek en plaatst u de papieren handdoek in de kooi op een verwarmde deken die op een constante temperatuur van 37.5 °C wordt gehouden totdat de muizen volledig zijn hersteld. Laat de dieren niet zonder toezicht achter totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben om de sternale lighouding te behouden.
16. Breng de wakkere muizen over naar de omgeving van de voederbarrière en laat ze vrij drinken tot de detectietijd.

4. Gastro-intestinale transittest

1. Dien 22,5 uur na de operatie 200 μl FITC-dextranoplossing (5 mg/ml in PBS) toe aan de nuchtere muizen via een maagsonde (figuur 1A).
2. Euthanaseer de muizen met behulp van een methode die is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), zoals CO₂ -inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
   1. Om het spijsverteringskanaal te isoleren, maakt u een incisie in de middellijn van het middenrif naar het bekken en verwijdert u voorzichtig de omliggende bindweefsels en organen.
   2. Scheid het spijsverteringskanaal van de omliggende weefsels en organen en zorg ervoor dat het hele kanaal van de maag tot de anus wordt opgenomen.
3. Verdeel het spijsverteringskanaal in 15 gelijke segmenten (van maag tot dikke darm), achtereenvolgens genummerd van 1 tot 15 op basis van fysiologische positie (volgorde: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (Figuur 2A).
4. Snijd elk segment darmweefsel met de inhoud in stukjes van 1-4 mm en plaats ze in afzonderlijke centrifugebuisjes van 1,5 ml met 1 ml DPBS.
5. Vortex de centrifugebuisjes gedurende 10 s om de monsters te homogeniseren.
6. Centrifugeer de buisjes bij 500 × g gedurende 1 min. Verzamel het supernatans voor FITC-fluorescentiekwantificering met behulp van een multimode microplaatlezer.
7. Beschrijf de gastro-intestinale transit door het geometrische centrum (GC) van het FITC-dextran te berekenen en bereken met behulp van de volgende formule: (Σ[% FITC per segment x segmentnummer])/100.

5. Inbedding van paraffine en kleuring van hematoxyline en eosine (HE)

1. Euthanaseer de muizen door CO₂ -inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie na 24 uur. Voer paraffine-inbedding en gastro-intestinale tests uit op hetzelfde dier.
2. Open de buikholte en verzamel dun darmweefsel voor verdere analyse.
3. Fixeer de hele darm met darminhoud in het fixeermiddel van Carnoy (60% methanol + 10% azijnzuur + 30% chloroform) bij 4 °C gedurende 2 uur.
4. Ontzuur het weefsel door twee keer 30 minuten lang met methanol te spoelen.
5. Vervang methanol twee keer gedurende 30 minuten door ethanol.
6. Ontzuur het weefsel door twee keer 30 minuten lang met methanol te spoelen. Om weefseltransparantie met xyleen te bereiken, dompelt u het weefsel onder in xyleen en incubeert u gedurende 1 uur.
7. Veranker het weefsel in paraffinewas met behulp van een paraffine-inbeddingsmachine. Snijd het ingebedde weefsel met behulp van een microtoom in plakjes van 4 μm dik.
   OPMERKING: Verdeel de dunne darm in verschillende wassen voor betere prestaties. Label de segmenten op de juiste manier om hun locatie te identificeren.
8. Voer HE-kleuring uit met behulp van de HE-kleuringsset. Sluit de objectglaasjes af en onderzoek ze onder een microscoop voor analyse.

6. Isolatie van immuuncellen en flowcytometrie

1. Bereid de volgende oplossingen voor.
   1. Voorverteringsoplossing: Bereid Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca²⁺ en Mg²⁺ met 1 mM dithiothreitol (DTT) en 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
   2. Digestieoplossing: Bereid een oplossing met 200 μg/ml DNAase I, 500 μg/ml collagenase IV, 4% FBS en 100 μM HEPES-buffer in RPMI 1640.
   3. Magnetisch geactiveerde celsorteerwerkbuffer (MACS): Bereid een buffer voor met 5 g/L BSA en 2 mM EDTA in PBS zonder Ca²⁺ of Mg²⁺.
2. Verwijder de fecale inhoud door de darmen te wassen met een normale zoutoplossing. Verwijder Peyer's pleisters en bindweefsel van de dunne darm. Snijd de dunne darm in de lengterichting open en snijd vervolgens in ijskoude PBS in segmenten van 1 cm.
3. Was de darmsegmenten met voordigestieoplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een orbitale schudder. Verzamel de voordigestieoplossing en filtreer deze door 70 μm celzeven om intra-epitheliale lymfocyten (IEL's) te verkrijgen.
4. Verteer de segmenten gedurende 30 minuten in de digestieoplossing en filtreer vervolgens de suspensie door 70 μm celzeven om lamina propria-lymfocyten (LPL's) te verkrijgen.
5. Centrifugeer de LPL-cellen gedurende 10 minuten bij 500 × g en gooi het bovenstaande weg.
6. Was en suspendeer de cellen met DPBS (natriumazide, Tris en eiwitvrij) in een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/100 μL.
7. Incubeer de cellen met een fluorescerende kleurstof (1:500) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) in het donker.
8. Suspendeer de cellen met MACS-buffer en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 500 × g .
9. Tel de gekleurde cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cellenteller. Resuspendeer de cellen in een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/100 μL MACS-buffer. Voer antilichaamkleuring (1:200-1:400) uit door het juiste volume antilichaam aan de celsuspensie toe te voegen en gedurende 15 minuten bij 4 °C te incuberen.
10. Was de cellen zoals beschreven in stap 6.8.
11. Detecteer de monsters met behulp van flowcytometrie en analyseer gegevens met de bijbehorende flowcytometriesoftware ^7,8.

Resultaten

In dit protocol werd POI chirurgisch geïnduceerd door darmmanipulatie (IM), wat vergelijkbaar is met het effect van klinische chirurgie. In de schijngroep werd een incisie gemaakt zonder de IM. POI-muizen werden 24 uur na de POI-operatie geofferd, samen met schijncontrolemuizen. De kritieke functie van het spijsverteringskanaal, de functie van de overdracht van inhoud, werd gedetecteerd door een maagsonde van FITC-dextran. Het POI-model werd als succesvol beschouwd omdat de FITC-intensit...

Discussie

Het succes van een operatie is afhankelijk van verschillende cruciale stappen. Ten eerste is het handhaven van consistentie tijdens intestinale intramurale (IM) chirurgie absoluut noodzakelijk om uitgebreid letsel aan de dunne darm te veroorzaken. De juiste druk die tijdens de IM-procedure wordt uitgeoefend en het daaruit voortvloeiende hyperemische effect op de darm zijn cruciaal voor chirurgisch succes. De observatie van het hele spijsverteringskanaal dat roze werd en rode hemorragisch...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I van bovien pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol oplossing	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE kleuringskit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immuunceldetectie en -sortering
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesie
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplaatlezer
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescente levensvatbaarheidskleurstof