We beschrijven een algemeen protocol dat massaspectrometrie-analyse met hoge resolutie en moleculaire docking integreert in onderzoek naar traditionele Chinese geneeskunde.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tandem-massaspectrometrie met hoge resolutie voor het bestuderen van chemische bestanddelen van Gynura bicolor DC
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het scheiden en analyseren van de gewenste chemische componenten zijn belangrijke onderwerpen voor het fundamenteel onderzoek van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM). Ultra-high-performance vloeistofchromatografie quadrupole time-of-flight tandem massaspectrometrie (UPLC-Q-TOF-MS/MS) is geleidelijk uitgegroeid tot een toonaangevende technologie voor de identificatie van TCM-ingrediënten. Gynura tweekleurig gelijkstroom. (BFH), een overblijvend stengelloos kruid dat in China wordt gebruikt voor medicijnen en voedsel, heeft geneeskrachtige effecten zoals het opruimen van warmte, het bevochtigen van de longen, het verlichten van hoest, het verspreiden van stasis en het verlichten van zwelling. Polyfenolen en flavonoïden bevatten talrijke isomeren, die de identificatie van de complexe verbindingen in BFH belemmeren. Dit artikel presenteert een systematisch protocol voor het bestuderen van chemische bestanddelen van BFH op basis van oplosmiddelextractie en geïntegreerde gegevens via UPLC-Q-TOF-MS.
De hier beschreven methode omvat systematische protocollen voor de voorbehandeling van monsters, MS-kalibratie, MS-acquisitie, gegevensverwerking en analyse van resultaten. De voorbehandeling van het monster omvat het verzamelen, reinigen, drogen, vermalen en extraheren. MS-kalibratie bestaat uit meerpunts- en enkelpuntscorrectie. Gegevensverwerking omvat het importeren van gegevens, het vaststellen van methoden, analyseverwerking en presentatie van resultaten. Representatieve resultaten van het typische fragmentatiepatroon van fenolzuren, esters en glycosiden in Gynura bicolor DC. (BFH) worden in dit artikel gepresenteerd. Daarnaast worden de selectie van organische oplosmiddelen, extractie, data-integratie, selectie van botsingsenergie en methodeverbetering in detail besproken. Dit universele protocol kan op grote schaal worden gebruikt om complexe verbindingen in TCM te identificeren.
Inleiding
Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) wordt al duizenden jaren klinisch beoefend in China en speelt een cruciale rol bij het behoud van de gezondheid vanChinezen. De samenstelling van TCM is divers en complex, en TCM is op grote schaal gerapporteerd in veel kwalitatieve onderzoeken die zich richten op de chemische samenstelling2. De chemische componenten in TCM kunnen grofweg worden onderverdeeld in de volgende categorieën, zoals alkaloïden, organische zuren, fenylpropanoïden, coumarines, lignanen, chinonen, flavonoïden, terpenoïden, triterpenoïde saponinen, steroïde saponinen, hartglycosiden en tannines3. Gezien de grote aantallen onbekende componenten en niet van elkaar te onderscheiden isomeren in TCM, zijn de scheiding en analyse van de gewenste chemische componenten belangrijke onderwerpen voor het fundamentele onderzoek van TCM4.
Ultra-high-performance vloeistofchromatografie quadrupole time-of-flight massaspectrometrie (UPLC-Q-TOF-MS) is toegepast om stoffen in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) te analyseren, die kunnen worden gescheiden door ultra-high-performance vloeistofchromatografie 5,6. De hoge resolutie van MS kan uitgebreide ioneninformatie opleveren, die wordt gebruikt voor database-analyse met een fout van minder dan 5 ppm7. Na het inschakelen van de botsingsenergie kan de secundaire MS-modus secundaire fragmentionen verkrijgen, waarvan de intensiteit en het aantal worden beïnvloed door de grootte van energie8.
Gynura tweekleurig gelijkstroom. (BFH), een overblijvend stengelloos kruid dat veel wordt gebruikt voor medicijnen en voedsel (Figuur 1A), is een zeldzame en bedreigde plant die uniek is voor China9. BFH heeft een overvloed aan anthocyanen, polyfenolen, flavonoïden en een sterke antioxidantcapaciteit10. BFH heeft medicinale effecten, waaronder het opruimen van warmte, het koelen van bloed, het bevochtigen van de longen, het verlichten van hoest, het verspreiden van stasis, het verlichten van zwelling, het verlichten van zomerhitte en het elimineren van hitte. Er zijn maar weinig studies die zich hebben gericht op de chemische samenstelling van BFH11. Polyfenolen en flavonoïden bevatten talrijke isomeren, die de identificatie van de complexe verbindingen in BFH bemoeilijken. Er moet een universele methode worden ontwikkeld voor de identificatie van chemische componenten, die kan worden toegepast op alle soorten TCM. Deze studie had tot doel een systematisch protocol te rapporteren voor het bestuderen van chemische bestanddelen van BFH op basis van oplosmiddelextractie en geïntegreerde gegevens via UPLC-Q-TOF-MS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbehandeling van de steekproef
- Was het hele kruid BFH in zuiver water totdat er geen zichtbare afzettingen en onzuiverheden meer zijn. Doe de schone BFH in een schaal en plaats deze vervolgens in de oven (Figuur 1B). Zet de oven 24 uur op 50 °C.
OPMERKING: De volledige plant van BFH werd verzameld in de provincie Sichuan, China. - Plet gedroogde BFH in een multifunctionele breker met hoge snelheid. Breng het grove poeder over in een zeef met mazen van 50 mazen (Figuur 1C). Verzamel het fijne poeder in een luchtdichte zak en bewaar het in een droogtoren.
- Weeg nauwkeurig zes BFH-monsters van elk 0,25 g af en plaats ze in zes kegelvormige kolven. Voeg 30 ml organisch oplosmiddel (50% ethanolwater, 70% ethanolwater, chloroform, petroleumether, ethylacetaat en n-butylalcohol) toe aan elke conische fles (Figuur 1D).
- Breng het mengsel over naar een ultrasone badsonicator voor 30 minuten extractie bij 25 °C. Centrifugeer het monster bij 14.000 x g gedurende 5 minuten. Bereid een injectiespuit en een organisch microporeus membraanfilter van 0,22 μm voor. Filtreer alle supernatanten in monsterflesjes van 2 ml.
2. MS-kalibratie
- Breng met een pipet van 1.000 μl 500 μl natriumhydroxideoplossing van 0,1 M over in een maatkolf van 100 ml en breng vervolgens 450 μl gedeïoniseerd of ultrapuur water over in de maatkolf van 100 ml (figuur 2).
- Voeg met een pipet van 200 μl 50 μl mierenzuur toe aan de maatkolf van 100 ml. Maak een totaal volume van 100 ml met 90:10 2-propanol:water en sonificeer de oplossing gedurende 5 minuten. Etiketteer de kolf als 0,5 mM natriumformiaatoplossing in 90:10 2-propanol:water en bewaar deze in de koelkast.
OPMERKING: De natriumformiaatoplossing vervalt binnen 1 week bij kamertemperatuur. - Start de besturingssoftware UPLC-Q-TOF-MS en open vervolgens het MS tune-venster . Stel in het Sample Flow Control-paneel 25 μL/min in bij de optie Infusion Flow Rate en selecteer C bij de optie Reservoir . Wacht ongeveer 1 minuut totdat de automatische ontluchting tot het einde is.
- Klik op de Flow-knop om te beginnen met het toedienen van natriumformiaatoplossing. Klik op de positieve knop om over te schakelen naar de positieve ionenmodus en klik op de gevoeligheidsknop om over te schakelen naar de gevoeligheidsmodus.
OPMERKING: Ga verder met de volgende stap totdat de karakteristieke pieken van natriumformiaat verschijnen in het real-time spectrumvenster. - Open in de besturingssoftware UPLC-Q-TOF-MS het venster MS Console . Selecteer in de linkerpositie achtereenvolgens de opties SYNAPT XS en Intellistart .
- Vink de Kalibratie maken aan en klik op de Start knop. Klik op de knop Volgende en selecteer Kalibratieprofiel in het vervolgkeuzemenu. Klik op de knop Volgende en selecteer de gevoeligheidsmodus in positieve polariteit. Klik achtereenvolgens op de knoppen Volgende, Pagina Afstemmen, Volgende en Start .
- Schakel over naar het MS tune-venster en klik op de negatieve knop om over te schakelen naar de negatieve ionenmodus. Ga terug naar het MS Console-venster .
- Vink de Kalibratie maken aan en klik op de Start knop. Klik op de knop Volgende en selecteer Kalibratieprofiel in het vervolgkeuzemenu. Klik op de knop Volgende en selecteer de gevoeligheidsmodus in negatieve polariteit. Klik achtereenvolgens op de knoppen Volgende, Pagina Afstemmen, Volgende en Start .
- Stel in het LockSpray Flow Control-paneel een debiet van 50 μL/min in en klik op de Flow-knop om de LE-oplossing in de massaspectrometer te laten komen. Schakel over naar het MS-tune-venster , vink de LockSpray Source Setup aan en klik op de Start-knop om de kalibratie te starten.
3. Overname van LS
- Schakel over naar de hoofdinterface en klik met de rechtermuisknop op de kolom Inlaatbestand om de vloeistofchromatografiemethode te openen.
- Klik op de knop Inlaat en stel vervolgens parameters in, waaronder Looptijd en Gradiënt. Klik op de knop Autosampler en stel vervolgens parameters in, waaronder Runtime, Column en Sample. Klik op de knop Opslaan .
- Klik met de rechtermuisknop op de kolom MS-methode om de massaspectrometriemethode te openen.
- Klik op de knop Informatie en stel vervolgens parameters in, waaronder Eindtijd, Polariteit, Analysatormodus, Lage massa, Hoge massa en Ramp Transfer Collision Energy. Klik op de knop OK en vervolgens op de knop Opslaan .
- Vul de sequentietabel in, inclusief bestandsnaam, flacon en volume. Klik op de knop Opslaan .
- Selecteer de rij in de volgordetabel voor het voorbeeld dat u wilt uitvoeren. Klik op de knop Uitvoeren en klik op de knop OK in het venster dat zojuist verschijnt.
4. Gegevensverwerking
- Start de software voor gegevensanalyse. Klik in de kolom Mijn werk op de knop MassLynx-gegevens importeren om een nieuw venster te openen.
- Klik op de plustekenknop en controleer alle vijf onbewerkte bestanden vanuit de positieve modus. Voer een groepsnaam in en klik op de knop UNIFI-voorbeeldset maken om het importeren van gegevens te starten (Afbeelding 3A).
- Dubbelklik op het bestand Analysemethode in de positieve modus. Klik op het verwerkingslabel en klik op de knop Target by Mass . Voer het aantal van 5 ppm in het invoervak in na Tolerantie voor doelovereenkomst en Tolerantie voor fragmentovereenkomst.
- Klik op de Home-knop en klik op de Adducts-knop . Selecteer de rijen van +H en +Na en klik op de pijlvormige knop naar rechts . Klik op de knop Opslaan (Figuur 3B).
- Dubbelklik op het bestand Analysemethode in de negatieve modus. Klik op het verwerkingslabel en klik op de knop Target by Mass . Voer het aantal van 5 ppm in het invoervak in na Tolerantie voor doelovereenkomst en Tolerantie voor fragmentovereenkomst.
- Klik op de Home-knop en klik vervolgens op de Adducts-knop . Selecteer de rijen van -H en +HCOO en klik op de pijlvormige knop naar rechts . Klik op de knop Opslaan .
- Klik in de kolom Mijn werk op de knop Analyse om een nieuw venster te openen. Kies de zojuist geïmporteerde gegevens en de zojuist gemaakte methode en klik vervolgens op de knop Volgende. Voer de bestandsnaam in. Selecteer de map waarin de analysegegevens zijn opgeslagen en klik vervolgens op de knop Voltooien
- Klik op de knop Verwerken en wacht een paar minuten totdat de resultaten verschijnen (Figuur 3C).
- Kopieer de resultatentabel naar een leeg formulier (Figuur 3D).
5. Analyse van de resultaten
- Selecteer een verbinding in de resultatentabel. Het bijbehorende secundaire massaspectrum wordt weergegeven in de rechterbenedenhoek (Figuur 4A).
- Klik op de tabelvormige knop en selecteer de optie Hoge Energie Fragmenten om de tabel met secundaire fragmentionen weer te geven (Figuur 4B).
- Selecteer een secundair fragmention in de tabel. Beweeg de muis over de ionenpiek die overeenkomt met het secundaire massaspectrum en de bijbehorende structurele breuk wordt op het scherm weergegeven (Figuur 4C).
OPMERKING: Beoordeel handmatig de redelijkheid van het kraken dat door de software wordt gegeven en onderscheid isomeren op basis van de secundaire fragmentionen. - Teken het fragmentatiepatroon handmatig in de tekensoftware.
OPMERKING: Voorbeelden van fragmentatiepatronen worden in detail beschreven in de sectie representatieve resultaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De identificatie van de chemische samenstelling van BFH werd gebruikt als model om de representatieve resultaten weer te geven. Basispiekchromatogrammen van met oplosmiddel geëxtraheerde Gynura bicolor DC. worden weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende figuur S1-S6, en de waargenomen retentietijd (RT), componentnaam, formule, massa-tot-ladingsverhouding (m/z) en massafout worden vermeld in tabellen S1-S6. In de ZBTK werden alle 35 soorten verbindingen ge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Naast waterafkooksel12 is extractie met organische oplosmiddelen een andere veelgebruikte methode voor TCM-voorbehandeling13. Volgens het principe van gelijksoortige fase-oplossing zijn talrijke componenten geëxtraheerd door de combinatie van verschillende organische oplosmiddelen14. Ultrasoon geassisteerde extractie is een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt om componenten in TCM15
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (82104881), Inheritance and Innovation Team of TCM Treatment of Immune Diseases, Chongqing Medical Scientific Research Project (gezamenlijk project van Chongqing Health Commission en Science and Technology Bureau) (2022DBXM007), Een speciaal project voor prestatieprikkeling en begeleiding van het Chongqing Scientific Research Institute (cstc2022jxjl120005), Een speciaal project voor Chongqing Postdoctoral Science Foundation (2022CQBSHTB3035), Senior Medical Talents Program van Chongqing voor Yong en mensen van middelbare leeftijd, het programma voor wetenschappelijke instellingen van Chongqing (onafhankelijk onderzoeksproject nr. 2022GDRC015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| chloroform | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | CAS 67-66-3 | |
| ethanol | ChuandongChemical | CAS 64-17-5 | |
| ethyl acetate | ChuandongChemical | CAS 141-78-6 | |
| liquid chromatograph | Waters | ACQUITY Class 1 plus | |
| MassLynx | Waters | V4.2 | MS control software |
| n-butyl alcohol | ChuandongChemical | CAS 71-36-3 | |
| petroleum ether | ChuandongChemical | CAS 8032-32-4 | |
| Quadrupole time-of-flight mass spectrometry | Waters | SYNAPT XS | |
| UNIFI | Waters | Data analysis software |
Referenties
- Lin, P., et al. Qualitative and quantitative analysis of the chemical profile for gualou-xiebai-banxia decoction, a classical traditional chinese medicine formula for the treatment of coronary heart disease, by uplc-q/tof-ms combined with chemometric analysis. J Pharm Biomed Anal. 197, 113950(2021).
- Hui, D., et al. Uplc-q-tof/ms-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional chinese medicine chuanwu and the detoxification mechanisms of gancao, baishao, and ganjiang. Chinese J Nat Med. 13 (9), 687-698 (2015).
- Newman, D. J. Modern traditional chinese medicine: Identifying, defining and usage of tcm components. Adv Pharmacol. 87, 113-158 (2020).
- Liu, S., Yi, L. Z., Liang, Y. Z. Traditional chinese medicine and separation science. J Sep Sci. 31 (11), 2113-2137 (2008).
- Yuan, L., et al. Rapid classification and identification of complex chemical compositions in traditional chinese medicine based on uplc-q-tof/ms coupled with data processing techniques using the kudiezi injection as an example. Anal Methods. 7 (12), 5210-5217 (2015).
- Wang, F., et al. Hplc coupled with chemical fingerprinting for multi-pattern recognition for identifying the authenticity of clematidis armandii caulis. JoVE. (189), e64690(2022).
- Gao, Y., et al. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry and self-established database analysis of chinese herbal medicine components. JoVE. (201), e66091(2023).
- Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE. (193), e65054(2023).
- Wang, Y., et al. Comparison of morphological and physiological characteristics in two phenotypes of a rare and endangered plant, begonia fimbristipula hance. Photosynthetica. 54, 381-389 (2016).
- Zhang, P., et al. Response of population canopy color gradation skewed distribution parameters of the rgb model to micrometeorology environment in begonia fimbristipula hance. Atmosphere. 13 (6), 890(2022).
- Yu, L., Ning, L., Youzhen, D. Studies on microwave extraction of the pigment from begonia fimbristipula hance. Guangdong Trace Elements Science. 11 (10), 60-63 (2004).
- Xiao, Q., et al. Novel fusion protein consisting of metallothionein, cellulose binding module, and superfolder gfp for lead removal from the water decoction of traditional chinese medicine. ACS Omega. 5 (6), 2893-2898 (2020).
- Huang, H., et al. Using multiple light scattering to examine the stability of phyllanthus emblica l. Extracts obtained with different extraction methods. JoVE. (194), e65130(2023).
- Miao, W. G., Tang, C., Ye, Y., Quinn, R. J., Feng, Y. Traditional chinese medicine extraction method by ethanol delivers drug-like molecules. Chin J Nat Med. 17 (9), 713-720 (2019).
- Olejar, K. J., et al. Ultrasonic-assisted extraction of cannabidiolic acid from cannabis biomass. JoVE. (183), e63076(2022).
- Zhu, H. Y., et al. Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction from schisandra chinensis in mice. J Food Drug Anal. 24 (4), 831-838 (2016).
- Lin, X., Wang, Y., Liu, X., Huang, S., Zeng, Q. Ils-based microwave-assisted extraction coupled with aqueous two-phase for the extraction of useful compounds from chinese medicine. Analyst. 137 (17), 4076-4085 (2012).
- Wu, T., Lv, H., Wang, F., Wang, Y. Characterization of polyphenols from lycium ruthenicum fruit by uplc-q-tof/mse and their antioxidant activity in caco-2 cells. J Agric Food Chem. 64 (11), 2280-2288 (2016).
- Distler, U., et al. Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 11 (2), 167-170 (2014).
- Sawada, Y., et al. Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants. Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).
- Zhang, X. M., et al. Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification. Food Chem. 364, 130450(2021).
- Downard, K. M. Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the "intensity-fading" approach. Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
