Methodenartikel

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66649

⸱

6 september 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) wordt geassocieerd met verminderd sociaal en communicatief gedrag en het ontstaan van repetitief gedrag. Voor het bestuderen van de onderlinge relatie tussen ASS-genen en gedragsstoornissen in het Drosophila-model , worden in dit artikel vijf gedragsparadigma's beschreven voor het bepalen van sociale afstand, agressie, verkering, verzorging en gewenningsgedrag.

Samenvatting

Autismespectrumstoornis (ASS) omvat een heterogene groep neurologische ontwikkelingsstoornissen met veel voorkomende gedragssymptomen, waaronder tekorten in sociale interactie en het vermogen om te communiceren, verbeterd beperkt of repetitief gedrag, en ook, in sommige gevallen, leerstoornissen en motorische stoornissen. Drosophila heeft gediend als een ongeëvenaard modelorganisme voor het modelleren van een groot aantal menselijke ziekten. Omdat veel genen betrokken zijn bij ASS, zijn fruitvliegjes naar voren gekomen als een krachtige en efficiënte manier om de genen te testen die vermoedelijk betrokken zijn bij de aandoening. Aangezien honderden genen, met verschillende functionele rollen, betrokken zijn bij ASS, is een enkel genetisch vliegmodel van ASS onhaalbaar; in plaats daarvan zijn individuele genetische mutanten, gen-knockdowns of op overexpressie gebaseerde studies van de vlieghomologen van ASS-geassocieerde genen de gebruikelijke middelen om inzicht te krijgen in moleculaire routes die ten grondslag liggen aan deze genproducten. Er zijn tal van gedragstechnieken beschikbaar in Drosophila die het gemakkelijk maken om tekorten in specifieke gedragscomponenten af te lezen. Het is aangetoond dat sociale ruimtetest en agressie- en baltstests bij vliegen nuttig zijn bij het beoordelen van defecten in sociale interactie of communicatie. Verzorgingsgedrag bij vliegen is een uitstekende uitlezing van repetitief gedrag. Gewenningstest wordt gebruikt bij vliegen om het vermogen tot gewenningsleren te schatten, dat bij sommige ASS-patiënten wordt aangetast. Een combinatie van deze gedragsparadigma's kan worden gebruikt om een grondige beoordeling te maken van de menselijke ASS-achtige ziektetoestand bij vliegen. Met behulp van Fmr1-mutante vliegen, het recapituleren van het Fragile-X-syndroom bij mensen en POGZ-homologe row-knockdown bij vliegneuronen, hebben we kwantificeerbare tekorten aangetoond in sociale afstand, agressie, baltsgedrag, verzorgingsgedrag en gewenning. Deze gedragsparadigma's worden hier in hun eenvoudigste en ongecompliceerde vorm gedemonstreerd, in de veronderstelling dat het het wijdverbreide gebruik ervan voor onderzoek naar ASS en andere neurologische ontwikkelingsstoornissen in vliegmodellen zou vergemakkelijken.

Inleiding

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) omvat een heterogene groep van neurologische aandoeningen. Het omvat een reeks complexe neurologische ontwikkelingsstoornissen die worden gekenmerkt door multicontextuele en aanhoudende tekorten in sociale communicatie en sociale interactie en de aanwezigheid van beperkte, repetitieve gedrags- en activiteitspatronen en interesses1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) wordt wereldwijd 1 op de 100 kinderen gediagnosticeerd met ASS met een man-vrouwverhouding van 4,22. De ziekte wordt duidelijk in het tweede of derde levensjaar. ASS-kinderen tonen een gebrek aan interesse in sociaal-emotionele wederkerigheid, non-verbale communicatie en relatievaardigheden. Ze vertonen repetitief gedrag zoals stereotiepe motorische bewegingen, onbuigzame en geritualiseerde routinematige volgorde, en intense focus op beperkte interesses. ASS-kinderen vertonen een hoge mate van respons op aanraking, geur, geluid en smaak, terwijl pijn- en temperatuurrespons relatief laag is1. De penetrantie van deze aandoening is ook verschillend tussen verschillende patiënten die lijden aan ASS en daarom neemt de variabiliteit toe.

De huidige klinische diagnose van ASS is gebaseerd op gedragsbeoordeling van de individuen, aangezien er geen bevestigende, op biomarkers gebaseerde of gemeenschappelijke genetische test is die alle vormen vanASS omvat. Het ontcijferen van de genetische en neurofysiologische basis zou nuttig zijn bij het richten van behandelingsstrategieën. In het afgelopen decennium heeft een grote hoeveelheid onderzoek geresulteerd in de identificatie van honderden genen die zijn verwijderd of gemuteerd of waarvan de expressieniveaus zijn veranderd bij ASS-patiënten. Lopend onderzoek benadrukt de validatie van de bijdrage van deze kandidaat-genen met behulp van modelorganismen zoals de muis of fruitvlieg, waarbij deze genen worden uitgeschakeld of uitgeschakeld, gevolgd door tests voor ASS-achtige gedragsstoornissen en opheldering van onderliggende genetische en moleculaire routes die de anomalieën veroorzaken. Een muismodel dat Copy Number Variations (CNV's) recapituleert in de menselijke chromosomale loci 16p11.2 toont enkele van de ASS-gedragsdefecten 4,5,6. Prenatale blootstelling aan een teratogeen geneesmiddel, valproïnezuur (VPA) is een ander muismodel dat eigenschappen vertoont die lijken op menselijke ASS 7,8. Daarnaast bestaat er een reeks muismodellen die genetisch syndroom-geassocieerd autisme vertonen, bijvoorbeeld syndromale modellen met één gen veroorzaakt door mutaties in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c en niet-syndromale modellen met één gen veroorzaakt door mutaties in genen zoals Cntnap2, Shank, Neurexine of Neuroligin-genen 5.

Fruitvlieg (Drosophila melanogaster) is een ander prominent modelorganisme voor het bestuderen van de cellulaire, moleculaire en genetische basis van een overvloed aan menselijke aandoeningen9, waaronder ASS. Drosophila en mensen delen sterk geconserveerde biologische processen op moleculair, cellulair en synaptisch niveau. Fruitvliegjes zijn met succes gebruikt in ASS-studies 10,11,12 om genen te karakteriseren die verband houden met ASS en hun exacte rol te ontcijferen bij synaptogenese, synaptische functie en plasticiteit, neurale circuitassemblage en rijping; vlieghomologen van ASS-geassocieerde genen bleken een rol te spelen bij de regulatie van sociaal en/of repetitief gedrag 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. De fruitvlieg heeft ook gewerkt als model voor de screening van ASS-genen en hun varianten 15,22,23. De grootste uitdaging in ASS-onderzoek bij vliegen is dat er, in tegenstelling tot andere ziektemodellen, niet één ASS-vliegmodel is. Om de impact van mutaties of het uitschakelen van een specifiek ASS-gen te begrijpen, moet een onderzoeker valideren of de gedragsfenotypes de symptomen van ASS-patiënten voldoende nabootsen en vervolgens doorgaan met het begrijpen van de moleculaire of fysiologische onderbouwing van de fenotypes.

Daarom is de detectie van ASS-achtige fenotypes van vitaal belang voor ASS-onderzoek in het vliegenmodel. In de loop der jaren zijn er een handvol gedragstechnieken ontstaan die ons in staat stellen om afwijkingen op te sporen, zoals tekorten in sociaal gedrag/interactie, communicatie, repetitief gedrag en reactievermogen op stimuli. Bovendien zijn er in verschillende laboratoria verschillende aanpassingen en upgrades van deze gedragstechnieken doorgevoerd om aan specifieke eisen te voldoen, zoals opschaling, automatisering van assays, uitlezingen, kwantificering en vergelijkingsmethoden. In dit video-artikel worden de meest basale versies van vijf gedragsparadigma's gedemonstreerd, die in combinatie kunnen worden gebruikt om ASS-achtige gedragsuitkomsten op de gemakkelijkste manier te detecteren.

Agressie is een evolutionair geconserveerd aangeboren gedrag dat overleving en voortplanting beïnvloedt24. Agressief gedrag ten opzichte van soortgenoten wordt beïnvloed door 'motivatie voor socialisatie'25,26 en 'communicatie'27, die beide in het gedrang komen bij personen met ASS. Agressief gedrag is goed beschreven in Drosophila en de kwantificeerbaarheid ervan door de robuuste agressietest 28,29,30 en een goed begrepen genetische en neurobiologische basis 31 maakt het een geschikt gedragsparadigma32 voor het beoordelen van het ASS-fenotype in een vliegmodel. Agressie wordt beïnvloed door sociaal isolement, weg van een sociale omgeving, wat leidt tot verhoogde agressie; Hetzelfde is waargenomen wanneer mannetjesvliegen een paar dagen in afzondering worden gehuisvest33,34. Een andere gedragstest die de sociabiliteit bij vliegen kwantificeert, is de Social Space Assay35, die afstanden meet tussen naaste buren en interfly-afstanden in een kleine groep vliegen, waardoor het perfect geschikt is voor het testen van de rollen van ASS-genorthologen in vlieg 12,21,36,37 evenals door het milieu geïnduceerde ASS-vliegmodellen 38, 39. okt.

De Drosophila-verkeringstest is een ander gedragsparadigma dat vaak wordt gebruikt om te testen op verandering in sociale en communicatieve vaardigheden bij circuit of genetische manipulatie, inclusief autisme-gerelateerde genen 18,19,21,40. Repetitieve gedragspatronen komen veel voor bij ASS-patiënten, wat bij vliegen wordt gerecapituleerd door verzorgingsgedrag - een reeks afzonderlijke, stereotiepe acties die worden uitgevoerd voor schoonmaken en andere doeleinden. Het is met succes gebruikt om de impact van ASS-genmutaties bij vliegente testen 21,41, evenals blootstelling aan chemicaliën38,39. Meerdere ontwikkelingen en automatisering in de test zijn beschreven vóór 16,41,42,43; Hier demonstreren we het meest elementaire testpatroon, dat gemakkelijk kan worden aangenomen en gekwantificeerd.

Het is bekend dat ASS bij sommige patiënten invloed heeft op het vermogen tot gewenning, leren en geheugen 44,45,46,47,48,49,50, ASS-modelorganismen 51,52 en veroorzaakt ook tekorten in verschillende olfactorische gedragingen50. Drosophila light-off jump habituation is eerder gebruikt om te screenen op ASS-genen23. Gewenning kan worden getest met een eenvoudige methode van olfactorische gewenningstest 53,54,55. We beschrijven de methode om olfactorische gewenning te induceren en testen de uitkomst met behulp van een klassieke, op Y-doolhof gebaseerde binaire geurkeuzetest56 die kan worden gebruikt om defecten in gewenning te detecteren bij ASS-genmutant of genknockdown-aandoening. Om te beoordelen of de impact van een mutatie (of gen knock-down) of een farmacologische behandeling op het gedrag van een vlieg neerkomt op een ASS-achtig fenotype, kan men een combinatie van deze 5 hier beschreven testen gebruiken.

Protocol

Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Agressie test

  1. Voorbereiding van de agressie-testarena
    1. Neem een standaard plaat met 24 putjes (Figuur 1A) en gebruik elk putje van de plaat als een enkele 'arena' (Figuur 1B) voor vliegagressie. Vul de helft van elk putje met gewoon vliegenvoer en laat het een nacht drogen.
      OPMERKING: Optioneel kan een brandpunt voor agressie in de arena worden opgenomen, zoals een puntje gistpasta of een onthoofde vrouw om mannelijke agressie te garanderen.
    2. Neem een doorzichtige plastic/acrylplaat, genoeg om het oppervlak van ongeveer drie tot vier putjes te bedekken. Perforeer de plaat om een kleine opening van ~2,5 mm diameter te maken om individuele vliegen erdoorheen in de putjes te steken.
  2. Voorbereiding van de vliegenzuiger
    1. Neem een 30-50 cm lange rubber/siliconen buis (Figuur 1C1).
    2. Neem een pipetpunt van 200 μL (of 1.000 μL) en hak ~1 cm van de smalle punt af. Steek het afgeknipte uiteinde aan het ene uiteinde van de rubberen buis; Deze tip is het 'monduiteinde', dat wordt gebruikt voor aspiratie in de mond.
    3. Neem een andere pipetpunt en knip het smalle uiteinde van deze punt af om een opening te maken die voldoende is voor een vlieg om er doorheen te gaan. Steek de basis van deze pipetpunt in het uiteinde van de buis; dit is het 'vlieguiteinde' van de aspirator, van waaruit de vlieg wordt opgezogen (Figuur 1C2).
    4. Steek een stuk gaasdoek of een dunne laag katoen op het 'vliegenuiteinde' van de buis - op de kruising tussen de buis en de punt. Zorg ervoor dat een vlieg die in de pipetpunt wordt opgezogen, vast blijft zitten in de tip, voor het gaas.
    5. Dicht de verbindingen tussen de buis en de pipetpunten af met parafilm.
  3. Voorbereiding van buizen met enkelvoudige behuizing en flesjes voor groepshuisvesting
    1. Voorbereiding van buizen met één behuizing
      1. Voeg bijna 500 μL vers bereid vliegenvoer toe aan een microfuge-buisje van 2 ml (Figuur 1D). Gebruik een minicentrifuge om het voedsel naar het onderste deel van de buis te trekken.
      2. Laat het voedsel stollen bij kamertemperatuur door het deksel een nacht open te houden. Dek de buizen af met een fijn stuk doek om te voorkomen dat verdwaalde vliegen de buizen binnendringen.
      3. Perforeer de deksels van de microfuge-buizen met naalden voor luchtcirculatie en sluit de deksels nadat het voedsel is gestold.
    2. Bereiding van flesjes voor groepshuisvesting
      1. Neem gewone vliegenflesjes en vul een absoluut minimum van de flesjes met vers bereid voedsel (Figuur 1D).
  4. De vliegen voorbereiden voor het experiment
    1. Onderhoud vlieglijnen van de gewenste genotypen in gewone glazen/plastic flessen met standaard vliegenvoer in een incubator bij 25 °C op een licht/donkercyclus van 12 uur.
    2. Verzamel nieuw gesloten (0 tot 24 uur) vliegen van het gewenste genotype en scheid ze onder kooldioxide-anesthesie met behulp van een stereomicroscoop.
    3. Steek de helft van de mannetjesvliegen afzonderlijk in 'buizen met één behuizing'. Houd de andere helft van de mannetjesvliegen in een groep van 10 met de vrouwtjes in gewone 'groepshuisvestingflacons', waardoor een sociale conditie ontstaat. Bewaar alle tubes en injectieflacons gedurende 5 dagen bij 25 °C.
      NOTITIE: Houd een temperatuur van 24-25 °C en ~50% luchtvochtigheid aan in de gedragskamer. De gebruikte vliegstammen waren: w1118 en FMR trans-heterozygote mutante vliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Fmr1-vliegen , die 5 dagen in isolatie werden gehouden, vertonen significant verminderde agressieaanvallen naar een ander mannetje (Figuur 1E).
  5. Het uitvoeren van het agressie gedrag experiment
    1. Voer het agressie-experiment uit tijdens het ZT0-ZT3-tijdvenster, aangezien de vliegen op dit moment van de dag piekactiviteit vertonen.
      OPMERKING: ZT=Zeitgeber tijd in een standaard 12 uur licht/donker cyclus; ZT0= lichten aan, d.w.z. het begin van de lichtfase, ZT3= 3 uur na het begin van de lichtfase, enzovoort. ZT12= lichten uit.
    2. Breng twee mannetjesvliegen over van de een- of groepshuisvestingskamers door middel van de mondaspiratiemethode naar de agressie-arena door het gat in het deksel; Verplaats het gat onmiddellijk weg om ervoor te zorgen dat de vliegen niet kunnen ontsnappen.
    3. Laat de vliegen 1-2 minuten acclimatiseren in de arena. Start een timer voor 20 minuten. Video-opname van de vliegen gedurende de hele 20 minuten door een camera of een mobiele telefoon precies verticaal boven de arena te plaatsen met behulp van een standaard. Zorg ervoor dat de soorten agressieve aanvallen zichtbaar zijn in de video.
      NOTITIE: Zorg voor een duidelijke verlichting van de arena en voorkom verblinding/reflectie van het deksel die rechtstreeks op de lens van de camera valt.
    4. Herhaal het experiment voor 15-20 paren vliegen voor elk genotype en elk type huisvesting.
      OPMERKING: Onbewuste vooroordelen kunnen worden tenietgedaan door dubbele blindering van de controle- en testvliegen, evenals videobestanden die tot meerdere genotypen behoren.
  6. Analyse van de agressietestgegevens
    1. Breng de videobestanden over naar een computer met een voldoende groot scherm zodat de agressieve aanvallen zichtbaar zijn.
    2. Bekijk de video en tel het totaal aantal agressieve aanvallen in een tijdspanne van 20 min58,59.
    3. Verzamel en organiseer gegevens van elk genotype en elk huisvestingspatroon in een spreadsheet en voer gegevensanalyse uit met behulp van statistische software. Voer een tweezijdige t-toets uit en plot de gegevens als doos en snorharen.

2. Analyse van de sociale ruimte

OPMERKING: Het testprotocol, de arena en de analyse die hier worden beschreven, zijn eerder beschreven60,61.

  1. Voorbereiding van de arena voor de sociale ruimtetest (SSA)
    1. Plaats beide driehoekige acrylafstandhouders (hoogte = 8,9 cm, basis = 6,7 cm en dikte = 0,3 cm) plat op een rechthoekige ruit (13,5 cm x 10,4 cm, dikte 0,3 cm) zodat de rechte hoeken van de acrylafstandhouders zijn uitgelijnd met de hoeken van de ruit (Figuur 2A).
    2. Plaats twee rechthoekige acryl afstandhouders (6,7 cm x 1,5 cm, dikte = 0,3 cm) plat op de ruit, uitgelijnd met de basis van de twee driehoekige afstandhouders. Controleer na deze opstelling of de vier afstandhouders van acryl een driehoekige arena (~2,16 vierkante cm61) omringen op de rechthoekige ruit die niet wordt afgedekt door afstandhouders (Figuur 2A,B). Plak een sticker van een liniaal (Figuur 2C) op een van de driehoekige afstandhouders en zorg ervoor dat deze van bovenaf zichtbaar is.
    3. Plaats nu een tweede rechthoekige ruit (13,5 cm x 10,4 cm, dikte 0,3 cm) op de acrylafstandhouders zodat deze uitgelijnd is met de ruit aan de onderkant; Acryl afstandhouders zouden tussen de glasruimte komen te zitten, waardoor er een driehoekige ruimte in het midden tussen twee glasplaten overblijft. Gebruik vier kleine bindclips om de ruiten en afstandhouders vast te houden.
  2. Voorbereiding van de vliegen voor SSA
    1. Verzamel nieuw gesloten (0 tot 24 uur) vliegen van het gewenste genotype en scheid ze onder koude anesthesie met behulp van een stereomicroscoop.
      OPMERKING: Koel het koude anesthesieapparaat (er kan een petrischaal worden gebruikt) in een incubator van -20 °C. Plaats de vliegen in lege flesjes, dompel deze flesjes onder in ijs (in een ijsemmer) tot de vliegen onbeweeglijk worden, plaats ze op de koude petrischaal en begin met sorteren.
    2. Bewaar de mannetjes- en vrouwtjesvliegen 24 uur apart in voedselflesjes in een incubator van 25 °C met een licht/donkercyclus van 12 uur.
      OPMERKING: Voor de hier gedemonstreerde experimenten waren de gebruikte vliegstammen w1118 en FMR trans-heterozygote mutante vliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Uitvoeren van het SSA-experiment
    1. Handhaaf dezelfde experimentele omstandigheden als de agressietest (temperatuur: 24-25°C, vochtigheid ~ 50%) en voer het experiment uit tijdens het ZT0-ZT3-tijdvenster.
    2. Verwijder de bindklem rechtsonder en schuif die rechthoekige afstandhouder iets naar buiten zodat er een opening (~0,5 cm) ontstaat tussen de twee rechthoekige afstandhouders.
    3. Breng vliegen (verzameld op de vorige dag) over van de voedselflacon in een lege flacon. Breng ze over naar de arena van de sociale ruimte (het driehoekige gebied) door zachte aspiratie door de ruimte die tussen de rechthoekige afstandhouders is gecreëerd. Sluit de ruimte onmiddellijk af door de rechthoekige afstandhouder en bindclip terug te schuiven op hun plaats en zorg ervoor dat er geen ruimte overblijft voor de vliegen om te ontsnappen.
    4. Door de kamer rechtop te houden, stamp je de kamer voorzichtig 3x op een zacht kussentje om ervoor te zorgen dat alle vliegen zich aan het begin van het experiment aan de basis van de kamer bevinden.
    5. Klem de SSA-kamer rechtop en start de timer. Maak na 20 minuten een duidelijke foto van de arena wanneer de vliegen zich op hun posities in de arena vestigen en minimale beweging vertonen. Vermijd verblinding en onregelmatige verlichting.
    6. Herhaal het experiment 3x voor dezelfde populatie vliegen door de vliegen te beuken en de stappen van stap 2.3.5 tot en met 2.3.7 (interne replicaten) te herhalen. Herhaal 3x met een andere populatie vliegen van hetzelfde genotype/dezelfde aandoening (onafhankelijke herhalingen).
      NOTITIE: Vries de analysekamer in om de vliegen uit de kamer weg te gooien. Veeg de glazen en plastic oppervlakken af met ethanol om alle geuren te verwijderen nadat een experimenteerronde is gedaan met één groep vliegen.
  4. Analyse van de testgegevens van de sociale ruimte
    1. Analyseer de beelden in de ImageJ62-software en maak een lijst van de afstanden tussen de dichtstbijzijnde buren tussen de vliegen zoals eerder beschreven61.
    2. Voer statistische analyses uit en plot grafieken met behulp van statistische software.
      OPMERKING: De vliegstammen die werden gebruikt voor de SSA-test die hier wordt beschreven, waren w1118 en Fmr1 transheterozygote mutante vliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Fmr1-vliegen vertonen een aanzienlijk grotere afstand tot de dichtstbijzijnde buren (Figuur 2D).

3. Verkeringstest

  1. De verkeringskamer
    1. Monteer alle vier de stukken van de verkeringskamer (Figuur 3A) in elkaar in de volgorde die wordt weergegeven in Figuur 3B. Elke perforatie van de centrale schijf, ingeklemd tussen het deksel en de basisstukken, zal fungeren als de 'baltskamer' (Figuur 3C).
  2. Het verkrijgen van gepremateerde vrouwtjes
    1. Start en onderhoud meerdere kweekflessen CS (Canton S, wild type) vliegen met ~60-100 mannelijke en vrouwelijke vliegen in elke voedselfles.
    2. Wanneer volwassenen tevoorschijn komen, gooi dan alle volwassen vliegen weg en breng de vliegen die uit deze flessen komen elke 2-3 uur over naar nieuwe voedselflesjes aangevuld met een kleine hoeveelheid gistpasta.
      NOTITIE: Vermijd overbevolking van de injectieflacons. Zorg ervoor dat u geen oude vliegen, larven of poppen overbrengt naar de parende flacon.
    3. Incubeer deze "paringsflesjes" gedurende 4 dagen om er zeker van te zijn dat alle vrouwtjes hebben gepaard.
  3. Voorbereiding van buizen met één behuizing voor mannen
    1. Voeg bijna 500 μL vliegenvoer toe aan elk buisje van 2 ml microfuge. Gebruik een minicentrifugemachine om het voedsel naar het onderste deel van de buis te trekken.
    2. Laat het voedsel een nacht stollen, snijd het deksel van de microfuge-buis, bedek het met parafilm en perforeer de parafilm met een naald voor luchtcirculatie.
  4. Verzameling en isolatie van maagdelijke mannetjes
    1. Zet kruisingen op met 10-15 mannetjes en 20-30 maagdelijke vrouwtjes van de gewenste genotypen in aparte voedselflesjes.
    2. Verzamel maagdelijke mannetjes van de gewenste genotypen van het nageslacht en bewaar ze individueel in 'buizen met één behuizing' met behulp van de aspirator. Blijf elke 5-6 uur nieuw gesloten mannetjes verzamelen (tot 40-50 mannetjes voor elk genotype) en isoleer ze in individuele buizen met één behuizing.
    3. Sluit het deksel van de buis weer af met de parafilm.
  5. Het experiment met de verkeringstest uitvoeren
    1. Na 5 dagen isolatie van de testmannetjes, voert u de baltstest uit tijdens het ZT0-ZT3-tijdvenster.
    2. Stel de video-opnameapparaten ruim van tevoren in, met de nadruk op de testwerkruimte.
    3. Verzamel met behulp van een aspirator een voorgemat vrouwtje (6-10 dagen oud) uit de paringsflesjes en plaats het in een baltskamer.
    4. Breng met behulp van de aspirator voorzichtig een mannetje (controle-/testvlieg) over van de buis met één behuizing naar de baltskamer met het enkele voorgedekte vrouwtje door het transfergat. Draai het deksel snel om de kamer te sluiten.
    5. Video neem het gedrag van de vliegen op gedurende 15 minuten.
  6. Analyse en statistieken van videogegevens
    1. Breng de videobestanden over naar een computer; Noteer de tijdsduur die het mannetje gedurende 15 minuten in verkering doorbrengt door de video handmatig door te nemen.
    2. Bereken de baltsindex (BI) voor elke mannetjesvlieg, wat de fractie (of het percentage) is van de tijd die het mannetje besteedt aan het hof maken van het vrouwtje gedurende 15 minuten.
    3. Tel het totale aantal copulatiepogingen in 15 minuten.
    4. Let op de tijdsduur die het mannetje laat zien voordat het voor het eerst het hof probeert te maken, als de verkeringslatentie (CL).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 40-60 mannetjes per aandoening/genotype te analyseren om statistische kracht te bereiken en de consistentie van de CI-resultaten te bepalen.

4. Analyse van verzorgingsgedrag

  1. De arena van de gedragstest van het vlooien
    1. Gebruik een kleine ronde kamer met een volume van ~0,4cm3 als arena voor het vastleggen van het verzorgingsgedrag.
      OPMERKING: Dezelfde baltsarena die in sectie 3 wordt beschreven, kan worden gebruikt voor het testen van vlooigedrag.
    2. Aangezien verzorgingsgedrag bestaat uit het opnemen van bewegingen van fijnere organen zoals benen, moet u video-opnamen met een hoge resolutie of een hoog contrast gebruiken. Om dit protocol te volgen, gebruikt u een diffuus met glas bedekt LED-paneel als een gelijkmatig verlicht oppervlak met afmetingen van 20 cm x 20 cm. Plaats de baltskamer op het paneel om ervoor te zorgen dat het licht van de bodem door de kamer gaat.
  2. De vliegen voorbereiden voor het experiment
    1. Handhaaf experimentele genotypevliegen in voedselflessen bij 25 °C met een licht/donkercyclus van 12 uur.
    2. Verzamel nieuw gesloten (0 tot 24 uur) vliegen van het gewenste genotype en scheid ze onder koude anesthesie met behulp van een stereomicroscoop zoals beschreven in de sociale ruimtetest.
    3. Isoleer de mannetjesvliegen in buizen met één behuizing (zoals gebruikt in de agressietest) gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Voor het hier gedemonstreerde experiment waren de gebruikte vliegstammen: W1118 en FMR trans-heterozygote mutante vliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Uitvoeren van de verzorgingsgedragstest
    1. Handhaaf een temperatuur van 24-25 °C en vochtigheid ~ 50%; voer het experiment uit tijdens het ZT0-ZT3-tijdvenster16.
    2. Breng een mannetjesvlieg met één behuizing over van een buis met één behuizing naar de verzorgingsarena met behulp van een aspirator. Schuif het gat in het deksel direct weg om ervoor te zorgen dat de vliegen niet kunnen ontsnappen.
    3. Plaats de trimbak op een diffuus LED-paneel en laat de vlieg 1 minuut acclimatiseren in de arena. Video neem de vlieg gedurende 10 minuten op door de camera precies verticaal boven de arena te plaatsen die op een standaard is gemonteerd. Zorg ervoor dat de soorten verzorgingsaanvallen zichtbaar en kwantificeerbaar zijn in de video.
      OPMERKING: Het verzorgingsgedrag omvat wrijven van het hoofd, de ogen, de antennes, de borstkas, de buik, de geslachtsorganen en de vleugels met poten (eerste paar: T1, tweede paar: T2 of derde paar poten: T3). Grooming gedragsparameters waarmee in deze studie rekening is gehouden, zijn zoals beschreven in Andrew et al. 41 en aangetoond in figuur 4.
    4. Herhaal het experiment voor elk genotype.
    5. Analyse van de gegevens over het verzorgingsgedrag
      1. Analyseer de video's en bereken de volgende vier parameters: grooming Index (percentage van de tijd besteed aan verzorging); verzorgingslatentie (tijd tot de eerste verzorgingsperiode); nummer van de verzorgingswedstrijd; en de gemiddelde duur van de verzorgingsperiode (totale duur van de wedstrijd/aantal van de wedstrijd).
      2. Markeer een enkele verzorgingsperiode als voltooid wanneer een vlieg stopt met het vertonen van een van de parameters en 2 s onbeweeglijk blijft, of de aanval stopt en ten minste 4 stappen loopt.

5. Bepaling voor olfactorische gewenning

OPMERKING: Zoals weergegeven in figuur 5, moet de eindmontage worden uitgevoerd op de dag van Y-doolhoftest54,56.

  1. Vliegen voorbereiden op gewenning
    1. Kweek vliegen van de gewenste genotypen voor alle experimenten in een incubator met een omgevingstemperatuur van 25 °C en een luchtvochtigheid van 70% onder standaard 12 uur licht: 12 uur donkere cyclus (LD).
    2. Verzamel 0-12 uur oude, pas gesloten vliegen en breng ~30-40 vliegen over in een verse middelgrote fles met een vastgedraaide katoenen stop.
    3. Wijs codes toe aan elke fles om de onderzoeker blind te houden voor de genotypen waarmee wordt geëxperimenteerd.
  2. Inductie van olfactorische gewenning
    1. Doe 1 ml van de gewenste geurstof verdund met paraffine vloeistof (light) in een microfuge-tube van 1,5 ml. Gebruik voor de controle gewoon 1 ml paraffine vloeibaar licht in een microfuge-tube van 1,5 ml. Draai de inhoud gedurende 10 minuten in de buis om een gelijkmatige menging te garanderen en dek deze vervolgens af met gelijkmatig geperforeerde plasticfolie.
      OPMERKING: In de video wordt 20% ethylbutyraat gebruikt.
    2. Gebruik draad om de buizen met de verdunde geurstof of alleen de verdunningsvloeistof op te hangen in aparte mediaflessen met vliegen.
    3. Bedek de flessen goed met katoen en wikkel ze vervolgens in kraftpapier om diffusie van de geurdamp te voorkomen. Label de controle- en geurbevattende flessen als respectievelijk naïef en aan geur blootgesteld (gewend). Bewaar deze inductieflessen 3 dagen in een couveuse onder de bovengenoemde voorwaarden.
  3. Voorbereiding van vliegen en het Y-doolhofapparaat
    1. Breng de vliegen over van de inductieflessen naar injectieflacons met alleen met water doordrenkt filtreerpapier.
    2. Honger ze ongeveer 16-18 uur uit bij kamertemperatuur voorafgaand aan het experiment om de motivatie te vergroten.
    3. Zorg ervoor dat de onderdelen van het Y-doolhofapparaat schoon en geurvrij zijn; Monteer de vier delen op een verticale manier. Bevestig de klimkamers aan het Y-doolhof, dat vervolgens wordt aangesloten op de bovenkant van de adapter. Bevestig de bodem van het Y-doolhof stevig aan de instapflacon die dient als de centrale steel aan de onderkant, zoals weergegeven in afbeelding 5.
    4. Verbind het taps toelopende uiteinde van elke klimkamer met de reagensflessen met odorant (10-3 verdunning met gedestilleerd water) met behulp van geurvrije siliconenslangen.
    5. Pomp de geurstof met een gelijkmatig debiet (~120 ml/min) van de gasflessen naar de twee armen van de Y met behulp van een vacuümpomp en laat het 15 minuten verzadigen voor consistentie.
  4. Uitvoering van de klassieke Y-doolhoftest
    1. Introduceer de uitgehongerde vliegen van elke injectieflacon voorzichtig in de invoerflacon van de Y-doolhofopstelling.
    2. Laat ze een korte periode acclimatiseren; sluit de invoerflacon aan op de Y-doolhofadapter om de test te starten; en laat de vliegen in de armen van het Y-doolhof klimmen en vast komen te zitten in de twee verzamelkamers. Stel de tijdsduur van elke test in op 1 minuut.
    3. Tik na voltooiing de vliegen terug naar de bodem van de invoerflacon en verander de positie van de armen van het Y-doolhof om zijwaartse voorinspanning te voorkomen. Voer vier metingen uit voor dezelfde set vliegen.
    4. Noteer het aantal vliegen dat elk van de twee armen van het Y-doolhof beklimt binnen de tijdsduur.
    5. Herhaal de test voor ten minste 8 batches om een representatieve dataset te verkrijgen.
  5. Analyse en interpretatie van verzamelde gegevens
    1. Kwantificeer de resultaten door de Performance Index (PI) te berekenen, die kan worden weergegeven als het verschil tussen het aantal vliegen dat de luchtarm kiest (A) en het aantal vliegen dat de geurarm kiest (O) als een fractie van het totale aantal deelnemende vliegen.
    2. Gebruik statistische tests (ongepaarde Student's t-toets) om te controleren of de PI van naïeve versus aan geur blootgestelde vliegen significant is.

Resultaten

Agressie test
Als ASD-model voor vliegen zijn Fmr1-mutante vliegen63,64 gebruikt. w1118 mannetjes werden gebruikt als controle en Fmr1 trans-heterozygoot Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 mannetjes als experimentele vliegen; Volwassen mannetjes werden gedurende 5 dagen in isolatiebuizen gehuisvest. Homotypische mannetjes (zelfde genotype, zelfde huisvestingsomstandigheden) werden geïntroduceerd in de agressie-arena en hun gedrag werd gedurende 20 minuten geregistreerd. Het totale aantal agressieve aanvallen in 20 minuten werd geteld voor elk genotype. Het aantal agressieve aanvallen gedurende 20 minuten bleek significant verminderd te zijn in het geval van gemuteerde mannetjes dan in de controlemannetjes (Figuur 1E). Deze verminderde agressiviteit bij Fmr1-vliegen kan te wijten zijn aan verminderde interesse in sociale interactie met een andere vlieg. Daarentegen vertonen groeps-/sociaal gehuisveste Fmr1-mutante mannetjesvliegen vergelijkbare aantallen agressieaanvallen als die van sociaal gehuisveste w1118-vliegen (gegevens niet getoond), wat waarschijnlijk wijst op een positieve rol van de sociale omgeving bij de inductie van sociaal gedrag.

Sociale ruimte-test
De sociale ruimtetest werd uitgevoerd in w1118 en ASD-model (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M) vliegen. De afstand tot de dichtstbijzijnde buur werd voor elke vlieg berekend en voor elk genotype werden 10 biologische replicaten uitgevoerd. De gemuteerde vliegen vertonen significant grotere afstanden tot de dichtstbijzijnde buren dan de controle-tegenhangers (Figuur 2D), wat wijst op een voorkeur voor een grotere afstand tot andere vliegen.

Verkeringstest
De baltstest van mannetjesvliegen met één huis werd uitgevoerd om het aangeboren baltsgedrag van twee afzonderlijke ASS-modelvliegen te kwantificeren. Eerst werd het baltsgedrag van Fmr1 transheterozygote vliegen vergeleken met dat van w1118; Fmr1-vliegen vertoonden een significant lagere baltsindex en een verminderd aantal pogingen tot copulatie (Figuur 3E1). In een tweede experiment, rij, werd een Drosophila-ortholoog van het menselijke POGZ-gen (een veel voorkomend ASS-risicogen20), uitgeschakeld door een microRNA met een korte haarspeld tegen rij tot expressie te brengen in neuronen van het paddenstoelenlichaam met behulp van de MB247-GAL4-driverlijn. Deze row-knockdown ASD-modelvliegen werden getest op elk defect in het aangeboren baltspatroon; De verkeringsindex en het aantal pogingen tot copulatie werden berekend op basis van video's van 15 minuten. De rij knockdown vliegen vertoonden een significant verminderde baltsindex en tellingen van pogingen tot copulatie (Figuur 3E2), wat wijst op hun gebrekkige communicatie met vrouwtjes.

Grooming gedrag
Grooming-gedrag wordt gebruikt als uitlezing voor repetitief gedrag in Drosophila 16,42,43. Het verzorgingsgedrag werd gekwantificeerd in Fmr1 transheterozygote vliegen en vergeleken met dat van w1118. De latentie tot de eerste vachtverzorging is significant afgenomen bij Fmr1-vliegen, terwijl de gemiddelde duur van de vachtperiode en de vachtindex significant zijn verhoogd bij Fmr1-vliegen (Figuur 4C), wat wijst op verbeterd vlooigedrag (of repetitief) gedrag bij ASS-modelvliegen. Daarentegen bleek het totale aantal vlooien bij de gemuteerde vliegen niet significant te zijn veranderd in vergelijking met dat van controlevliegen.

Olfactorische gewenningstest
Gewenning blijkt defect te zijn bij een groot aantal autistische personen en het kan worden gebruikt als een test voor hetzelfde in Drosophila23. Hier werd olfactorische gewenning getest in het ASS-model door een rij neer te halen in olfactorische lokale interneuronen aangedreven door LN1-GAL4. Een aversieve geurstof, 20% ethylbutyraat, is in deze experimenten gebruikt om gewenning bij deze vliegen op te wekken. De resultaten laten zien dat row-knockdown vliegen niet gewend raakten na een 3-daagse blootstelling aan geurstof (de laatste twee balken in de grafiek in Figuur 5E laten geen significant verschil zien tussen naïeve versus gewende vliegen) in vergelijking met wildtype, vliegen die typische gewenning vertonen na blootstelling aan ethylbutyraat gedurende 3 dagen (blootgestelde vliegen vertonen een significante daling van de prestatie-index in vergelijking met naïeve vliegen). Dit geeft aan dat row-knockdown vliegen niet gewend raken na blootstelling aan ethylbutyraat gedurende 3 dagen en worden afgestoten door de weerzinwekkende geurstof, wat bewijst dat deze ASS-vliegen een gewenningstekort hebben.

figure-results-1
Figuur 1: Agressie-arena en representatieve gedragspatronen. (A) De opstelling van de agressie-arena in een plaat met 24 putjes en een geperforeerd deksel voor het betreden van vliegen. Inzet: Afmetingen van een enkele arena met vliegenvoer erin. (B) Foto van een buis met één behuizing met een enkele, geïsoleerde mannetjesvlieg en een flesje met groepshuisvesting met mannelijke en vrouwelijke vliegen, die een sociale omgeving recapituleert. (C) Een aspirator voor het overbrengen van vliegen via mondaspiratie. Items die nodig zijn voor het monteren van een vliegenzuiger, met vermelding van de zijkanten van de buis voor het binnendringen van vliegen (vlieguiteinde) en de kant die in de mond zou worden ingebracht (monduiteinde) (C1) en een gemonteerde vliegaspirator (C2). (D) Representatieve man-man agressieve gedragspatronen: benadering, vleugeldreiging, schermen, vasthouden, longeren, boksen en worstelen. (E) Fmr1 mutante mannetjesvliegen vertonen minder agressief gedrag ten opzichte van andere mannetjes in vergelijking met controles. Boxplot met het aantal agressieve aanvallen voor sociaal geïsoleerde mannetjes van w1118 (controle) versus Fmr1 transheterozygote vliegen (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Opstelling van de sociale ruimte-assay arena. (A) Diagram met de afmetingen en opstelling van glasplaten en acrylafstandhouders. (B) De uiteindelijke opstelling van de arena-componenten waarbij de acrylafstandhouders tussen de glasstukken zijn ingeklemd, waardoor er aan de onderkant een kleine opening overblijft voor het binnendringen van vliegen. De driehoekige ruimte die ontstaat tussen glasstukken en afstandhouders is de SSA-arena voor de vliegen, hier kunnen vliegen alleen in twee dimensies bewegen. (C) Foto van de uiteindelijke opstelling van de SSA-arena met vliegen in de kamer. Afkorting: SSA = social space array. (D) ASS-model (Fmr1 transheterozygote) vliegen vertonen een grotere afstand tot elkaar in de sociale ruimtetest in vergelijking met w1118. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Verkeringsarena en representatieve gedragspatronen. Diagrammen met (A) ontwerp en (B) opstelling van de schijven in een baltstestarena. (C) Foto van de baltsarena na de definitieve regeling. (D) Representatieve afbeeldingen die de verkeringsgedragspatronen van een naïef mannetje ten opzichte van een gedekt vrouwtje laten zien: jagen, oriëntatie, flikkeren van de vleugels, likken, poging tot copulatie en copulatie. (E) Grafieken met de baltsindex en het aantal pogingen tot copulatie in twee ASD-modellen: (E1) Fmr1-mutante vliegen vertonen een significante vermindering van de baltsindex en poging tot copulatie in vergelijking met w1118-controle . (E2) row knockdown-vliegen werden gebruikt als een ander ASS-model waarbij row-shRNA tot expressie werd gebracht in neuronen van paddenstoelen(MB247-GAL4); Een significante vermindering van het baltsgedrag werd waargenomen bij het neerhalen van de rij. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Opstelling van de arena en representatieve gedragspatronen van verzorgingsgedrag. (A) De schijf- of wielvormige arena (dezelfde baltsarena weergegeven in figuur 3) is opgesteld op een LED-paneel met een diffuser voor uniforme verlichting vanaf de onderkant en de video is van bovenaf vastgelegd. Dit zorgt voor een hoger contrast dat nodig is voor het identificeren van fijne bewegingen van aanhangsels tijdens het trimmen. (B) Foto's van verzorgingsgedragspatronen die zijn waargenomen bij volwassen mannelijke vliegen. T1 = 1paar poten, T2 = 2e paar poten, T3 = derde paar poten. Intuïtieve verkorte nomenclatuur wordt gebruikt voor verzorgingspatronen in B: T1-hoofd = hoofd gewreven met de eerste poten; T1-T1 = eerste paar benen tegen elkaar gewreven, enzovoort. Afkorting: LED = light-emitting diode. (C) Grafieken met de resultaten van de vachttest uitgevoerd bij Fmr1 transheterozygote vliegen en vergeleken met w1118. Fmr1-mutante vliegen vertoonden een significant verminderde latentie voor de eerste verzorgingsperiode, wat wijst op een vroege start van de vachtverzorging in vergelijking met de controlegroep. Bovendien waren de gemiddelde duur van de vachtperiode en de vlooienindex significant verhoogd bij Fmr1-mutanten , wat wijst op verbeterd repetitief gedrag bij ASS-modelvliegen. Daarentegen was het totale aantal vlooien niet significant veranderd bij de gemuteerde vliegen in vergelijking met de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Inductie- en testopstelling voor olfactorische gewenning en representatief resultaat na de test. (A) Componenten van de binaire geurkeuzetestopstelling: (A1) het Y-doolhof, (A2) de adapter, (A3) de opstelling van deze twee, (A4) een paar verzamelbuisjes voor bevestiging aan de bovenkant van de Y-doolhofarmen, (A5) de glazen fles en glazen buisjes voor het bewaren van de geuroplossing of het water waardoor lucht zal borrelen voordat het naar het Y-doolhof gaat. (B) Opstelling van de vliegvoedselfles voor inductie van olfactorische gewenning; cartoondiagram (B1) laat zien hoe de geurstofhoudende microfuge-buis halverwege de fles aan een koperdraad wordt gehangen; (B2) ten slotte wordt de opening van de fles afgedekt met katoen en verzegeld met bruine papieren enveloppen. (C) Foto van de totale opstelling van de Y-doolhofopstelling. (D) Foto's van de verspreiding van vliegen in verzamelkamers na afloop van een experiment. (D1) Naïeve vliegen (alleen blootgesteld aan geurloze paraffine, controle) vertonen afkeer van de aversieve geurstof (20% ethylbutyraat gebruikt voor inductie van gewenning in deze studie) en kiezen in de arm van het Y-doolhof gevuld met gewone lucht, terwijl (D2) blootgestelde (gewone) vliegen gelijkmatig over beide armen verdelen. Afkorting: ID = inwendige diameter. (E) Olfactorische gewenningstestresultaten van row-knockdown vliegen vertoonden een gewenningsdefect. Vliegen van het wilde type (Canton S) vertoonden na 3 dagen blootstelling aan ethylbutyraat een significante vermindering van de prestatie-index in vergelijking met naïeve vliegen, wat wijst op gewenning. Wanneer nakomelingen van LN1-GAL4 x row-shRNA-vliegen gedurende 3 dagen werden blootgesteld, bleek de prestatie-index niet significant te verschillen van die van naïeve vliegen; dit toont aan dat deze row-knockdown-vliegen niet gewend raakten aan 3-daagse blootstelling aan geurstof, wat een menselijk ASS-achtig symptoom recapituleert. Afkortingen: ASS = autisme spectrum stoornis; shRNA = kort haarspeld-RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Drosophila wordt gebruikt als een fijn modelorganisme voor onderzoek naar menselijke neurologische aandoeningen vanwege een hoge mate van conservering van gensequenties tussen vlieg- en menselijke ziektegenen9. Talrijke robuuste gedragsparadigma's maken het een aantrekkelijk model voor het bestuderen van fenotypes die zich manifesteren in mutanten die menselijke ziekten recapituleren. Aangezien honderden genen betrokken zijn bij autismespectrumstoornis (ASS), bestaat er geen gemeenschappelijk ASS-model in een modelorganisme. Daarom moeten onderzoekers voor elke mutant eerst ASS-achtige fenotypes in de vlieg vaststellen. In dit artikel hebben we geprobeerd het proces te stroomlijnen door het gebruik van vijf vlieggedragsparadigma's in overleg voor een dergelijke beoordeling voor te stellen. Deze paradigma's worden bij vliegen gebruikt om belangrijke en vaak voorkomende gedragsstoornissen van menselijke ASS-patiënten te beoordelen: sociale en communicatiestoornissen, verbetering van repetitief gedrag en een gewenningsdefect. Als een mutatie in het vliegengen defecten vertoont in alle of de meeste van deze vijf paradigma's, kan dit een sterke aanwijzing zijn voor een ASS-achtig scenario.

De meeste van de hier beschreven gedragsparadigma's zijn in eerdere literatuur meerdere keren gebruikt voor het oplossen van uiteenlopende onderzoeksvragen. Het is niet ongebruikelijk om variaties in de technieken te vinden tussen verschillende onderzoeken. De aanpassingen in de technieken zijn gemaakt om aan te sluiten bij de onderzoeksbehoefte en om te voldoen aan de vraag van de specifieke vraag die wordt opgelost. In de verkeringstest kan bijvoorbeeld zowel aangeboren als aangeleerd baltsgedrag worden gekwantificeerd ten opzichte van een testvlieg die een onvolwassen mannetjevan 65 kan zijn, een maagdelijk vrouwtje66,67, een voorgedekt vrouwtje 68,69,70, een door bevriezing gedode maagdelijke vrouw van 65, of zelfs een onthoofd vrouwtje19. In de methode die in dit artikel wordt beschreven, zijn wildtype voorgedekte vrouwtjes gebruikt als tester om het baltspatroon van een mannelijke ASS-modelvlieg te controleren. De suitwendige ontvankelijkheid van een voorgedekt vrouwtje is relatief lager dan die van een maagdelijke vlieg71. Als gevolg hiervan zijn het aantal mannelijke verkeringsperiodes en hun duur meer in de richting van een gedekt vrouwtje dan in de richting van een maagd; Evenzo is de latentie tot copulatie ook langer dan die van maagdelijke testervrouwtjes, in welk geval vroege copulatie leidt tot een verminderde verkeringsindex, waardoor de ruimte voor effectieve vergelijking tussen genotypen wordt verkleind. Daarom biedt het gebruik van een gepremateerd vrouwtje als tester een betere vergelijkende analyse van het baltsgedrag van een ASS-vlieg versus een wildtype vlieg. Aan de andere kant kan het gebruik van maagdelijke vrouwtjes aanvullende informatie opleveren die kan worden gemaskeerd wanneer gedekte vrouwtjes worden gebruikt. Het gebruik van gedekte vrouwtjes kan ook het baltsgedrag van mannetjes beïnvloeden en veranderen. Kortom, er wordt gesuggereerd dat onderzoekers hun experimentele strategie en detail kiezen, afhankelijk van de noodzaak van het specifieke experiment.

Men moet hier voorzichtig zijn voordat men de techniek toepast in een of alle vlieghomologen van ASS-genen. Al deze gedragsparadigma's worden gereguleerd door een specifiek en klein aantal neuronen. De expressie van een bepaald gen moet eerst worden vastgesteld voordat wordt overgegaan tot een specifiek gedragsparadigma. Als de vlieghomoloog van een ASS-geassocieerd gen bijvoorbeeld niet tot expressie wordt gebracht in lichaamsneuronen van paddenstoelen of glutamaterge neuronen, dan worden verkerings- en verzorgingsgedrag mogelijk niet beïnvloed bij de mutant.

Een ander punt waar onderzoekers voorzichtig mee moeten zijn, is dat het ontbreken van een defect niet altijd betekent dat de mutatie geen rol speelt. Bijvoorbeeld, in de experimenten met vlooiengedrag met Fmr1-mutanten is het totale aantal vlooien niet significant lager bij mutanten dan bij controles, terwijl andere parameters zoals vlooienindex, enz. een defect in vlooiengedrag aantonen. Dit kan worden verklaard door de verlenging van elke verzorgingsperiode bij Fmr1-mutanten , wat resulteert in een laag aantal van de totale aanval, ondanks dat de totale duur van de aanval veel hoger is. Dit benadrukt de noodzaak van kwantificering van meerdere parameters voor elk gedragspatroon. Bovendien moet eraan worden herinnerd dat de term ASS een breed scala aan ziekten omvat die worden veroorzaakt door variaties in een van de honderden genen, wat resulteert in heterogene fenotypes met verschillende gradaties van penetrantie onder de getroffen individuen. Een gewenningstekort wordt bijvoorbeeld bij sommige patiënten waargenomen, maar niet bij alle. Hetzelfde zou worden verwacht in vliegmodellen van de ziekte.

Voor de analyse van agressief gedrag werd in deze studie rekening gehouden met verschillende soorten agressieve parameters: longeren, vleugeldreiging, worstelen, enz. (Figuur 1)30. Elke wedstrijd moet worden geïdentificeerd en geteld als een individueel type wedstrijd of als een totaal aantal wedstrijden. Het is belangrijk om eerst kennis te maken met de agressiepatronen van mannetjesvliegen, die zijn beschreven in 59,72 en weergegeven in Figuur 1. Bij het tellen van agressieve aanvalsnummers moeten het begin- en eindpunt van een enkele agressie-gebeurtenis duidelijk worden geïdentificeerd; Meerdere soorten agressiepatronen kunnen worden getoond binnen een enkele wedstrijd, gevolgd door het einde van de wedstrijd. Een agressieaanval wordt als voorbij beschouwd wanneer een vlieg ofwel stopt met het vertonen van agressief gedrag of beweging gedurende 2 seconden of de aanval stopt en begint weg te lopen.

De meeste van deze gedragsparadigma's hebben meerdere variaties en ontwikkelingen die door meerdere laboratoria zijn beschreven. Elk van de specifieke aanpassingen was gemaakt om te voldoen aan de behoeften van een specifiek doel. Evenzo hebben geautomatiseerde en op algoritmen gebaseerde kwantificerings- of analysetechnieken deze technieken bevrijd van de kans op handmatige fouten. In dit artikel zijn de meest basale technieken gedemonstreerd met de minste materiaalvereisten, in de hoop dat deze technieken gemakkelijk kunnen worden overgenomen en gebruikt door een maximaal aantal onderzoekers.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

We zijn Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) en Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) enorm dankbaar voor de opstelling van de gewennings- en geurkeuzetest, Pavan Agrawal (MAHE) voor zijn waardevolle suggesties voor de agressietest, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) voor het delen van zijn prototype van de verkeringstestkamer en Fmr1-mutantenvlieglijnen, en Gaurav Das (NCCS, Pune) voor het delen van de MB247-GAL4-lijn. We danken Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, VS), National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Japan), Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, India) en National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, India) voor Drosophila-lijnen. Het werk in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van SERB-DST (ECR/2017/002963) aan AD, DBT Ramalingaswami-fellowship toegekend aan AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) en institutionele steun van IIT Kharagpur, India. SD en SM ontvangen Ph.D. beurzen van CSIR-Senior Research Fellowship; PM ontvangt een Ph.D. fellowship van MHRD, India.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aggression arena:
Standaard 24-wellplaat gemaakt van transparant polystyreen12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter van een enkele well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; diepte = 1 cm
Transparante plastic/acrylplaatAlternatief: een geperforeerd deksel van een celkweekplaat
Social Space Assay:
Binderclips19 mm
Glas- en acrylplaten van aangepaste matenDikte = 5 mm
Courtship assay:
Moer en bout met schroefdraad
Perspexplaten van aangepaste vormeni) Deksel: Een op maat gemaakte ronde transparante Perspex-schijf (2-3 mm dikte, 70 mm diameter) met een laadgat in de perifere regio en een tweede schroefgat in het midden (diameter ~ 3 mm voor elk); ii) Een tweede transparante dikkere Perspex-schijf (3-4 mm dikte, 70 mm diameter), met 6-8 perforaties met een diameter van 15 mm, gelijkmatig verdeeld vanaf het centrum; iii) Basis: Hetzelfde als het deksel, behalve zonder het laadgat
Grooming assay:
Diffuus met glas bedekte LED-paneel10–15-Watt plafondmontage LED-paneel
Habituatie en Y-labyrint assay
Klimkamersx2, Borosilicaatglas
Adapter voor het aansluiten van Y-labyrint met invoerviaalPerspex, op maat gemaakt, metingen in Figuur 5A
Duidelijke reagentiaflesjesBorosil #1500017
GaswasstopperBorosil #1761021
GlasbuisjeOD= 25 mm x Hoogte= 85 mm; Borosilicaatglas
Geurmiddel (Ethyl Butyraat)Merck #E15701
Paraffinewas (vloeibaar) lichtSRL #18211
RollerklemmenPolymed #14098
Siliconen buizenOD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; rollerklemmen voor stroomcontrole
VacuümpompHana #HN-648 (Elke aquariumpomp met manuele stroomrichtingsomkering)
Y-labyrintBorosilicaatglas
Y-vormige glazen buis (borosilicaatglas)Op maat gemaakt, metingen in Figuur 5A
Algemene items:
Elke software voor videoweergave (bijv. VLC media player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer voor videogegevensanalyse
VliegblikjesOD= 60 mm x Hoogte= 140 mm; glas/polypropyleen
VliegbuisjesOD= 25 mm x Hoogte= 85 mm; Borosilicaatglas
Graph-pad Prism-softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ-softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer
Videocamera met videorecorder-setupEen camcorder of een mobiele telefooncamera zal werken
Voor Fly Aspirator:
KatoenAbsorbeerbaar, geautoclaveerd
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipettipjes200 µL of 1000 µL, kies afhankelijk van de buitendiameter van de siliconenbuis
Siliconen/rubberbuislengte= 30-50 cm. De buis moet geurloos zijn
Samenstelling van vliegvoer:
Ingrediënten (hoeveelheid voor 1 L voer)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Maïsmeel (80 g)Organisch, lokaal betrokken
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionzuur (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoaat) (1,25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Gistpoeder (10 g)HIMEDIA # RM027
Vlieglijnen gebruikt in de experimenten in deze studie:
Wild type (Canton S of CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971

Referenties

  1. American Psychiatric Association. American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , Am. Psychiatr. Publ. Inc. (2013).
  2. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778(2022).
  3. Lordan, R., Storni, C., De Benedictis, C. A. Autism spectrum disorders: diagnosis and treatment. Autism Spectr Disord. , Exon Publications. (2021).
  4. Horev, G., et al. Dosage-dependent phenotypes in models of 16p11.2 lesions found in autism. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 17076-17081 (2011).
  5. Bey, A. L., Jiang, Y. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol. 66 (1), 1(2014).
  6. Fetit, R., Price, D. J., Lawrie, S. M., Johnstone, M. Understanding the clinical manifestations of 16p11.2 deletion syndrome: a series of developmental case reports in children. Psychiatr Genet. 30 (5), 136-140 (2020).
  7. Nicolini, C., Fahnestock, M. The valproic acid-induced rodent model of autism. Exp Neurol. 299, 217-227 (2018).
  8. Tartaglione, A. M., Schiavi, S., Calamandrei, G., Trezza, V. Prenatal valproate in rodents as a tool to understand the neural underpinnings of social dysfunctions in autism spectrum disorder. Neuropharmacology. 159, 107477(2019).
  9. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophilamelanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  10. Coll-Tane, M., Krebbers, A., Castells-Nobau, A., Zweier, C., Schenck, A. Intellectual disability and autism spectrum disorders "on the fly": Insights from Drosophila. DMM Dis Model Mech. 12 (5), 1-16 (2019).
  11. Tian, Y., Zhang, Z. C., Han, J. Drosophila studies on autism spectrum disorders. Neurosci Bull. 33 (6), 737-746 (2017).
  12. Ueoka, I., Pham, H. T. N., Matsumoto, K., Yamaguchi, M. Autism spectrum disorder-related syndromes: Modeling with Drosophila and rodents. Int J Mol Sci. 20 (17), 1-24 (2019).
  13. Yost, R. T., et al. Abnormal social interactions in a Drosophila mutant of an autism candidate gene: Neuroligin 3. Int J Mol Sci. 21 (13), 1-20 (2020).
  14. Wise, A., et al. Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurogenet. 29 (2-3), 135-143 (2015).
  15. Koemans, T. S., et al. Functional convergence of histone methyltransferases EHMT1 and KMT2C involved in intellectual disability and autism spectrum disorder. PLoS Genet. 13 (10), e1006864(2017).
  16. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated levels of the vesicular monoamine transporter and a novel repetitive behavior in the Drosophila model of fragile X syndrome. PLoS One. 6 (11), e27100(2011).
  17. Iyer, J., et al. Pervasive genetic interactions modulate neurodevelopmental defects of the autism-associated 16p11.2 deletion in Drosophilamelanogaster. Nat Commun. 9 (1), 1-19 (2018).
  18. Palacios-Muñoz, A., et al. Mutations in trpγ, the homologue of TRPC6 autism candidate gene, causes autism-like behavioral deficits in Drosophila. Mol Psychiatry. 27 (8), 3328-3342 (2022).
  19. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  20. Stessman, H. A. F., et al. Disruption of POGZ is associated with intellectual disability and autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 98 (3), 541-552 (2016).
  21. Hope, K. A., et al. The Drosophila gene sulfateless modulates autism-like behaviors. Front Genet. 10, 574(2019).
  22. Stessman, H. A. F., et al. Targeted sequencing identifies 91 neurodevelopmental-disorder risk genes with autism and developmental-disability biases. Nat Genet. 49 (4), 515-526 (2017).
  23. Fenckova, M., et al. Habituation learning is a widely affected mechanism in Drosophila models of intellectual disability and autism spectrum disorders. Biol Psychiatry. 86 (4), 294-305 (2019).
  24. Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and "loser" effect formation in Drosophilamelanogaster. Learn Mem. 22 (2), 64-68 (2015).
  25. Anderson, D. J. Circuit modules linking internal states and social behaviour in flies and mice. Nat Rev Neurosci. 17 (11), 692-704 (2016).
  26. Flanigan, M. E., Russo, S. J. Recent advances in the study of aggression. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 241-244 (2018).
  27. Sun, Y., et al. Social attraction in Drosophila is regulated by the mushroom body and serotonergic system. Nat Commun. 11 (1), 1-14 (2020).
  28. Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12342-12347 (2004).
  29. Kravitz, E. A., Fernandez, M. delaP. Aggression in Drosophila. Behav Neurosci. 129 (5), 549-563 (2015).
  30. Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (8), 5664-5668 (2002).
  31. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly (Austin). 6 (1), 35-48 (2012).
  32. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J Vis Exp. (2), e155(2007).
  33. Agrawal, P., Kao, D., Chung, P., Looger, L. L. The neuropeptide Drosulfakinin regulates social isolation-induced aggression in Drosophila. J Exp Biol. 223 (2), 207407(2020).
  34. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5657-5663 (2008).
  35. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: Measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11 (2), 243-252 (2012).
  36. Corthals, K., et al. Neuroligins Nlg2 and Nlg4 affect social behavior in Drosophilamelanogaster. Front Psychiatry. 8, 113(2017).
  37. Cao, H., Tang, J., Liu, Q., Huang, J., Xu, R. Autism-like behaviors regulated by the serotonin receptor 5-HT2B in the dorsal fan-shaped body neurons of Drosophilamelanogaster. Eur J Med Res. 27 (1), 1-15 (2022).
  38. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophilamelanogaster behavior - A new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  39. Shilpa, O., Anupama, K. P., Antony, A., Gurushankara, H. P. Lead (Pb)-induced oxidative stress mediates sex-specific autistic-like behaviour in Drosophilamelanogaster. Mol Neurobiol. 58 (12), 6378-6393 (2021).
  40. Dockendorff, T. C., et al. Drosophila lacking dfmr1 activity show defects in crcadian output and fail to maintain courtship interest. Neuron. 34 (6), 973-984 (2002).
  41. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  42. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. (125), e55231(2017).
  43. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).
  44. Webb, S. J., et al. Toddlers with elevated autism symptoms show slowed habituation to faces. Child Neuropsychol. 16 (3), 255-278 (2010).
  45. Kleinhans, N. M., et al. Reduced neural habituation in the amygdala and social impairments in autism spectrum disorders. Am J Psychiatry. 166 (4), 467-475 (2009).
  46. Ethridge, L. E., et al. Reduced habituation of auditory evoked potentials indicate cortical hyper-excitability in Fragile X Syndrome. Transl Psychiatry. 6 (4), e787-e787 (2016).
  47. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neurosci Biobehav Rev. 80, 286-305 (2017).
  48. Kuiper, M. W. M., Verhoeven, E. W. M., Geurts, H. M. Stop making noise! Auditory sensitivity in adults with an autism spectrum disorder diagnosis: physiological habituation and subjective detection thresholds. J Autism Dev Disord. 49 (5), 2116-2128 (2019).
  49. McDiarmid, T. A., et al. Systematic phenomics analysis of autism-associated genes reveals parallel networks underlying reversible impairments in habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 656-667 (2020).
  50. Lyons-Warren, A. M., Herman, I., Hunt, P. J., Arenkiel, B. A systematic-review of olfactory deficits in neurodevelopmental disorders: From mouse to human. Neurosci Biobehav Rev. 125, 110-121 (2021).
  51. Kepler, L. D., McDiarmid, T. A., Rankin, C. H. Habituation in high-throughput genetic model organisms as a tool to investigate the mechanisms of neurodevelopmental disorders. Neurobiol Learn Mem. 171, 107208(2020).
  52. Huang, T. N., Yen, T. L., Qiu, L. R., Chuang, H. C., Lerch, J. P., Hsueh, Y. P. Haploinsufficiency of autism causative gene Tbr1 impairs olfactory discrimination and neuronal activation of the olfactory system in mice. Mol Autism. 10 (1), 1-16 (2019).
  53. Twick, I., Lee, J. A., Ramaswami, M. Chapter 1 - Olfactory habituation in Drosophila-odor encoding and its plasticity in the antennal lobe. Prog Brain Res. 208, 3-38 (2014).
  54. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (36), E646-E654 (2011).
  55. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  56. Ayyub, C., Paranjape, J., Rodrigues, V., Siddiqi, O. Genetics of olfactory behavior in Drosophilamelanogaster. J Neurogenet. 6 (4), 243-262 (1990).
  57. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  58. Fernandez, M. P., Trannoy, S., Certel, S. J. Fighting flies: quantifying and analyzing Drosophila aggression. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 107985(2023).
  59. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  60. Simon, A. F., et al. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181 (2), 525-541 (2008).
  61. McNeil, A. R., et al. Conditions affecting social space in Drosophilamelanogaster. J Vis Exp. (105), e53242(2015).
  62. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  63. Drozd, M., Bardoni, B., Capovilla, M. Modeling Fragile X Syndrome in Drosophila. Front Mol Neurosci. 11, 124(2018).
  64. Trajković, J., et al. Drosophilamelanogaster as a model to study Fragile X-associated disorders. Genes (Basel). 14 (1), 87(2022).
  65. Gailey, D. A., Jackson, F. R., Siegel, R. W. Male courtship in Drosophila: the conditioned response to immature males and its genetic control. Genetics. 102 (4), 771-782 (1982).
  66. Cannon, R. J. C. Drosophila courtship behaviour. Courtship and Mate-finding Insects. , 1-13 (2023).
  67. von Philipsborn, A. C., Shohat-Ophir, G., Rezaval, C. Single-pair courtship and competition assays in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (7), 450-459 (2023).
  68. Keleman, K., Krüttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  69. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. J Vis Exp. (124), e55808(2017).
  70. Fitzsimons, H. L., Scott, M. J. Genetic modulation of Rpd3 expression impairs long-term courtship memory in Drosophila. PLoS One. 6 (12), e29171(2011).
  71. Kubli, E. My favorite molecule. The sex-peptide. BioEssays. 14 (11), 779-784 (1992).
  72. Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophilamelanogaster. Nat Protoc. 2 (11), 2712-2718 (2007).

Herprints en machtigingen

Tags

Drosophila-autisme-modelgedragsparadigma'ssociale ruimte-assayagressie-assayhofmakerijgedragpoetsgedraghabituatie-assayneuro-ontwikkelingsstoornissengene knockdownrepetitief gedrag
Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.