Basement Membrane Matrix Ingekapselde Celaggregatie voor het onderzoeken van de vorming van miltweefsel bij muizen

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste basaalmembraanmatrix. Basale membraanmatrixconstructies kunnen worden gebruikt in driedimensionale kweek voor het bestuderen van de ontwikkeling van organoïden, of voor in vivo transplantatie- en weefselregeneratiestudies.

Abstract

De milt is een immuunorgaan dat een sleutelrol speelt bij door bloed overgedragen immuunresponsen. Het anatomische of functionele verlies van dit weefsel verhoogt de vatbaarheid voor ernstige bloedinfecties en sepsis. Autotransplantatie van miltplakken is klinisch gebruikt om verloren weefsel te vervangen en de immuunfunctie te herstellen. Het mechanisme dat robuuste en immunologisch functionele miltweefselregeneratie aandrijft, is echter niet volledig opgehelderd. Hier willen we een methode ontwikkelen voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste matrix om de cellulaire vereisten voor de vorming van miltweefsel te onderzoeken. Ingekapselde celconstructies met basale membraanmatrix zijn geschikt voor zowel in vitro weefselkweek van driedimensionale organoïden als transplantatie onder het nierkapsel om de weefselvorming in vivo direct te beoordelen. Door de inputcellen te manipuleren voor aggregatie en inkapseling, tonen we aan dat graft-afgeleide PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- neonatale stromale cellen nodig zijn voor de regeneratie van miltweefsel onder diertransplantatiemodellen.

Introduction

Traumatische ruptuur van de milt en het verschijnen van meerdere miltknobbeltjes in het lichaam was een van de eerste aanwijzingen dat miltweefsel regeneratief vermogen had ^1,2. Automatische milttransplantaties werden later in de kliniek geïntroduceerd om miltweefsel te behouden bij patiënten die een spoedsplenectomie nodig hadden³. Maar ondanks het feit dat het al tientallen jaren deel uitmaakt van de klinische praktijk, is er heel weinig bekend over hoe de milt regenereert. Diertransplantatiemodellen hebben inzicht gegeven in meerdere parameters van miltregeneratie en immuunfunctie ^4,5. Met name experimentele wijzigingen in de methode voor de voorbereiding van het transplantaat hebben het mogelijk gemaakt weefselregeneratie gedetailleerder te bestuderen op cellulair en moleculair niveau.

Transplantaties waarbij hele miltplakken betrokken zijn, ondergaan een fase van massale necrose voordat een nieuwe miltstructuur wordt herbouwd⁶. De beginfase van transplantaatnecrose suggereert dat het grootste deel van het getransplanteerde weefsel grotendeels bestaat uit rode en witte bloedcellen en niet nodig is voor miltregeneratie. Dit werd experimenteel onderzocht door hematopoëtische cellen uit milttransplantaten uit te sluiten vóór transplantatie onder het nierkapsel van de muis. Hier bleek de niet-leukocyten/niet-erytrocytenfractie van de milt, die stromale en endotheelcellen omvat, voldoende te zijn om de novo weefselvorming te induceren⁷. Milt stromaal weefsel zou verder kunnen worden verwerkt tot een eencellige suspensie, waardoor het gebruik van celsorteertechnologieën mogelijk wordt om de samenstelling van cellulaire transplantaten te manipuleren. Door selectief kandidaat-celtypen te verwijderen, werden twee CD45-TER-119-stromale celpopulaties geïdentificeerd die onmisbaar waren voor de ontwikkeling van transplantaten: een endotheelachtige CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ celpopulatie en een breder gedefinieerde PDGFRβ⁺ mesenchymale celpopulatie⁸.

De constructie van transplantaten uit miltcellen varieert in termen van ondersteuningsmaterialen en celbelastingsprocessen. Weefselgemanipuleerde milten zijn eerder bereid door milteenheden op een polyglycolzuur/poly-L melkzuurpolymeersteiger ^5,9 te laden. Interessant is dat stromale cellen van de milt die in een collageenspons werden geabsorbeerd, er niet in slaagden om te implanteren, terwijl stromale cellen die werden geaggregeerd en over een collageenvel werden geladen,^{de regeneratie van} de milt vergemakkelijkten. Het is ook aangetoond dat de resuspensie van stromale cellen in een Matrigel-matrix celaggregatie induceert onder driedimensionale kweekomstandigheden¹⁰. Deze methode is echter niet getest voor gebruik in transplantatiemodellen. Het algemene doel van het huidige protocol is om stromale cellen van de milt rechtstreeks in de basale membraanmatrix te aggregeren en in te kapselen, die vervolgens kunnen worden overgebracht naar een driedimensionaal in vitro weefselkweeksysteem of kunnen worden gebruikt als voertuig voor transplantaties van diermodellen (aanvullende figuur 1).

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens experimentele protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Queensland (UQBR/079/19).

1. Weefselafname en voorbereiding van stromale cellen

1. Euthanaseer 0,5-1,5 dag oude mannelijke en/of vrouwelijke BALB/c neonatale donormuizen door onderkoeling op te wekken door dieren in het tissuepapier te wikkelen en ze gedurende >10 minuten onder gemalen ijs te plaatsen.
   OPMERKING: Dit protocol kan worden aangepast aan verschillende muizenstammen, leeftijden en het aantal dieren.
2. Bereid steriele chirurgische instrumenten voor.
3. Leg de muis in een rechter zijwaartse positie. Veeg de huid af met 80% ethanol en maak een incisie van 1 cm met een chirurgische Irisschaar om de peritoneale wand bloot te leggen.
4. Maak een tweede incisie van 0,5 cm boven de milt en gebruik een fijne pincet om het weefsel voorzichtig op te tillen. Gebruik een chirurgische schaar om de bloedvaten door te knippen en het weefsel weg te snijden. Breng het weefsel over in een petrischaal met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder eventueel achtergebleven bindweefsel dat aan de milt vastzit.
   OPMERKING: Een stereomicroscoop kan helpen bij fijne motorische bewegingen die nodig zijn voor het manipuleren van chirurgische instrumenten.
5. Om hele weefsels te dissociëren, brengt u neonatale milten (pools van 10 of minder) over in de binnenrand van een omgekeerde conische buisdop van 14 ml. Verstoor weefsels mechanisch met een drukkende beweging met behulp van de plastic achterkant van een spuitzuiger van 1 ml.
6. Plaats en zet de dop stevig vast over een conische buis van 14 ml met 10 ml koude PBS. Keer de buis 5x om om al het verstoorde weefsel van de dop in de buis te wassen.
7. Herhaal stap 1.6 voor eventueel achtergebleven weefsel.
8. Laat de buis 1 minuut op ijs staan om het weefsel naar de bodem van de buis te laten zakken.
9. Gooi het supernatans (dat hematopoëtische cellen bevat) voorzichtig weg door de oplossing door een omkeerbare celzeef van 70 μm te leiden.
10. Herstel de niet-oplosbare stromale fractie door de zeef om te keren en stromaal weefsel terug te wassen in de conische buis van 14 ml met vers bereide 2 ml aangevuld Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) met 1 mg/ml Collagenase IV, 40 μg/ml DNase I en 2% foetaal runderserum (FBS).
    LET OP: Collagenase IV en Collagenase D zijn gevaarlijke stoffen en moeten worden gehanteerd in een bioveiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
11. Om een eencellige suspensie te bereiden, wordt het samengevoegde weefsel (tot 20) gedurende 10 minuten bij 37 °C met constante rotatie enzymatisch verteerd.
12. Voeg 4 ml vers bereide sDMEM met 1 mg/ml collagenase D, 40 μg/ml DNase I en 2% FBS rechtstreeks toe aan de buis met stromaal weefsel. Incubeer nog eens 10 minuten bij 37 °C met constante rotatie.
13. Stop de spijsvertering door 8 ml ijskoude PBS toe te voegen. Verzamel de cellen door te centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
14. Gooi het supernatant weg en was de cellen tweemaal door ze te resuspenderen in 1 ml koud PBS en gedurende 5 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 200 x g . Houd cellen op ijs.
    OPMERKING: Cellen kunnen worden geteld en aangepast aan een gewenste concentratie. Dit kan optimalisatie vereisen voor verschillende celpopulaties. Met behulp van dit protocol worden doorgaans 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ stromale cellen/milt hersteld, afhankelijk van de leeftijd van donormuizen. Cellen kunnen optioneel worden gekleurd en FACS kunnen in dit stadium worden gesorteerd om de celsamenstelling te bepalen.

2. Matrixinkapseling van celaggregaten

1. Koel steriele P200-pipetpunten voor in een vriezer van -20 °C.
2. Snijd flexibele laboratoriumfolie (bijv. Parafilm) in stukken van 1 cm x 2 cm en steriliseer door onderdompeling in 80% ethanol gedurende 10 minuten, gevolgd door PBS gedurende 10 minuten. Laboratoriumfilm kan van tevoren worden voorbereid en steriel worden bewaard.
3. Bereid 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ cellen door te centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op, zodat er ongeveer 20 μL van het resterende PBS-volume overblijft. Bewaar de celpellet op ijs.
   NOTITIE: De resterende PBS kan voorzichtig worden opgezogen zonder de celpellet te verstoren om het volume te bevestigen.
4. Zuig 2 μl ijskoude basaalmembraanmatrix op in een voorgekoelde P200-pipetpunt met behulp van een P20-pipettor.
   OPMERKING: Een sterk geconcentreerde basaalmembraanmatrix (bijv. Corning Matrigel Matrix High Concentration) helpt bij het vormen van een sterk gestolde plug.
5. Draai voorzichtig om de pipetpunt uit te werpen. Rek een voorgesteriliseerde strook van de laboratoriumfilm uit en plaats deze over het uiteinde van de pipetpunt, zorg ervoor dat u de film niet doorboort. Wikkel de punt verder in de folie om de pipetpunt te verzegelen. Plaats de verzegelde punt voorzichtig direct op ijs en zorg ervoor dat de film niet scheurt.
6. Resuspendeer de celpellet in de resterende PBS en leg de oplossing voorzichtig over de basaalmembraanmatrix. Houd de constructie op ijs.
7. Bereid een centrifugatiebuis voor door een clusterbuis van 1.2 ml in een conische buis van 14 ml te plaatsen.
8. Plaats de pipetpunt in de geneste buisconfiguratie en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C.
9. Plaats de conische buis van 14 ml in verticale richting en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om de basaalmembraanmatrix in de pipetpunt te laten stollen.
   NOTITIE: De conische buis van 14 ml kan op ijs worden geplaatst totdat deze nodig is voor stroomafwaartse toepassing.

3. Driedimensionale organoïdecultuur

1. Verwijder voorzichtig de laboratoriumfilm van de pipetpunt.
2. Steek een dunne roestvrijstalen draadzuiger door de grotere opening van de pipetpunt.
3. Verdrijf de matrixplug totdat deze via de punt wordt losgelaten in een putje van een niet-behandelde weefselkweekplaat met 6 putjes die 2 ml sDMEM bevat, aangevuld met 10% FBS, 1x glutamax, 1x niet-essentiële aminozuren (NEAA), 10 μM Rock Inhibitor, 10 E/ml penicilline/streptomycine en 50 μM β-mercaptoethanol.
   OPMERKING: Het weefselkweekvat en het bijbehorende mediavolume kunnen naar wens worden aangepast.
   LET OP: NEAA, penicilline/streptomycine en β-mercaptoethanol zijn gevaarlijke stoffen en moeten worden gehanteerd in een bioveiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
4. Kweek organoïden bij 37 °C, 5% CO₂ en 95% luchtvochtigheid gedurende 4-12 weken.
5. Vervang de helft van het medium elke 5 dagen.
   OPMERKING: Als organoïden zich aan de weefselkweekplaat beginnen te hechten, breng ze dan over naar een nieuw putje.

4. Nierkapsel transplantatie

1. Bereid steriele chirurgische instrumenten voor.
2. Voer een subcapsulaire niertransplantatie uit van de matrixplug van het basale membraan:
   1. Verdoof de 8 weken oude vrouwelijke ontvangende muis met BALB/c met isofluraan volgens de richtlijnen voor institutionele dierethiek.
      LET OP: Isofluraan is een gevaarlijke stof. Afvalgas moet worden opgevist om te voorkomen dat het de werkomgeving binnendringt.
   2. Leg de muis in een rechter zijwaartse positie.
   3. Scheer het haar van de operatieplaats en desinfecteer de huid volgens de richtlijnen van de instelling.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de operatieplaats drie keer in een cirkelvormige beweging te desinfecteren met afwisselend scrub op jodiumbasis of chloorhexidine en op alcoholbasis.
   4. Maak een incisie van 2 cm in de huid loodrecht op de wervelkolom om de peritoneale wand bloot te leggen.
      OPMERKING: Een fijne chirurgische schaar of een scalpelmesje kan worden gebruikt voor een incisie in de huid. Gebruikers dienen de institutionele richtlijnen voor dierethiek of de standaard operationele procedures te volgen.
   5. Maak een kleinere incisie van 0,5 cm in de buikvlieswand boven de nier.
      NOTITIE: De incisie moet de nierbreedte benaderen om ervoor te zorgen dat de nier tijdens de transplantatie naar buiten blijft komen.
   6. Exterioriseer de nier door de peritoneale opening door neerwaartse druk uit te oefenen met de duim en wijsvinger. Een ringpincet kan worden gebruikt om de exteriorisatie te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de nier tijdens de procedure vochtig is door regelmatig steriele PBS aan te brengen met een wattenstaafje.
   7. Knijp onder een stereomicroscoop in het perirenale vet van het nierkapsel met een gebogen ultrafijne pincet aan één pool van de nier. Gebruik een tweede gebogen ultrafijne pincet om het membraan van het nierkapsel voorzichtig in tegengestelde richting naar boven te scheuren, waardoor een kleine opening ontstaat.
   8. Steek voorzichtig de tand van een pincet onder het capsulemembraan. Gebruik een langzame vegende beweging om het capsulemembraan te scheiden van het nierparenchym.
   9. Bereid de matrixplug van het basaalmembraan voor op transplantatie door de laboratoriumfilm van de pipetpunt te verwijderen.
   10. Til het nierkapsel op met één punt van de pincet en steek de pipetpunt door de opening en duw deze naar de tegenoverliggende pool van de nier.
   11. Steek een draadzuiger in de pipetpunt en verwijder de matrixplug terwijl u tegelijkertijd de pipetpunt uit de nier trekt.
   12. Bevochtig de nier met PBS en internaliseer opnieuw.
   13. Sluit de buikvlieswand met één 5-0 Vicryl hechting en sluit de huid met twee autoclips.
   14. Pijnstiller toedienen (buprenorfine in een dosis van 0,05-0,1 mg/kg subcutaan of volgens de richtlijnen voor institutionele dierethiek).
       LET OP: Buprenorfine is een gevaarlijke stof en moet worden gehanteerd met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
3. Schakel de toevoer van isofluraan uit, maar houd de zuurstofstroom aan zodat de muis zuivere zuurstof kan inademen totdat hij bij bewustzijn komt.
4. Plaats de muis terug in zijn kooi. Houd het dier warm tijdens het herstel door de kooi gedeeltelijk op een verwarmingskussen of onder een warmtelamp te plaatsen en houd in de gaten totdat de muis volledig herstelt van de anesthesie.
5. Bewaak het postoperatieve herstel gedurende de eerste twee weken of zoals vereist door de institutionele richtlijnen.

Results

Celaggregatie is belangrijk voor het bevorderen van cel-tot-cel contact en signalering. Het omhullen van celaggregaten in de basale membraanmatrix ondersteunde beide 3-dimensionale culturen voor in vitro weefselorganoïdevorming en vergemakkelijkte de mechanische afgifte van cellen in het nierkapsel voor transplantaattransplantatie. Om deze constructies vast te stellen, werd de basaalmembraanmatrix eerst in een fluïdische toestand gehouden onder ijskoude omstandigheden. Celaggregatie werd vervolgens bereikt door een geconcentreerde celsuspensie erboven te leggen en middelpuntvliedende kracht te gebruiken om cellen door de matrix met hoge dichtheid te duwen. Optimalisatie van de centrifugatiesnelheid (200-2000 x g) was nodig om een celpositionering in het midden van de laag te bereiken (figuur 1A), die ook afhankelijk was van het celaantal. Hogere middelpuntvliedende krachten (>500 x g) stuwden cellen naar het uiterste puntje van de pipet (Figuur 1B), en voorzichtigheid is geboden voor kleinere celaantallen (d.w.z. <5 x 10⁵) die verloren kunnen gaan tijdens het verwijderen van de flexibele laboratoriumfilmbedekking. Omgekeerd is het mogelijk dat cellen niet voldoende door de basale membraanmatrix reizen als de G-krachten te laag zijn (≤200 x g) (Figuur 1C). De centrifugatiesnelheid voor celnummers <1 x 10⁵ of >2,5 x 10⁶ moet mogelijk verder worden geoptimaliseerd. Na het centrifugeren werden de cellen in de basale membraanmatrix geplaatst door het construct gedurende 15 minuten op 37 °C te verwarmen. Door dit stollingsproces kon de "plug" van de matrix volledig worden uitgeworpen (figuur 1D) met behulp van een dunne draadplunjer.

In vitro milt-organoïdevorming
Pluggen van de basaalmembraanmatrix die in een geschikt weefselkweekvat werden uitgeworpen, vormden reproduceerbaar 3-dimensionale organoïde-achtige structuren die konden worden gehandhaafd volgens standaard weefselkweektechnieken en -omstandigheden (37 °C, 5% CO₂, 95% vochtigheid)¹¹. In cultuur verdween het substraat van de ondersteunende basale membraanmatrix geleidelijk tussen dag 0 en 14 (Figuur 2A, i-iii) en kon het op dag 21 niet meer worden waargenomen, waardoor een intacte organoïde-achtige bolvormige celmassa overbleef (Figuur 2A, vi) van ongeveer 545 μm (s.d. = 120 μm, n = 6)¹¹ in diameter. Deze organoïdestructuren werden langer dan 30 dagen in cultuur gebracht, maar namen in de loop van de tijd niet in omvang toe (Figuur 2B). Miltorganoïden waren samengesteld uit CD45-TER-119-stromale, CD45-TER-119⁺ erytrocyten- en CD45⁺TER-119-lymfoïde cellen (Figuur 2C), maar de frequentie van elke populatie was variabel tussen individuele organoïden (n = 4; Tabel 1). Om de algemene structuur van miltorganoïden te beoordelen, werden cryosecties van 50 μm dik weefsel voorbereid en gevisualiseerd. Organoïden bestonden uit een niet-holle structuur, met cellen die over de gehele diameter van het weefsel aanwezig waren (Figuur 2D). Beoordeling van organoïde secties met een laagdikte van 7 μm enkele cel onthulde dat cellen waren gerangschikt in koordachtige structuren zonder een duidelijke ruimtelijke oriëntatie (Figuur 2D), met gebieden zonder kernen tussen celstrengen. CD45-antilichaamkleuring verifieerde de aanwezigheid van nucleaire hematopoëtische cellen die de perifere regio's van de organoïde dicht omringden (Figuur 2E). Bovendien werden CD45⁺-cellen met een duidelijke, spoelvormige morfologie waargenomen in meer centrale organoïde regio's. Een algemene afwezigheid van CD90.2 (T-cel) en CD19 (B-cel) antilichaamkleuring, maar positieve CD11b-kleuring toonde de specifieke aanwezigheid van myeloïde cellen aan (Figuur 2F). Niet-hematopoëtische CD105⁺ en CD31⁺ endotheelcellen werden ook gedetecteerd in meerdere organoïden¹¹.

In vivo milttransplantatie
De inkapseling van geaggregeerde stromale cellen van de milt in een halfvaste matrix vergemakkelijkt diertransplantatiestudies. Deze techniek werd gebruikt om ongefractioneerde of CD45-TER-119-FACS gesorteerde neonatale milt stromale celpreparaten in te bedden in een basale membraanmatrixplug, die diende als een voertuig voor transplantatie onder de niercapsule van de muis. In overeenstemming met vergelijkbare celaggregatieprotocollen⁸, hebben ingekapselde celconstructies (MECC's) met succes miltweefsel geregenereerd in 4/5 onafhankelijke diertransplantaties, waardoor de levensvatbaarheid van deze transplantaatconstructietechniek wordt bevestigd. Om het nut van MECC's te testen bij het definiëren van celtypen die nodig zijn voor miltregeneratie, werden ^{MECC-transplantaten} geconstrueerd uit neonatale miltcellen die specifiek waren uitgeput van PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ of PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- stromale (CD45-) cellen¹¹. Transplantaten zonder PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺-cellen behielden het vermogen tot grove weefselregeneratie (4/4 grafts; Figuur 3A) ¹¹. Drie van de vier geregenereerde weefsels vertoonden een normale miltcelsamenstelling en -structuur, met centrale arteriolen, witte pulpafollikels, gescheiden T- en B-celcompartimenten, folliculaire dendritische cellen, reticulaire cellen in de marginale zone en marginale metallofiele macrofagen, sinusoïden van rode pulpa, myeloïde cellen en macrofagen (figuur 3B)¹¹. Daarentegen slaagden transplantaten zonder PDGFRβ⁺MAdCAM-1-cellen er grotendeels niet in om miltweefsel te regenereren (1/4 grafts)¹¹. Deze gegevens ondersteunen het belang van van transplantaten afgeleide PDGFRβ⁺-cellen bij^{de regeneratie van} miltweefsel8 en wijzen op een specifieke vereiste voor PDGFRβ⁺MAdCAM-1-stromale cellen.

Figuur 1. Inkapseling van basale membraanmatrix van geaggregeerde stromale cellen van de milt. Een pipetpunt van 200 μl wordt gebruikt om de celaggregatie in een basaalmembraanmatrix te vergemakkelijken. Een fluïdische matrixlaag wordt eerst tot stand gebracht door 2 μL ijskoude basaalmembraanmatrix op te zuigen in een voorgekoelde pipetpunt. Een celsuspensie wordt afgezet boven de matrixlaag en er wordt middelpuntvliedende kracht uitgeoefend om cellen in de basaalmembraanmatrix te mobiliseren en samen te voegen. (A) De instellingen voor de centrifugesnelheid zijn geoptimaliseerd om celaggregaten halverwege de matrixlaag te plaatsen. (B) Een te hoge centrifugaalsnelheid resulteert in cellen die aan het uiteinde van de pipet samenklonteren. (C) Onvoldoende snelheid verhindert de beweging van de cel door de matrix. (D) Na incubatie bij 37 °C gedurende 15 minuten wordt een halfvaste matrixplug uit de pipetpunt geworpen. Pijlpunten geven de plaatsing van celaggregaten binnen de matrix aan. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. In vitro kweek van basale membraan matrix-ingekapselde miltaggregaten en de vorming van 3-dimensionale organoïde structuren. (A) Ontwikkeling van miltorganoïden gedurende een periode van 35 dagen. Panelen (i-vi) komen overeen met dag 0, 7, 14, 21, 28 en 35 in cultuur. De beelden zijn vastgelegd met een Nikon TS2 omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Schaalbalk, 500 μm. (B) Diameter van de organoïde van de milt gedurende langere kweekperioden. Elke lijn vertegenwoordigt een individuele organoïde. (C) Flowcytometriekarakterisering van stromale (CD45-TER-119^-), lymfoïde (CD45⁺TER-119^-) en erytroïde (CD45-TER-119⁺) celpopulaties na 53 dagen in kweek. Bovenste paneel: Controleweefsel bereid uit neonatale miltstroma. Onderste paneel: Miltorganoïde, dag 52. (D) Grove morfologie van organoïdeweefsel bij een doorsnededikte van 50 μm (bovenste panelen) en 7 μm (onderste panelen) na 22 dagen in kweek. (E) Lokalisatie en morfologie van CD45⁺ hematopoëtische cellen na 34 dagen in kweek. Het vergrote gebied wordt weergegeven in de rechterdeelvensters. Secties zijn 7 μm. (F) Beoordeling van myeloïde (CD11b), T (CD90.2) en B (CD19) cellen na 34 dagen in kweek. Het vergrote gebied wordt weergegeven in de inzet. Secties zijn 7 μm. De beelden zijn gemaakt met een Nikon Eclipse Ti2-E Live Cell Microscope. Schaalbalken (D, E, F), 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Analyse van het transplantaatweefsel van het basale membraanmatrix. Transplantaten werden geconstrueerd uit neonatale miltstroma zonder PDGFRβ⁺MAdCAM-1^+- cellen (n = 4). Aanvullende gegevens online beschikbaar¹¹. (A) Macroscopisch uiterlijk van een geregenereerd milttransplantaat 4 weken na transplantatie onder het nierkapsel. Het omkaderde gele gebied geeft geregenereerd miltweefsel aan. Het beeld is gemaakt met een Leica M60 stereomicroscoop die is uitgerust met een Snap-zoomadapter en een Apple iPhone 6S. Schaalbalk, 1000 μm. (B) Samengestelde meerkleurige immunofluorescentiebeelden van transplantaatweefsels met een dikte van 30 μm die op het coronale vlak zijn gecryosectieerd. Antilichaamkleuring werd uitgevoerd met aangegeven markers om de microarchitectuur van het miltweefsel te visualiseren. De beelden zijn gemaakt met een Nikon Eclipse Ti2-E Live Cell Microscope. Gebieden in kaders tonen gebieden met een hogere vergroting. Schaalbalk, 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Organoïde nr.	Stromale cellen	Erytrocyten	Lymfocyten
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Tabel 1. Percentage stromale, erytroïde en lymfoïde celpopulaties onder individuele miltorganoïden.

Aanvullende figuur 1. Schematisch overzicht van het protocol met de belangrijkste stappen in het genereren van in matrix ingebedde celconstructen voor in vitro en in vivo studies. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De aggregatie van neonatale miltcellen in een halfvast medium vertegenwoordigt een levensvatbare methode voor het genereren van miltconstructen. Vergelijkbare protocollen op basis van basaalmembraanmatrix zijn gebruikt om driedimensionale miltculturen te initiëren¹⁰. Hier tonen we aan dat miltconstructen even geschikt zijn voor in vitro organoïdekweeksystemen als voor in vivo transplantatiemodellen. Merk op dat de transplantatie van in vitro gekweekte miltorganoïden nog niet is getest, maar het zou van belang zijn om de capaciteit voor volledige of gedeeltelijke regeneratie van miltweefsel te bepalen. Dit protocol erft ook celaggregatietechnieken die zijn beschreven in eerdere milttransplantatiestudies⁸. Deze studies omvatten het laden van celaggregaten over een collageenvel, gevolgd door transplantatie onder het nierkapsel. Inkapseling van celaggregaten in de basale membraanmatrix biedt een duidelijk voordeel in termen van transplantaatoriëntatie, waarbij variatie geassocieerd met collageen met de bladzijde naar beneden versus celaggregaat-side naar beneden transplantatie wordt geëlimineerd.

De methodologie voor het voorbereiden van basale membraanmatrixconstructies is relatief eenvoudig. Het gebruik van een basaalmembraanmatrix met een hoge concentratie zorgt ervoor dat cellen in eerste instantie in een geaggregeerde toestand worden ondersteund, voordat de matrix gedurende meerdere dagen verdwijnt. Onze ervaring is dat er sprake is van minimale vermenging en verdunning van de basaalmembraanmatrix na zorgvuldige gelaagdheid (stap 2.6) en centrifugatie (stap 2.8) van een PBS-gesuspendeerde celoplossing. De meeste optimalisaties zijn gericht op het positioneren van de celpellet in de matrixplug (Figuur 1). Dit kan worden aangepakt door verschillende variabelen te testen, zoals centrifugatiesnelheid, tijd, volumesamenstelling van de basaalmembraanmatrix, volume van PBS-gesuspendeerde celoplossing en pipetpuntgrootte. Het aantal cellen en de kenmerken (grootte, dichtheid) kunnen ook van invloed zijn op de instellingen, en elk celpreparaat moet afzonderlijk worden geoptimaliseerd.

Verschillende beperkingen zijn belangrijk om te benadrukken. Keldermembraanmatrix kan een temperatuurgevoelig product zijn en er moet voor worden gezorgd dat het snel werkt om reagentia koud te houden. Dit voorkomt voortijdige stolling van de matrix en zorgt voor een goede inkapseling van de cellen. Hoewel alle relevante materialen in een koude omgeving worden opgeslagen, bereid of bewaard, kunnen handmatige hanteringsstappen (bijv. het uitwerpen van de pipetpunt, het sealen met flexibele laboratoriumfilm [Stap 2.5]) variabel externe warmte van de gebruiker introduceren, waardoor de viscositeit van de matrix verandert en de celmigratiekarakteristieken tijdens het centrifugeren worden beïnvloed. Reproduceerbaarheid binnen en tussen experimenten kan daarom moeilijk consistent te bereiken zijn.

De tweede beperking is de eis voor gebruikerservaring en vaardigheid. Bepaalde manuele technieken kunnen een uitgebreide training vereisen om efficiënt en succesvol te kunnen presteren. Het verzegelen van de pipetpunt met laboratoriumfolie (stap 2.5) kan bijvoorbeeld in eerste instantie leiden tot lage slagingspercentages, maar dit zal onvermijdelijk verbeteren met de praktijk. Competentie met microchirurgische technieken bij dieren wordt ook verkregen door herhaling. Bij transplantaties moet voorzichtigheid worden betracht, vooral bij het inbrengen van de pipetpunt onder het nierkapsel (stap 4.2.10), het inbrengen van de draadzuiger om de plug uit te werpen (stap 4.2.11) en het terugtrekken van de punt uit de nier. Het is belangrijk dat de plug voorzichtig en gestaag wordt uitgeworpen terwijl tegelijkertijd de pipetpunt wordt teruggetrokken. Overmatige beweging kan ertoe leiden dat het nierkapsel wordt geperforeerd of dat het parenchym beschadigd raakt, wat leidt tot overmatig bloeden.

Samenvattend is hier een proces beschreven voor het inkapselen van cellen in een halfvaste matrix met een focus op het begrijpen van de vorming van miltweefsel. Dit systeem kan ook worden toegepast op een breed scala aan celtypen met het potentieel voor meerdere in vitro of in vivo downstream-toepassingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm