Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het voorbereiden van een muizenmodel van ernstige acute pancreatitis via een combinatie van caeruleïne en lipopolysaccharide intraperitoneale injectie

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66780

⸱

10 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Intraperitoneale toediening van geneesmiddelen is een veilige en effectieve niet-invasieve benadering voor het induceren van pancreasletsel. Deze studie vergeleek vijf verschillende intraperitoneale injectieprotocollen bij muizen om verschillende gradaties van pancreasletsel te induceren en stelde een model van ernstig pancreasletsel vast om de pathologische veranderingen en behandelingsstrategieën voor ernstige acute pancreatitis (SAP) te onderzoeken.

Samenvatting

De behandeling van ernstige acute pancreatitis (SAP), met hoge sterftecijfers, vormt een aanzienlijke klinische uitdaging. Het onderzoeken van de pathologische veranderingen die verband houden met SAP met behulp van diermodellen kan helpen bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen en het verkennen van nieuwe behandelingsbenaderingen. Eerdere studies veroorzaakten voornamelijk pancreasbeschadiging door retrograde galweginjectie van natriumtaviaurocholaat, maar de impact van chirurgische schade op de kwaliteit van het diermodel blijft onduidelijk. In deze studie gebruikten we verschillende frequenties van intraperitoneale caeruleïne-injecties in combinatie met verschillende doses LPS om pancreasletsel te induceren bij C57BL/6J-muizen en vergeleken we de mate van letsel in vijf intraperitoneale injectieprotocollen. Met betrekking tot het induceren van acute pancreatitis bij muizen wordt een intraperitoneaal injectieprotocol voorgesteld dat resulteert in een sterftecijfer van maar liefst 80% binnen 5 dagen. Concreet kregen muizen tien dagelijkse intraperitoneale injecties met caeruleïne (50 μg/kg), gevolgd door een injectie met LPS (15 mg/kg) een uur na de laatste toediening van caeruleïne. Door de frequentie en dosering van geïnjecteerde medicijnen aan te passen, kan men de ernst van pancreasletsel effectief manipuleren. Dit model vertoont een sterke controleerbaarheid en heeft een korte replicatiecyclus, waardoor het door een enkele onderzoeker kan worden voltooid zonder dat er dure apparatuur nodig is. Het simuleert gemakkelijk en nauwkeurig de belangrijkste ziektekenmerken die worden waargenomen in menselijk SAP, terwijl het een hoge mate van reproduceerbaarheid aantoont.

Inleiding

Ernstige acute pancreatitis wordt gekenmerkt door een snel begin, snelle progressie en hoge sterftecijfers binnen het domein van de ziekte van het spijsverteringsstelsel1. Het hoge sterftecijfer is altijd een prominente focus geweest van klinisch onderzoek. Vanwege onvoorspelbare veranderingen in klinische omstandigheden, heterogeniteit van ziekteverschijnselen en beperkte beschikbaarheid van menselijke monsters, is het opzetten van diermodellen steeds belangrijker geworden voor ziekteonderzoek.

Retrograde injectie van natriumtaurocholaat in het gemeenschappelijke galkanaal wordt vaak gebruikt om een rattenmodel van SAP2 te creëren. Door pancreaticobiliaire obstructie te simuleren en reflux van gal en pancreasvloeistof te induceren, vertoont deze modelleringstechniek een hoog slagingspercentage bij het repliceren van SAP-diermodellen. Er moet echter worden opgemerkt dat invasieve chirurgie wel een impact heeft op het diermodel zelf. Bovendien is deze methode beperkt tot grotere dieren, zoals ratten en honden, die voornamelijk als proefpersonen worden gebruikt. Alternatieve technieken, waaronder intubatie van de twaalfvingerige darm3, directe twaalfvingerige darmpunctie4 en directe punctie van de galweg-pancreasbuis5, worden vaak gebruikt voor modelleringsdoeleinden.

Intraperitoneale injectie en dieetmodelleringsmethoden bieden niet-invasieve voordelen die kunnen worden toegepast op dieren van elke grootte. Het muismodel van SAP geïnduceerd door het voeren van choline-deficiënt-ethionine (CDE)6 vertoont bepaalde complicaties, zoals slecht controleerbare hyperglykemie en hypocalciëmie, waardoor het ongeschikt is voor het evalueren van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen. Aan de andere kant is intraperitoneale injectie van caeruleïne in combinatie met L-arginine7 de meest gebruikte methode voor het induceren van acute pancreatitis bij muizen. Met name herhaalde intraperitoneale toediening van caeruleïne - een cholecystokinine-analoog - biedt een zeer geschikte benadering voor het onderzoeken van verschillende aspecten die verband houden met deze destructieve ziekte, waaronder pathogenese, ontsteking en regeneratieprocessen. Vanwege de structurele gelijkenis met cholecystokinine (CCK), stimuleert caeruleïne effectief de samentrekking van de galblaas en de secretie van pancreasenzymen, wat leidt tot een onbalans in de enzymsecretie, gevolgd door daaropvolgende zelfvernietiging8. Lipopolysaccharide (LPS), dat alomtegenwoordig is en uitgebreid wordt bestudeerd als een pathogeen-geassocieerd moleculair patroonmolecuul, kan via intraperitoneale injectie worden gecombineerd met caeruleïne om een effectief muizenmodel van SAP op te zetten. Deze combinatie activeert snel een aanzienlijk aantal inflammatoire cytokines en geeft deze vrij, wat resulteert in overmatige lokale en systemische ontsteking. Verschillende onderzoeken hebben de inductie van SAP-modellen bij muizen gerapporteerd door intraperitoneale injectie van caeruleïne in combinatie met LPS. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat intraperitoneale injectie van caeruleïne pancreasoedeem en bloeding bij muizen kan veroorzaken, terwijl de toevoeging van LPS onmiddellijk pancreasnecrose kan induceren en systemische ontstekingsreacties, sepsis en zelfs orgaanfalen kan verergeren. Momenteel is er variatie in de dosering en frequentie van intraperitoneale caeruleïne-injecties, evenals inconsistentie in aanvullende LPS-dosering. Het bereiken van consistentie in SAP-muismodellen is een uitdaging 9,10,11,12; Daarom is het noodzakelijk om een gestandaardiseerd protocol op te stellen voor het verkrijgen van een ideaal model. In dit artikel beschrijven we een protocol voor intraperitoneale injectie bij muizen en onderzoeken we de optimale injectiefrequentie en aanvullende dosering van LPS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het First Affiliated Hospital van de Anhui University of Science and Technology (Huainan, China) (Ethische Code: 2023-KY-905-001). De studie volgde de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van onderzoeksknaagdieren in alle dierproeven. C57BL/6J volwassen muizen met een gewicht van 20-30 g werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden gedurende een week onder gecontroleerde omstandigheden (ongeveer 21 °C met een afwisselende dag-nachtcyclus van 12 uur) gehuisvest in een dierlaboratorium. De muizen hadden overal ad libitum toegang tot voedsel en water. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Wijs 84 gezonde C57BL/6J-muizen toe aan zes groepen, waaronder de controlegroep, pancreasletsel (PI) I, PI II, PI III, PI IV en PI V.
  2. Voordat u de modelleringsprocedure start, labelt u elke groep muizen met oorinkepingen en laat u ze 12 uur vasten.

2. Bereiding van geïnduceerd geneesmiddelverdunningsmiddel

  1. Los de caeruleïne (1 mg) op in 1 ml PBS en zet in de koelkast bij -20 °C.
  2. Meet en registreer het gewicht van de experimentele muizen 1 uur voor de intraperitoneale injectie van het geneesmiddel.
  3. Extraheer de totale massa caeruleïne die nodig is in een verhouding van 50 μg/kg, op basis van het totale gewicht van alle muizen.
  4. Verdun het verkregen caeruleïne-medicijn opnieuw met PBS.
    OPMERKING: Het totale volume van de PBS-verdunning moet gelijk zijn aan 5 keer de totale gewichtswaarde van alle muizen. Dezelfde verdunningsmethode werd gebruikt om LPS-verdunningsmiddel te verkrijgen.

3. Intraperitoneale injectie

OPMERKING: Intraperitoneale injecties werden toegediend aan elke groep muizen volgens het protocol beschreven in aanvullende tabel 1 om het model te induceren. Nog eens 10 muizen werden gegroepeerd en behandeld om de 7-daagse overlevingspercentages te observeren.

  1. Pak de muizen vast en houd ze zo vast dat de buik van de muizen naar boven wijst en de kop lager is geplaatst dan de staart om schade aan de organen bij het inbrengen van de spuit te voorkomen.
  2. Desinfecteer de buik van de muizen met wattenbolletjes met 75% alcohol.
  3. Houd de spuit in de rechterhand (met behulp van een naald van ≤0,5/≥0,3) en steek de naald in de onderhuidse huid aan de linkerkant van de witte buiklijn.
    OPMERKING: Wissel naar de rechterkant voor de volgende injectie.
  4. Zodra de naald de onderhuidse laag heeft bereikt, beweegt u deze ongeveer 3-5 mm naar voren en steekt u de naald van de spuit in een hoek van 45° in de buikholte. Op dit punt zou men enige weerstand moeten voelen.
  5. Houd de naald stil en injecteer de stof langzaam.
    OPMERKING: Overschrijd niet 5 keer de gewichtswaarde van de muizen als het volume van een enkele intraperitoneale injectie.
  6. Trek na de injectie de naald eruit en masseer en druk zachtjes op de injectieplaats met een steriel wattenstaafje om het medicijn volledig in de buikholte van de muizen te verspreiden.
  7. Gebruik een nieuwe spuit om te herhalen met de volgende experimentele muizen.

4. Gedragsvaardigheidstesten in het open veld

OPMERKING: 12 uur na de laatste intraperitoneale injectie werden open-field gedragsvaardigheidstests uitgevoerd om de totale activiteitsafstand en immobiliteitstijd van de muizen te beoordelen.

  1. Plaats vier identieke witte dozen direct onder de camera.
  2. Sluit de camera aan op de computer met behulp van een videokabel.
  3. Zorg ervoor dat de experimentele doos schoon en vrij van geuren is voordat u met het experiment begint.
  4. Plaats het dier in het midden van het rooster, met het gezicht van de onderzoeker af, en laat het zich gedurende 10 minuten aanpassen aan de omgeving.
  5. Start de videotrackingsoftware en klik op het menu Bestand om een nieuw experiment te maken.
  6. Stel de bewaking in voor vier gelijktijdige gezichtsvelden.
  7. Markeer de lengte en breedte van het experimentele object dat binnen de doos kan bewegen in het real-time bewakingsscherm (30 cm × 30 cm).
  8. Zodra de installatie is voltooid, begint u met videobewaking en opname.
  9. Registreer de activiteit van de muizen gedurende 15 minuten.
  10. Haal het dier na het testen van het rooster en leg het terug in zijn kooi. Reinig het rooster grondig met een sterilisatiemiddel dat chloordioxide bevat.

5. Het verzamelen en testen van het perifere bloed van muizen

  1. Euthanaseer de muizen (volgens het institutioneel goedgekeurde protocol).
    1. Voer euthanasie uit op de experimentele muizen 36 uur na de intraperitoneale injectie. Meet en registreer het lichaamsgewicht van de muizen voorafgaand aan euthanasie.
      OPMERKING: Dien 0,18 ml 10% chloraalhydraat intraperitoneaal toe, zorg ervoor dat er geen reactie is op stimulatie van de teen of staart.
    2. Zet de muizen met de linkerhand vast en houd met de rechterhand de schaar vast om de snorharen aan één kant van de muizen af te knippen.
    3. Druk voorzichtig op de huid rond het oog om congestie en uitsteeksel van de oogbol te veroorzaken.
    4. Gebruik een gebogen pincet om de oogbol vast te pakken en snel te verwijderen, waarbij perifeer bloed wordt verzameld in een microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Er werden twee verschillende soorten microcentrifugebuisjes gebruikt, de ene met antistollingsmiddel en de andere zonder.
    5. Druk tegelijkertijd lichtjes op het hartgebied van de muizen met de middelvinger van de linkerhand om de pompsnelheid van het hart te verhogen.
  2. Laat het perifere bloed zonder antistollingsmiddel 30 minuten op kamertemperatuur staan.
  3. Meet de concentraties van serumamylase (Amy) en lipase (Lip) met behulp van een geautomatiseerde biochemische analysator via de enzymsnelheidsmethode en de enzymcirculatiemethode (volgens de instructies van de fabrikant).
  4. Bepaal de niveaus van ontstekingsindicatoren zoals Pro Calcitonin (PCT) in plasma met behulp van de chemiluminescentiemethode met behulp van een in de handel verkrijgbare chemiluminescentiebeeldvormer (volgens de instructies van de fabrikant).
  5. Gebruik ELISA-kits om HMGB-1-, IL-6- en TNF-α-niveaus in muizenserum te meten (volgens de instructies van de fabrikant).
  6. Analyseer het perifere bloed dat is behandeld met anticoagulantia met behulp van een volautomatische bloedcelanalysator om de relevante parameters te beoordelen.

6. Het verzamelen van het alvleesklierweefsel en het voorbereiden van een paraffinesectie

  1. Leg de muizen in rugligging en leg ze vast op een schuimplaat.
  2. Scheer en desinfecteer het gebied, maak vervolgens een incisie in de mediane buik en draai de dunne darmbuis naar rechts om de alvleesklier volledig bloot te leggen.
  3. Koppel de twaalfvingerige darm en het pyloruskanaal los en zoek de dunne darm onder de alvleesklier. Maak het alvleesklierweefsel langs het darmkanaal volledig vrij.
  4. Gebruik een tandeloze tang om de milt vast te klemmen en trek deze voorzichtig omhoog.
    OPMERKING: Raak het alvleesklierweefsel niet rechtstreeks aan en vermijd het gebruik van overmatige kracht tijdens het gehele dissociatieproces.
  5. Ontleed het achterste pancreasligamentweefsel scherp tot aan de kop van de alvleesklier en koppel de galwegen en bloedvaten los.
  6. Verwijder het alvleesklierweefsel, dep het oppervlaktevocht droog met absorberend papier, weeg en registreer.
  7. Fixeer de helft van het alvleesklierweefsel met 4% paraformaldehyde en bewaar de andere helft in de koelkast bij -80 °C.
  8. Bereid de paraffinesecties van de alvleesklier voor volgens de onderstaande stappen.
    1. Reinig het vaste alvleesklierweefsel met 75% alcohol en snijd het bij tot een grootte van ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm.
    2. Dompel het weefsel onder in 70% ethanol gedurende 20 minuten, 80% ethanol gedurende nog eens 20 minuten en 90% ethanol gedurende 15 minuten.
    3. Behandel het weefsel twee keer met 95% ethanol gedurende 15 minuten per keer en vervolgens twee keer met 100% ethanol gedurende 5 minuten per keer.
    4. Onderwerp het weefsel aan twee rondes van behandelingen van 12 minuten en 5 minuten met xyleenoplossing voor transparantie.
    5. Week het transparante weefsel gedurende 1 uur in een wastank bij 65 °C.
    6. Veranker het weefsel in gesmolten paraffine en laat het afkoelen. Verkrijg paraffinesecties van de alvleesklier met een snijmachine (dikte: 5 μm).
    7. Druk de verkregen paraffineschijfjes plat in water van 45 °C, monteer ze en droog ze af (bakomstandigheden: 40 °C gedurende 14-16 uur).

7. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring

  1. Plaats de paraffinesecties van de alvleesklier gedurende 30 minuten in xyleen I en II, vervolgens in watervrije, 95%, 85% en 75% alcohol gedurende elk 5 minuten en ultrapuur water gedurende 5 minuten.
  2. Kleur de celkern gedurende 160 s met hematoxyline en spoel vervolgens langzaam af met stromend water.
  3. Breng gedurende 5-10 s een zoutzuuralcoholdifferentiatieoplossing aan en spoel vervolgens snel af met stromend water.
  4. Behandel de secties gedurende 5 minuten met watervrije alcohol.
  5. Incubeer het cytoplasma met eosine gedurende 30 s en spoel vervolgens af met stromend water.
  6. Dompel de secties elk 10 s onder in 75%, 85%, 95% en 100% ethanol en behandel ze vervolgens gedurende 5 minuten met xyleen om te drogen.
  7. Verzegel ten slotte de secties met neutrale hars en observeer onder een microscoop.
  8. Voer de pathologische score en normenuit 13.
    OPMERKING: Bepaal de ernst van pancreatitis op basis van indicatoren zoals oedeem, acinaire necrose, bloeding, bloeding en vetnecrose, en inflammatoire en perivasculaire ontsteking. Gebruik de eerder gepubliceerde implementatierichtlijnen voor het scorenvan 13.

8. Immunohistochemische kleuring

  1. Dewax de in paraffine ingebedde delen van het pancreasweefsel in xyleen en rehydrateer ze vervolgens in een gradiënt van ethanoloplossingen.
  2. Voer endogene enzymblokkering uit met behulp van 3% H2O2 gedurende 20 minuten na een membraanbreuk van 30 minuten.
  3. Blokkeer het antilichaam met 5% runderserum bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en incubeer vervolgens een nacht bij 4 °C met een verdunning van 1:1500 konijn anti-HMGB1.
  4. Spoel de secties af met PBS en incubeer ze vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C in overeenkomstige secundaire antilichamen. Voer daarna DAB-kleurontwikkeling uit, hematoxyline-tegenkleuring en sluit af met neutrale gom.

9. TUNEL-methode voor het detecteren van apoptose in pancreassecties

  1. Dewax de paraffinesecties van de alvleesklier gedurende 5 minuten in xyleen, herhaal dit twee keer en was met gradiënt ethanol (100% gedurende 5 minuten, 90% gedurende 2 minuten, 70% gedurende 2 minuten en gedestilleerd water gedurende 2 minuten).
  2. Spoel overtollige vloeistof rond de paraffinesecties weg met PBS. Behandel elk monster met 100 μL proteïnase K en zorg ervoor dat het weefsel volledig wordt bedekt. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 20 minuten. Week de monsters vervolgens 3 keer in PBS, telkens gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: De proteïnase K-oplossing werd bereid door de oorspronkelijke proteïnase K-oplossing (200 μg/ml) te verdunnen met PBS in een verhouding van 1:9 (volume), wat resulteerde in een eindconcentratie van 20 μg/ml, exclusief DNase. Grondig wassen van proteïnase K is essentieel om interferentie met daaropvolgende etiketteringsreacties te voorkomen.
  3. Voeg een geschikte hoeveelheid van 3% H2O2 (verdund door PBS) toe aan het weefsel om het volledig te infiltreren en gedurende 20 minuten te incuberen. Spoel de tissue 3 keer gedurende 5 minuten met PBS.
    OPMERKING: De paraffinesecties moeten vochtig worden gehouden. Om de endogene peroxidasen in het weefsel te inactiveren, mag de incubatietijd niet te lang zijn om valse positieven als gevolg van DNA-breuk veroorzaakt door 3% H2O2 te voorkomen.
  4. Bedek het gehele gebied van het te testen monster met 50 μL evenwichtsbuffer en incubeer gedurende 10 minuten.
  5. Verwijder zoveel mogelijk evenwichtsbuffer. Voeg vervolgens 56 μL TdT-incubatiebuffer toe aan elk weefselmonster en incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur).
    OPMERKING: De dia mag niet drogen en blootstelling aan licht moet worden vermeden. TdT Incubatiebuffer werd bereid volgens de instructies van de fabrikant (Recombinant TdT-enzym: Biotine-dUTP Labeling Mix: Equilibration Buffer = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
  6. Was de weefselmonsters onmiddellijk met PBS. Spoel ze 4 keer af gedurende 5 minuten elk. Verwijder overtollige PBS-oplossing rond de monsters voorzichtig met filtreerpapier.
  7. Voeg 100 μL eerder verdunde Streptavidin-HRP-reactieoplossing (Streptavidin-HRP: TBST = 1: 300) toe aan elk weefselmonster voor de Streptavidin-HRP-reactie. Incubeer gedurende 30 min. Was de monsters vervolgens met PBS en spoel ze 3 keer gedurende 5 minuten elk.
  8. Voer DAB-kleuring uit door 50 μL DAB toe te voegen aan elke paraffinesectie. Bekijk de kleuring onder een microscoop in realtime. Nadat positieve kleuring is verschenen, plaatst u de objectglaasjes onmiddellijk in een vochtige doos. Stop de reactie door het te wassen met zuiver water.
  9. Dompel de objectglaasjes 3-5 minuten onder in hematoxylinekleuringsoplossing en spoel ze vervolgens af met zuiver water.
  10. Differentieer in hematoxyline-differentiatieoplossing gedurende ongeveer 2 s, gevolgd door onmiddellijk spoelen met zuiver water.
  11. Bereik een blauwe verkleuring met behulp van hematoxyline-herblusingoplossing gedurende een paar seconden en spoel de objectglaasjes schoon met zuiver water.
    OPMERKING: Voer microscopisch onderzoek uit na nucleaire kleuring. Als de kleuring te donker is, plaatst u de objectglaasjes terug in de differentiatieoplossing. Als de kleuring te licht is, start u het kleuringsproces opnieuw vanaf de stap van de nucleaire kleuring.
  12. Dehydrateer de monsters met 4 rondes verse watervrije ethanol gedurende elk 5 minuten. Week ze vervolgens 5 minuten in butanol en 5 minuten in xyleen. Gebruik ten slotte nog 5 minuten vers xyleen.
  13. Monteer de dia's met behulp van neutrale gom. Laat ze op natuurlijke wijze aan de lucht drogen of droog ze in een oven van 60 °C.
  14. Voer histologisch onderzoek uit met behulp van een witlichtmicroscoop. Apoptotische kernen zullen bruin lijken.
  15. Bereken de bijbehorende apoptotische index (AI).
    OPMERKING: Bekijk de dia's op een dubbelblinde manier. Selecteer in TUNEL-positieve objectglaasjes willekeurig 5 positieve gebieden onder sterke vergroting (400x) en tel ten minste 100 acinaire cellen in elk gebied om het percentage positieve cellen te bepalen. AI = (totaal aantal apoptotische cellen/totaal aantal cellen) × 100%.

10. Flowcytometrie

  1. Verkrijg verse alvleesklierweefsels en was ze grondig na perfusie met PBS.
  2. Bereid een 0,5% collagenase IV-vergistingsoplossing voor en gebruik een steriele weefselschaar om het pancreasweefsel voldoende te verteren.
  3. Voeg een 5% BSA-digestie-beëindigingsoplossing toe, afhankelijk van de toestand van de pancreasfragmenten en de troebelheid van de vloeistof, en centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten op lage temperatuur (~300 x g, 4 °C).
  4. Gooi het supernatans weg om de spijsvertering te beëindigen.
  5. Bereid een celkweekmedium met fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) en 2,5% foetale runderserumcelsuspensie om de pancreascellen te resuspenderen.
  6. Filtreer de achinaire celsuspensies van de pancreas door een nylon gaas met 200 mesh om celsuspensies te verkrijgen door middel van celfiltering.
  7. Centrifugeer de pancreas-acinaire celsuspensie bij lage temperatuur (volg de voorwaarden zoals vermeld in stap 10.3).
  8. Gooi het supernatant weg.
  9. Was de cellen met voorgekoeld PBS.
  10. Resuspendeer de cellen voorzichtig in voorgekoelde 1x bindingsbuffer door middel van centrifugale resuspensie.
  11. Label de acinaire cellen van de pancreas met Annexin V-FITC/PI volgens de instructies van de fabrikant na aanpassing van de celconcentratie.
  12. Gebruik flowcytometrie binnen 1 uur om apoptose in acinaire cellen van de pancreas te detecteren.

11. Western blot detectie van Caspase-3 en HMGB-1

  1. Extraheer het pancreaseiwit.
    1. Extraheer 50 mg pancreasweefsel en snijd het in kleine fragmenten.
    2. Voeg 1 ml RIPA lysisbuffer toe (met PMSF en gefosforyleerde proteaseremmer).
    3. Homogeniseer het pancreasweefsel gedurende 5 minuten op ijs met behulp van een elektrische molen.
    4. Incubeer het gehomogeniseerde weefsel op ijs met zacht schudden gedurende 2 uur.
    5. Centrifugeer het homogenaat bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 4.500 x g.
    6. Vang de bovenstaande oplossing op en bewaar deze bij -80 °C.
  2. Voer eiwitkwantificering uit.
    1. Verdun een bepaald volume BSA-standaardmonster (25 mg/ml) tot een concentratie van 0,5 mg/ml.
    2. Bereid een specifieke hoeveelheid BCA-werkoplossing voor door 50 volumes BCA-oplossing A te mengen met 1 volume BCA-oplossing B, zodat een grondige en gelijkmatige menging wordt gegarandeerd.
    3. Plaats het BSA-standaardmonster in de standaardmonstergaten op een plaat met 96 putjes in de orde van 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 en 20 μL. Breng het volume van elk gat in evenwicht met gedestilleerd water, wat resulteert in een totaal volume van 20 μL.
    4. Voeg 2 μl monsters toe aan de monstergaten en voeg vervolgens achtereenvolgens 18 μl gedestilleerd water toe voor verdunning (1:9).
    5. Vul elk putje met 200 μL BCA-werkoplossing en laat het ongeveer 20-30 minuten op 37 °C staan.
    6. Meet de absorptie bij een golflengte van 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie van de monsters op basis van de standaardcurve.
    7. Voeg een specifiek volume RIPA kraakoplossing en verdunningsbuffer toe om de monsters te verdunnen tot de concentratie 5-10 μg/μL bereikt, wat passend wordt geacht.
    8. Bewaar de monsters bij -20 °C na eiwitdenaturatie (100 °C; 10 min).
  3. Voer de Western Blotting uit.
    1. Bereid je voor op SDS-PAGE.
      1. Installeer de mallen voor het maken van lijm en inspecteer hun afdichtingsprestaties.
      2. Voeg TEMED toe aan de 10% scheidingslijm en meng gelijkmatig.
      3. Injecteer het mengsel in de vorm, goed voor ongeveer tweederde van het volume, terwijl u luchtbellen vermijdt.
      4. Voeg isopropanol toe aan de mal en druk de lijm ongeveer 40 minuten aan.
      5. Gebruik hetzelfde programma om de 5% geconcentreerde lijm te configureren.
      6. Giet isopropanol eruit en voeg de lijm onmiddellijk toe.
      7. Plaats de kam verticaal totdat de lijm volledig polymeriseert.
    2. Voer de elektroforese-operatie uit.
      1. Voeg het te testen monster in de verwachte experimentele controlevolgorde, in omgekeerde volgorde, toe aan de bemonsteringsgaten van de SDS-PAGE-lijm.
      2. Voeg tegelijkertijd de eiwitmarkering toe om de locatie van het doeleiwit en het interne referentie-eiwit te bepalen.
      3. Plaats het monster in de elektroforesetank nadat de monstertoevoeging is voltooid.
      4. Draai eerst 30 minuten op 80 V, gevolgd door de gel te laten draaien om het eiwit gedurende 60 minuten op 100 V te scheiden.
        OPMERKING: Er moet aandacht worden besteed aan de positie van broomfenolblauw om overmatige elektroforese te voorkomen.
    3. Voer de eiwitoverdracht uit.
      1. Knip de PVDF-film in de rechterbovenhoek af om als markering te dienen.
      2. Plaats de PVDF-film 5-10 s in een methanoloplossing om te activeren.
      3. Week de PVDF-film ongeveer 15 minuten in een elektroforesebuffer.
      4. Verwijder de gel voorzichtig na elektroforese en snijd overtollige gel bij, zorg ervoor dat de gel gedurende het hele proces nat blijft.
      5. Monteer de spalk in de volgende volgorde: negatieve plaat → spons → drie lagen filtreerpapier → gel → PVDF-film → drie lagen filtreerpapier → spons → positieve plaat.
        NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn tussen de gel en de PVDF-film.
      6. Plaats de gemonteerde klem in de natte roterende groef (zwart naar zwart) met ijsblokjes eromheen.
      7. Schakel de stroom in en start de filmoverdracht op 400 mA gedurende 100 min.
    4. Voer PVDF-filmafdichting en incubatie van primaire en secundaire antilichamen uit.
      1. Verwijder de PVDF-film voorzichtig na de overdracht en spoel gedurende 10 minuten met TBST, waarbij u het proces 3-5 keer herhaalt.
      2. Sluit de PVDF-film gedurende 2 uur af in 5% magere melk.
      3. Verwijder de PVDF-film en spoel gedurende 10 minuten met TBST, herhaal het proces 4 keer.
      4. Plaats de PVDF-film en het verdunde primaire antilichaam samen in een koelkast bij 4 °C met zacht schudden en incubeer een nacht.
      5. Verwijder de PVDF-film de volgende dag en spoel gedurende 10 minuten met TBST, herhaal het proces 4 keer.
      6. Incubeer de PVDF-film in HRP-gelabeld secundair antilichaamverdunningsmiddel gedurende ongeveer 2 uur.
      7. Spoel de PVDF-film gedurende 10 minuten af met TBST en herhaal het proces 4 keer.
    5. Belicht de film en analyseer deze.
      1. Breng de bereide ECL-oplossing gelijkmatig aan op de film.
      2. Belicht de film ongeveer 2-3 minuten in een donkere kamer met een belichtingsmeter en bewaar deze vervolgens.
      3. Voer de analyse uit met behulp van image J-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het proces van experimentele muismodellering wordt geïllustreerd in figuur 1. Na 12 uur voltooiing van de injectie werd een videorecorder in het open veld gebruikt om de bewegingsafstand en immobiliteitsduur van verschillende experimentele groepen muizen gedurende 5 cycli te volgen (Figuur 2A). Tijdens de 5 cycli behielden muizen in de PI V-groep binnen 3 minuten een lage bewegingsafstand, terwijl de immobiliteitsratio binnen 3 minuten met elke ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Momenteel is er een gebrek aan effectieve middelen om het hoge sterftecijfer bij patiënten met ernstige acute pancreatitis te verbeteren. Het is van cruciaal belang om de werkzaamheid van geneesmiddelen bij het verbeteren van de immuunstabiliteitsmechanismen te onderzoeken. Er is dringend behoefte aan een ideaal diermodel voor ernstige acute pancreatitis. Muizen met een C57BL/6J genetische achtergrond worden veel gebruikt in biomedisch onderzoek, waaronder studies naar SAP-pathofysiologie. Meer dan 70 jaar genetische dif...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door Research Projects in Health and Medical Science in Huainan City (nr. HNWJ2023005); Gemeentelijk begeleidend wetenschaps- en technologieplanprogramma in Huainan City (nr. 2023151); Trainingsprogramma voor innovatie en ondernemerschap van studenten van het Anhui Provincial College (nr. S202310361254); De negende lichting van de "50· Sterren van wetenschap en technologie" innovatieteams in Huainan City en Anhui Provincial Key Clinical Specialty Construction Project. We willen onze dank uitspreken aan de laboratoriumafdeling van het First Affiliated Hospital van de Anhui University of Science and Technology voor het verstrekken van de relevante testgegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1202-250 ml
AmylaseMindray,China
Annexin V-FITC/PIWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1511  verdund bij 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pABWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB11103  verdund bij 1:1800
BCA protein kwantitatieve detectiekitWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG2026-200T
BD FACSCanto II Flow CytometerBD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USABD FACSCanto II
BSAWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGC305010-100g
C57BL/6JCavion Experimental Animal Co., Changzhou, Chinalicentienummer SCXY (Su) 2011–0003
Ceruletide MCE, New Jersey, USA17650-98-5 50 µg/kg
Chemiluminescence imagerCytiva CO.,LTD.;USA
Citric acid antigen repair Solution (droog poeder pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1201-5 L
Collagenase IVWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GC3050140,5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detectie KitWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1507-100 T
Dimension EXL met LM Geïntegreerde Chemie SysteemSiemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USAYZB/USA 8311-2014
ECL developerWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China
Eosine kleurstof (alcoholoplosbaar)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1001-100 ml
EthoVision XT Noldus, Netherlands
FITC-labeled geitenanti-konijn IgGWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB22303  verdund bij 1:50
Volledig automatische bloedcel analyzerZybio Inc. China Zybio-Z3 CRP
GapDHWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB11103  verdund bij 1:1500
Hematoxyline blauwe retouroplossingWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1040-500 ml
Hematoxyline differentiatie oplossingWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1039-500 ml
Hematoxyline kleurstofWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kitsnjjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENIZERWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaKZ-III-F;IC111150 100222
HRP-labeled geitenanti-konijn IgGWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGB23303  verdund bij 1:1500
IL-6 ELISA kitsWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGEM0001
Lipase Mindray,China
Lipopolysaccharide Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGC20500915 mg/kg
Koudwater hoge snelheid centrifugeChangsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,ChinaTGL-20M
Membraan brekende vloeistofWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1204
microtomeJinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;ChinaCR-601ST
Nylon gaasWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China200-mesh
One-step TUNEL cell apoptosis detectie kit (DAB kleuring methode)Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG1507-100T
Paraffine weefsel inbedding machinePRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,ChinaPBM-A
Pathologische weefsel drogingsapparaatPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,ChinaPHY-III
Fosfaat-gebufferde zoutoplossingWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG4202-100ML
PMSFWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG2008-1 ml
Positieve fluorescentie microscoopOlympus Corporation,Tokyo, JapanBX53
Pro CalcitoninMindray,China
PVDF membraanMillipore, USA0,22 µm
RIPAWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaG2002-100 ml
SDS-PAGEBeyotime Biotechnology,ChinaP0012A
TNF-αELISA kitsWuhan servicebio Technology Co.,Ltd, ChinaGEM0004
Ultrasoon waterbadDONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;ChinaKQ-200KDE
Western BlotBio-Rad Laboratories, Inc.,USA
Western blot beeldvorming SystemGlobal Life Sciences IP Holdco LLC, JAPANAmersham ImageQuant 800 
Whirlpool mixerSCILOGEX;USA

Referenties

  1. Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
  2. Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).
  3. Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
  4. Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
  5. Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
  6. Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
  7. Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).
  8. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).
  9. Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).
  10. Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).
  11. Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).
  12. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  13. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
  14. Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
  15. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
  16. Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).
  17. Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
  18. Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).
  19. Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
  20. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  21. Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455(2023).
  22. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  23. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  24. Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
  25. Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Caeruleïne-injectieLipopolysaccharide-injectieAlvleesklierletselTUNEL-kleuringFlowcytometrieCaspase-3-expressieHistologisch onderzoek
Het voorbereiden van een muizenmodel van ernstige acute pancreatitis via een combinatie van caeruleïne en lipopolysaccharide intraperitoneale injectie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.