Isolatie van kernen uit menselijk intermusculair vetweefsel en stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern

Samenvatting

De biologie van intermusculair vetweefsel (IMAT) is grotendeels onontgonnen vanwege de beperkte toegankelijkheid van menselijk weefsel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor kernisolatie en bibliotheekvoorbereiding van bevroren menselijke IMAT voor sequencing van enkelvoudige kernen RNA om de cellulaire samenstelling van dit unieke vetdepot te identificeren.

Samenvatting

Intermusculair vetweefsel (IMAT) is een relatief onderbelicht vetdepot dat zich tussen spiervezels bevindt. Het IMAT-gehalte neemt toe met de leeftijd en BMI en wordt in verband gebracht met metabole en spierdegeneratieve ziekten; er is echter een groot gebrek aan inzicht in de biologische eigenschappen van IMAT en de wisselwerking met de omringende spiervezels. In de afgelopen jaren heeft single-cell en nuclei RNA-sequencing ons voorzien van celtype-specifieke atlassen van verschillende menselijke weefsels. De cellulaire samenstelling van humaan IMAT blijft echter grotendeels onontgonnen vanwege de inherente uitdagingen van de toegankelijkheid ervan door biopsieverzameling bij mensen. Naast de beperkte hoeveelheid verzameld weefsel, is de verwerking van humaan IMAT gecompliceerd vanwege de nabijheid van skeletspierweefsel en fascia. De met lipiden beladen aard van de adipocyten maakt het onverenigbaar met isolatie van één cel. Daarom is RNA-sequencing met één kern optimaal voor het verkrijgen van hoogdimensionale transcriptomics met een resolutie van één cel en biedt het de mogelijkheid om de biologie van dit depot bloot te leggen, inclusief de exacte cellulaire samenstelling van IMAT. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van kernen en bibliotheekvoorbereiding van bevroren menselijke IMAT voor sequencing van enkelvoudige kernen. Dit protocol maakt het mogelijk om duizenden kernen te profileren met behulp van een op druppels gebaseerde benadering, waardoor het mogelijk is om zeldzame en laagfrequente celtypen te detecteren.

Inleiding

Intermusculair vetweefsel (IMAT) is een ectopisch vetdepot dat zich tussen en rond spiervezels bevindt¹. Zoals in detail beschreven in een recente recensie van Goodpaster et al., kan IMAT worden gedetecteerd met behulp van computertomografie met hoge resolutie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) (Figuur 1A,B) en wordt het gevonden rond en in spiervezels door het hele lichaam¹. De hoeveelheid IMAT varieert sterk van persoon tot persoon en wordt beïnvloed door BMI, leeftijd, geslacht, ras en sedentair^{gedrag 2,3,4}. Bovendien wordt IMAT-afzetting vaak gezien bij pathologische aandoeningen die verband houden met spierdegeneratie⁵, en talrijke onderzoeken hebben een verhoogde IMAT-massa gedocumenteerd bij personen met obesitas, diabetes type 2, metabool syndroom en insulineresistentie 6,7,8,9. Desalniettemin beginnen de cellulaire en biologische eigenschappen van IMAT nog maar net te worden ontrafeld. De beperkte toegankelijkheid en de variatie in IMAT-locaties en -inhoud door het hele lichaam hebben de verzameling van monsters uit dit unieke vetdepot² op de proef gesteld. Bovendien worden monsters bij afname gemakkelijk 'besmet' met skeletspieren (SM), waardoor de scheiding tussen de biologische bijdrage van de verschillende weefsels moeilijk te ontcijferen is (Figuur 1C). Daartoe dient single nuclei RNA-sequencing (snRNA-seq), die de afgelopen tien jaar veel aandacht heeft gekregen, als een ideale methodologie om de scheiding van IMAT- en SM-afgeleide genexpressiepatronen met single-cell resolutie mogelijk te maken. Bovendien is de isolatie van kernen bijzonder nuttig voor vetweefsel vanwege de grote met lipiden beladen adipocyten, die onmogelijk kunnen worden gedissocieerd tot eencellige suspensie zonder de integriteit van de cellen in gevaar te brengen. Ten slotte heeft deze technologie het potentieel om nieuwe markers van IMAT-specifieke adipocyten te ontdekken en de samenstelling en aanwezigheid van verschillende voorlopercelpopulaties bloot te leggen, en om de variatie van de celsamenstelling in pathologische en normale omstandigheden te bestuderen.

Figuur 1: Afbeeldingen van IMAT. Representatief magnetische resonantie (MRI) beeld van IMAT van (A) een magere vrouw van middelbare leeftijd en (B) een man van middelbare leeftijd met obesitas. Rood: onderhuids vetweefsel, geel: intermusculair vetweefsel, groen: skeletspier, blauw: bot. Afbeelding met dank aan Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Vers weefselmonster met IMAT (omcirkeld door een zwarte stippellijn). Afbeelding met dank aan Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute en Bryan Bergman, Universiteit van Colorado. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Goodpaster et ^al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er zijn een aantal studies gepubliceerd uit de vee-industrie die de marmering van vlees (IMAT in het bijzonder) bij varkens, kippen en runderen onderzoeken met behulp van single-cell (sc) en snRNA-seq¹⁰. Deze studies hebben verschillende subpopulaties van adipocyten en markers van potentiële voorlopercellen van IMAT 11,12,13 geïdentificeerd; het is echter niet bekend of deze cellulaire samenstellingen zich vertalen naar menselijke IMAT. Voor zover wij weten, heeft slechts één studie gekeken naar de cellulaire heterogeniteit van menselijke spieren met vetinfiltratie, verkregen van mannelijke patiënten met heupartrose, met behulp van snRNA-seq¹⁴. De onderzoekers rapporteerden een kleine adipocytenpopulatie en verschillende fibro-adipogene voorloper (FAP) subpopulaties binnen de grote populatie van myonuclei¹⁴. Onze studie is de eerste die een methode heeft ontwikkeld om IMAT, handmatig ontleed uit menselijke spieren, direct te ondervragen voor cellulaire samenstelling met behulp van snRNA-seq.

Belangrijk is dat protocollen voor snRNA-seq moeten worden aangepast aan het specifieke bestudeerde weefsel, aangezien de hoeveelheid beschikbaar weefsel en de fysische eigenschappen van het specifieke weefsel de optimale verwerkingsstappen zullen dicteren. De weefselopbrengst voor IMAT is doorgaans klein, vaak niet hoger dan 50 mg, zelfs bij het uitvoeren van echogeleide biopsieën. Daarom is een goede verwerking van dit schaarse weefsel essentieel. Wij zijn van mening dat dit protocol zal dienen als een waardevolle bron voor onderzoekers die menselijke IMAT bestuderen.

Protocol

Het monster dat voor dit protocol werd gebruikt, maakte deel uit van de Study of Muscle, Mobility, and Aging (SOMMA)^15, die werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Western IRB-Copernicus Group (WCG) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor hun deelname aan het onderzoek.

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van een eerder protocol met behulp van 100 mg menselijk abdominaal onderhuids vetweefsel op een op nanowells gebaseerd platform¹⁶. Het huidige protocol is geoptimaliseerd voor 50 mg menselijke IMAT en bibliotheekvoorbereiding met behulp van een op druppels gebaseerd platform. Verdere optimalisatie van dit protocol voor kernisolaties uit niet-menselijke IMAT of andere vetdepots kan nodig zijn.

1. Bereiding van buffers en reagentia (tabel 1 en tabel 2)

OPMERKING: Bereid buffers vers op de dag van het experiment en gebruik ze niet opnieuw.

1. Koel een centrifuge voor op 4 °C.
2. Bereid de homogenisatiebuffer en het kernisolatiemedium voor.
   1. Verpak twee emmers ijs en koel 2 x 15 ml conische buizen voor.
   2. Meng alle reagentia voor de homogenisatiebuffer (HB) in een conische buis van 15 ml in de volgorde vermeld in tabel 1. Blijf op het ijs. Mengen door vortexen.
   3. Meng alle reagentia voor nuclei isolation medium (NIM) in een conische buis van 15 ml in de geordende lijst in tabel 2. Blijf op het ijs. Mengen door vortexen.
   4. Bereid 10% Triton-X voor door 100 μL Triton X-100 toe te voegen aan 900 μL nucleasevrij water. Vortex om een goede menging te garanderen. Bewaren op kamertemperatuur (RT).

Reagens	Inhoud (μL)		Eindconcentratie (mM)
	1x	2x
1 M MgCl2	10	20	5
1 m Tris Buffer, pH 8,0	20	40	10
2 M KCl	25	50	25
1,5 m sucrose (-4°C)	334	668	250
1mM DTT	2	4	0,001 (~1 μM)
100x proteaseremmer	20	40	1x
Superasin 20 E/μL	40	80	0,4 E/μL
Nuclease-vrij water	1549	3098	-
Totaal volume	2000	4000	-

Tabel 1: Homogenisatiebuffer (HB). Blijf op het ijs. Mengen door vortexen.

Reagens	Inhoud (μL)		Eindconcentratie (mM)
	1x	2x
EDTA	0.4	0.8	0.1
Ribolock RNAse-remmer (40U/μL)	40	80	0,8 E/μL
1% BSA-PBS (-/-)	1959.6	3919.2	-
Totaal volume	2000	4000	-

Tabel 2: Nuclei isolatiemedium (NIM). Blijf op het ijs. Mengen door vortexen.

2. Verpulvering van bevroren weefsel ( Figuur 2A)

1. Stel het werkstation in voor homogenisatie.
   1. Vul de bus met vloeibare stikstof (LN₂).
      LET OP: draag bij het werken met LN₂ altijd een veiligheidsbril en cryohandschoenen.
   2. Verkrijg 2x vijzels, 1x stamper, 1x microschepspatel, 1x glazen dounce en 1x roestvrijstalen stamper voor de automatische douncer.
   3. Stel de automatische douncer in.
   4. Vul een beker met ijs en koel het glas dounce voor.
2. Vul de 2 vijzels (met daarin de stamper en spatel) met LN₂ om de instrumenten af te koelen. Laat de LN₂ verdampen en herhaal.
3. Terwijl de instrumenten afkoelen, voegt u 1 ml HB toe aan het glas.
4. Vul beide mortels nog een laatste keer met LN₂ en giet het 50 mg IMAT-monster in een van de mortels.
5. Verpulver de IMAT met behulp van de stamper door hem voorzichtig op het stukje tissue te drukken om hem in kleine stukjes te breken. Zorg ervoor dat alle stukken verpulverd zijn.
6. De LN₂ zal langzaam verdampen tijdens het verpulveren van het weefsel. Wanneer het weefsel goed is verpulverd en er nog 1/4 - 1/2 van een mortel LN₂ over is, kantelt u de mortel naar de lip van de mortel om het verpulverde weefsel bij de lip te verzamelen. Laat de LN₂ volledig verdampen.
7. Onmiddellijk nadat de laatste LN₂ is verdampt, schept u het verpulverde weefsel in de glazen dounce met 1 ml HB.

3. Homogenisatie van verpulverd weefsel

1. Homogeniseer het verpulverde weefsel met behulp van de automatische douncer. Breng de glazen dounce op en neer langs de roestvrijstalen stamper voor 10 slagen in voorwaartse richting, gevolgd door 10 slagen in omgekeerde richting.
2. Zorg ervoor dat de oplossing na homogenisatie troebel is en geen zichtbare stukjes weefsel bevat. Een lichtroze kleur wordt vaak verwacht vanwege vervuiling met spierweefsel.
3. Breng het homogenaat over in een voorgekoelde buis van 1,7 ml met lage binding op ijs.
4. Gebruik 400 μL HB om de dounce te spoelen om ervoor te zorgen dat al het materiaal is overgebracht en voeg het toe aan de buis.
   OPMERKING: Er kunnen twee monsters tegelijk worden verwerkt. Om dit te doen, verdubbelt u de hoeveelheid HB en NIM. Verpulver en homogeniseer één weefselmonster en verpulver en homogeniseer onmiddellijk daarna het tweede weefselmonster om de isolatie- en opruimstappen parallel te kunnen uitvoeren.

4. Isolatie en opruiming van kernen ( Figuur 2B)

1. Voeg 14 μL Triton-X (10%) toe aan het homogenaat voor een concentratie van 0,1%.
2. Houd de tube 10-15 minuten op ijs en in het donker terwijl je elke 3 minuten wervelt.
3. Bevochtig vooraf een celzeef van 100 μm en een celzeef van 40 μm (per monster) met 100 μl RT DPBS voor elk in een conische buis van 50 ml.
4. Filtreer het homogenaat door de 100 μm celzeef.
5. Spoel de tube van 1,7 ml met 400 μl HB en filtreer door de celzeef van 100 μm.
6. Filtreer vervolgens de oplossing door de celzeef van 40 μm.
7. Breng een gelijke hoeveelheid oplossing over in twee voorgekoelde 1,7 ml low-binding buisjes die overeenkomen met ~900 μL in elk buisje.
8. Centrifugeer de buisjes gedurende 10 minuten bij 2700 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren moet er een kleine korrel zichtbaar zijn.
9. Verwijder de bovenste lipidenlaag en de resterende supernatant en gooi deze weg, zodat er een oplossing van ~50 μL uit de eerste buis overblijft.
10. Herhaal dit voor de tweede buis.
11. Resuspendeer de pellet grondig in de eerste buis door voorzichtig 20x op en neer te pipetteren en over te brengen naar een nieuwe 1,7 ml low-bind buis. Vermijd het creëren van bubbels.
12. Herhaal deze procedure voor de tweede buis en breng de geresuspendeerde oplossing over in dezelfde buis.
13. Voeg 500 μL NIM toe en meng met pipetteren.
14. Centrifugeer de buis met een balans bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
15. Verwijder het supernatant, laat ~50 μL over en pipetteer voorzichtig op en neer totdat de pellet opnieuw is gesuspendeerd. Breng eventueel de geresuspendeerde pellet over in een nieuwe schone buis als er wat lipideresten aan de zijkant van de buis achterblijven.
16. Voeg 200 μL NIM toe en meng door te pipetteren.

5. Kleuring en telling van kernen (Figuur 2C en Figuur 3)

OPMERKING : Om het tellen te vergemakkelijken, stelt u een protocol voor het tellen van kernen in op een geautomatiseerde cellenteller, aangezien het aanpassen van het heldere veld en de DAPI-kanalen de telling sterk kan beïnvloeden. Pas de kanalen zo aan dat alleen kernen en geen puin worden opgevangen. Zorg ervoor dat het helderveldkanaal alleen 'objecten' markeert die ook een DAPI-vlek hebben.

1. Voeg 1 druppel van de levende celkleuringsoplossing toe en laat deze 15 minuten in het donker op ijs staan.
2. Filtreer de oplossing door een celzeef van 30 μm.
3. Meng de kernoplossing door te pipetteren en voeg 10 μl van de oplossing toe aan een objectglaasje van de cellentelkamer.
4. Tel kernen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller.
   OPMERKING: De optimale concentratie is 1000 kern/μl, wat overeenkomt met 1,0 x 10⁶/ml.
   1. Zorg ervoor dat er geen klompjes kernen aanwezig zijn, omdat dit de chip kan verstoppen voor het genereren van druppeltjes met één kern (Afbeelding 3).
   2. Als de kernconcentratie niet hoog genoeg is, centrifugeer de oplossing dan gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 1000 x g om een pellet te verkrijgen, verwijder de supernatant en resuspendeer in een kleiner volume.
   3. Als de hoeveelheid vuil in de oplossing hoog is, resuspendeer de kernoplossing dan in een groter volume NIM (d.w.z. 1 ml) en filtreer opnieuw door een celzeef van 30 μm. Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 1000 x g en resuspendeer in voldoende volume in verhouding tot de concentratie van de kernen.
5. Nadat u de kernconcentratie hebt verkregen, gaat u direct verder met de eerste stap in de voorbereiding van de bibliotheek.

Figuur 3: Kleuring van geïsoleerde kernen. Afbeelding van de celteller van kernen gekleurd met NucBlue/DAPI (linkerafbeelding) en het bijbehorende helderveldbeeld (rechterafbeelding). De aanwezigheid van kleine hoeveelheden puin is duidelijk te zien in het heldere veldbeeld. De geautomatiseerde cellenteller die hier wordt gebruikt, heeft geen optie om schaalbalken op te nemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Parameters voor voorbereiding en rangschikking van de bibliotheek

1. Raadpleeg een grondig protocol voor de voorbereiding van de bibliotheek met behulp van de op druppels gebaseerde benadering met één kern die beschikbaar is op de webpagina van de provider¹⁷.
   1. Streef naar een gericht herstel van kernen van 10.000. Voor monsters met een hoog gehalte aan puin of fragiele kernen zou echter een lager aantal teruggevonden kernen worden verwacht.
   2. Bewaar de monsters bij 4°C tot 72 uur na stap 2.3. in het voorbereidingsprotocol van de bibliotheek om de verwerking van meer monsters parallel te combineren. Doe dit door op twee opeenvolgende dagen twee monsters te verwerken tot stap 2.3 en op de derde dag de 4 monsters samen te verwerken uit stap 3 en verder in het voorbereidingsprotocol van de bibliotheek.
2. Sequencingparameters: Sequentie op een sequencingplatform gericht op 50.000 gepaarde lezingen per kern.
   OPMERKING: De gegevens die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn gesequenced op het NovaSeq 6000-platform, met als doel 50.000 gepaarde uitlezingen per kern.

Figuur 2: Protocolwerkstroom. Schematische weergave van de workflow in (A) stappen 2 en 3, (B) stap 4 en (C) stap 5 van het protocol. De figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Gegevensverwerking en -analyse

OPMERKING : In dit protocol worden enkele van de aanbevolen software en R-pakketten die worden gebruikt om de resulterende sequentiegegevens te verwerken, kort geïntroduceerd, waarbij de nadruk ligt op de stappen na de eerste voorbewerking (tabel 3). Deze studie biedt algemene kwaliteitscontrolestatistieken (QC) en een voorbeeld van uniforme variëteitbenadering en projectie (UMAP) in figuur 4. Een diepgaande beschrijving van de bioinformatica-analyse valt echter buiten het bestek van dit protocol. Daarom kunnen lezers verwijzen naar de recente review over best practices voor single-cell analyse door Heumos et ^al.18.

1. Voorbewerking van sequentiegegevens
   1. Wijs de afgelezen enkelvoudige kernen toe aan het menselijke referentiegenoom GRCh38.
   2. Neem intron-metingen op in de telling.
2. Voer QC uit en filtreer de gegevens met behulp van het Seurat R-pakket ¹⁹.
   1. Bereken een celcomplexiteitsscore door het log(10)-aantal gedetecteerde genen te delen door het log(10)-aantal gedetecteerde metingen.
   2. Zet de belangrijkste QC-metrieken uit met behulp van een histogram of vioolplot, inclusief het aantal gedetecteerde genen per kern, het mitochondriale leespercentage en de celcomplexiteitsscore.
   3. Filter kernen uit met minder dan 200 of meer dan 10.000 genen per kern, meer dan 10% mitochondriale metingen en een complexiteitsscore van minder dan 0,8.
3. Normaliseer gegevens en voer dimensionaliteitsreductie uit.
   1. Gebruik de SCTransform-functie van Seurat om de gegevens te normaliseren met behulp van 2000 variabele functies.
   2. Clustergegevens met behulp van de volgende functies uit het Seurat R-pakket: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters en RunUMAP.
   3. Plot een UMAP om de clustering van de gegevens te visualiseren.
4. Filter voorspelde doubletten uit met behulp van het DoubletFinder R-pakket ²⁰ en cluster de gegevens opnieuw.
5. Annoteer clusters met behulp van bekende genmarkers van de celtypen die naar verwachting in het weefsel aanwezig zullen zijn (gesuperviseerde benadering) of op basis van de top 5 differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de clusters (niet-gesuperviseerde benadering).
6. Gebruik decontX²¹om de mate van omringende RNA-contaminatie te bepalen en om de genexpressiematrix voor omringend RNA aan te passen.
   1. Neem de ruwe genenmatrix op als achtergrond.
7. Bewaar het Seurat-object voor toekomstige verkenning van de gegevens.
   OPMERKING: De code voor QC- en clusteringanalyse is beschikbaar in aanvullend bestand 1.

Software/R-pakketten die worden gebruikt in de gegevensworkflow	Alternatieve software/pakketten	Stap van de verwerking
CelRanger	STARsolo, kallisto	Bijsnijden, uitlijnen, in kaart brengen
Seurat	SingleCellExperiment, Cellranger	QC, analyse en gegevensverkenning
DoubletFinder	scds, scdblFinder, Schrobben	Doublet detectie
DecontX	SoupX, CellBender	Aanpassing van omringend RNA

Tabel 3: Software/tools voor gegevensworkflow.

Resultaten

Deze workflow is ontworpen om de verwerking van ingevroren menselijke IMAT-monsters te begeleiden om genexpressieprofielen te verkrijgen met een resolutie van één kern, waardoor identificatie van celtypen mogelijk wordt. Hier wordt een representatieve IMAT-steekproef van een deelnemer aan de SOMMA-studie gepresenteerd.

De eerste stap van elke analyse van snRNA-seq-gegevens is het evalueren van de kwaliteit van de gegevens om kernen van slechte kwaliteit te identificeren, die mogelijk uit de dataset moeten worden verwijderd. Belangrijk is dat de filterstappen en drempels moeten worden bepaald voor het specifieke type monster en dataset dat u bij de hand heeft, aangezien de algemeen geëvalueerde statistieken kunnen verschillen tussen weefsels en celtypen^22,23. Figuur 4A geeft een beeld van enkele van de belangrijkste statistieken die worden gebruikt om de kwaliteit van de gegenereerde snRNA-seq-gegevens te beoordelen. Het aantal gedetecteerde genen per kern is afhankelijk van de sequentiediepte en het celtype, maar zou naar verwachting boven de 200 liggen voor kernen van goede kwaliteit^18,23. Het bleek dat de gegevens die met behulp van dit protocol zijn gegenereerd, binnen het verwachte bereik liggen met een mediaan van 1134 genen per kern, op een totaal van 4662 kernen.

Het percentage mitochondriale lezingen wordt geëvalueerd, aangezien een hoge mate van mitochondriale besmetting kan ontstaan door beschadigde kernen of omringend RNA dat zich aan de kernen hecht, wat wijst op kernen van slechte kwaliteit. In de hier gepresenteerde dataset werd een mediaan mitochondriaal leespercentage van 2,65 gevonden, wat ruim onder de drempel van 5%-20% ligt die gewoonlijk in de literatuur wordt gebruikt 24,25,26. Het percentage ribosomale lezingen verschilt tussen celtypen en weefsels. Aangezien grote hoeveelheden ribosomale genen echter de clustering van de gegevens kunnen beïnvloeden, wordt aanbevolen om het ribosomale leespercentage te controleren en mogelijk ribosomale genen of kernen met hoge niveaus van ribosomale genen uit de dataset te verwijderen voordat ze worden geclusterd. De gegevens die met dit protocol werden gegenereerd, toonden een laag niveau van ribosomale metingen met een mediaan van 2,46% en een maximum van 16,5%, en daarom hebben we niet gefilterd op basis van deze metriek. Ten slotte werd een celcomplexiteitsscore berekend op basis van het log(10) aantal gedetecteerde genen gedeeld door het log(10) aantal gedetecteerde reads. Kernen van goede kwaliteit zullen naar verwachting hoger zijn dan 0,8, en een mediaan van 0,92 werd verkregen in de steekproef die in deze studie werd gebruikt. Op basis van deze QC-metrieken kan men beslissen welke kernen uit de dataset moeten worden gefilterd. Voor analyse hebben we ervoor gekozen om kernen uit te filteren met minder dan 200 of meer dan 10.000 genen per kern, meer dan 10% mitochondriale lezingen en een complexiteitsscore van minder dan 0,8.

Na de eerste stap van de kwaliteitsbeoordeling en filtering kan een UMAP worden gegenereerd om de clustering van de kernen te visualiseren. Clustering werd uitgevoerd op basis van de 2000 meest variabele genen met behulp van SCT-transformatie. De eerste clusterstappen kunnen worden gebruikt om te controleren of een van de QC-kenmerken samenklontert, bijvoorbeeld kernen met hoge mitochondriale aflezingen. Bovendien is clusterinformatie vereist voor sommige doubletdetectiemethoden, waaronder DoubletFinder²⁰, dat in dit protocol werd gebruikt. DoubletFinder werd gebruikt met een verwachte multipletsnelheid ingesteld op 4,8%, zoals voorgesteld door de aanbieders van het op druppels gebaseerde platform. Na verwijdering van het doublet werd het niveau van omringende RNA-besmetting geschat, wat vooral gebruikelijk is bij preparaten met één kern, aangezien RNA na cellyse uit het cytoplasma wordt vrijgegeven en in de gelkralen-in-emulsie (GEM's) wordt gedoseerd en wordt versterkt in de volgende voorbereidingsstappen van de bibliotheek. Daarom zijn er verschillende instrumenten ontwikkeld om het inherente probleem van omringende RNA-contaminatie te corrigeren (zie tabel 3). We gebruikten het R-pakket decontX^21, waarin de ruwe achtergrondmatrix (inclusief alleen lege druppels) wordt gebruikt om de genexpressiematrix aan te passen, waardoor de echte genexpressiesignatuur wordt versterkt.

De clustering en het vermogen om weinig overvloedige celtypen te detecteren, zijn afhankelijk van het aantal kernen. Deze studie detecteerde alle verwachte belangrijke celtypen in IMAT (Figuur 4B) uit een totaal van 3817 kernen na QC-filtering, doubletverwijdering en omringende RNA-aanpassing. Deze omvatten stamcellen, fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) en rijpe adipocyten, evenals pericyten, gladde spiercellen, immuuncellen, spiervoorlopercellen en myonuclei van skeletspiercelbesmetting.

Over het algemeen hebben we aangetoond dat dit protocol gegevens met een hoge resolutie van één kern produceert waarmee annotatie van celtypen kan worden gedetecteerd die belangrijk is voor het ontrafelen van de biologie en cellulaire oorsprong van IMAT.

Figuur 4: Kwaliteitsbeoordeling, clustering en celtype-annotatie van sequentiegegevens. (A) Vioolgrafieken van essentiële metrieken voor de evaluatie van de steekproef en sequentieprestaties, inclusief het aantal gedetecteerde genen per kern, het percentage mitochondriale lezingen, het percentage ribosomale lezingen en celcomplexiteit gemeten als het log(10) aantal gedetecteerde genen gedeeld door het log(10) aantal gedetecteerde lezingen. Mediaanwaarden voor elke metriek worden gegeven in gesloten vakken. Totaal aantal kernen: 4662. (B) UMAP met clustering van individuele kernen en bijbehorende DotPlot met relatieve genexpressie van celtypemerkergenen voor elk cluster na filtering. Aantal kernen: 3817. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: De code voor QC- en clusteringanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Er zijn verschillende inherente uitdagingen aan het werken met IMAT. Naast de beperkte toegankelijkheid is de opbrengst van monstermateriaal vaak zeer schaars en is "besmetting" van skeletspieren bijna onmogelijk te vermijden. Om het monster van de beste kwaliteit te verkrijgen, moet men bij het inbrengen van de biopsienaald de spierfascia binnendringen (om ervoor te zorgen dat er geen onderhuids vetweefsel wordt verzameld) en zoveel mogelijk spierweefsel verwijderen door het monster onmiddellijk na afname onder een microscoop te ontleden, gevolgd door daaropvolgende verwerking voor histologie, snap-freezing, enz. Dit is de eerste methode om IMAT-monsters te gebruiken die prospectief zijn verzameld en ontleed uit skeletspieren. Ter vergelijking: eerdere snRNA-seq-gegevens in IMAT zijn door kernisolaties gegaan van een mengsel van skeletspierbiopten met bekende vetinfiltratie en niet alleen de IMAT.

IMAT is dichter van aard in vergelijking met onderhuids vetweefsel, waardoor een goede verpulvering van het weefsel tijdens de isolatie van kernen essentieel is om kernen uit de weefselstructuur vrij te maken. Onjuiste verpulvering kan leiden tot een lagere opbrengst van de kernen, wat ongunstig is bij een beperkte hoeveelheid weefsel. Bovendien is het berekenen van het juiste aantal kernen in de bereide kernoplossing een cruciale stap om ervoor te zorgen dat er voldoende (maar niet te veel) kernen op de chip worden geladen voor GEM-generatie. Te veel kernen, of de aanwezigheid van grote kernclusters of puin, kan leiden tot een verstopping, wat gevolgen heeft voor de uiteindelijke cDNA-concentratie en uiteindelijk voor de sequentie-output. Het omzeilen van het samenklonteren van kernen en puin in de voorbereiding van enkele kernen is moeilijk en wordt beïnvloed door de kwaliteit van het monster. Het samenklonteren van kernen en/of de aanwezigheid van puin kan worden verminderd door een extra filterstap met de 30 μm celzeef op te nemen.

Het is belangrijk om monsters snel te verwerken om het risico op RNA-afbraak te verminderen. Door oplossingen op ijs of gekoeld te houden tijdens alle mogelijke stappen van kernisolatie, evenals de toevoeging van een voldoende hoeveelheid RNAse-remmers, kan de afbraak tot een minimum worden beperkt. Vanwege het belang van de verwerkingstijd voor elk monster, raden we aan om maximaal twee monsters tegelijk uit te voeren. Bovendien moet er voorzichtig met de kernoplossing worden omgegaan om de kernen niet te kwetsbaar te maken. Fragiele kernen zijn vatbaar voor barsten bij het genereren van GEM, wat kan resulteren in grote hoeveelheden omringend RNA in het monster. In dit protocol werd de filterstap met behulp van een spuit (beschreven in het STAR-protocol¹⁶) uitgesloten om de integriteit van de kernen te behouden.

De keuze van de bibliotheekvoorbereidingsmethode is afhankelijk van de onderzoeksvraag. We hebben gewerkt met zowel een druppel-gebaseerde als nano-well-based single nuclei benadering. De op nano-well-gebaseerde benadering profileert 1200-1600 kernen en ongeveer 3000-6000 gedetecteerde genen per kern¹⁶. Bovendien ondersteunt deze benadering transcriptomics van volledige lengte, wat het onderzoek naar structurele variatie, pseudo-genen en splice-varianten mogelijk maakt²⁷. Ter vergelijking: meer dan 10.000 kernen kunnen worden geprofileerd met behulp van de druppelgebaseerde benadering, maar ten koste van een lager aantal gedetecteerde genen per kern (2-3 keer lager). Voor dit protocol hebben we ervoor gekozen om een van de op druppels gebaseerde platforms te gebruiken, omdat het grotere aantal geprofileerde kernen ons een grotere capaciteit geeft om zeldzame celtypen met een lage abundantie te detecteren²⁸.

De belangrijkste beperking van snRNA-seq is het verlies van cytosolische inhoud, waardoor de expressieanalyse wordt beperkt tot nucleaire transcripten. De kern bevat 10-100 keer minder mRNA dan die van de hele cel²⁹, wat van belang kan zijn voor het blootleggen van alle celtypen in een weefsel. Uit een recente studie van Gupta et al. bleek echter dat nucleaire transcriptomics - vergeleken met transcriptomics²⁹ van hele cellen - vergelijkbare celpopulaties en expressieprofielen van biologisch relevante genen detecteerde in gekweekte pre-adipocyten en rijpe adipocyten. Vergelijkbare resultaten zijn gevonden in andere celtypen^30,31.

Isolatie van enkele kernen heeft zijn voordelen bij het bieden van genexpressiepatronen voor enkelvoudige cellen (sc) van fragiele cellen die onverenigbaar zijn met scRNA-seq. Bovendien kunnen bevroren biobankmonsters worden gebruikt en vereist de isolatie van kernen geen enzymatische vertering van het weefsel, wat een stressreactie in de cellen kan veroorzaken, die het transcriptoom beïnvloedt³². Door snRNA-seq te gebruiken, waren we in staat om adipocyten en andere celtypen die aanwezig zijn in IMAT transcriptioneel te profileren, wat niet mogelijk zou zijn met scRNA-seq omdat adipocyten met lipiden beladen zijn en onverenigbaar zijn met de op druppeltjes gebaseerde benadering.

Een belangrijke toepassing van snRNA-Seq van IMAT is het ontcijferen van de celsamenstelling en transcriptionele verschillen van IMAT in verschillende metabole toestanden. Bovendien kunnen snRNA-seq-datasets worden gebruikt om bulk RNA-seq op IMAT te deconvolueren om verschillen in celsamenstelling op grotere schaal te beoordelen³³. Bovendien kan pseudo-tijdanalyse van snRNA-seq-gegevens dienen om trajecten van celrijping te identificeren, wat van bijzonder belang is in weefsels zoals IMAT, waarin de cellulaire oorsprong van de rijpe adipocyten nog steeds wordt besproken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 µm corning syringe filters	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	22431021	low-bind tubes
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x protease inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetic Separator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics	330002
15 mL canonical tubes	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
50 mL conical tubes	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX accesory kit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µm Cell strainer	Corning Life Science	352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Health care logistics	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µL	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Tissue homogenizer	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020