Methodenartikel

Engineering van door menselijk bloed geïnduceerde microglia-achtige cellen voor omgekeerd translationeel hersenonderzoek

DOI:

10.3791/66819

⸱

6 september 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie schetst een nieuwe benadering voor de oprichting van menselijke monocyt-afgeleide microglia-achtige (iMG) cellen die de indirecte beoordeling van hersenontsteking mogelijk maken. Dit presenteert een cellulair model dat nuttig kan zijn voor onderzoek dat zich richt op mogelijke ontsteking van de hersenen en bijbehorende neuropsychiatrische stoornissen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente onderzoeken met diermodellen hebben het belang van microglia als cruciale immunologische modulatoren bij verschillende neuropsychiatrische en fysieke ziekten benadrukt. Postmortale hersenanalyse en beeldvorming met positronemissietomografie zijn representatieve onderzoeksmethoden die microgliale activering bij menselijke patiënten evalueren; De bevindingen hebben de activering van microglia in de hersenen van patiënten met verschillende neuropsychiatrische stoornissen en chronische pijn aan het licht gebracht. Desalniettemin vergemakkelijkt de bovengenoemde techniek slechts de beoordeling van beperkte aspecten van microgliale activering.

In plaats van hersenbiopsie en de geïnduceerde pluripotente stamceltechniek, bedachten we in eerste instantie een techniek om direct geïnduceerde microglia-achtige (iMG) cellen te genereren uit vers afgeleide menselijke perifere bloedmonocyten door ze gedurende 2 weken aan te vullen met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor en interleukine 34. Deze iMG-cellen kunnen worden gebruikt om dynamische morfologische en moleculaire analyses uit te voeren met betrekking tot fagocytische capaciteit en cytokine-afgifte na stressstimulatie op cellulair niveau. Onlangs is uitgebreide transcriptoomanalyse gebruikt om de gelijkenis tussen menselijke iMG-cellen en primaire microglia in de hersenen te verifiëren.

De van de patiënt afgeleide iMG-cellen kunnen dienen als belangrijke surrogaatmarkers voor het voorspellen van microgliale activering in menselijke hersenen en hebben geholpen bij de onthulling van voorheen onbekende dynamische pathofysiologie van microglia bij patiënten met de ziekte van Nasu-Hakola, fibromyalgie, bipolaire stoornis en de ziekte van Moyamoya. Daarom dient de op iMG gebaseerde techniek als een waardevol omgekeerd translationeel hulpmiddel en biedt het nieuwe inzichten in het ophelderen van de moleculaire pathofysiologie van microglia bij een verscheidenheid aan mentale en fysieke ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is gesuggereerd dat hersenontsteking een cruciale rol speelt in de pathofysiologie van verschillende hersen- en neuropsychiatrische stoornissen; de microglia zijn gemarkeerd als belangrijke immunomodulerende cellen door menselijke postmortale hersenanalyse en op positronemissietomografie (PET) gebaseerde biobeeldvormingstechnieken 1,2,3,4. Postmortale hersen- en PET-beeldvormingsanalyses onthullen significante bevindingen; Desalniettemin zijn deze benaderingen echter inefficiënt in termen van het vastleggen van de dynamische moleculaire activiteiten van menselijke microglia in de hersenen in hun geheel. Daarom zijn nieuwe strategieën nodig om de uitgebreide evaluatie van menselijke microgliale functies en disfuncties op moleculair en cellulair niveau mogelijk te maken.

In 2014 ontwikkelden we oorspronkelijk een nieuwe techniek om direct geïnduceerde microglia-achtige (iMG) cellen 5,6 te produceren, voorafgaand aan de eerste publicatie van van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide microglia-achtige cellen in 20167. In slechts 2 weken hebben we met succes menselijke perifere bloedmonocyten omgezet in iMG-cellen door de cytokines, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 34 (IL-34) te optimaliseren. Toen we deze techniek ontwikkelden, begon de innovatieve herprogrammeringsmethode om neuronale cellen te induceren uit iPS-cellen of fibroblasten net de overhand te krijgen in de wereld 8,9,10,11. Op dat moment was er echter nog geen methode gerapporteerd voor het induceren van iPS-afgeleide microgliacellen en was het genereren van een menselijk somatisch cel-afgeleid microgliamodel gewenst. Aangezien cytokinen zoals GM-CSF en IL-34, macrofaagkoloniestimulerende factor, noodzakelijk werden geacht voor de ontwikkeling en het onderhoud van microglia 12,13,14,15, veronderstelden we dat een combinatie van deze cytokinen direct zou kunnen worden toegepast om een microgliaal cellulair model te genereren uit bloedmonocyten. Ten slotte zijn we erin geslaagd om een model van microglia afgeleid van monocyten te ontwikkelen door GM-CSF en IL-345 te combineren. Bovendien worden sommige van deze combinaties van cytokinen ook gebruikt om microglia uit iPS-cellente induceren 7,16 en wordt aangenomen dat ze een belangrijke factor zijn bij het verkrijgen van microgliale kenmerken.

In tegenstelling tot iPSC-methoden vereisen iMG-cellen geen genetische modificatie en kunnen ze in zeer korte tijd worden gegenereerd door eenvoudige chemische inductie, wat resulteert in lagere tijd- en financiële kosten. Bovendien vereisen iMG-cellen geen genetische herprogrammering, dus we zijn van mening dat iMG-cellen krachtige surrogaatcellen zijn om niet alleen de eigenschappen, maar ook de toestanden van menselijke microglia te evalueren. In het eerste artikel over de iMG-techniek in 2014 bevestigden we dat iMG-cellen een fenotype van menselijke microglia vertonen, dat kan verschillen van monocyten en macrofagen. iMG-cellen vertoonden bijvoorbeeld een overexpressieverhouding van CX3C-chemokinereceptor 1 (CX3CR1) en C-C-chemokinereceptor type 2 (CCR2) dan monocyten en typische microglia-markers, waaronder transmembraaneiwit 119 (TMEM 119) en purinerge receptor P2RY12 5,17. Onlangs hebben we gevalideerd dat perifere bloed-afgeleide iMG-cellen lijken op hersenmicroglia in hun genexpressieprofiel van bekende microgliale markers bij dezelfde patiënt die hersenoperaties onderging18. De iMG-cellen kunnen worden geanalyseerd op dynamische functies op moleculair niveau, zoals fagocytose en cytokineproductie, en zullen naar verwachting de nadelen van postmortaal hersenonderzoek en PET-onderzoeken compenseren.

We hebben voorheen onbekende dynamische pathofysiologische mechanismen ontdekt waarbij microglia betrokken zijn bij patiënten met de diagnose Nasu-Hakola-ziekte5, fibromyalgie19, bipolaire stoornis20,21 of de ziekte van Moyamoya22. Bovendien hebben verschillende laboratoria, op basis van onze oorspronkelijke methodologie, de iMG-cellen gebruikt (bepaalde laboratoria hebben alternatieve namen voor deze cellen aangewezen) als een cruciaal reverse-translationeel onderzoeksinstrument 23,24,25,26,27. Sellgren et al. genereerden met succes iMG-cellen in overeenstemming met onze aanbevelingen en voerden een microarray-analyse uit, waaruit bleek dat deze cellen sterk lijken op microglia van de menselijke hersenen23. Onlangs hebben we de gelijkenis tussen menselijke iMG-cellen en primaire microglia in de hersenen bevestigd met behulp van RNA-sequencing18.

Deze studie had tot doel de methodologie te documenteren om iMG-cellen te genereren uit menselijk perifeer bloed om omgekeerd translationeel onderzoek gericht op neuropsychiatrische ziekten te vergemakkelijken. Deze techniek biedt potentieel als een redelijk analytisch hulpmiddel dat moeiteloos microgliale cellulaire modellen in korte tijd kan produceren, zelfs in slecht uitgeruste laboratoria die geen apparatuur voor genoverdracht of bekwaam personeel hebben.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Kyushu Universiteit en voldeed aan alle bepalingen van de Verklaring van Helsinki. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers, inclusief gezonde vrijwilligers en patiënten, om hun bloed te analyseren en hun gegevens te publiceren. Materialen en apparatuur worden vermeld in de Tabel met materialen en de samenstellingen van de oplossingen worden gedetailleerd beschreven in Tabel 1.

1. Voorbereiding van media en buffers voor experimenten

  1. Bereid het isolatiemedium voor door RPMI-1640 aan te vullen met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (56 °C, 30 min) en 1 % penicilline-streptomycine.
  2. Bereid de isolatiebuffer voor door de basisbufferoplossing aan te vullen met 0,5% runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing en steriliseer deze via filtratie (0,22 μm).

2. Isolatie van mononucleaire cellen uit volbloed

  1. Breng 15 ml van het dichtheidsgradiëntmedium over in een dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuis van 50 ml en centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 1 minuut bij 20 °C.
    OPMERKING: Isoleer 15 ml bloed per centrifugatiebuisje met dichtheidsgradiënt van 50 ml. Verhoog het aantal buisjes wanneer het bloedvolume hoog is.
  2. Homogeniseer het bloed dat in de heparinebuisjes is verzameld door inversie en verwijder het deksel van het bloedafnamebuisje met een vuurgesteriliseerd pincet.
  3. Doseer een gelijk volume (10-15 ml) bloed in het dichtheidsgradiëntmedium in de dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuis.
  4. Stel het vertragingsniveau van de centrifuge in op 1 van de 4 niveaus en centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: Bij deze vertragingssnelheid komt een toerental van 180 × g (1.000 tpm) in 3 minuten tot stilstand.
  5. Bereid een gelijk aantal centrifugebuisjes van 50 ml voor als de centrifugeerbuisjes met dichtheidsgradiënt van 50 ml en vul elk buisje met 10 ml PBS (−).
  6. Verwijder na het centrifugeren de bovenste laag plasma tot ongeveer 1 cm boven de buffy coat.
    NOTITIE: Steek een aanzuigpipet verticaal in de buis en zuig voorzichtig op vanuit het midden van het vloeistofoppervlak. Niet te veel aspireren om te voorkomen dat de buffy coat wordt verstoord.
  7. Decanteer al het resterende supernatans van de centrifugatiebuis met dichtheidsgradiënt van 50 ml in een centrifugebuis met 10 ml PBS (−).
  8. Reset het vertragingsniveau van de centrifuge naar 3 van de 4 niveaus en centrifugeer bij 250 × g gedurende 10 minuten bij RT. Bereid tijdens deze stap een centrifugebuisje van 50 ml en twee centrifugebuisjes van 15 ml en een celzeef van 100 μm voor.
  9. Stel na het centrifugeren de temperatuur van de centrifuge in op 4 °C. Zoek naar een witte korrel met een rode periferie aan de onderkant van de centrifugebuis. Verwijder het supernatans door aspiratie en maak de pellet voorzichtig los door te tikken.
  10. Plaats een celzeef van 100 μm op de conische buis van 50 ml met behulp van een vuurgesteriliseerd pincet.
  11. Voeg 13 ml isolatiemedium toe aan een van de gecentrifugeerde buisjes en was de binnenwand om de cellen goed te verzamelen. Neem de celsuspensie en was de resterende gecentrifugeerde buisjes op een opeenvolgende manier. Nadat u de cellen uit alle buisjes hebt verzameld, filtert u de celsuspensie door een celzeef in de conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Het isolatiemedium moet tijdens het isolatieproces worden gekoeld (stappen 2.11-2.16).
  12. Was elke tube opnieuw met 13 ml isolatiemedium zoals beschreven in stap 2.11. Verzamel in totaal 26 ml celsuspensie.
  13. Doseer gelijke hoeveelheden in twee conische buisjes van 15 ml, noteer de cellen en bereken de juiste concentratie van de isolatiebuffer (60 μl buffer per10,7 totale cellen) voor stap 2.16.
    OPMERKING: De conische buis van 15 ml is beter om mee te werken omdat het vloeistofvolume klein is en de vloeistof gemakkelijk bubbelt bij het pipetteren in stap 2.16.
  14. Centrifugeer bij 250 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  15. Desinfecteer tijdens het centrifugeren de magnetische standaard (vooral het deel dat in contact komt met de kolom) grondig met 70% ethanol en plaats deze op de bank om aan de lucht te drogen. Bewaar de isolatiebuffer op ijs.
  16. Verwijder het supernatans door aspiratie (zoek in dit stadium naar rode pellets van ~1 mm dik vanwege de aanwezigheid van rode bloedcellen), voeg de juiste hoeveelheid isolatiebuffer toe en maak de pellet voorzichtig los door ~20x te pipetteren.

3. Isolatie van monocyten met behulp van CD11b-microbeads

  1. Vortex humaan FcR-blokkerend reagens gedurende 10 s voorafgaand aan het aanbrengen. Voeg de vereiste hoeveelheid reagens toe (20 μL FcR-blokkerend reagens per 10,7 cellen in totaal) en incubeer in een kamer bij 4 °C gedurende 5 minuten.
  2. Draai de CD11b-microbeads gedurende 10 s voor het aanbrengen. Voeg de vereiste hoeveelheid reagens toe (20 μL CD11b-microbeads per 10,7 cellen in totaal) en incubeer gedurende 20 minuten in een kamer van 4 °C terwijl u elke 5 minuten met de hand roert.
  3. Voeg na de incubatie 10 ml isolatiebuffer toe, suspendeer door voorzichtig pipetteren en centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Plaats tijdens het centrifugeren de magnetische kolom op de magnetische standaard en spoel deze af met 3 ml isolatiebuffer.
    NOTITIE: Raak het magnetische deel van de zuil niet aan en plaats de zuil correct. Als er luchtbellen in de kolom komen, verwijder deze dan met een pipet. De isolatiebuffer moet gedurende het hele isolatieproces worden gekoeld (stappen 3.4-3.9).
  5. Verwijder het supernatans na het centrifugeren door aspiratie, voeg 1 ml isolatiebuffer toe, meng door voorzichtig te pipetteren en breng de suspensie aan op de kolom.
  6. Was de kolom 3x door elke keer dat het kolomreservoir leeg is 3 ml isolatiebuffer toe te voegen.
  7. Plaats de kolom in een conische buis van 15 ml zonder het magnetische deel aan te raken; Voeg 5 ml isolatiebuffer toe aan de kolom en duw de vloeistof door de kolom naar buiten met een zuiger die in de buis wordt ingebracht.
  8. Centrifugeer de in de buis opgevangen celsuspensie bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  9. Aspireer het supernatans en resuspendeer de cellen in isolatiemedium. Aangezien ~5-10% van het aantal cellen dat in stap 2.13 is geteld, wordt hersteld, past u het suspensievolume aan op basis van het aantal cellen.
    OPMERKING: Isolatiemedium moet worden gebruikt bij RT en niet worden verwarmd om een snelle temperatuurverandering van 4 °C te voorkomen.
  10. Tel de cellen op en aliquot 500 μl celsuspensie in elk putje met platen met 24 putjes in een concentratie van 40 ×10 4 cellen/ml en incubeer een nacht.
    OPMERKING: De celsuspensies moeten op de juiste manier worden gepipetteerd in overeenstemming met het aangepaste zaaivolume dat nodig is voor verschillende platen. Bijvoorbeeld, 1 ml voor één putje in een plaat met 12 putjes en 250 μl voor één putje in een objectglaasje met 8 putjes.
  11. Gooi ten slotte de besmette apparatuur weg of desinfecteer deze in overeenstemming met het beleid voor het omgaan met besmettelijk afval dat door de faciliteit is opgesteld.

4. Inductie van iMG-cellen uit monocyten

  1. Bereid het inductiemedium voor door het basale inductiemedium aan te vullen met 1% antibiotica-antimycotische oplossing, 10 ng/ml recombinant humaan GM-CSF en 100 ng/ml recombinant humaan IL-34.
  2. Vervang het isolatiemedium van de vorige dag door inductiemedium. Kantel de plaat naar voren en zuig het uitgeputte medium onmiddellijk op vanaf de voorkant van de putbodem met een pasteurpipet. Vervang het medium met een snelheid van maximaal 1 plaat (= 24 putjes) per keer en voeg onmiddellijk voorzichtig 500 μL inductiemedium toe.
    OPMERKING: Verkleefde monocyten moeten in deze stap worden geselecteerd.
  3. Incubeer de cellen gedurende 14 dagen om de inductie te voltooien.
  4. Vervang het medium na 14 dagen weer door 500 μL inductiemedium. Vervang vervolgens, voor het onderhoud van de cellen na inductie, het inductiemedium elke week door 500 μL vers inductiemedium.

5. Immunocytochemie

  1. Verwijder het medium uit het met cellen bezaaide objectglaasje met 8 putjes in stap 3.10 door middel van aspiratie en spoel af met PBS (−).
  2. Fixeer de cellen gedurende 20 minuten bij RT met 4% paraformaldehyde.
  3. Verwijder het fixeermiddel en spoel de cellen gedurende 3 x 5 minuten met PBS (−).
  4. Permeabiliseer de cellen met PBS (−) met 0,1% Triton X-100 bij RT.
  5. Incubeer de gepermeabiliseerde cellen met een blokkerende oplossing (3% BSA/PBS (−)) gedurende 1 uur bij RT.
  6. Incubeer de cellen 's nachts met primaire antilichamen (materiaaltabel) bij 4 °C.
    OPMERKING: Alle antilichamen worden verdund in een blokkerende oplossing.
  7. Spoel de cellen gedurende 3 x 5 minuten met PBS (−) gedurende 5 minuten elk.
  8. Incubeer de gespoelde cellen met de juiste fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij RT (Table of Materials).
  9. Spoel de cellen 3 x 5 minuten met PBS (−) om de secundaire antilichamen te verwijderen.
  10. Incubeer de cellen met DAPI (1:10.000) oplossing verdund met PBS (−) gedurende 5 minuten bij RT.
  11. Spoel de cellen 3 x 5 minuten met PBS (−).
  12. Monteer de put met behulp van het montagemedium en visualiseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belangrijk is dat er veel heterogeniteit op persoons- en timingniveau is in de karakters van iMG-cellen, inclusief morfologieën en genexpressies. De iMG-cellen nemen bij sommige individuen een talrijk vertakt uiterlijk aan (Figuur 1A), terwijl ze bij andere bolvormig blijven (Figuur 1B). De iMG-kenmerken kunnen zelfs binnen een enkel individu verschillen, waardoor iMG-cellen een cruciaal hulpmiddel zijn voor het detecteren van biomarkers voor de ziektetoestand. Omgekeerd rechtvaardigt het onderzoek van dergelijke interindividuele verschillen de vermindering van technische fouten. De iMG-cellen worden gedefinieerd als monocyten geïnduceerd met GM-CSF en IL-34 gedurende minimaal 14 dagen. Om technische fouten tot een minimum te beperken, wordt aanbevolen om de inductietijd te standaardiseren, dezelfde hoeveelheden reagentia te gebruiken en af te zien van het gebruik van verlopen reagentia.

Validatie van immunokleuring bevestigt ook dat iMG-cellen microgliale markers tot expressie brengen, waaronder P2RY12 en TMEM119 (Figuur 2). Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de morfologische en genexpressiekenmerken van iMG-cellen geassocieerd zijn met de pathofysiologie van een bipolaire stoornis20,21. De vroegst vertakte cellen werden waargenomen op DAG 3 na behandeling met GM-CSF en IL-34, en iMG-cellen in optimale conditie kunnen meer dan 1 maand overleven wanneer eenmaal per week een gemiddelde verandering wordt uitgevoerd. De iMG-cellen kunnen worden gebruikt voor analyse van genexpressie. Onder stimulatie met interferon-gamma of IL-4 veranderden iMG-cellen bijvoorbeeld het genexpressiepatroon, dat kan worden gebruikt voor de functionele evaluatie van M1 en M2 gepolariseerde microglia 5,22. Bovendien veroorzaken FITC-korrels amoeboïde-achtige morfologische modificaties en reguleren ze de expressie van TNFα en andere genen5. Bovendien kan fagocytose worden geëvalueerd door de fluorescentie-intensiteit van de korrels te meten 5,22. Aangezien iMG-cellen levensvatbare cellen zijn, kunnen hun daadwerkelijke beweging en morfologische veranderingen bovendien worden waargenomen door het maken van celfoto's (Figuur 3) of door middel van time-lapse-fotografie (Video 1).

figure-results-1
Figuur 1: Morfologie van iMG-cellen. (A) Typische vertakte iMG vertoonde minuscule soma-lichaampjes en talrijke vertakte collateralen. (B) Bepaalde monsters varieerden in uiterlijk, zoals het ameboïde type. Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunocytokleuring van iMG-cellen. iMG-cellen brengen typische microgliale markers tot expressie: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Morfologische modificaties in iMG-cellen. iMG veranderen hun morfologie tijdens het inductieproces. Celuitsteeksels verschijnen (A) rond dag 3 en worden langer op dag (B) 7 en (C) 14 naarmate de inductie vordert. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Time-lapse fotografie van iMG-cellen. De vertakte iMG-cel in het midden leek contact te maken met de omringende cellen terwijl ze hun processen uitbreidden en samentrokken. Bovendien voerde de cel fagocytose uit van beschadigde cellen. De intervallen voor het verzamelen van beelden waren 46 sec en de filmtijd was ongeveer 14 uur. Klik hier om deze video te downloaden.

Tabel 1: Samenstelling van de oplossingen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analytische technieken waarbij gebruik wordt gemaakt van iMG-cellen kunnen dienen als krachtige reverse-translationele onderzoeksinstrumenten 5,6. Om voldoende hoeveelheden menselijke iMG-cellen te genereren, moeten onderzoekers bij het ontwerpen van hun studies rekening houden met bepaalde kwesties. Bloedmonsters afkomstig van mensen zijn extreem gevoelig; Bijgevolg garanderen de verkregen monsters een snelle verwerking en een nauwgezette behandeling om besmetting te voorkomen. In het bijzonder moeten bloedmonsters onmiddellijk na het afnemen worden gescheiden en niet voor langere tijd onbeheerd worden achtergelaten. Experimenten worden conventioneel binnen 3 uur na bloedafname gestart om hun geldigheid te bevestigen; het is echter mogelijk om bloedmonsters langer dan 3 uur bij 4°C te bewaren en op kamertemperatuur te brengen voordat met scheidingsprotocollen wordt begonnen.

Om stabiele resultaten te garanderen, wordt aanbevolen om reagentia zoals kweekmedia binnen een maand na het verbreken van de verzegeling te gebruiken en na afloop weg te gooien. Bij het scheiden van perifere mononucleaire bloedcellen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie, kan celaggregatie worden waargenomen in bepaalde monsters. In dergelijke gevallen moet het volbloedmonster worden verdund met PBS (−) om samenklontering te voorkomen. Tijdens de inductie van differentiatie in microglia wordt het kweekmedium gedurende 14 dagen niet vervangen om onnodige stimulatie van de cellen te voorkomen. Na voltooiing van de differentiatie-inductie kan mediumvervanging door vers medium de verzwakte cellen herstellen en de levensvatbaarheid een tijdje behouden.

De iMG-techniek die in deze studie is vastgesteld, heeft een beperking; De experimenteel geïnduceerde "microglia-achtige cellen" zijn vergelijkbaar, maar niet volledig identiek aan de werkelijke microgliacellen in het menselijk brein. Bovendien heeft eerder onderzoek de methodologie gedocumenteerd voor de inductie van van menselijke monocyten afgeleide microglia-achtige cellen, en verschillende onderzoeksgroepen hebben hun eigen specifieke protocollen en namen voorgesteld, afhankelijk van de oorspronkelijke iMG-methoden. Bepaalde protocollen gebruiken bijvoorbeeld M-CSF 29,30,31,32 of TGF-β 33, waarvan wordt gemeld dat ze een microglia-achtig fenotype bevorderen in iPSC-afgeleide microgliaculturen of op coatings zoals Geltrex 24,34; Deze factoren kunnen effectief blijken te zijn voor het induceren van microglia-achtige cellen.

De originele iMG-technologie is voordelig vanwege het eenvoudige en gemakkelijk te reproduceren protocol met slechts twee cytokines en geen coatings, waardoor een verscheidenheid aan omgekeerde translationele experimenten met menselijk bloed mogelijk is. Omgekeerd heeft de technologische vooruitgang de ontwikkeling van veel producten mogelijk gemaakt. Magnetische scheidingsmethoden omvatten op kolommen gebaseerde positieve selectie, vergelijkbaar met ons protocol, evenals negatieve selectie en kolomvrije methoden. Bovendien kan in plaats van magnetische scheiding een alternatieve scheidingsmethode met behulp van plastische hechting worden overwogen. Positieve selectie op basis van kolommen zorgt voor zuiverheid, maar de techniek is tijdrovend en stimulatie door magnetische kralen heeft een aanzienlijke invloed op de cellen35. Integendeel, negatieve selectie en plastische adhesie kunnen minder schadelijk zijn voor de cellen; Desalniettemin kunnen deze benaderingen minder zuiver zijn 35,36. Verdere aanpassingen kunnen in de toekomst nodig zijn op basis van andere protocollen.

De bovengenoemde bevindingen onderbouwen dat het overheersende voordeel van deze iMG-technologie de korte duur, de kosteneffectieve methodologie en het vermogen is om een groot aantal monsters te verwerken voor high-throughput-studies. Daarom kan deze technologie worden gebruikt om kennis te vergaren uit menselijke monsters en vervolgens verdere validatiestudies uit te voeren met behulp van verschillende diermodellen. Bovendien kunnen de bevindingen die zijn verkregen uit onderzoeken die zijn uitgevoerd op cellulaire en diermodellen door toepassing van de iMG-techniek nuttig zijn. Op deze manier kan onze iMG-techniek worden toegepast op bidirectioneel translationeel onderzoek op een bedside-to-bench en bench-to-bedside manier.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de volgende subsidies voor wetenschappelijk onderzoek: (1) De Japanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 en JP22H00494 aan TAK, JP22H03000 aan M.O.); (2) Het Japanse Agentschap voor Medisch Onderzoek en Ontwikkeling (AMED; JP21wm0425010 naar TAK, JP22dk0207065 naar M.O.) en (3) Het Japanse Agentschap voor Wetenschap en Technologie CREST (JPMJCR22N5 aan TAK). De financieringsinstanties namen geen rol op zich bij de opzet van het onderzoek, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. We willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor de Engelse taalbewerking.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
4% paraformaldehydeNacalai Tesque09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)gibco15240-062beschreef als "antibioticum-antimycotische oplossing"
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222beschreef als "basisbufferoplossing" en gebruikt voor "isolatiebuffer"
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130–049-601
DAPI-oplossingDOJINDO28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineNacalai Tesque14249-24beschreef als "PBS (−)"
Fetal Bovine SerumbiowestS1760-500
Human FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec130–059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290beschreef als "dichtheidsgradientcentrifugeringsbuis"
MACS LS kolommenMiltenyi Biotec130-042-401beschreef als "magnetische kolom"
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376beschreef als "runderserumalbumine (BSA) stockoplossing"
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303beschreef als "magnetische standaard"
Penicilline-StreptomycineNacalai Tesque26253–84
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144beschreef als "montagemedium"
recombinant humaan GM-CSFR&D Systems215-GM
recombinant humaan IL-34R&D Systems5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (voorgevuld medium)Thermo Fisher Scientific61870036beschreef als "basisinductiemedium"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
Antilichamen
anti-P2RY12-antilichaamSigma-AldrichHPA014518primair antilichaam, konijn, 1:100
anti-TMEM119-antilichaamSigma-AldrichHPA051870primair antilichaam, konijn, 1:100
Geiten anti-konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbed secundair antilichaam, Alexa Fluor 568invitrogenA-11011secundair antilichaam, konijn, 1:1000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
  2. Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
  3. Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
  4. Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
  5. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957(2014).
  6. Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).
  7. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  8. Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
  9. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  10. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
  11. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  12. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
  13. Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
  14. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317(2011).
  15. Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
  16. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  17. Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756(2023).
  18. Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
  19. Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).
  20. Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676(2016).
  21. Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
  22. Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).
  23. Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  24. Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
  25. Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).
  26. You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).
  27. Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).
  28. Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
  29. Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8(2017).
  30. Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).
  31. Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
  32. Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).
  33. Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
  34. Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
  35. Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
  36. Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Menselijke bloedmonocytenreverse translationeel onderzoekneuropsychiatrische stoornissencelisolatiedichtheidsgradi ntmagnetische celseparatiecytokineruilsingfagocytische capaciteitgranulocyt macrofage factor

Gerelateerde artikelen