Methodenartikel

Beoordeling van functioneel herstel van eupneuïsche middenrifactiviteit na unilaterale cervicale ruggenmerghemisectie bij ratten

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66828

⸱

14 juni 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic

In dit artikel

Samenvatting

Respiratoire complicaties zijn de belangrijkste doodsoorzaak bij personen met cervicale dwarslaesie (cSCI). Diermodellen van cSCI zijn essentieel voor mechanistische evaluaties en preklinische studies. Hier introduceren we een reproduceerbare methode om functioneel herstel van de activiteit van de middenrifspier (DIAm) te beoordelen na unilaterale C2 spinale hemisectie (C2SH) bij ratten.

Samenvatting

Na cSCI kan de activering van de DIAm worden beïnvloed, afhankelijk van de omvang van het letsel. Het huidige manuscript beschrijft een unilateraal C2 hemisectie (C2SH) model van cSCI dat de eupneïsche ipsilaterale diafragma (iDIAm) elektromyografische (EMG) activiteit tijdens het ademen bij ratten verstoort. Om het herstel van de DIAm-motorische controle te evalueren, moet eerst de omvang van het tekort als gevolg van C2SH duidelijk worden vastgesteld. Door een volledig initieel verlies van iDIAm EMG tijdens de ademhaling te verifiëren, kan het daaropvolgende herstel worden geclassificeerd als afwezig of aanwezig, en kan de mate van herstel worden geschat met behulp van de EMG-amplitude. Bovendien kan het succes van de initiële C2SH worden gevalideerd door de aanhoudende afwezigheid van iDIAm EMG-activiteit tijdens de ademhaling na de acute spinale shockperiode na C2SH te meten. Het meten van contralateraal diafragma (cDIAm) EMG-activiteit kan informatie opleveren over de compenserende effecten van C2SH, die ook neuroplasticiteit weerspiegelt. Bovendien kunnen DIAm EMG-opnames van wakkere dieren essentiële fysiologische informatie verschaffen over de motorische controle van de DIAm na C2SH. Dit artikel beschrijft een methode voor een rigoureus, reproduceerbaar en betrouwbaar C2SH-model van cSCI bij ratten, dat een uitstekend platform is voor het bestuderen van respiratoire neuroplasticiteit, compenserende cDIAm-activiteit en therapeutische strategieën en geneesmiddelen.

Inleiding

Er zijn meer dan 300.000 mensen met een dwarslaesie (SCI) in de Verenigde Staten, van wie ongeveer de helft cervicaal letselheeft. Deze verwondingen leiden tot een aanzienlijk verlies van welzijn en leggen een financiële druk op individuen, hun families en het gezondheidszorgsysteem. Gelukkig zijn de meeste SCI's onvolledig, wat het potentieel biedt voor versterking van gespaard gebleven paden1. Deze neuroplasticiteit kan herstel van ten minste een deel van de functie mogelijk maken, waaronder DIA-activiteit, wat belangrijk is voor beademings- en niet-beademingsgedrag. Het bevorderen van neuroplasticiteit is dus een veelbelovende onderzoeksrichting om mensen met SCI2 te helpen.

Knaagdiermodellen van dwarslaesie hebben het potentieel om substantieel bij te dragen aan de ontdekking van behandelingen om de menselijke gezondheid te verbeteren. Een van de klassieke modellen van dwarslaesie die worden gebruikt om neuroplasticiteit te bestuderen, is een eenzijdige doorsnede (hemisectie) van het ruggenmerg bij C2 (C2SH), waarbij de contralaterale zijde intact blijft 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Het effect van C2SH op de phrenische output en het belang van gespaard gebleven contralaterale routes werd meer dan honderd jaar geleden voor het eerst onthuld door Porter12, wiens baanbrekende artikel de basis legde voor moderne studies van respiratoire neuroplasticiteit. Het C2SH-model onderbreekt de dalende input van de rostrale ventrale respiratoire groep (rVRG) in de medulla, die premotorische neuronen bevat die verantwoordelijk zijn voor het overbrengen van de output van respiratoire ritmegeneratie14. Deze rVRG premotorische neuronen zenden ook exciterende neurale drive uit naar frene motorneuronen (Figuur 1). Verschillende onderzoekers hebben verschillende benaderingen gekozen voor het C2SH-model 10,11,15,16, wat gedeeltelijk een deel van de variabiliteit in herstel in verschillende onderzoeken kan verklaren. Kortom, benaderingen variëren in termen van het sparen van de dorsale funiculi, het uitvoeren van een volledige hemisectie of het uitvoeren van een laterale gedeeltelijke transsectie die de dalende input van de ipsilaterale rVRG niet volledig onderbreekt. Over het algemeen zijn C2SH-modellen bijzonder nuttig voor het bestuderen van respiratoire neuroplasticiteit vanwege de snelheid van spontaan herstel van eupneutische iDIAm elektromyografische (EMG) activiteit in de loop van de tijd, die kan worden verbeterd door verschillende factoren, waaronder neurotrofe signalering 17,18,19,20,21. Een initieel functieverlies - gedefinieerd als het uitschakelen van eupneïsche iDIAm EMG-activiteit - moet echter eerst worden vastgesteld voordat herstel duidelijk kan worden geclassificeerd. Deze validatie van inactiviteit op het moment van C2SH is in verschillende onderzoeken niet gedaan 3,4,6,7,11,22,23.

Histologische beoordelingen van het uitgesneden ruggenmerg leveren alleen bewijs van schade aan de juiste locatie van ipsilaterale excitatoire bulbospinale routes die frene motorneuronen in het ruggenmerg innerven, maar histologie vervangt geen fysiologisch bewijs (bijv. DIAm EMG). Bovendien worden histologische beoordelingen in ex vivo uitgevoerd op terminale tijdstippen (vaak enkele weken tot maanden na het letsel) enleveren ze geen "real-time" informatie op. Sommige onderzoekers hebben opgemerkt dat de grootte van de laesie verband houdt met de hoeveelheid functioneel tekort of het ontbreken daarvan 5,24,25,26. Het is belangrijk op te merken dat de geldigheid van dergelijke beweringen waarschijnlijk sterk afhankelijk is van hoe "functie" wordt geclassificeerd (d.w.z. wat de functionele taken zijn en hoe ze worden gekwantificeerd), en de variabiliteit tussen studies benadrukt de moeilijkheid om functioneel identieke laesies bij dieren te produceren. Onderzoekers hebben inderdaad benadrukt dat de relatie tussen de mate van letsel en de locomotorische functie van de ledemaatspieren (gekwantificeerd door de Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) score24) niet lineair27,28 is. In eerdere studies hebben we geen verband gevonden tussen de mate van de C2SH en de mate van herstel van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit na letsel 10,29,30,31, hoewel andere onderzoekers een verband hebben gerapporteerd tussen de beademingsfunctie en de mate van witte stof die 5 spaart. In het geval van het C2SH-model is een benadering voor functionele validatie van iDIAm-inactiviteit op het moment van de operatie en bij voorkeur vroeg in het tijdsverloop van experimenten met chronische ruggenmergletsel dus zowel nuttig als noodzakelijk.

Het huidige artikel onderstreept het gebruik van DIAm EMG voor real-time bevestiging van het initiële verlies van DIAm EMG tijdens de ademhaling na de C2SH, evenals daaropvolgende bevestigende beoordelingen 3 dagen (dag 3) na het letsel 18,21,31,32,33. In eerder werk met het C2SH-model werden herhaalde laparotomieën uitgevoerd om DIAm EMG 10,13,30,34 vast te leggen. Recenter werk heeft echter chronische EMG-elektroden gebruikt, waarmee EMG kan worden opgenomen bij verdoofde en wakkere ratten. Bovendien verminderen chronische elektroden het risico op pneumothorax en vereisen ze geen herhaalde laparotomieën, wat remming van de DIAm kan veroorzaken35,36. Hoewel versies van het C2SH-model door veel onderzoekers zijn gebruikt, was er op het moment vande operatie geen bevestiging van het uitschakelen van iDIAm-activiteit 3,4,6,7,11,22,23. Zonder een dergelijke bevestiging van inactiviteit is het moeilijk om te weten welk deel van het daaropvolgende herstel moet worden toegeschreven aan de neuroplasticiteit van ipsilaterale versus contralaterale routes, die differentiële effecten kunnen hebben. Dit is een belangrijke overweging omdat de inspiratoire neurale aandrijving van de rVRG naar phrenische motorneuronen voornamelijk ipsilateraal is, met een verlies van ongeveer 50% van de excitatoire glutamaterge input naar phrenische motorneuronen na C2SH33. Er zijn echter resterende inspiratoire prikkelende inputs van de contralaterale rVRG die onder de plaats van de laesie decusseren om ipsilaterale frenische motorneuronen te innerveren en kunnen worden versterkt via neuroplasticiteit om functioneel herstel te bevorderen. Door de overheersende ipsilaterale prikkelende input naar frene motorneuronen te verwijderen, gaat eupneïsche iDIAm EMG-activiteit verloren (althans onder anesthesie), terwijl de activiteit van de cDIAm doorgaat en zelfs wordt versterkt. Het verlies van iDIAm EMG-activiteit tijdens de ademhaling is dus een maat voor een succesvolle C2SH (Figuur 2).

Een bepaald niveau van iDIAm EMG-activiteit is al 1-4 dagen na C2SH aanwezig bij wakkere dieren23,37. Bovendien is bij gedecrebraatte dieren de iDIAm-activiteit aanwezig binnen enkele minuten tot uren na de bovenste cervicale hemisectie en wordt deze onderdrukt door anesthesie38. Bovendien wordt het succes van de C2SH gevalideerd door de afwezigheid van iDIAm EMG-activiteit tijdens de ademhaling (eupneu) bij verdoofde ratten op dag 3 na het letsel te bevestigen. Confocale beeldvormingsstudies bevestigden het verlies van glutamaterge synaptische inputs op phrenic-motorneuronen tijdens dit beginstadium van het letsel37. Als er op dag 3 na het letsel enige resterende eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit is, wordt dit geïnterpreteerd als bewijs van onvolledige verwijdering van ipsilaterale dalende inspiratoire drive van de rVRG. Het huidige artikel is verdeeld in drie secties: (1) chronische DIAm EMG-opnames, (2) C2SH en (3) EMG-data-acquisitie bij wakkere en verdoofde dieren. Dit protocol beschrijft een rigoureus, reproduceerbaar en betrouwbaar C2SH-model van cSCI bij ratten, dat een uitstekend platform is voor het bestuderen van respiratoire neuroplasticiteit, compenserende cDIAm-activiteit en therapeutische strategieën en geneesmiddelen.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: A00003105-17-R23). De dieren in de huidige studie waren een mix van mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten van ongeveer 3 maanden oud en met een gewicht tussen 200 g en 350 g. De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Implantatie van de elektrode

  1. Voorbereiding van de elektroden
    1. Zorg ervoor dat de genoemde apparatuur beschikbaar is: (1) Meeraderige roestvrijstalen draad, (2) scalpel met #11 mesje, (3) schaar, 4) dissectiemicroscoop, (5) liniaal, (6) pincet, (7) naalden van 25 g, (8) 2 tangen (ten minste één met een krimpzone).
    2. Details van het proces voor het maken van elektroden worden weergegeven in figuur 3. Herhaal dit proces ten minste twee keer voor gekoppelde differentiële opname-elektroden.
    3. Meet en knip eerst 18 cm van de roestvrijstalen draad af.
    4. Leg een eenvoudige platte knoop op 4 cm van het ene uiteinde van de draad, zoals weergegeven in afbeelding 3; dit zal als anker dienen wanneer de korte zijde van de draad wordt geïmplanteerd en in de DIAm wordt gehecht.
    5. Gebruik een scalpel en een chirurgische dissectiescoop om voorzichtig 2 mm isolatie direct naast de knoop aan de korte kant van de draad te strippen. Wees zeer voorzichtig om geen strengen van de meeraderige draad door te knippen.
      NOTITIE: Dit niet-geïsoleerde gedeelte dient als het geleidende oppervlak van de elektrode. Over het algemeen begint de signaalkwaliteit te verslechteren als drie of meer strengen per ongeluk worden doorgesneden, en als dat het geval is, wordt de elektrode vervangen.
    6. Strip vervolgens ~5 mm van het uiteinde van de korte zijde van de draad, die vervolgens in het lumen van een naald van 25 G wordt gestoken om een hechtdraadachtig hulpmiddel te maken dat zal worden gebruikt om de elektrode in de DIAm te implanteren.
      OPMERKING: Naalden met een hogere dikte (bijv. tot 28 G) kunnen ook worden gebruikt, afhankelijk van persoonlijke voorkeur. Vanwege de dunnere diameter van naalden met een hogere dikte kan het risico op pneumothorax mogelijk worden verminderd. Het kan echter ook moeilijker zijn om de meeraderige draden in het kleinere lumen van de naald te steken.
    7. Om dit te bereiken, haalt u een naald van 25 G uit de verpakking en buigt u met beide tangen de naald voorzichtig op ~1 cm van het scherpe afgeschuinde uiteinde van links naar rechts totdat deze breekt.
      OPMERKING: Dit proces mag niet worden overhaast; Anders kunnen de schuifkrachten ervoor zorgen dat het lumen van de naald sluit, waardoor het proces moet worden herhaald.
    8. Steek het gestripte uiteinde van de draad in het lumen van de afgebroken naald van 1 cm en zorg ervoor dat de naald direct naast het resterende geïsoleerde deel van de draad rust.
    9. Zorg ervoor dat er geen niet-geïsoleerd gedeelte is tussen de naald en de resterende kortere kant van de draad, krimp de naald om deze aan de draad te bevestigen.
    10. Gebruik vervolgens de twee tangen om de bijgevoegde naald voorzichtig te buigen om deze een kromming te geven die lijkt op die van een standaard chirurgische hechtnaald.
    11. Verwijder ten slotte ~5 mm van het uiteinde van de lange zijde van de draad (Figuur 3). Nadat de elektroden in de DIAm zijn gehecht, wordt de lange zijde van de draad getunneld voor externe toegang om DIAm EMG-opnames mogelijk te maken.
    12. Herhaal het proces om een tweede elektrode te maken voor differentiële opnames.
  2. Diafragma EMG-elektrode plaatsing
    1. Steriliseer of autoclaaf voorafgaand aan de operatie alle chirurgische apparatuur, inclusief (1) tondeuses voor kleine dierenharen, (2) scalpel met #11 mesje, (3) chirurgische schaar, (4) pincet en (5) micronaaldhouder.
    2. Zorg voor een schone kooi en zorg voor voedsel, water, bodembedekking en verrijking van de omgeving. Zet opzij op een verwarmingskussen. Deze kooi zal worden gebruikt om het dier na de operatie te huisvesten.
    3. Steriliseer het operatieveld met het juiste ontsmettingsmiddel en trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan (scrubs, petten, masker en chirurgische handschoenen). Plaats de eerder bereide elektroden in een plas van 70% isopropylalcohol.
    4. Plaats een verwarmingskussen in het operatiegebied om de lichaamstemperatuur van de rat op peil te houden tijdens anesthesie en chirurgie. Bedek het verwarmingskussen met een gesteriliseerde operatiehanddoek.
    5. Weeg de rat en bereken de juiste dosering van verdovingsmiddel op basis van de richtlijnen voor institutionele dierenverzorging en -gebruik.
    6. Verdoof de rat met een intramusculaire injectie van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) of een ander geschikt verdovingsmiddel (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Injecteer buprenorfine (1 mg/kg) en carprofen (5 mg/kg) met verlengde afgifte preoperatief. Ga verder zodra het dier niet meer reageert op teenknijpen.
    7. Gebruik een tondeuse om de rat te scheren vanaf het xiphoid-proces tot ongeveer halverwege de achterpoten. Scheer ook de rug van de rat waar elektroden buiten het bereik van het dier worden geplaatst (meestal rond de schouderbladen). Verwijder overtollig haar met een stuk gaas.
    8. Bereid de huid voor op de incisie door deze schoon te maken met een steriel gaasje gedrenkt in chloorhexidinegluconaat (4% gewicht in volume).
    9. Leg het dier in rugligging op het gesteriliseerde verwarmingskussen. Gebruik vanaf het xiphoid-proces de scalpel en een schoon #11-mesje om een rostrocaudale incisie van 4-5 cm te maken. Dit zou de onderliggende buikspierlagen moeten blootleggen.
    10. Maak nog een incisie (3-4 cm) langs de middellijn in de spierlagen om de buikinhoud bloot te leggen. Zorg ervoor dat u niet doorsnijdt in de buikorganen.
    11. Zorg ervoor dat het abdominale (d.w.z. inferieure) oppervlak van de DIAm zichtbaar is, hoewel de rechterkant van het dier door de lever wordt verborgen.
    12. Gebruik een scalpelhandvat of een ander stomp instrument om de lever en andere organen naar beneden te duwen om de buikzijde van de DIAm bloot te leggen.
    13. Maak de elektrode klaar voor gebruik door deze uit de plas isopropylalcohol te halen en te wassen met steriele zoutoplossing. Oriënteer vervolgens met behulp van een micronaaldhouder een van de eerder voorbereide elektroden loodrecht op spiervezels in het middenribbengebied van de DIAm. Spiervezels verspreiden zich radiaal over de DIAm.
      OPMERKING: De DIAm is dun (~2 mm) en mag niet worden doorboord. Het doel is eerder om het niet-geïsoleerde deel van de elektrodedraad (Figuur 3) in de DIAm in te sluiten.
    14. Gebruik de chirurgische microscoop om de hechtdraad van de elektrode (naalduiteinde) voorzichtig in de DIAm te plaatsen. Laat de kromming van de naald de elektrode in en uit het buikoppervlak van de DIAm leiden, en zorg ervoor dat het volledige niet-geïsoleerde deel van de draad volledig in de spier wordt ingebed.
    15. Trek de naald voorzichtig door totdat de knoop in de draad zich verankert in de DIAm. Zorg ervoor dat het niet-geïsoleerde gedeelte (2 mm) van de elektrodedraad zich volledig binnen de DIAm bevindt, met een knoop op het punt waar de naald voor het eerst de DIAm binnenkwam.
    16. Knip vervolgens de naald af van de elektrodedraad en gooi deze weg in een naaldencontainer.
    17. Leg met twee tangen een knoop op het punt waar de hechtdraad (3-0) uit de DIAm komt. Om dit te doen, bindt u een lus aan de korte zijde van de draad, schuift u de lus naar beneden naar het buikoppervlak van de DIAm en trekt u de lus voorzichtig vast tot een knoop. De elektrode (niet-geïsoleerd gedeelte) moet nu zowel bij de ingang als bij de uitgang worden verankerd.
    18. Knip het overtollige deel van de korte kant van de draad af.
    19. Volg de stappen 1.2.14-1.2.18 om een andere elektrode aan dezelfde kant van de DIAm te hechten, ~3 mm verwijderd van de eerste.
    20. Voer op dezelfde manier implantatie van het elektrodepaar uit in het tegenovergestelde hemiaafragm.
    21. Zorg er vervolgens voor dat de langere zijde van de elektrodedraden zich allemaal buiten de buikholte bevinden en begin de spierlagen te hechten (3-0) om de buik te sluiten. Maak voor elk paar elektroden een lus en veranker deze.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er 2-3 cm draad in de buikholte blijft zodat de rat zich kan uitrekken zonder spanning op de DIAm te veroorzaken.
    22. Verwijder overtollig bloed met zoutoplossing en hecht vervolgens (3-0) de spierlaag in een doorlopend patroon om het buikvlies te sluiten.
    23. Tunnel een katheter van 16 G van de mediale dorsale huid van de rat naar de open buikhuid en trek een paar elektrodedraden door naar de achterkant van de rat.
    24. Herhaal het proces met een tweede katheter aan de andere kant en trek het tweede paar elektrodedraden erdoorheen.
    25. Hecht de buikhuid met een 3-0 hechting in een onderbroken hechtpatroon.
    26. Bind vervolgens voor elk paar de elektrodedraden in een knoop en hecht ze op hun plaats.
    27. Geef het dier een injectie met subcutane zoutoplossing (~1 ml per 50 g diermassa). Zet het dier in een schone kooi op een verwarmingskussen om te herstellen.
      OPMERKING: Laparotomie kan remming van DIAm-activiteit veroorzaken35,36. Wacht ten minste 72 uur voordat EMG-metingen kwantitatief worden geanalyseerd.

2. Cervicale spinale hemisectie

  1. Bereid het steriele operatiegebied voor zoals eerder.
  2. Voorafgaand aan de operatie autoclaaf of steriliseer alle chirurgische apparatuur. Benodigde apparatuur: (1) tondeuse voor kleine dierenharen, (2) scalpel met #11 mes, (3) chirurgische schaar, (4) pincet, (5) rongeurs, (6) retractors, (7) schuin ontleedmes.
  3. Weeg de rat ongeveer 72 uur na de implantatie van de DIAm EMG-elektrode en bereken de juiste verdovingsdosering op basis van de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren in de instelling.
  4. Voordat u de rat verdooft, plaatst u de rat in een kooi in Bowman-stijl en registreert u bilaterale DIAm EMG zoals beschreven in stap 3.2.
  5. Verdoof de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) of een ander geschikt verdovingsmiddel volgens het protocol van het lokale Institutional Animal Care and Use Committee. Preoperatief buprenorfine met verlengde afgifte (1 mg/kg) subcutaan en carprofen (5 mg/kg) intraperitoneaal injecteren.
  6. Ga verder zodra het dier niet meer reageert op teenknijpen. Controleer ongeveer elke 15 minuten de diepte van de anesthesie met een teenkneep.
  7. Voordat u met de operatie begint, plaatst u de rat in buikligging en registreert u EMG bij de verdoofde rat zoals beschreven in stap 3.3.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle opnames worden uitgevoerd met de rat in dezelfde positie.
  8. Scheer het haar vanaf de nek op ongeveer oorhoogte en tot aan de schouderbladen en verwijder het met nat gaas.
  9. Reinig de huid met chloorhexidinegluconaat (4% gewicht per volume) en bedek het dier met steriele chirurgische hoezen (behalve de bovenste rug).
  10. Maak met een scalpel een rostro-caudale incisie van 4 cm. Trek de huid terug en snijd de acromiotrapezius-spier door. Ontleed vervolgens de rhomboïde spier om de spinalis-spieren bloot te leggen.
    OPMERKING: De acromiotrapezius is de middelste trapeziusspier en de spiervezels lopen ongeveer evenwijdig aan de wervelkolom. De ruitvormige spier ligt bloot in het vlak onder de acromiotrapezius en de spiervezels lopen diagonaal.
  11. Trek de spinalisspieren terug van C1 naar C3.
    OPMERKING: De ruggengraatspieren lopen direct naast de wervelkolom.
  12. Voer voorzichtig een laminectomie uit bij C2 met behulp van een rongeur terwijl u door een chirurgische microscoop kijkt om er zeker van te zijn dat er geen grote slagaders of zenuwen worden beschadigd.
  13. Snijd de dura mater af en trek deze in bij C2.
  14. Sluit blootliggende elektrodedraden van de rug van de rat aan op de amplifier tijdens het uitvoeren van de spinale hemisectie. Raadpleeg stap 3 voor meer informatie.
  15. Terwijl u DIAm EMG bewaakt, steekt u het schuine snijmes net onder het punt waar de dorsale wortel het ruggenmerg binnenkomt en snijdt u het helemaal door tot het middelpunt van het ventrale oppervlak op de manier zoals weergegeven in figuur 2A.
    NOTITIE: Als u een elektronisch warmtekussen gebruikt, kan het nodig zijn om dit uit te schakelen tijdens het bewaken van EMG om ruis te voorkomen.
  16. Zorg er binnen enkele seconden na deze doorsnede voor dat de eupneoïsche DIAm EMG-activiteit ipsilateraal voor het letsel stopt en dat een compenserende toename van de cDIAm EMG-activiteit duidelijk is (Figuur 2C).
  17. Als de eupneïsche iDIAm EMG-activiteit aanhoudt, voer dan nog een snede uit met het snijmes, zoals gemarkeerd in figuur 2C. Snijd echter niet over de middellijn; Snijden naar de contralaterale zijde zal hoogstwaarschijnlijk leiden tot de dood van het dier.
  18. Hecht de spieren en vervolgens de huid met steriele hechtingen (3-0).
  19. Om de hydratatie op peil te houden, injecteert u subcutaan 1 ml zoutoplossing per 50 g diermassa en plaatst u het dier in een schone kooi met een verwarmingskussen voor herstel. Houd het dier in de gaten terwijl het herstelt van de operatie.
  20. Registreer ongeveer 72 uur later (dag 3 Post-C2SH) de EMG-activiteit bij wakkere ratten volgens protocolstap 3.2. Pas op dat u de hechtingen op de rug van de rat niet beschadigt.
  21. Verdoof de rat vervolgens opnieuw (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen), met een lichtere dosis verdoving dan nodig zou zijn voor een operatievliegtuig (tussen 1/3 en 1/2 van een normale dosis). Aanvullende doses kunnen worden gegeven zolang de ratten een intacte hoornvliesreflex vertonen en reageren op het knijpen van de teen.
  22. Bewaak DIAm EMG-activiteit volgens protocolstap 3.
    OPMERKING: Plaats de rat in dezelfde positie als die wordt gebruikt voor de eerste beoordeling van iDIAm EMG-activiteit.
  23. Als eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit (d.w.z. activiteit in fase met inspiratoire cDIAm EMG-activiteit) afwezig is op dag 3, concludeer dan dat de initiële C2SH succesvol was en neem hetzelfde dier op voor verdere analyses.

3. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Algemene instellingen en gegevensextractie
    1. Stel de banddoorlaatfilters van de voorversterker in op 100 Hz (hoogdoorlaat) en 1000 Hz (laagdoorlaat).
      OPMERKING: Deze filterinstellingen elimineren bewegingsartefacten en verminderen aanzienlijk 60 Hz ruis en ECG-vervuiling (die een piekvermogen heeft van ~75 Hz) terwijl het overgrote deel van de frequentie-inhoud van het intramusculaire DIAm EMG-signaal behouden blijft. Digitaliseer op basis van de Nyquist-theorie met een bemonsteringsfrequentie van 2000 Hz om aliasing te voorkomen en een adequate resolutie mogelijk te maken om de activiteit van de motoreenheid in de samengestelde EMG op te merken. Als u gespecialiseerde analyses van de frequentie-inhoud van het frequentiebereik van minder dan 100 Hz uitvoert, is het belangrijk om de filterinstellingen van de voorversterker in te stellen om ervoor te zorgen dat de betreffende frequenties niet worden gefilterd.
    2. Bewaak twee kanalen (linker en rechter hemidiaphragm EMG) in visualisatiesoftware op een computer en sla de gegevens op in een geschikt formaat voor verdere analyses.
    3. Verzamel ten minste 1-2 minuten aan eupneïsche opnames om voldoende gegevens te hebben voor analyses.
    4. Zorg ervoor dat de gegevens op drie of meer tijdstippen worden verzameld:
      1. Voorafgaand aan C2SH, stelt u een baseline eupneïsche opname in wakkere en verdoofde omstandigheden vast.
      2. Tijdens de C2SH-operatie om het uitschakelen van eupneïsche iDIAm EMG-activiteit in verdoofde omstandigheden tot stand te brengen.
      3. Op dag 3 na C2SH om te bevestigen dat de afwezigheid van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit aanhoudt en om een beginpunt vast te stellen van de omvang van het tekort bij wakkere dieren dat niet zo wordt beïnvloed door spinale shock 2,39 of toediening van respiratoire depressiva zoals buprenorfine.
    5. Analyseer de DIAm EMG-opnames met behulp van software waarmee berekeningen kunnen worden uitgevoerd op gedigitaliseerde signalen (bijv. Matlab, Python, R). Het basisproces is als volgt:
      1. Laad de onbewerkte EMG-bestanden. Afhankelijk van de filterinstellingen kan het nodig zijn om rekening te houden met een DC-offset in het signaal.
        OPMERKING: Een eenvoudige oplossing is om het gemiddelde van het onbewerkte EMG-signaal van zichzelf af te trekken.
      2. Bereken het wortel-gemiddelde-kwadraat van het EMG-signaal met een bewegend venster van 50 ms. Dit kan worden gedaan door een berekeningsvenster van 50 ms één bemonsteringspunt per keer vooruit te schuiven totdat het einde van het signaal is bereikt.
        OPMERKING: Analyses van individuele DIAm EMG-gebeurtenissen bieden de meeste statistische kracht en maken clustering van eupneoïsche en niet-eupneïsche activiteit mogelijk. Detectie van het begin en de offset van individuele ademhalingen in de DIAm EMG is dus van het grootste belang, zoals benadrukt in een eerder rapport40.
    6. Voer het filteren van eupneïsche activiteit uit door de histogrammen van de momentane ademhalingsfrequentie en de duur van de uitbarsting te visualiseren, zoals weergegeven in een eerder rapport41.
  2. Wakkere opnames.
    1. Voer wakkere opnames uit door ratten in een knaagdierkooi in Bowman-stijl te plaatsen. Een cilindrische kooi in Bowman-stijl is geschikt voor volwassen ratten tot 750 g.
    2. Schroef de metalen staven aan één kant van de kooi in Bowman-stijl los en lok de rat voorzichtig naar binnen. Schroef de metalen staven er weer op en sluit de rat op in de cilindrische kooi.
      OPMERKING: Laat de ratten minstens 30 minuten aan de kooi acclimatiseren voordat u doorgaat met opnemen. Indien mogelijk is het het beste om ratten meerdere dagen te laten wennen aan de kooi in Bowman-stijl voordat er metingen worden uitgevoerd. Het is een goede gewoonte om tijdens deze acclimatisatiefase traktaties te geven terwijl de ratten in de kooi zitten.
    3. Om externe visuele prikkels tot een minimum te beperken, gebruik je een papieren handdoek of iets dergelijks om een tent te maken rond de voorkant van de kooi waar het hoofd van de rat is. Minimaliseer bovendien harde geluiden en zorg voor het fysieke comfort van de rat op alle punten.
      OPMERKING: Voor de hand liggende tekenen van ongemak zijn onder meer friemelen, snelle ademhaling en worstelen tegen de kooi. Als een van deze tekenen wordt waargenomen, kan het nodig zijn om de rat terug te brengen naar de thuiskooi en te proberen op te nemen wanneer de rat rustiger is.
    4. Voor kleinere ratten (<300 g) plaatst u vulmateriaal (bijv. keukenpapier, wattenbolletjes) in extra ruimtes in de kooi om de rat te ontmoedigen 180 graden te draaien.
    5. Nadat de rat is geacclimatiseerd, sluit u de draden die het dorsum van de rat verlaten voorzichtig aan op een voorversterker, die de analoge signalen naar een analoog-naar-digitaal-omzetter voert, en volgt u de procedures die worden beschreven in stap 3.1.
  3. Verdoofde opnames
    1. Plaats ratten elke keer in dezelfde positie, bij voorkeur geneigd om de wakkere rattenhouding beter na te bootsen.
    2. Sluit de draden die het dorsum van de rat verlaten aan op een voorversterker, die de analoge signalen naar een analoog-naar-digitaal-converter voert, en volg de procedures die worden beschreven in stap 3.1.
  4. Herstel van dieren
    1. Plaats ratten in een lege, schone rattenkooi zonder bodembedekking voor herstel.
    2. Plaats de kooi op een verwarmingskussen.
    3. Bewaak de rat met regelmatige tussenpozen (<15 min) gedurende de eerste 3 uur of totdat de rat begint te bewegen. Controleer met minder regelmatige tussenpozen (30 min) totdat het dier weer wakker is.
    4. Nadat de rat ambulant is, plaats je ze in een schone kooi met bodembedekking, toegang tot voedsel en water en verrijking van de omgeving.
    5. Blijf de rat minstens eenmaal per dag volgen gedurende de hele duur van het experiment. Besteed speciale aandacht aan veranderingen in gewicht/vermogen om te voeden, evenals de integriteit van de incisieplaatsen en hechtingen.

Resultaten

De benadering die in dit artikel wordt gepresenteerd, minimaliseert de variabiliteit tussen operators door duidelijke criteria vast te stellen voor het evalueren van DIAm EMG in een rattenmodel van C2SH. Ten eerste moet de stopzetting van de eupneïsche iDIAm EMG-activiteit onmiddellijk na C2SH worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 2. Als dit niet het geval is, kan een secundaire doorsnede worden uitgevoerd totdat de eupneïsche iDIAm-activiteit verdwijnt. Ten tweede moet op dag 3 na C2SH de voortdurende afwezigheid van eupneuïsche iDIAm EMG worden geverifieerd terwijl de dieren worden verdoofd. Figuur 4A toont een voorbeeld van een succesvolle C2SH zoals bepaald door de voortdurende afwezigheid van eupneïsche iDIAm EMG-activiteit onder narcose op dag 3 na het letsel. Figuur 4B toont DIAm EMG-activiteit bij hetzelfde dier onder onverdoofde wakkere omstandigheden, waarbij de vermindering - maar niet de afwezigheid - van iDIAm-activiteit wordt benadrukt in vergelijking met de basislijn van vóór de verwonding. Met name de cDIAm EMG-activiteit is verhoogd in zowel wakkere als verdoofde omstandigheden. De verdoofde opnames op dag 3 bevestigen dat de eerste C2SH succesvol was, maar kwantitatieve analyses moeten worden uitgevoerd bij wakkere dieren. Bij wakkere dieren vertegenwoordigt DIAm EMG-activiteit op dag 3 na C2SH het startpunt voor herstel. Figuur 4B laat zien dat de iDIAm EMG-activiteit op dag 3 bij wakkere ratten verminderd, maar niet afwezig is.

In sommige gevallen gaat C2SH niet gepaard met volledige stopzetting van de eupneïsche iDIAm EMG-activiteit (Figuur 5A). Een ontoereikende C2SH komt voor in minder dan 5% van alle gevallen bij gebruik van de aanpak die in dit manuscript wordt beschreven; het is echter essentieel dat een evaluatie van de DIAm EMG-activiteit op dag 3 na C2SH wordt uitgevoerd op elke rat om het succes van de C2SH te valideren. Figuur 5A toont een voorbeeld van DIAm EMG-activiteit van een rat op dag 3 na verwonding, waarbij de C2SH ontoereikend was in het elimineren van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit op dag 3. Het is belangrijk op te merken dat de validatie van de werkzaamheid van de C2SH werd uitgevoerd terwijl het dier werd verdoofd. Voortdurende eupneïsche EMG-activiteit suggereert dat ten minste een deel van de dalende ipsilaterale bulbospinale route gespaard is gebleven, wat de interpretatie van de resultaten kan bemoeilijken. Figuur 5B laat zien dat de iDIAm EMG-activiteit verminderd, maar niet afwezig is op dag 3 bij wakkere ratten. Het sparen van ipsilaterale dalende inputs kan echter het aanvankelijke tekort verminderen.

figure-results-1
Figuur 1: Conceptueel kader. De rostrale ventrale respiratoire groep (rVRG) stuurt dalende input naar phrenic-motorneuronen in het cervicale ruggenmerg (C3-C 5). De meerderheid van deze dalende axonen innerveren de ipsilaterale phrenic-motorneuronenpool, maar een klein deel kruist de middellijn om de contralaterale motorneuronpool te activeren. Onmiddellijk na een C2SH worden de dalende inputs van de rVRG naar de ipsilaterale phrenische motorneuronpool verstoord. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve C2SH en DIAm EMG activiteit. (A) Het dwarsaanzicht van het ruggenmerg en de tran van de rat (rood gearceerd) met belangrijke structuren gelabeld wordt getoond. De spinale laesie wordt uitgevoerd door een ontleedmes in te brengen direct onder het punt waar de dorsale wortel binnenkomt en door te snijden tot ongeveer de middellijn (gearceerd doorschijnend rood gebied). Let op het doorsnijden van de belangrijkste motorische kanalen in de laterale en ventrale funiculi, maar het sparen van de dorsale funiculi. (B) De longitudinale weergave, die het uitschakelen van de ipsilaterale motorneuronactiviteit weergeeft, vormt een aanvulling op de ruwe EMG-sporen die worden gebruikt voor real-time bevestiging van een bevredigende laesie (C). Naarmate het ruggenmerg wordt beschadigd, stopt de eupneic iDIAm EMG-activiteit, wat suggereert dat de ipsilaterale invoer naar frene motorneuronen is verbroken; ondertussen verhoogt de cDIAm EMG onmiddellijk zijn activiteit, zoals weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Productie van elektroden. Het proces voor het vervaardigen van DIAm EMG-elektroden wordt getoond. Het basisproces omvatte het meten en knippen van een geschikte draadlengte (stap 1), het leggen van een verankeringsknoop en het strippen van de isolatie om de elektrode bloot te leggen (stap 2), het bevestigen van een naald van 25 gauge aan de draad (stappen 3 en 4), het buigen van de naald om deze een kromming te geven die lijkt op die van een chirurgische hechtnaald (stap 5), en het verwijderen van isolatie om een deel van de draad bloot te leggen die op de versterker zal worden aangesloten voor het opnemen van EMG (stap 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Succesvolle spinale hemisectie. (A) DIAm EMG-activiteit wordt aangetoond bij een verdoofde rat vóór C2SH en op dag 3 na verwonding. Er is geen bewijs van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit bij deze rat op dag 3 na het verwonden, wat aangeeft dat de initiële C2SH succesvol was. Let op de compenserende toename van cDIAm EMG-activiteit en toename van de ademhalingsfrequentie in vergelijking met de toestand van vóór het letsel. (B) DIAm EMG-activiteit wordt aangetoond bij dezelfde rat onder onverdoofde wakkere omstandigheden op dag 3 na C2SH. Er is duidelijk bewijs van verminderde, zij het niet volledig tot zwijgen gebrachte, iDIAm EMG-activiteit. Let op de compenserende toename van cDIAm EMG-activiteit en toename van de ademhalingsfrequentie in vergelijking met de toestand van vóór het letsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Mislukte hemisectie van de wervelkolom. (A) DIAm EMG-activiteit wordt getoond bij een verdoofde rat vóór C2SH en op dag 3 na verwonding. Bij deze rat hield de eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit aan op dag 3 na het letsel, wat aangeeft dat de aanvankelijke C2SH ontoereikend was. Dienovereenkomstig werd deze rat uitgesloten van verdere analyses van functioneel herstel. Let op de compenserende toename van de cDIAm EMG-activiteit ondanks een mislukte C2SH, maar een minimale toename van de ademhalingsfrequentie. (B) DIAm EMG-activiteit wordt getoond in dezelfde run onder onverdoofde wakkere omstandigheden op dag 3 na C2SH. Er zijn aanwijzingen voor verminderde iDIAm EMG, verhoogde cDIAm EMG-activiteit en een lichte toename van de ademhalingsfrequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

C2 spinale hemisectie
De procedure die in dit artikel wordt beschreven, legt de nadruk op beoordelingen van DIAm EMG-activiteit die dienen als validatie van eenC2-spinale laesie die de laterale en ventrale funiculi doorsnijdt terwijl de dorsale funiculi worden gespaard (Figuur 2A). De voorgestelde chirurgische aanpak heeft twee grote voordelen. Ten eerste spaart het de dorsale funiculi, die de ambulante functie bij ratten behoudt, terwijl de ipsilaterale input naar frene motorneuronen nog steeds wordt verbroken. Ten tweede kunnen we, door DIAm EMG te monitoren, de werkzaamheid van deC2-laesie valideren bij het elimineren van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit in eerste instantie tijdens de operatie terwijl de dieren worden verdoofd. Op dag 3 na het letsel, terwijl de dieren worden verdoofd, verifiëren we vervolgens dat er inderdaad sprake is van een voortdurende uitschakeling van eupneic iDIAm EMG-activiteit. Eerder werd aangetoond dat rVRG-excitatoire inputs op phrenische motorneuronen en NMDA-receptorexpressie in phrenic-motorneuronen 3 tot 7 dagen na het letsel zijn verminderd en dat zowel glutamaterge synaptische input als NMDA-receptorexpressie in de loop van de tijd toenemen na 7 dagen na het letsel33,42. Deze gegevens, gecombineerd met histologische bevestiging van de C 2-laesie10,13,29,30,33, suggereren dat voortdurende inactiviteit onder narcose op dag 3 na het letsel informatie geeft over de werkzaamheid van de initiële C2SH. In onderzoeken die gedurende meerdere jaren zijn uitgevoerd, werden relatief stabiele percentages van spontaan herstel onder anesthesie tussen 30%-40% gezien 14 dagen na C 2 SH 18,19,20,29,31,43, wat suggereert dat deze methode om het succes van de C2SH te verifiëren reproduceerbaar en betrouwbaar is.

De C2SH-procedure omvat verschillende kritieke stappen. Belangrijk is dat het hier voorgestelde C2SH-model de dorsale funiculi spaart en dus niet leidt tot motorische tekorten aan de ledematen. In volledige C2 spinale hemisectiemodellen waarbij de dorsale funiculi betrokken zijn, zijn de motorische tekorten van de ledematen aanzienlijk groter 3,4,5,6,7,37. Een bijkomend voordeel van het C2SH-model (Figuur 2A) is dus dat naast het tot zwijgen brengen van eupneoïsche iDIAm EMG-activiteit bij verdoofde C2-gelaesioneerde ratten, de ratten functioneel vergelijkbaar zijn met nep-laminectomieratten in termen van lopen en andere functies. Dienovereenkomstig zijn ze over het algemeen in staat om zichzelf te voeden en te verzorgen, wat de zorglast vermindert en toch studies van DIAm neuromotorische controle en respiratoire neuroplasticiteit mogelijk maakt. Om ervoor te zorgen dat hetC2-model op de juiste manier wordt geïmplementeerd, moet grote zorg worden besteed aan het voorkomen van overmatige laesies. Het inbrengen van het ontleedmes direct onder de plaats waar de dorsale wortel het ruggenmerg binnenkomt en het spaarzaam doorsnijden van het ventrale gedeelte zijn beide nuttige vuistregels. Het doel is ervoor te zorgen dat de eupneic iDIAm EMG-activiteit stopt; Dit kan indien nodig met meerdere kleine sneden. Inderdaad, in de week na de C2SH zal duidelijk worden of er overmatige schade aan het ruggenmerg was als de dieren moeite hebben met lopen en reiken naar voedselkorrels.

Plaatsing van elektroden en EMG-opnames
Chronische DIAm EMG-elektroden hebben verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere benaderingen. Elektroden kunnen (en moeten) enkele dagen voor de C2SH-procedure worden geïmplanteerd, waardoor er voldoende tijd is voor herstel en er geen laparotomie en een C2SH nodig zijn tijdens dezelfde chirurgische sessie. Dit is belangrijk omdat het algemeen aanvaard is dat laparotomie remming van de DIAm35,36 veroorzaakt. Door chronische DIAm-elektroden te implanteren, is er ook geen noodzaak voor herhaalde laparotomieën, die bij eerder werk werden uitgevoerd10,13; er is ook een verminderd risico op pneumothorax omdat er niet tijdens elke sessie elektroden in de DIAm worden ingebracht. Er kunnen echter verschillende potentieel ernstige bijwerkingen optreden als gevolg van de plaatsing van de elektrode. Hoewel het risico op pneumothorax wordt verminderd door herhaalde elektrode-inserties te vermijden, wordt het niet volledig teniet gedaan, en inderdaad, pneumothorax kan optreden, wat ofwel onmiddellijke dood ofwel langdurige problemen veroorzaakt. Om dit risico te verminderen, is het het beste om ervoor te zorgen dat de naald die door de DIAm wordt geregen het bovenste oppervlak van de DIAm niet perforeert. Vermijd bovendien het gebruik van een scherpe pincet die schade aan de DIAm kan veroorzaken tijdens het manipuleren van de elektrodedraden. Af en toe kunnen de ratten op de hechtingen in hun buik kauwen, waardoor ze zichzelf mogelijk ontdarmen als ze aan hun lot worden overgelaten. Ratten moeten met regelmatige tussenpozen worden geobserveerd na het plaatsen van de elektrode om dit soort gedrag vroegtijdig te detecteren. In sommige gevallen kan het mogelijk zijn om de ratten te verdoven om schade aan hechtingen te herstellen. Het is echter het beste als dergelijk gedrag wordt verzacht door voldoende pijnverlichting te bieden tijdens en na de operatie en door ervoor te zorgen dat het steriele veld tijdens de operatie niet wordt verbroken. In extreme gevallen kan het nodig zijn om ratten te euthanaseren die herhaaldelijk hun hechtingen verwijderen.

Het registreren en analyseren van de EMG-signalen is niet de primaire focus van de huidige studie en is sterk afhankelijk van de specifieke apparatuur en software die in elk lab beschikbaar is. Hoewel informatie over de apparatuur wordt verstrekt in de materiaaltabel, bestaat er een grote verscheidenheid aan hardware-opties voor het versterken en opnemen van EMG-activiteit, en de details zullen afhangen van een mix van functies, beschikbaarheid en betaalbaarheid voor elk laboratorium. Er zijn echter enkele algemene principes voor het opnemen van EMG die belangrijk zijn om te vermelden. Een mogelijk probleem is de verplaatsing of vernietiging van geïmplanteerde elektroden, wat de kwantitatieve beoordelingen van DIAm EMG kan beperken. Als de elektroden zijn losgekomen van de DIAm, of als de ratten erin geslaagd zijn de externe draden te consumeren of anderszins te beschadigen, is het mogelijk niet mogelijk om EMG-activiteit te registreren of kan het ruisniveau veranderen. Dit kan worden voorkomen door te bevestigen dat de elektroden stevig in de DIAm zijn bevestigd en dat er een signaal met een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) van kan worden opgenomen tijdens de plaatsing van de DIAm-elektrode. Bovendien zijn het externaliseren van de elektrodedraden hoog op het dorsum en het afsnijden van overtollige draad zodat de ratten geen toegang hebben tot de elektrodedraden beide bevorderlijk voor het succes van chronische elektroden. Als alternatief voor externe draden kunnen hoofddoppen37 of telemetrie 44,45 redelijke opties zijn. Beide benaderingen kunnen gemakkelijker opnames bij wakkere dieren verkrijgen, maar kunnen iets moeilijker te implementeren zijn dan alleen het externaliseren van de meeraderige draden. Alle elektronische bronnen in de buurt kunnen mogelijk geluidsbronnen zijn. Het is van het grootste belang dat alle apparatuur op de juiste manier wordt geaard, afgeschermde kabels worden gebruikt en de ratten niet worden aangeraakt terwijl er actieve opnames plaatsvinden. Naast het uitschakelen van elektronische warmtekussens tijdens het opnemen, moeten lichten, apparatuur in de buurt, elektrisch bediende operatietafels en andere dergelijke apparaten mogelijk tijdelijk worden uitgeschakeld om geluidsarme opnamen te maken. Om omgevingsinvloeden tot een minimum te beperken, moet elektronische apparatuur die niet aan hoeft te staan voor de DIAm EMG-opnames worden uitgeschakeld. Indien mogelijk moeten opnames worden gemaakt in een elektrisch afgeschermde ruimte. Na verloop van tijd kunnen weefsellittekens en fibrose rond de DIAm EMG-elektroden de geleidbaarheid van de elektrode verminderen, waardoor de SNR afneemt. Bovendien kunnen zelfs kleine veranderingen in de houding grote gevolgen hebben voor het DIAm EMG-signaal; om deze potentieel complicerende problemen tot een minimum te beperken, moet DIAm EMG dus worden opgenomen met de ratten in dezelfde houding tijdens opnamesessies.

Een andere belangrijke overweging zijn de filter- en steekproefinstellingen. Het type elektrode (d.w.z. intramusculair versus slokdarm/oppervlak) is uiterst relevant als het gaat om het bepalen van de frequentie-inhoud van - en dus geschikte hoog- en laagdoorlaatfilters voor - een signaal. Er is veel moeite gedaan om de optimale filters voor oppervlakte-/slokdarm-DIAmEMG 46 te bepalen. Soortgelijke studies bij de DIAm van de rat zijn niet uitgevoerd, maar eerder toonden we aan dat de volledige frequentie-inhoud van de DIAm-EMG die werd geregistreerd met behulp van chronische intramusculaire elektroden bij ratten effectief lager was dan 1000 Hz, met de zwaartepuntfrequentie rond de 300 Hz47. In een directe vergelijking van de gemiddelde en mediane frequenties van het vermogensspectrum van biceps brachialis EMG bij mensen, verkregen via zowel oppervlakte- als intramusculaire elektroden, ontdekten Christensen et al.48 dat zowel de gemiddelde als de mediane frequenties ongeveer 3 keer hoger waren voor intramusculaire elektroden in vergelijking met oppervlakte-elektroden. In de DIAm hebben onderzoekers zwaartepuntfrequenties van ongeveer 100 Hz gerapporteerd bij gebruik van bipolaire slokdarmelektroden 49,50,51,52,53,54, wat zou suggereren dat de 300 Hz, die eerder werd bepaald voor intramusculaire elektroden, ongeveer overeenkomt met dezelfde trend die wordt getoond door Christensen et al.48. Desondanks hebben meerdere gepubliceerde onderzoeken die gebruik maken van intramusculaire DIAm EMG in knaagdiermodellen hun hoogdoorlaatfilters op 300 Hz 4,37,55,56 geplaatst en sommige zijn zelfs zo hoog gegaan als 500 Hz57. Het is onomstreden dat een dergelijke filterbenadering de amplitude van het DIAm EMG-signaal met ten minste de helft zou verminderen. We stellen een veel minder destructieve aanpak voor: (1) hoogdoorlaatfiltering bij 100 Hz omdat het grootste deel van het ECG-vermogensspectrum onder de 100 Hz ligt, terwijl relatief weinig van het DIAm EMG-vermogensspectrum onder 100 Hz51,52 ligt, en (2) vervolgens het resterende ECG verwijderen door golfvormovereenkomst58. Daarom kunnen de geschikte filters voor DIAm EMG voor de meeste onderzoeken worden ingesteld tussen 100 Hz en 1000 Hz, met een bemonsteringsfrequentie van ten minste 2000 Hz om alle relevante kenmerken in de gegevens vast te leggen. Gedetailleerde analyses van het DIAm-EMG kunnen vervolgens worden uitgevoerd met behulp van de technieken die in eerdere rapporten 40,41,47,58 zijn gepubliceerd.

Wakkere en verdoofde dieren
Met name sommige onderzoeken hebben aangetoond dat C2SH-modellen van cSCI niet leiden tot volledige inactiviteit van eupneuic iDIAm EMG23,37. In zekere zin is dit niet verrassend, aangezien eerder is opgemerkt dat "doorbraak"-activiteit optreedt tijdens gedrag dat een hogere drive vereist (bijv. diep ademhalen en de reactie op luchtwegocclusie)4,7,29,42. Deze gegevens suggereren dat het waarschijnlijk niet gepast is om het C2SH-model te beschouwen als een echt model van continue inactiviteit. Het lijkt er inderdaad op dat de drive bij wakkere dieren voldoende hoog is om eupneïsche iDIAm EMG-activiteit al vier dagen na een volledige C2SH37 aanwezig te laten zijn, hoewel deze niet consistent aanwezig is op één dag na de verwonding23. In alle gevallen onderdrukt anesthesie de iDIAm-activiteit na de bovenste cervicale spinale hemisectie, zoals benadrukt in eerdere rapporten23,38 en weergegeven in figuur 4 en figuur 5. Er zijn geen gepubliceerde gegevens beschikbaar over DIAm EMG-activiteit bij wakkere ratten met de C2SH met gespaard gebleven dorsale funiculi die in dit manuscript wordt voorgesteld (Figuur 2A). Toekomstig werk zou een gedetailleerde karakterisering moeten opleveren van het tijdsverloop van DIAm EMG-activiteit bij wakkere dieren met dit C2SH-model. Dat gezegd hebbende, is het nog steeds verstandig om validatie uit te voeren van de aanhoudende afwezigheid van eupneïsche iDIAm-inactiviteit op dag 3 na het letsel onder narcose om de experimentele omstandigheden na te bootsen waarin het ruggenmerg aanvankelijk werd beschadigd/doorgesneden. Wanneer eupneïsche iDIAm EMG-activiteit bij wakkere dieren op dag 3 na verwonding aanwezig kan zijn, wordt opgemerkt dat zelfs halve doses anesthetica meestal leiden tot een volledige stopzetting van eupneïsche iDIAm EMG-activiteit. Met deze doseringen zijn de dieren kalm en bezadigd. Naast het verifiëren van het uitschakelen van eupneïsche iDIAm EMG-activiteit tijdens C2SH en op dag 3 na het letsel, wordt aanbevolen om het ruggenmerg na het terminale experiment te extraheren om histologische bevestiging van de plaats en omvang van de C2SH uit te voeren 9,29,59. Histologische bevestiging van het letsel - in combinatie met functionele bevestiging van tot zwijgen gebrachte eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit - levert sterk bewijs van een succesvolle C2SH.

Het huidige artikel presenteert een C2SH van cSCI bij ratten die leidt tot het onmiddellijk uitschakelen van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit met voortgezette uitschakeling onder narcose op dag 3 na het letsel. Door het sparen van de dorsale funiculus in het C2SH-model dat in dit manuscript wordt voorgesteld, blijft de motorische functie van de ledematen behouden, waardoor off-target effecten worden vermeden. Hierdoor kunnen longitudinale studies naar de effecten van een hoge cervicale laesie op de neuromotorische controle van DIAm worden uitgevoerd bij ratten die verder relatief gezond zijn, waardoor de zorglast voor onderzoekers minimaal is. De validatie van inactiviteit onder narcose op dag 3 na het letsel zorgt ervoor dat er een duidelijke basislijn wordt vastgesteld voor het beoordelen van de daaropvolgende mate van herstel van eupneuïsche iDIAm EMG. Deze aanpak biedt een rigoureuze, betrouwbare en reproduceerbare methode om een C2SH bij ratten uit te voeren. Dit model heeft het potentieel om het begrip van het tijdsverloop van respiratoire neuroplasticiteit en de kruising ervan met mogelijke therapeutische strategieën aanzienlijk te verbeteren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de NIH-financieringsbron (NIH-R01HL146114).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
25 G NeedleCardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 Suture
Adson-Brown ForcepsFine Science Tools11627-12Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style CageBraintree ScientificPOR-530Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of.5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle HolderFine Science Tools12565-14Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP ShieldedBiopac Systems, IncLEAD110SAfgevoerde kabeldraden voor EMG
Data Acquisition SoftwareLabChartLabChart 7.3.8Software voor gegevensopname, visualisatie en analyse voor opnames met meerdere kanalen en real-time beoordelingen
Data Analysis Software - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2Algemene programmeertaal voor post hoc-analyse
Dissecting KnifeFine Science Tools10056-12Snijrand: 4 mm, Dikte: 0.5 mm, Alloy / Materiaal: Roestvrij staal, Lengte: 12.5 cm, Bladvorm: Geschuinde 30°
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11293-00Stijl: #3, Tipvorm: Recht, Tips: Standaard, Tipafmetingen: 0.17 x 0.1 mm, Lengte: 12 cm, Alloy / Materiaal: Dumostar
Electromyogram AmplifierBiopac Systems, IncEMG100CEMG-versterker
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14Tipvorm: Gebogen, Cupgrootte: 2.5mm, Alloy / Materiaal: Roestvrij staal, Lengte: 13cm, Gewrichtactie: Enkel
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14Alloy / Materiaal: Roestvrij staal, Lengte: 14cm, Gewrichtactie: Enkel, Cupgrootte: 1mm, Tipvorm: Gebogen
Isolated Power Supply ModuleBiopac Systems, IncIPS100CBewerking van 100-serie versterkermodules onafhankelijk van het Biopac Systems, Inc.'s MP-serie Data Acquisition System
Kelly HemostatsFine Science Tools13019-14Tips: Gekarteld, Tipbreedte: 1.5mm, Klemlengte: 22mm, Alloy / Materiaal: Roestvrij staal, Lengte: 14cm, Tipvorm: Gebogen
Knife CuretteV. MuellerVM101-4414Tip: Scherp, Tipdiameter: 2 mm
Micro Dissecting ScissorsBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420Lengte: 4", Hoek: Recht, Bladlengte: 23 mm
Multistranded stainless steel wireCooner Wire, Inc.AS 631AWG 40; Totale diameter: 0.011 mm (met isolatie), 0.008 mm (zonder isolatie).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508Gegevensverzamelsysteem
Scalpel Blade #11Fine Science Tools10011-00Bladvorm: Geschuind, Snijrand: 20 mm, Dikte: 0.4 mm, Alloy / Materiaal: Koolstofstaal
Scalpel Handle #3Fine Science Tools10003-12Alloy / Materiaal: Roestvrij staal, Lengte: 12 cm
Sprague Dawley RatInotivBestelcode: 002Sprague Dawley outbred ratten (vrouwtje en mannetje)
Surgical MicroscopeOlympusSZ61Chirurgische microscoop 
Suture Cutting ScissorsGeorge Tiemann & Co.110-1250SBAlloy / Materiaal: Roestvrij staal, Tipvorm: Recht, Tips: Scherp/Blunt, Lengte: 4.5"
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Tips: Scherp, Snijrand: 2.5 mm, Tipdiameter: 0.05 mm, Lengte: 8 cm, Alloy / Materiaal: Roestvrij staal, Gekarteld: Nee, Tipvorm: Recht
Weitlaner RetractorCodman50-5647Tandvorken: 2 x 3 Blunt, Lengte: 4.5"
```

Referenties

  1. Center, N. S. C. I. S. Spinal cord injury model systems 2022 annual report - complete public version. Center, N. S. C. I. S. , University of Alabama at Birmingham. (2023).
  2. Punjani, N., Deska-Gauthier, D., Hachem, L. D., Abramian, M., Fehlings, M. G. Neuroplasticity and regeneration after spinal cord injury. N Am Spine Soc J. 15, 100235(2023).
  3. El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Exp Neurol. 156 (1), 172-179 (1999).
  4. Fuller, D. D., et al. Modest spontaneous recovery of ventilation following chronic high cervical hemisection in rats. Exp Neurol. 211 (1), 97-106 (2008).
  5. Fuller, D. D., et al. Graded unilateral cervical spinal cord injury and respiratory motor recovery. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 245-253 (2009).
  6. Golder, F. J., et al. Respiratory motor recovery after unilateral spinal cord injury: Eliminating crossed phrenic activity decreases tidal volume and increases contralateral respiratory motor output. J Neurosci. 23 (6), 2494-2501 (2003).
  7. Golder, F. J., Reier, P. J., Davenport, P. W., Bolser, D. C. Cervical spinal cord injury alters the pattern of breathing in anesthetized rats. J Appl Physiol. 91 (6), 2451-2458 (2001).
  8. Goshgarian, H. G. The role of cervical afferent nerve fiber inhibition of the crossed phrenic phenomenon. Exp Neurol. 72 (1), 211-225 (1981).
  9. Keomani, E., et al. A murine model of cervical spinal cord injury to study post-lesional respiratory neuroplasticity. J Vis Exp. (87), e51235(2014).
  10. Miyata, H., Zhan, W. Z., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Myoneural interactions affect diaphragm muscle adaptations to inactivity. J Appl Physiol. 79 (5), 1640-1649 (1995).
  11. Moreno, D. E., Yu, X. J., Goshgarian, H. G. Identification of the axon pathways which mediate functional recovery of a paralyzed hemidiaphragm following spinal cord hemisection in the adult rat. Exp Neurol. 116 (3), 219-228 (1992).
  12. Porter, W. T. The path of the respiratory impulse from the bulb to the phrenic nuclei. J Physiol. 17 (6), 455-485 (1895).
  13. Zhan, W. Z., Miyata, H., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Metabolic and phenotypic adaptations of diaphragm muscle fibers with inactivation. J Appl Physiol. 82 (4), 1145-1153 (1997).
  14. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-botzinger complex: A brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254 (5032), 726-729 (1991).
  15. Vinit, S., Gauthier, P., Stamegna, J. C., Kastner, A. High cervical lateral spinal cord injury results in long-term ipsilateral hemidiaphragm paralysis. J Neurotrauma. 23 (7), 1137-1146 (2006).
  16. Warren, P. M., et al. Rapid and robust restoration of breathing long after spinal cord injury. Nat Commun. 9 (1), 4843(2018).
  17. Fogarty, M. J., Dasgupta, D., Khurram, O. U., Sieck, G. C. Chemogenetic inhibition of TrkB signalling reduces phrenic motor neuron survival and size. Mol Cell Neurosci. 125, 103847(2023).
  18. Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS One. 8 (5), e64755(2013).
  19. Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Localized delivery of brain-derived neurotrophic factor-expressing mesenchymal stem cells enhances functional recovery following cervical spinal cord injury. J Neurotrauma. 32 (3), 185-193 (2015).
  20. Mantilla, C. B., Greising, S. M., Stowe, J. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. TrkB kinase activity is critical for recovery of respiratory function after cervical spinal cord hemisection. Exp Neurol. 261, 190-195 (2014).
  21. Sieck, G. C., Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Mantilla, C. B. Acute intrathecal BDNF enhances functional recovery after cervical spinal cord injury in rats. J Neurophysiol. 125 (6), 2158-2165 (2021).
  22. Fuller, D. D., Golder, F. J., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Recovery of phrenic activity and ventilation after cervical spinal hemisection in rats. J Appl Physiol. 100 (3), 800-806 (2006).
  23. Bezdudnaya, T., Hormigo, K. M., Marchenko, V., Lane, M. A. Spontaneous respiratory plasticity following unilateral high cervical spinal cord injury in behaving rats. Exp Neurol. 305, 56-65 (2018).
  24. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  25. Cloud, B. A., et al. Hemisection spinal cord injury in rat: The value of intraoperative somatosensory evoked potential monitoring. J Neurosci Methods. 211 (2), 179-184 (2012).
  26. Hurd, C., Weishaupt, N., Fouad, K. Anatomical correlates of recovery in single pellet reaching in spinal cord injured rats. Exp Neurol. 247, 605-614 (2013).
  27. Fouad, K., Hurd, C., Magnuson, D. S. Functional testing in animal models of spinal cord injury: Not as straight forward as one would think. Front Integr Neurosci. 7, 85(2013).
  28. Fouad, K., Popovich, P. G., Kopp, M. A., Schwab, J. M. The neuroanatomical-functional paradox in spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 17 (1), 53-62 (2021).
  29. Fogarty, M. J., et al. Novel regenerative drug, SPG302 promotes functional recovery of diaphragm muscle activity after cervical spinal cord injury. J Physiol. 601 (12), 2513-2532 (2023).
  30. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  31. Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Role of neurotrophins in recovery of phrenic motor function following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169 (2), 218-225 (2009).
  32. Brown, A. D., et al. Mitochondrial adaptations to inactivity in diaphragm muscle fibers. J Appl Physiol. 133 (1), 191-204 (2022).
  33. Rana, S., Zhan, W. Z., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Disproportionate loss of excitatory inputs to smaller phrenic motor neurons following cervical spinal hemisection. J Physiol. 598 (20), 4693-4711 (2020).
  34. Mantilla, C. B., Rowley, K. L., Zhan, W. Z., Fahim, M. A., Sieck, G. C. Synaptic vesicle pools at diaphragm neuromuscular junctions vary with motoneuron soma, not axon terminal, inactivity. Neuroscience. 146 (1), 178-189 (2007).
  35. Ford, G. T., Whitelaw, W. A., Rosenal, T. W., Cruse, P. J., Guenter, C. A. Diaphragm function after upper abdominal surgery in humans. Am Rev Respir Dis. 127 (4), 431-436 (1983).
  36. Road, J. D., Burgess, K. R., Whitelaw, W. A., Ford, G. T. Diaphragm function and respiratory response after upper abdominal surgery in dogs. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 57 (2), 576-582 (1984).
  37. Rana, S., Sunshine, M. D., Greer, J. J., Fuller, D. D. Ampakines stimulate diaphragm activity after spinal cord injury. J Neurotrauma. 38 (24), 3467-3482 (2021).
  38. Ghali, M. G., Marchenko, V. Dynamic changes in phrenic motor output following high cervical hemisection in the decerebrate rat. Exp Neurol. 271, 379-389 (2015).
  39. Ditunno, J. F., Little, J. W., Tessler, A., Burns, A. S. Spinal shock revisited: A four-phase model. Spinal Cord. 42 (7), 383-395 (2004).
  40. Khurram, O. U., Gransee, H. M., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Automated evaluation of respiratory signals to provide insight into respiratory drive. Respir Physiol Neurobiol. 300, 103872(2022).
  41. Khurram, O. U., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Neuromotor control of spontaneous quiet breathing in awake rats evaluated by assessments of diaphragm emg stationarity. J Neurophysiol. 130 (5), 1344-1357 (2023).
  42. Rana, S., Zhan, W. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Cervical spinal hemisection alters phrenic motor neuron glutamatergic mRNA receptor expression. Exp Neurol. 353, 114030(2022).
  43. Mantilla, C. B., Greising, S. M., Zhan, W. Z., Seven, Y. B., Sieck, G. C. Prolonged c2 spinal hemisection-induced inactivity reduces diaphragm muscle specific force with modest, selective atrophy of type IIx and/or IIb fibers. J Appl Physiol. 114 (3), 380-386 (2013).
  44. Jensen, V. N., Romer, S. H., Turner, S. M., Crone, S. A. Repeated measurement of respiratory muscle activity and ventilation in mouse models of neuromuscular disease. J Vis Exp. (122), e55599(2017).
  45. Navarrete-Opazo, A., Mitchell, G. S. Recruitment and plasticity in diaphragm, intercostal, and abdominal muscles in unanesthetized rats. J Appl Physiol. 117 (2), 180-188 (2014).
  46. Redfern, M., Hughes, R., Chaffin, D. High-pass filtering to remove electrocardiographic interference from torso emg recordings. Clin Biomech. 8 (1), Bristol, Avon. 44-48 (1993).
  47. Seven, Y. B., Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Non-stationarity and power spectral shifts in emg activity reflect motor unit recruitment in rat diaphragm muscle. Respir Physiol Neurobiol. 185 (2), 400-409 (2013).
  48. Christensen, H., Sogaard, K., Jensen, B. R., Finsen, L., Sjogaard, G. Intramuscular and surface emg power spectrum from dynamic and static contractions. J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 27-36 (1995).
  49. Belman, M. J., Sieck, G. C. The ventilatory muscles. Fatigue, endurance and training. Chest. 82 (6), 761-766 (1982).
  50. Belman, M. J., Sieck, G. C., Mazar, A. Aminophylline and its influence on ventilatory endurance in humans. Am Rev Respir Dis. 131 (2), 226-229 (1985).
  51. Levine, S., Gillen, J., Weiser, P., Gillen, M., Kwatny, E. Description and validation of an ecg removal procedure for emgdi power spectrum analysis. J Appl Physiol. 60 (3), 1073-1081 (1986).
  52. Schweitzer, T. W., Fitzgerald, J. W., Bowden, J. A., Lynne-Davies, P. Spectral analysis of human inspiratory diaphragmatic electromyograms. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (1), 152-165 (1979).
  53. Sharp, J. T. The respiratory muscles in emphysema. Clin Chest Med. 4 (3), 421-432 (1983).
  54. Sinderby, C., Spahija, J., Beck, J. Changes in respiratory effort sensation over time are linked to the frequency content of diaphragm electrical activity. Am J Respir Crit Care Med. 163 (4), 905-910 (2001).
  55. Dougherty, B. J., et al. Recovery of inspiratory intercostal muscle activity following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 183 (3), 186-192 (2012).
  56. Lane, M. A., et al. Respiratory function following bilateral mid-cervical contusion injury in the adult rat. Exp Neurol. 235 (1), 197-210 (2012).
  57. Burns, D. P., Murphy, K. H., Lucking, E. F., O'halloran, K. D. Inspiratory pressure-generating capacity is preserved during ventilatory and non-ventilatory behaviours in young dystrophic mdx mice despite profound diaphragm muscle weakness. J Physiol. 597 (3), 831-848 (2019).
  58. Dow, D. E., Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. EMG-based detection of inspiration in the rat diaphragm muscle. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006, 1204-1207 (2006).
  59. Rana, S., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Diaphragm electromyographic activity following unilateral midcervical contusion injury in rats. J Neurophysiol. 117 (2), 545-555 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Letsel aan het cervicale ruggenmergEMG registratie van het diafragmaunilaterale C2 hemisectiemotorische controle van het diafragmarespiratoire neuroplasticiteitipsilaterale diafragma activiteitcontralaterale diafragma activiteitBDNF trkB signaleringwakker ratmodelelektromyografische analyse

Gerelateerde artikelen