Methodenartikel

Isolatie van van de navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellen met hoge opbrengsten en lage schade

5.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66835

⸱

5 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een unieke stompe dissectieprocedure om de integriteit van Wharton's jelly (WJ) te behouden, wat resulteert in minder beschadigde WJ en een grotere hoeveelheid en levensvatbaarheid van de geoogste mesenchymale stamcellen (MSC's). De methode vertoont een superieure opbrengst en proliferatief vermogen in vergelijking met conventionele methoden voor scherpe dissectie.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een populatie van multipotente cellen met opmerkelijke regeneratieve en immunomodulerende eigenschappen. Wharton's gelei (WJ) uit de navelstreng (UC) heeft steeds meer belangstelling gekregen in het biomedische veld als een uitstekende bron van MSC's. Er zijn echter uitdagingen ontstaan zoals het beperkte aanbod en het gebrek aan standaardisatie van bestaande methoden. Dit artikel presenteert een nieuwe methode om de MSC-opbrengst te verbeteren door intacte WJ uit de navelstreng te ontleden. De methode maakt gebruik van stompe dissectie om de epitheellaag te verwijderen, waardoor de integriteit van het gehele WJ behouden blijft en de hoeveelheid en levensvatbaarheid van de geoogste MSC's toeneemt. Deze aanpak vermindert het WJ-afval aanzienlijk in vergelijking met conventionele methoden voor scherpe dissectie. Om de zuiverheid van WJ-MSC's te garanderen en externe cellulaire invloed te minimaliseren, werd een procedure uitgevoerd waarbij gebruik werd gemaakt van interne spanning om het endotheel af te pellen na het omdraaien van de UC. Bovendien werd de petrischaal tijdens de explantatiecultuur korte tijd omgekeerd om de hechting en celuitgroei te verbeteren. Vergelijkende analyse toonde de superioriteit van de voorgestelde methode aan, met een hogere opbrengst van WJ en WJ-MSC's met een betere levensvatbaarheid dan traditionele methoden. De vergelijkbare morfologie en het expressiepatroon van celoppervlaktemarkers in beide methoden bevestigen hun karakterisering en zuiverheid voor verschillende toepassingen. Deze methode biedt een benadering met een hoog rendement en een hoge levensvatbaarheid voor WJ-MSC-isolatie, wat een groot potentieel aantoont voor de klinische toepassing van MSC's.

Inleiding

Sinds de eerste isolatie van mesenchymale stamcellen (MSC's) uit Wharton's jelly (WJ) in 1991, hebben deze multipotente stamcellen veel aandacht gekregen van onderzoekers vanwege hun regeneratieve eigenschappen en differentiatievermogenvoor meerdere afstammingslijnen. MSC's kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen, waaronder beenmerg, perifeer bloed, tandpulp, vetweefsel, foetale (menselijke abortus) en geboortegerelateerde weefsels2. De navelstreng (UC) is naar voren gekomen als een veelbelovend reservoir vanwege zijn niet-invasieve aard, overvloedige celopbrengst en differentiatiecapaciteit, met een hoge proliferatiesnelheid, differentiatiepotentieel en immuunmodulatie-eigenschappen3. Foetale MSC's vertonen een sterke stam en immuuneigenschappen, waardoor ze de primaire focus zijn van klinische onderzoeken en fundamenteel onderzoek die de afgelopen twee decennia zijn uitgevoerd 2,4,5. UC-afgeleide MSC's hebben een superieur therapeutisch potentieel in vergelijking met andere bronnen van MSC, zoals beenmerg of vetweefsel 6,7.

De CU bestaat uit vruchtwaterepitheel, drie bloedvaten (twee slagaders en één ader) en de gelatineuze substantie die bekend staat als WJ3. Intrigerend genoeg vormt de UC een eenvoudig vaatstelsel, dat alleen bestaat uit het endotheel en het mesotheel, maar niet uit de tunica adventitia; de WJ bevat geen lymfe of zenuwen8. De UC heeft een unieke structuur die ideaal is voor segmentale scheiding. UC-MSC's bevinden zich voornamelijk in de WJ. MSC's kunnen worden geïsoleerd uit verschillende compartimenten van de WJ, waaronder amnion, subamnion (het amnion en subamnion ook aangeduid als navelstrengvoeringsgebied) en het perivasculaire gebied van de WJ8. Elk gebied van de WJ heeft zijn eigen structuur, immunohistochemische kenmerken en functie 3,6.

MSC's geïsoleerd uit de WJ van de CU worden algemeen beschouwd als superieur klinisch bruikbaar in vergelijking met die uit andere regio's3. WJ-MSC's zijn uitgebreid bestudeerd in preklinische en klinische omgevingen voor de behandeling van verschillende ziekten vanwege hun differentiatiepotentieel voor meerdere lijnen, immunomodulerende eigenschappen, paracriene effecten, ontstekingsremmende effecten en immuunbevoorrechte eigenschappen 2,3. Het is bewezen dat WJ-MSC's veelbelovend zijn bij de behandeling van een reeks ziekten, waaronder graft-versus-host-ziekte (GvHD), transplantaatafstoting, de ziekte van Crohn, auto-immuunziekten en hart- en vaatziekten 9,10,11,12,13,14. Aangezien de klinische vraag naar WJ-MSC's blijft toenemen, vormt het tekort aan navelstrengen momenteel een belemmering voor hun wijdverbreide toepassingen.

De opbrengst van WJ-MSC's is afhankelijk van de methode die wordt gebruikt voor celextractie15. Hoewel WJ-MSC's kunnen worden geïsoleerd door middel van explantatiecultuur of enzymvertering, heeft de laatste methode een langere voortplantingstijd die het risico op celbeschadiging kan verhogen en de levensvatbaarheid van de cel kan verminderen16. Talrijke onderzoeken hebben echter aangetoond dat de explantatiecultuurmethode de celopbrengst en levensvatbaarheid verhoogt, en dat paracriene factoren die vrijkomen uit explantatieweefsels ook helpen bij het bevorderen van celproliferatie17,18.

Deze studie paste een unieke dissectiebenadering toe om volledige WJ te verkrijgen, wat MSC's opleverde met een verbeterde proliferatieve capaciteit, levensvatbaarheid en kwantiteit, terwijl de schade aan de WJ werd geminimaliseerd. Deze innovatieve methode biedt een gestroomlijnde strategie voor het isoleren van WJ-MSC's, waarmee wordt ingespeeld op kritieke behoeften in MSC-toepassingen.

Protocol

Monsters werden verkregen van de instemmende, gezonde donoren van het Shenzhen Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital, Guangdong, China. Het gebruik van menselijke monsters voor het onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Shenzhen Hospital, de Beijing University of Chinese Medicine (SZLDH2020LSYM-095) en de Medical Ethics Committee van het Shenzhen Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital (LGFYYXLLS-2020-005). Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde richtlijnen. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Verzameling van menselijke navelstreng

  1. Verkrijg monsters van de menselijke navelstreng van het coöperatieve ziekenhuis onder steriele omstandigheden.
    OPMERKING: Kies een donor jonger dan 35 jaar, bij voorkeur een primipara, zonder voorgeschiedenis van hepatitis, seksueel overdraagbare aandoeningen of genetische aandoeningen. De resultaten van het toelatingsexamen voor het hepatitis B-virus, het hepatitis C-virus en het cytomegalovirus moeten negatief zijn. Kies een keizersnede als bevallingswijze.
  2. Kies een recht en intact stuk UC van ongeveer 10-15 cm lang.
  3. Sluit beide uiteinden met een hemostatische pincet en leg ze vast met chirurgische knopen aan het binnenste uiteinde tussen de tang direct na de bevalling van een voldragen pasgeborene via een keizersnede. (verzamelde UC zoals weergegeven in figuur 1, stap 1).
    OPMERKING: De werking van de keizersnede zorgt ervoor dat de afname steriel is. Gebruik chirurgische knopen van maat 0 of 2-0 hechtdraad voor een betere treksterkte.
  4. Knip de vastgebonden navelstreng tussen de tang en knopen door met een chirurgische schaar (Figuur 1, stap 1).
  5. Spoel het af met een zoutoplossing om eventuele verontreinigende bloedstolsels op het oppervlak te verwijderen en breng het onmiddellijk over in een steriele plastic buis van 50 ml met 20 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: Er is geen antibioticum gebruikt tijdens de overdracht.
  6. Sluit de buis af. Plaats het op ijs in een doos van polystyreen en bewaar het bij 4 °C voordat u het naar het laboratorium vervoert.
    NOTITIE: Ontleed het snoer binnen 4 uur na verzameling.

2. Isolatie van Wharton's gelei uit de navelstreng

  1. Verwerk de navelstreng volgens de onderstaande stappen:
    1. Bereid een gesteriliseerde tray voor met chirurgische instrumenten, aseptisch verpakte schaaltjes van 90 mm, pipetten van 1000 μl, steriel PBS, 75% ethanoloplossing en xenovrij humaan MSC-kweekmedium.
      OPMERKING: Met de getande tang en muggenklemmen kan het glibberige koord efficiënt worden aangepakt.
    2. Ontsmet de benodigde items en werkzone het oppervlak voordat u de items in de bioveiligheidskast plaatst.
      NOTITIE: Laat de lucht in de werkzone een paar minuten ontsnappen voordat u met de werkzaamheden begint.
    3. Desinfecteer het oppervlak van de buis en verwijder het monster in een petrischaaltje in de bioveiligheidskast. Dompel het monster met de knopen 30 s onder in 75% ethanol en spoel het vervolgens meerdere keren af met steriel PBS in een nieuw petrischaaltje.
      NOTITIE: Het snoer moet worden afgebonden voordat het wordt ondergedompeld in 75% ethanol, en de tijd van onderdompeling moet worden beperkt tot 30 s tot 1 minuut om het snoer volledig te desinfecteren zonder schade.
    4. Knip de knopen af en knip het koord tussen twee knopen overdwars in korte stukjes van ongeveer 2 cm lang met een chirurgische schaar en een tang.
      NOTITIE: De uiteinden van het snoer met knopen moeten worden weggegooid. De lengte van de UC mag niet te lang of te kort zijn; Beide omstandigheden kunnen de moeilijkheidsgraad van de operatie verhogen.
    5. Doordrenk de ader (groter vat) met PBS met behulp van pipetten van 1000 μl totdat de vloeistof die uit het andere uiteinde van de streng komt volledig transparant wordt19.
  2. Ontleed de navelstreng.
    1. Leg een van de reeds gesneden stukken op een nieuwe petrischaal.
      OPMERKING: Twee slagaders en één ader moeten zichtbaar zichtbaar zijn op de dwarsdoorsnede8 (Figuur 2B).
    2. Voeg de juiste hoeveelheid PBS toe om het snoer tijdens de hele operatie nat te houden.
    3. Pak het koord met een tang vast en trek de slagaders langs de hoofdas eruit met behulp van muggenklemmen.
      OPMERKING: Probeer aan het andere uiteinde van het koord te trekken als de slagader is afgescheurd, aangezien de slagaderwand een grote elasticiteit heeft.
    4. Bevestig het koord horizontaal met de dikkere kant naar boven door een blad van de pincet in de navelstrengader te steken en vervolgens stevig vast te klemmen, waarbij u ervoor zorgt dat de pincet clamp aan de dikkere kant.
    5. Maak met een scalpel een lineaire incisie in de laag vruchtwaterepitheel van het ene uiteinde naar het andere langs de rand van het andere blad van de tang (Figuur 3).
      OPMERKING: Behoud de integriteit van de gelei van Wharton door zo min mogelijk WJ te snijden.
    6. Begin bij een hoek van de snijopening. Til de hoek van het vruchtwaterepitheel op met getande klemmen en knip nog iets verder horizontaal met een hoornvliesschaar langs het binnenoppervlak van het epitheel.
      1. Scheid de gelei van Wharton en het vruchtwaterepitheel met klemmen en breid geleidelijk uit naar de hele cirkel van het ene uiteinde van UC. Trek de epitheellaag in de lengte af (Figuur 3).
        OPMERKING: De gelei van Wharton is een slijmvliesbindweefsel dat wordt omsloten door het dichte vruchtwaterepitheel8. De hele operatie moet soepel verlopen, maar muggenklemmen kunnen worden gebruikt voor stompe dissectie als men problemen ondervindt tijdens het pellen.
    7. Steek beide bladen van de pincet in de ader, klem een deel van WJ vast en draai het vervolgens binnenstebuiten om het epitheel van de navelstrengader bloot te leggen (Figuur 3).
    8. Verwijder het epitheel van de ader gemakkelijk, omdat de interne spanning een scheiding creëert tussen het epitheel van de ader en de perivasculaire WJ (Figuur 3).
  3. Ontleed de UC met behulp van de conventionele vergelijkingsmethode20.
    1. Kies een ander reeds gesneden monster van bijna hetzelfde gewicht als het vorige snoer en breng het over naar een nieuw petrischaaltje.
    2. Knip met een schaar in de lengterichting langs de navelstrengader en spreid de UC uit om de bloedvaten en WJ bloot te leggen.
    3. Verwijder de navelstrengader en twee slagaders en verwijder de WJ van de endotheellaag met een schaar en scalpel.

3. Isolatie en cultuur van UC-MSC's

  1. Plaats de verzamelde WJ in een vooraf geëtiketteerde petrischaal van 90 mm en snijd deze met een schaar en pincet in stukken van 1-3 mm.
  2. Keer de schaal om met de dop op de bodem en plaats deze gedurende 30 minuten in een incubator van 5% CO2 bij 37 °C om de hechting tussen de stukken en het plastic oppervlak te versterken.
  3. Draai de schaal om en voeg voorzichtig een geschikte hoeveelheid humaan MSC-kweekmedium toe voor verdere kweek.
    NOTITIE: Gebruik de laagste snelheid om er zeker van te zijn dat de stukken nog steeds vastzitten.
  4. Vervang het menselijke MSC-kweekmedium elke 3 dagen. Vervang tweederde van het medium en observeer het verschijnen van uitgroei van fibreuze cellen om de 2 dagen in de eerste 7 dagen, verander het volledige medium en observeer het daarna dagelijks.
    LET OP: Vermijd het verplaatsen van de petrischaal gedurende de eerste 7 dagen. De onderscheidende uitgroei van fibroblastachtige cellen werd in ongeveer 4 dagen waargenomen.
  5. Subcultuur totdat de samenvloeiing 80% bereikt.
    OPMERKING: Deze stap duurt 7-10 dagen.
    1. Verwarm het PBS, 0,25% trypsine en xenovrij humaan MSC-kweekmedium voor op 37 °C in een waterbad.
    2. Spoel met PBS na het opzuigen van het supernatans met pipetten en maak de cellen los met voorverwarmd 0,25% trypsine totdat de cellen kunnen worden losgemaakt door op de petrischaal te tikken.
    3. Inactiveer de trypsine door het voorverwarmde MSC-kweekmedium te mengen in een verhouding van 4:1, verzamel de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Deze cellen worden beschouwd als doorgang 0 (P0).
    4. Gooi het supernatans weg met een pipet, resuspendeer de cellen in het menselijke MSC-kweekmedium en inoculeer in nieuwe petrischaaltjes met een zaaidichtheid van 1x104 cellen/cm2 voor vermeerdering.
  6. Tel met behulp van een hemocytometer het totale aantal cellen van de twee methoden na amplificatie bij de eerste, tweede en derde passage. Bepaal de celmorfologie onder de microscoop in de eerste, derde en vijfde passage.
    OPMERKING: De morfologie van deze cellen moet vergelijkbaar zijn met die van de P0-cellen.
  7. Gebruik cellen bij de vijfde doorgang voor flowcytometrie en andere experimenten.

4. Expressie van celoppervlaktemarkers door flowcytometrie

  1. Maak doorgang 5 (P5) cellen los met 0,25% trypsine, was de cellen met celkleuringsbuffer en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellets met een celkleuringsbuffer tot 100 μl per stuk.
  2. Label elke buis en voeg de juiste hoeveelheden antilichamen toe, die zijn geconjugeerd met allofhycocyanine (APC), fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of fycoerythrine (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE volgens de instructies van de fabrikant21. Incubeer 15-20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
  3. Centrifugeer de gekleurde cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, zuig het supernatans op met een pipet en was eenmaal met de celkleuringsbuffer.
  4. Herhaal de centrifugatie en resuspensie van de cellen met 300 μl van de celkleuringsbuffer.
  5. Haal de cellen door de flowcytometer en analyseer de met antilichamen gekleurde cellen volgens de instructies van de fabrikant.

5. Bepaling van de celgroeicurve door middel van de celtelmethode

  1. Bereid een eencellige suspensie van P5-cellen met behulp van twee methoden door ze te verdunnen in een humaan MSC-kweekmedium.
  2. Zaai 8.000 cellen per putje in een plaat met 24 putjes, waarbij in totaal 21 putjes van elke methode worden gezaaid.
    OPMERKING: Meng de cellen voorzichtig door te blazen en te zuigen met pipetten voor het zaaien.
  3. Oogst cellen uit drie putjes na 24 uur zaaien. Voer celtellingen uit met behulp van een hemocytometer om de gemiddelde waarde te berekenen.
    NOTITIE: Schud de plaat voordat u de cellen telt. De duur van het schudden kan worden verlengd om de vorming van celaggregaten te voorkomen.
  4. Herhaal de cellentelling elke 24 uur voor een totale duur van 7 dagen. Teken een groeicurve met behulp van tijd (d) op de X-as en celgetal (x104/ml) op de Y-as.

Resultaten

De procedures voor het verzamelen en kweken van UC-MSC's, evenals de daaropvolgende analyse, zijn samengevat in figuur 1. De UC werd netjes ontleed in verschillende secties met behulp van de unieke methode; het specifieke bedieningsschema van de belangrijkste procedures wordt geïllustreerd in figuur 2. De uitgroei van cellen uit explantatieculturen werd routinematig gecontroleerd en geregistreerd. Aanhangende spoelvormige cellen werden ongeveer 4 dagen na het kweken van de explantaten waargenomen en kropen steeds meer in een vortexvorm. Deze cellen werden ook geïdentificeerd als P0 en bleven prolifereren voor daaropvolgende passaging, terwijl ze een uniforme grootte en morfologie behielden tijdens proliferatie en passaging. De conventionele en huidige methoden vertoonden verwaarloosbare verschillen in termen van celgrootte en morfologie (Figuur 3).

De conventionele dissectiemethode omvat het wegschrapen van de WJ van de bloedvaten en het binnenste epitheel van de UC. De WJ-opbrengst vertegenwoordigde een significant verschil tussen de twee methoden door gewichtsaanpassing. Het rendement van WJ kan worden berekend door het gewichtspercentage van de WJ in het snoer van 2 cm te meten (2,4 g ± 0,2 g). Een vergelijking van de verhouding tussen de WJ-opbrengst tussen de huidige en traditionele methoden toonde een significante toename van de WJ-opbrengst met behulp van de nieuwe benadering (Figuur 4A). Verdere analyse door het tellen van de totale hoeveelheid WJ-MSC's die met beide methoden was geoogst uit het equivalente gewicht van UC toonde tegelijkertijd een uitgesproken kloof in de celhoeveelheid met toenemende passageaantallen (Figuur 4B). De groeicurve gaf aan dat de proliferatiesnelheid van MSC's in de nieuwe methode significant hoger was dan in de conventionele methode bij dezelfde inoculatiedichtheid na 2 dagen (Figuur 4C). Deze experimenten demonstreren de voordelen van de huidige methode, die een efficiënte manier mogelijk maakt om de efficiënte aanvoer van hetzelfde materiaal te vergroten.

Volgens de minimumcriteria van de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) voor de definitie van MSC's, vertoont het immunofenotype van MSC's positieve expressie van CD105, CD44, CD90, CD73 (meer dan 95%), terwijl CD45, CD19, CD34, CD11b en HLA-DR (minder dan 2%)22 afwezig is. WJ-afgeleide MSC's werden onderzocht via kwantitatieve flowcytometrie (Figuur 5); de cellen die met beide methoden werden geïsoleerd, waren zeer positief voor de oppervlakteantigenen CD105, CD44, CD90 en CD73 (allemaal boven 99%), waarbij de expressie van de oppervlaktemoleculen CD45, CD19, CD34, CD11b en HLA-DR tot expressie kwam onder detecteerbare niveaus (gegevens niet getoond). Op basis van de resultaten van markers op het celoppervlak kunnen aanhangende cellen fijn worden beschouwd als MSC's en kan hun identificatie en zuiverheid worden gegarandeerd.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van de dissectie en isolatie van WJ-MSC's uit de navelstreng. Stap 1: Het monster van de menselijke navelstreng wordt verzameld bij de pasgeborene en gespoeld met een zoutoplossing, gevolgd door perfusie van de ader. Het koord wordt vervolgens in stukken van 2 cm gesneden. Stap 2: Pure Wharton's Jelly (WJ) wordt verkregen met behulp van de huidige methode, waarbij de scheiding van de slagaders, het vruchtwaterepitheel en het aderepitheel betrokken is. De traditionele methode wordt ook gebruikt voor vergelijking. De navelstreng wordt dienovereenkomstig ontleed. Stap 3: De ontlede WJ wordt in stukken van 1-3 mm gesneden en de schaal wordt 30 minuten ondersteboven in de incubator geplaatst om de hechting tussen de stukken en het plastic oppervlak te versterken. De WJ-stukken worden vervolgens gekweekt en gepasseerd met een zaaidichtheid van 1 x 104 cellen/cm2 totdat 80% samenvloeiing wordt bereikt. Stap 4: Flowcytometrie wordt gebruikt om de P5-cellen te karakteriseren door oppervlaktemarkers van mesenchymale stamcellen (MSC) te analyseren. Stap 5: Het proliferatieve vermogen van de cellen wordt bepaald door een celgroeicurve uit te zetten met behulp van de celtelmethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Anatomie van de navelstreng en schematische demonstratie van dissectie. (A) De dwarsdoorsnede van de UC, met de nadruk op slagaders (A), ader (V), Wharton's jelly (WJ) en de daaropvolgende dissectie scheidt UC in verschillende compartimenten. (B) Schematische demonstratie van het verwijderen van de vruchtwaterepitheellaag. De incisie wordt gemaakt langs de stippellijn op het vruchtwaterepitheel en scheidt het epitheel, te beginnen met de zijhoek van de streng. (C) Schematische demonstratie van het verwijderen van het epitheel van de ader. Door het koord binnenstebuiten te keren (de richting van de pijl geeft de richting van de kracht aan) komt het aderepitheel bloot te liggen voor verwijdering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Morfologische kenmerken van primair gekweekte en gepassageerde WJ-MSC's. Onderscheidende fibroblastoïde celgroei van de explantaten kan worden waargenomen rond dag 4 (aangegeven door de pijlen) en vertoonde in toenemende mate een vortexachtig groeipatroon. De explantaten werden verwijderd en gesubcultiveerd; De geïsoleerde cellen waren homogeen met betrekking tot de gevisualiseerde grootte en morfologie. Er werd een onbeduidend verschil waargenomen in de grootte en morfologie van cellen tussen de twee methoden. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Grafische vergelijkende analyse van de WJ-opbrengst en de groeikenmerken van de gekweekte MSC's. (A) Vergelijking van de WJ-opbrengst bij gebruik van 2 cm UC met een aanvangsgewicht van 2,4 g ± 0,2 g bij beide methoden. WJ-opbrengst = (gewicht van WJ) / (initieel gewicht van het onbewerkte snoer. Verhouding van WJ-opbrengst (%) = (WJ-opbrengst) / (gemiddelde WJ-opbrengst van de huidige methode) × 100. (B) Vergelijking van het aantal cellen na kweek en passage onder dezelfde omstandigheden met beide methoden. (C) Groeicurven van P5-cellen in beide methoden. Alle experimenten omvatten drie biologische replicaten en de statistische verschillen werden geanalyseerd met behulp van de tweerichtings-ANOVA-methode (***p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Expressie van het celoppervlak van MSC geanalyseerd door middel van flowcytometrie. P5-cellen die met zowel conventionele als huidige methoden worden verzameld, worden onderworpen aan flowcytometrie-analyse. De oppervlakteantigenen CD44, CD105, CD90 en CD73 waren zeer positief (allemaal boven de 99%), terwijl de expressies van CD45-, CD19-, CD34-, CD11b- en HLA-DR-oppervlaktemoleculen onder de detectielimiet lagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

MSC's vertegenwoordigen een dynamisch onderzoeksgebied met ingrijpende implicaties voor regeneratieve geneeskunde22. Hun unieke eigenschappen maken ze tot een brandpunt voor wetenschappelijk onderzoek en hebben het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de behandeling van een breed scala aan ziekten en verwondingen7. WJ-MSC's zijn een afzonderlijke subset van MSC's, die kunnen worden verkregen uit het gelatineuze bindweefsel binnen de CU dat zich tussen het intervasculaire en vruchtwaterepitheel bevindt23. De klinische toepassing van MSC's ligt in het bereiken van voldoende celaantallen24. Naarmate het aantal passages toenam, begonnen de cellen echter een zekere mate van verouderingsverschijnsel te vertonen en nam de proliferatieve capaciteit van MSC's geleidelijk af na P524. Het optimaliseren van methoden om de MSC-opbrengst te verbeteren is daarom absoluut noodzakelijk.

De meest efficiënte manier om WJ-MSC's te isoleren, is door de hele WJ te ontleden met behoud van de integriteit6. Onderzoek toont aan dat deze grenscellen uit grensregio's van de navelstreng een hogere migratiekarakteristiek en een hogere proliferatiesnelheid hebben dan intervasculaire WJ-MSC's23. De regio's en methoden voor het ontleden van WJ zijn echter niet gestandaardiseerd en het blijft onduidelijk of stamcelpopulaties binnen WJ-MSC's dezelfde kwaliteiten delen vanwege het ontbreken van duidelijke histologische grenzen tussen partities3.

Eerdere studies hebben significante verschillen aangetoond in de eigenschappen van WJ-MSC's afkomstig uit verschillende compartimenten van de navelstreng, waarbij cellen die zich dicht bij het vruchtwateroppervlak bevinden een verbeterd proliferatief vermogen vertonen3. De huidige unieke methode voor het ontleden van UC en het isoleren van WJ-MSC's is gericht op het verminderen van zowel het verlies van de WJ-bekleding als celbeschadiging, wat de celopbrengst en levensvatbaarheid verbetert. Dit protocol demonstreert een methode die de verwerking van CU tot bijna intacte WJ vergemakkelijkte. De primaire stap van het protocol omvat het verwijderen van de epitheellaag door middel van peeling en stompe dissectie. De innovatiestap is om de epitheellaag in de lengte af te pellen met muggenklemmen. Deze aanpak is effectief in het verminderen van de aangrenzende celbeschadiging veroorzaakt door conventionele scherpe dissectie met een schaar25.

Het endotheel van de ader is kwetsbaar en moeilijk te verwijderen. Na het verwijderen van het vruchtwaterepitheel uit de navelstrengader, wordt de navelstreng door de ader gedraaid om het endotheel bloot te leggen. Interne spanning die door de WJ wordt gecreëerd, wordt vervolgens gebruikt om het endotheel van de ader af te pellen, waardoor interferentie van menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC's) tijdens daaropvolgende celkweekprocessen wordt geminimaliseerd.

De explantatiecultuurmethode wordt toegepast omdat deze een hogere opbrengst heeft in vergelijking met andere beschikbare methoden18. De ongebonden cellen zullen geleidelijk worden verwijderd door de uitwisseling van het menselijke MSC-kweekmedium, wat resulteert in het verlies van cellen26. De explantaten die zich niet aan het plastic hechten, kunnen de celuitgroei belemmeren in eerdere ervaringen. Er moet rekening worden gehouden met de impact van waterdamp die uit het weefsel vrijkomt als gevolg van de veranderingen tussen de binnen- en buitentemperatuur van de couveuse. Om de droge toestand van de petrischaal te behouden, werd een innovatieve stap geïmplementeerd om de schaal tijdens het broeden 30 minuten ondersteboven te houden met het deksel op de bodem. Deze omkering van een schaal vermeed de condensatie van waterdamp op het contact tussen het weefsel en het oppervlak van de petrischaal, wat op zijn beurt een betere hechting van exosomen aan het plastic oppervlak mogelijk maakt om de celuitgroei te verbeteren.

De huidige methode wordt vergeleken met de conventionele ontleedmethode door het gewichtspercentage van de verkregen WJ en de hoeveelheid gekweekte en gepasseerde MSC's te meten; de nieuwe methode toonde een significant hogere opbrengst van WJ en een grotere hoeveelheid geoogste MSC's aan. Hoewel elk protocol om stamcelpopulaties uit elk van deze compartimenten te isoleren het risico van celbesmetting uit de andere compartimenten met zich meebrengt, toonden de resultaten de zuiverheid van geïsoleerde MSC's aan, gekenmerkt door een hoge expressie van mesenchymale markers (allemaal boven 99%) en minimale detectie van hematopoëtische en endotheliale markers (gegevens niet getoond). De resultaten toonden aan dat de WJ-MSC's zuiver zijn en geschikt voor verschillende toepassingen, in overeenstemming met de ISCT-richtlijnen21. De gekweekte MSC's vertoonden in korte tijd fibroblastachtige cellen en de cellen vormden zich steeds meer tot vortexvormige cellen, met een groot proliferatief potentieel en migratie-eigenschappen.

Het protocol dat in deze studie wordt geschetst, vertoont verschillende tekortkomingen. Ten eerste is de vereiste vaardigheid voor de operator hoog, zoals blijkt uit de scheiding van het vruchtwaterepitheel. Dit kan de wijdverbreide toepassing ervan in onderzoek of klinische toepassingen belemmeren. Ten tweede leunt het protocol sterk op handmatige manipulatie tijdens de dissectie, wat kan leiden tot inconsistentie tussen experimenten of operators. Standaardisatie van het dissectieproces zou de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van het protocolverbeteren 25. Bovendien laat het ontbreken van andere vergelijkingen met de conventionele methode vragen onbeantwoord.

Concluderend biedt de huidige methode een efficiënte manier om het intacte WJ te scheiden van het vruchtwaterepitheel en de bloedvaten, wat resulteert in een oogst die de perivasculaire en subamniotische Wharton's gelei omvat. De introductie van een omgekeerde incubatiestap draagt verder bij aan een verbeterde MSC-hechting. Vergelijkende analyse met traditionele methoden toont de aanzienlijke voordelen van het voorgestelde protocol aan in termen van het verkrijgen van een hogere WJ-opbrengst en het oogsten van meer MSC's met een beter proliferatief vermogen. De bevindingen benadrukken ook de zuiverheid van de geïsoleerde MSC's, zoals aangegeven door een duidelijk patroon van expressie van celoppervlaktemarkers. Deze methode zou de MSC-opbrengst en het proliferatieve vermogen kunnen verbeteren en een kosteneffectieve methode bieden om de MSC-productie te verhogen.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82172107), de Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Shenzhen Medical Research Fund (SMRF. D2301015), het Shenzhen Municipal Science and Technology Innovation Committee (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) en het Longgang District Special Fund for Economic and Technological Development (LGKCYLWS2022007).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APC anti-human CD44 Antibody Biolegend 338806
24-well cell culture platesThermo Scientific142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody Biolegend 344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400122
AutoclaafHIRAYAMAHVE-50
Automatische celtellerCountstarFL-CD
BAMBANKER cryopreserveringsoplossingWako302-14681
CelkleuringsbufferBiolegend 420201
CentrifugaatmachineEppendorf5424R
Schone werkbankShanghai ZhiChengC1112B
CO2-incubatorThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Elektro-thermostatische snelkookpanShanghai JingHongDHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400110
Flow CytometryBeckmanCytoFLEX
HemocytometerSuperior Marienfeld640410
Intracellulaire kleuringspermeabilisatie wasbuffer (10×) Biolegend 421002
Inverteerbare biologische microscoopZEISSAxio Vert. A1
Vloeibare stikstofopslagtankThermo ScientificCY50935-70
Normaal zout (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-human CD11b AntibodyBiolegend 393112
PE anti-human CD19 Antibody Biolegend 392506
PE anti-human CD34 AntibodyBiolegend 343606
PE anti-human CD45 AntibodyBiolegend 368510
PE anti-human HLA-DR Antibody Biolegend 307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400214
Precisie elektronisch weegschaalSatoriusPRACTUM313-1CN
Sneeuwvlok ijsmachineZIEGRAZBE 30-10
Gesteriliseerde 50 mL kunststof buisGreniner227270
Thermostaat waterbadShanghai YiHengHWS12
Trypsine 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios HPCFDCGL50
Ultrazuiver en zuiver water zuiveringssysteemMilli-QMilli-Q Reference
Xeno-vrij menselijk MSC-kweekmediumFUKOKU T2011301

Referenties

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Whartonsgeleiisolatie van stamcellenbotte dissectiecelviabiliteitexplantaatkweekceloppervlaktemarkersregeneratieve geneeskundetransplantatie van organo den
Isolatie van van de navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellen met hoge opbrengsten en lage schade
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.