Methodenartikel

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

DOI:

10.3791/66980

⸱

13 september 2024

 , 
1Systems Medicine Laboratory, Biotechnology Research and Innovation Council - National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen, bouwen en leveren van tetracycline-gecontroleerde geïnduceerbare synthetische schakelingen. Het effect van de synthetische circuits op de eliminatie van parasieten en de expressie van cytokines kan worden bestudeerd door de gepresenteerde pijplijn te kanaliseren. Dit protocol is relevant voor onderzoekers die op synthetische circuits gebaseerde therapieën bestuderen bij infectieziekten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunometabolisme is een cruciale bepalende factor in de progressie van leishmaniasis. Op synthetische biologie gebaseerde benadering heeft veel aandacht gekregen als een stap in de richting van therapeutische interventie gericht op gastheer-geassocieerde factoren die leishmaniasis veroorzaken. Synthetische biologie omvat de engineering van genetische componenten op een orthogonale en modulaire manier om biologische systemen nauwkeurig te moduleren, waardoor cellen nieuwe functies krijgen. In de gepresenteerde studie was de opheldering van een systematische pijplijn voor de ontwikkeling van een induceerbaar tetracycline-gecontroleerd (TetON) gebaseerd synthetisch circuit gericht op het leveren van succinaatdehydrogenase als therapeutisch middel om de eliminatie van intracellulaire Leishmania-parasieten te vergemakkelijken. Het geschetste protocol beschrijft het ontwerpen van een synthetisch circuit en de daaropvolgende validatie ervan. De voorgestelde strategie concentreert zich ook op de integratie van synthetische circuits in de plasmide-ruggengraat als leveringsvoertuig. Bovendien werden toedieningsmachines met behulp van op polyplexen gebaseerde nanodeeltjes voor de levering van synthetische circuits gebruikt in muizen macrofaagcellijnen zonder de cellulaire morfologie in gevaar te brengen. Standaardisatie van de methode werd uitgevoerd voor het selecteren van getransfecteerde cellen en het bepalen van de optimale inductieconcentratie voor expressie van synthetische circuits. Waarnemingen onthullen een duidelijke vermindering van de intracellulaire parasietbelasting in getransfecteerde cellen in vergelijking met geïnfecteerde cellen. Pro-inflammatoire cytokinen werden na infectie tot expressie gebracht in synthetisch circuit getransfecteerde en geïnduceerde cellen als een mechanisme om de eliminatie van parasieten te bevorderen. Dit onderstreept de op synthetische biologie gebaseerde methode als een krachtige benadering bij leishmaniasis door zich te richten op gastheerfactoren die verband houden met ziekteprogressie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vooruitgang van holistische, integratieve geneeskunde is een belangrijk verband dat is geïdentificeerd tussen metabole veranderingen in immuuncellen en hun vermogen om het fenotype van immuuncellen bij infectieziekten te moduleren. Immunometabolisme biedt nieuwe perspectieven voor het ophelderen van de pathogenese van veel voorkomende infectieziekten bij mensen. Bovendien biedt het veelbelovende technieken voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen door nieuwe aangrijpingspunten voor interventiete identificeren 1. Metabole herprogrammering van immuuncellen wordt geïdentificeerd bij verschillende infectieziekten, waaronder leishmaniasis. Leishmania spp. is verantwoordelijk voor het veroorzaken van leishmaniasis, waarvan Leishmania major (L. major) cutane leishmaniasis (CL) veroorzaakt. L. belangrijke parasieten hebben een aanzienlijke invloed op het metabolisme van gastheercellen, met name in macrofagen, voor proliferatie en overleving als intracellulaire parasieten2. Macrofagen kunnen doorgaans polariseren in klassiek geactiveerde (M1) of alternatief geactiveerde (M2) subsets waarbij M1-cellen een hoge pro-inflammatoire cytokinesecretie en productie van stikstofmonoxide (NO) bezitten via het metabolisme van stikstofsoorten. M2-cellen vertonen verhoogde niveaus van ontstekingsremmende cytokines en vertonen een hoge arginase-activiteit door het stikstofmetabolisme3. Beide fenotypes verschillen dus niet alleen door hun immuunrespons, maar ook door hun metabole routes.

Systeembiologie van leishmaniasis heeft tot doel moleculaire doelen te identificeren voor het ontwerpen van nieuwe therapieën door middel van het ontwerpen en ontwikkelen van geneesmiddelen. Reconstructie van signaleringsnetwerken en metabole routes helpt bij het begrijpen van leishmaniasis als een holistisch model en trekt inzicht voor de identificatie van de belangrijkste component die de zieke toestand veroorzaakt. Wiskundige modellering is een van de meest favoriete toegepaste analytische benaderingen voor het begrijpen van de complexiteit van leishmaniasis4. Immunometabole netwerken en wiskundige modellen maakten de identificatie van succinaatdehydrogenase (SDHA) mogelijk als een sleutelcomponent van het M1-fenotype, dat tot expressie wordt gebracht om de parasiet te elimineren5. Synthetische biologie heeft toepassingen in diagnostiek, vaccinontwikkeling en therapieën bij leishmaniasis. Metabolisme gericht op modulatie van de immuunrespons kan worden bereikt door middel van synthetische biologie-instrumenten. Voor modulatie van inositolfosforylceramidesynthase dat het sfingolipidenmetabolisme reguleert en de immuunsignalering van de gastheer verandert, werd een genetisch circuit met bistabiel gedrag gebruikt om de intrinsieke robuustheid van L. major infectiemodel 6,7 synthetisch af te stemmen. Daarom kunnen systemen en synthetische biologie een modelgebaseerd platform voor genetische manipulatie bieden voor de ontwikkeling van precisiegeneeskunde in het Leishmania-modelsysteem.

Het M1-fenotype wordt gekenmerkt door de expressie van immunometabole signaleringsnetwerken waarbij de productie van inflammatoire cytokines en metabole routes synergetisch de eliminatie van parasieten verbetert. M1-polarisatie betekent de productie van pro-inflammatoire cytokines zoals interleukine-12 (IL-12), interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α). Metabole routes die sterk verrijkt zijn in het M1-fenotype zijn onder meer glycolyse, pentosefosfaatroute en afgeknotte tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus)5. De afgekapte TCA-cyclus stuurt de eliminatiemachine van parasieten door middel van verhoogde succinaat- en citraatgehalten, die de productie van NO3 sturen. Accumulatie van succinaat door SDHA leidt tot activering van transcriptiefactor hypoxie-induceerbare factor 1-alfa (HIF-1α), die de productie van IL-1β8 induceert. In het M2-fenotype worden vetzuuroxidatie, toename van het glutaminegebruik en verbeterde oxidatieve fosforylering van glucose waargenomen, samen met de productie van ontstekingsremmende cytokines zoals interleukine-10 (IL-10), transformerende groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-4 (IL-4) en interleukine-13 (IL-13)3. M2 vertoont langwerpige mitochondriën als een onderscheidend kenmerk, wat leidt tot een verbeterde efficiëntie bij het opwekken van energie. Ze gebruiken vetzuren, glucose en glutamine als substraten om de TCA-cyclus van brandstof te voorzien, waardoor ATP wordt gegenereerd door oxidatieve fosforylering met een hogere snelheid om de groei en proliferatie van parasieten te bevorderen. Het SDHA-enzym dat verantwoordelijk is voor de accumulatie van succinaat door afgekapte TCA kan niet alleen de NO-productie bevorderen, maar ook een succinaat-afhankelijk zuurstofverbruik op gang brengen via elektronentransport10. Bij met Leishmania geïnfecteerde macrofagen wordt SDHA 2,17 keer gedownreguleerd, wat aangeeft dat de aerobe ademhaling ook gedownreguleerd kan zijn11. Om de consumptie van succinaat te verhogen om pro-inflammatoire cytokine-gemedieerde NO-productie te induceren en de eliminatie van parasieten te bevorderen, is expressie van SDHA essentieel.

Het synthetische circuit biedt precisiegerichte therapieën die het zieke systeem kunnen veranderen om een bistabiele oscillatie te bereiken die een gezond fenotype op spatiotemporeel niveau kan herstellen. De levering en expressie van synthetische circuits maken het systeem dynamisch en robuust. Een cruciale factor die bijdraagt aan de vooruitgang van synthetische biologie ligt in het vermogen om genetische onderdelen en elementen op een modulaire manier te assembleren om het genereren van ingewikkelde architecturen en op maat gemaakte functionaliteiten mogelijk te maken12. Beperkingen in verband met traditionele expressietechnieken hebben geleid tot de opkomst van op tetracycline operon gebaseerde induceerbare plasmide synthetische circuits, waardoor een snelle evaluatie van plasmide en gemakkelijke afgifte over verschillende celtypen mogelijkis13. Het tetracycline-responsieve repressor (TetR) eiwit, wanneer het bestaat als een dimeer, vertoont een sterke bindingsaffiniteit met het tet-operon (TetO), waardoor transcriptie effectief wordt onderdrukt. Bij de interactie van zijn ligand, doxycycline (dox), ondergaat TetR echter een structurele verandering, wat resulteert in zijn dissociatie van TetO, waardoor de transcriptie ongehinderd kan doorgaan. Dit circuit kan controle over de eiwittranslatie vertonen14. Daarom werd door de gedefinieerde methodologie het ontworpen tetracycline-operon-gebaseerde induceerbare plasmide synthetisch circuit in staat gesteld SDHA tot expressie te brengen in de pEGFP-N1-vector. Evaluatie van de transformatie-efficiëntie van het circuit en de opbrengst ervan gaf inzicht in de competentie van levering. Door de vergisting van de vector te beperken, werd de bepaling van de kloneringsefficiëntie bevestigd. Verder werd een getransfecteerde RAW264.7 muismacrofaagcellijn afgeleid van peritoneale macrofagen van Balb/c-muizen waargenomen voor doxycycline-dosisafhankelijke expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in getransfecteerde cellen. Bovendien werd het eliminatie-effect van parasieten in getransfecteerde cellen bevestigd door een expressie van het synthetische circuit. Bovendien werden inductie en expressie van pro-inflammatoire cytokines waargenomen, wat werd gestuurd door een toename van het tijdstip van infectie in de synthetische circuit getransfecteerde en geïnduceerde cellen, wat direct verband hield met de werking van het synthetische circuit.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek van RAW264.7 cellen

OPMERKING: Gebruik lage doorgangsnummers om te experimenteren. De RAW264.7-cellijn werd verkregen uit de National Cell repository van de Biotechnology Research Innovation Council-National Centre for cell Sciences (BRIC-NCCS), Pune. Aangezien de RAW264.7-cellijn een macrofaagcellijn is, kan deze beginnen te differentiëren met toenemende passages. Nadat de cellen weer tot leven zijn gewekt, gebruikt u de cellijn voor transfectie na 2 passages.

  1. Zaad 5 x 105 cellen van de RAW264.7 cellijn in een 25 cm2 kolf aangevuld met 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% Fetaal Bovine Serum (FBS) en 100 I.E./ml penicilline als compleet medium.
  2. Bewaar cellen voor groei en proliferatie in een incubator met 5% CO2 bij 37 °C totdat 90% confluentie is bereikt.
  3. Gooi de media weg en was 3x met 1x Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). Voeg 1 ml PBS toe aan de kolf, schraap de cellen met een schraper en verzamel de cellen in een buisje van 1,5 ml.
  4. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 24 °C en resuspendeer de pellet met een pipet van 1 ml in 1 ml DMEM compleet medium.
  5. Tel de cellen in de cellentelkamer met behulp van 0,5% trypan blauw om het percentage levende cellen te identificeren.

2. Celkweek van L. major parasiet

OPMERKING: L. major promastigoten (MHOM/Su73/5ASKH) was een geschenk van BRIC-NCCS. Promastigoten moeten een doorgangsnummer van minder dan 10 hebben. Het lagere passagegetal zorgt ervoor dat de parasiet gezond is en dat zijn vermogen om macrofagen te infecteren hoger is.

  1. Kweek L. major promastigoten (MHOM/Su73/5ASKH) in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) aangevuld met 20% FBS als compleet medium.
  2. Zaad 1 x 106 promastigoten in een niet-geventileerde kolf van 25 cm met2 cm en bevat 5 ml volledig medium. Incubeer de kolf gedurende 5 dagen bij 27 °C en observeer de stationaire fase promastigote L. major parasiet op 20x in een helderveldmicroscoop.
    OPMERKING: Promastigoten in de stationaire fase kunnen binnen 4-7 dagen na het kweken worden bereikt. Ze worden gekenmerkt door hun langwerpige flagellated state en verminderde beweeglijkheid.

3. Het ontwerpen van een synthetisch circuit in plasmide als afgiftevector

  1. Ontwerpen van onderdelen van het synthetische circuit
    1. Open de Tinker-celsoftware en ga verder naar het tabblad Onderdelen. Selecteer de Promoter-component uit de bibliotheek en plaats deze op het canvas om de Cytomegalovirus (CMV) promotor binnen het synthetische circuit te symboliseren. Haal de repressorbindingsplaats, analoog aan TetO, op uit het tabblad Onderdelen en plaats deze naast de promotor op het canvas, waarbij u deze naadloos integreert met de CMV-promotor.
    2. Neem de tetracycline-operator (TetO), Internal Ribosome Entry Sites (IRES) en het coderende gebied op door de repressorbindingsplaats, de ribosoombindingsplaats (rbs) en het coderende gebied naar het canvas te slepen en neer te zetten en ze te integreren met de bestaande genetische componenten.
    3. Hernoem het coderende gebied als TetR, wat de tetracycline-responsieve repressor aanduidt, die functioneert als een vermeende negatieve regulator binnen het synthetische circuit. Voeg deze genetische elementen samen om de constructie van de synthetische onderdelen te vergemakkelijken.
    4. Plaats een afstandsgebied (sd1) op het canvas, ontworpen om te kunnen worden gesplitst door cellulaire proteasen zoals varkensteschovirus-1 2A (P2A). Introduceer een extra coderend gebied dat het gen van interesse vertegenwoordigt, label het als SDHA in de synthetische constructie en integreer het met de andere elementen.
    5. Integreer naast het SDHA-coderingsgebied een ander protease-splitsbaar afstandsgebied (sd2), dat kan worden gesplitst door cellulair protease P2A. Introduceer een coderend gebied dat het reporter-gen vertegenwoordigt en label het als GFP in het construct.
      OPMERKING: GFP-expressie kan een schatting geven van de productie van SDHA en ervoor zorgen dat het synthetische circuit een logische werking heeft13.
    6. Voeg naast GFP een terminator (ter1) toe en controleer de geassembleerde onderdelen door te controleren of alle onderdelen zijn aangesloten. Het circuit moet rood worden weergegeven bij het klikken op een onderdeel. Dit bevestigt de vorming van een functioneel genetisch circuit.
    7. Wijs op het tabblad Reactie regulerende snelheden, waaronder parameters en beginwaarden voor eiwitproductie, toe aan TetR, SDHA en GFP om de translatiereactie binnen het synthetische circuit af te bakenen.
    8. Voeg een klein molecuul toe op het tabblad Onderdelen, noem het Doxycycline (dox) en wijs er een golffunctie aan toe door Invoer te selecteren op het tabblad Onderdelen en verbinding en vervolgens door op Golfinvoer te klikken.
    9. Klik op het tabblad Regulering op Repressiereactie. Sleep en zet de reactiesnelheid op het canvas neer tussen dox en TetR. Stel de reactiekinetiek tussen dox en TetR in door te dubbelklikken op het Wave Function-pictogram op dox en Doxyxycline.sin.amplitude aan te passen aan 10.
    10. Implementeer de transcriptionele regulerende reactie tussen het TetR-eiwit en de repressorbindingsplaats door de reactie te selecteren op het tabblad Regulatie en deze op het canvas tussen TetR en TetO te plaatsen.
    11. Door te dubbelklikken op elke component en reactie, stelt u een initiële concentratie en parameter voor simulatie in. Klik op Simulatie, kies Deterministisch en simuleer het circuit voor 100 tijdseenheden. Pas de simulatiegrafiek aan vanaf het bedieningspaneel, dat met de grafiek verschijnt, en observeer het grafiekpatroon voor SDHA- en TetR-eiwitten.
  2. Identificatie van genetische componenten uit het iGEM-onderdelenregister
    1. Open het register van standaard biologische onderdelen (materiaaltabel) en klik op Zoeken. Voer de naam van de genetische component in, bijvoorbeeld de CMV-promotor.
      OPMERKING: Het proces voor het zoeken naar iGEM-ID moet worden uitgevoerd voor alle genetische componenten van het synthetische circuit. De stappen voor het identificeren van de iGEM-ID van de CMV-promotor worden doorlopen; Vervolgens moeten de stappen worden herhaald voor andere componenten.
    2. Om de nucleotidesequentie van de CMV-promotor te verkrijgen, klikt u op de optie Deelsequentie ophalen en slaat u het bestand op als een tekstbestand.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang op te merken dat voorraden van alle genetische delen beschikbaar zijn.
    3. Herhaal stap 3.2.1 en stap 3.2.2 voor alle genetische delen (tetracycline-operator, Kozak-sequentie, TetR, P2A en GFP) behalve SDHA.
    4. Om de eiwitcoderende sequentie van SDHA te verkrijgen, opent u NCBI en kiest u Nucleotide in de vervolgkeuzelijst naast het zoekvenster. Typ Succinaatdehydrogenase en Mus musculus en zoek naar nucleotidesequentie.
    5. Klik op de CDS-optie om de coderingsvolgorde van SDHA op te halen en de reeks op te slaan in een tekstbestand.
    6. Voeg de nucleotidesequentie van alle genetische regulerende onderdelen achtereenvolgens samen in één bestand. Voeg startcodon (ATG) toe direct na de Kozak-sequentie en verwijder interne stopcodons om de vorming van ontluikende polypeptiden te voorkomen.
    7. Open ExPASy-website15 en plak de nucleotidesequentie. Klik op de optie Vertaal de sequentie . Selecteer 5'3' Frame 1 en verwijder de stopcodons, die rood worden gemarkeerd in het resultatengedeelte.
      OPMERKING: Om te bepalen of de nucleotidesequentie zich effectief vertaalt in de gewenste polypeptidesequentie, kan een vertaaltool zoals ExPASy worden gebruikt. Dit zorgt voor het voorkomen van ongewenste ontluikende polypeptiden. De selectie van de pEGFP-N1-vector voor het tot expressie brengen van het synthetische circuit is optimaal, aangezien de CMV-promotor en het GFP-gen al aanwezig waren in de vector. Alle genetische onderdelen werden geassembleerd met behulp van een kloonprotocol (dat werd uitbesteed). De restrictie-enzymen die worden gebruikt voor het klonen van de inserts zijn NotI en XhoI. Deze restrictie-enzymplaatsen bevinden zich in de meervoudige kloonplaats van de pEGFP-N1-vector.

4. Transformatie van het synthetisch circuit in Escherichia coli (E.coli) DH5α cellen

  1. Bereiding van E.coli DH5α competente cellen
    OPMERKING: Autoclaveren van de reagentia wordt aanbevolen. Reagentia kunnen tot gebruik bij 4 °C worden bewaard.
    1. Kweek 1 ml vers inoculum in 50 ml Luria-bouillon (LB) bij 37 °C, 180 tpm. Laat de cellen ongeveer 2 uur groeien tot een optische dichtheid (OD) van 0,4-0,6 is bereikt bij 600 nm.
    2. Centrifugeer de cellen bij 4.696 x g bij 4 °C gedurende 15 min. Gooi het supernatans handmatig weg in de afgooikolf door de centrifugebuis van 50 ml om te keren en de celpellet te oogsten.
    3. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 2 ml ijskoud 0,1 M magnesiumchloride (MgCl2) met behulp van een pipet van 1 ml. Vul het volume aan tot 20 ml met ijskoud MgCl2.
    4. Centrifugeer de buis bij 4.696 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen voorzichtig met behulp van een pipet van 1 ml in 1 ml ijskoud 0,1 M calciumchloride (CaCl2) en incubeer ze gedurende 2 uur op ijs. Gebruik de vers gemaakte competente cellen voor transformatie.
  2. Transformatie van competente cellen met synthetisch circuitconstruct
    1. Meet 50 μL competente cellen af en voeg de cellen toe aan een buisje van 1,5 ml. Plaats de buis op ijs. Voeg 10 ng synthetisch circuitconstruct toe aan de aliquot en houd 3 minuten op ijs.
    2. Hitteschokcellen bij 42 °C gedurende 3 minuten op een droog verwarmingsblok. Zodra de incubatie op het droge verwarmingsblok is voltooid, plaatst u de cellen 3 minuten terug op ijs, voegt u 1 ml LB toe aan de cellen en incubeert u gedurende 1 uur bij 37 °C bij 250 tpm.
    3. Wanneer de incubatie is voltooid, centrifugeert u de cellen bij 4,696 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten en gooit u het supernatans weg met een pipet van 1 ml. Resuspendeer de cellen in 100 μl LB en leg deze op LB-agar met 50 μg/ml kanamycine. Keer de plaat om en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.

5. Isolatie van de constructie van synthetische circuits

  1. Neem in een centrifugebuis van 50 ml 10 ml LB-medium en voeg 50 μg/ml kanamycine toe als selectiebouillon om getransformeerde cellen te kweken voor plasmide-isolatie. Pak een getransformeerde kolonie op met behulp van een punt van 200 μL en voeg deze toe aan de selectiebouillon.
  2. Selecteer met behulp van een inoculatielus een andere enkele kolonie, streep een plaat met behulp van de vijfhoekige techniek en broed gedurende 24 uur bij 37 °C om isolaten van één kolonie te behouden.
  3. Laat de cellen een nacht groeien bij 180 rpm bij 37 °C. Centrifugeer de cultuur de volgende dag bij 4.696 x g gedurende 20 minuten bij 24 °C. Gooi na het centrifugeren het supernatans weg door de buis om te keren en voeg 1 ml resuspensiebuffer (50 mM Tris (hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl), 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 100 μg/ml RNase A (pH-8.0)) toe aan de pellet en resuspendeer de cellen door voorzichtig te pipetteren.
    OPMERKING: Voeg aan de resuspensiebuffer RNase A toe 5 minuten voordat u het mengsel aan de celpellet toevoegt.
  4. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij RT. Voeg 1 ml lysisbuffer (0,2 N natriumhydroxide (NaOH), 1 % natriumdodecylsulfaat (SDS)) toe aan de cellen en meng door de buis 2 minuten om te keren. Incubeer de buis gedurende 5 minuten bij RT.
  5. Voeg 1 ml neutralisatiebuffer toe aan de cellen (3 M kaliumacetaat (CH3CO2K)) en meng door de buis meerdere keren om te keren. Centrifugeer de cellen bij 4.696 x g gedurende 20 minuten bij RT en verzamel het supernatans in een buisje van 1,5 ml.
  6. Voeg 500 μL isopropanol toe aan het supernatans en meng goed door om te keren. Incubeer het supernatans gedurende 15 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Incubatie kan variëren van 5 minuten tot 1 uur. Hierbij wordt geadviseerd om de inhoud voorzichtig te mengen door elke 5 minuten om te keren.
  7. Gooi het supernatant weg, voeg 1 ml 70% ethanol (gekoeld) toe aan de pellet en centrifugeer op 12000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Herhaal deze stap nog een keer.
  8. Laat de pellet aan de lucht drogen en resuspendeer het verkregen plasmide in 20 μL steriel nucleasevrij water (NFW). Meet de plasmideconcentratie op een spectrofotometer bij een golflengte van 260/280 nm.
    OPMERKING: Voeg meer NFW toe als de plasmideconcentratie erg hoog is om te worden geschat door middel van nanodrop. Het proces van plasmideverdunning moet worden uitgevoerd in een laminaire kap.

6. Agarosegelelektroforese (AGE) van synthetisch circuit

  1. Voorbereiding van plasmidemonster voor AGE
    1. Meet in een tube van 1,5 ml 20 μl 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) af. Voeg 4 μL 6x laadbuffer toe en meng goed door te pipetteren.
    2. Laat de buis snel draaien, voeg 1 μg van de plasmidevector van het synthetische circuit toe en meng goed door het mengsel te pipetteren. Dit reactiemengsel kan op agarosegel worden geladen.
      OPMERKING: Vermijd rigoureus pipetteren, omdat dit de plasmidestructuur kan beschadigen. Geef in plaats daarvan een snelle draai voor het mengen van reagentia.
  2. Beperking vergisting van synthetisch circuit
    1. Voeg in een buisje van 1,5 ml 2 μl 10x restrictiebuffer, 1 μl NotI en 1 μl XhoI-restrictie-enzym toe en meng goed door de inhoud snel rond te draaien. Voeg 1 μg plasmidevector van het synthetische circuit toe en laat de inhoud snel draaien.
    2. Vul het volume van de buis aan tot 20 μL door NFW aan de inhoud toe te voegen en de buis snel rond te draaien. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 1 uur.
    3. Houd de buis na de incubatie 15 minuten op 70 °C in een droog verwarmingsblok om de restrictie-enzymen te deactiveren. Koel de inhoud van de buis af en voeg 6 μL laadbuffer toe aan het reactiemengsel. Meng de inhoud door de tube snel rond te draaien. Dit reactiemengsel kan op agarosegel worden geladen.
    4. Zet de agarosegel op en laat de gel draaien volgens een eerder beschreven protocol16. Laad kort 20 μL-monsters in elk putje, laad 5 μL DNA-ladder van 1 Kb en laat de gel op 100V draaien. Koppel de voeding los nadat de elektroforese is voltooid, verkrijg de gel op een gelimager en schakel de fluorescentieoptie in om de banden te bekijken.

7. Transfectie van synthetisch circuitconstruct in RAW264.7-cellijn

  1. Voorbereiding van de monsters
    1. Bereid monsters voor om het parasiet-eliminerende effect te bepalen door een geïnduceerd synthetisch circuit. Het eerste monster is niet-getransfecteerde RAW264.7-cellen (controle), het tweede is RAW264.7-cellen geïnfecteerd met L. major promastigoten gedurende 6 uur (6 uur geïnfecteerd), het derde monster was RAW264.7-cellen getransfecteerd met synthetisch circuit en geïnduceerd met dox (IMT), de infectietijdpuntmonsters zijn RAW264.7-cellen getransfecteerd met synthetisch circuit en geïnduceerd met dox die is geïnfecteerd met L. major promastigoten (IMTI) voor verschillende tijdstippen 6 uur (6 uur IMTI), 12 uur (12 uur IMTI), 18 uur (18 uur IMTI) en 24 uur (24 uur IMTI).
    2. Om alle monsters voor te bereiden, schraapt u de RAW264.7-cellen uit een kolfvan 25 cm 2 en centrifugeert u deze gedurende 5 minuten bij RT op 300 x g .
    3. Resuspendeer de pellet in 1 ml DMEM compleet medium. Neem 10 μl van de geresuspendeerde cellen in een buisje van 100 μl, voeg 10 μl 0,5% trypanblauw toe aan de cellen en meng goed.
    4. Laad 10 μL van het blauwe mengsel van cellen en trypan op het glaasje van de celtelkamer en neem het celgetal van 4 kamers.
    5. Plaatcellen in dekglaasje, bodem 96 putjes, platen bij 2 x 10,4 cellen per putje en incubeer de cellen gedurende 24 uur. Dit monster is het controlemonster. Deze stap blijft constant voor de bereiding van andere monsters.
      OPMERKING: Verwarm de media voor gebruik voor op 37 °C in een waterbad.
    6. Om een geïnfecteerd monster van 6 uur voor te bereiden, centrifugeert u 1 ml stationaire fase L. major promastigoten bij 7,273 x g gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in 500 μl DMEM volledig medium en meet het celgetal op een cellentelkamer volgens de stappen 7.1.3-7.1.4.
    7. Voeg 2 x 10 grote promastigoten van5l. toe aan het putje en incubeer ze met 5% CO2 bij 37 °C gedurende 6 uur. Was de cellen na incubatie 3x met PBS.
    8. Om het IMT-monster voor te bereiden, zaait u de cellen door de stappen (7.1.2-7.1.5) te volgen en voert u de transfectiestappen 7.2.1-7.2.6 uit.
    9. Om monsters van tijdpunten van IMTI voor te bereiden, volgt u de stappen 7.1.2-7.1.5 en voert u de transfectiestappen 7.2.1-7.2.6 uit. Gooi de volledige DMEM-media met 500 μg/ml Geneticin (G418) en 1 μg/μL dox weg en was de cellen 3x met 1x PBS.
    10. Voeg 2 x 10 grote promastigoten van5L. toe aan de putjes en incubeer ze gedurende 6 uur, 12 uur, 18 uur en 24 uur. Gooi na infectie de promastigoten met DMEM complete media weg en was de putjes 3x met 1x PBS. Voeg 200 μL DMEM complete media met 500 μg/ml Geneticin (G418) en 1 μg/μL dox toe aan de cellen en incubeer gedurende 24 uur.
  2. Transfectie van synthetisch circuit
    1. Voeg in een tube van 1,5 ml 24 μl gereduceerd serummedium toe, een verbeterd minimaal essentieel medium. Voeg aan de media 1 μg pEGFP-N1-vector toe die is gekloond met synthetisch circuitplasmide.
    2. Voeg in een vers buisje van 1,5 ml 24 μl Minimal Essential Medium toe en voeg 1 μl polyethylenimine (PEI; 1 μg/μl) toe. Meng goed door het mengsel minimaal 10x te pipetteren en 5 minuten op RT te incuberen.
    3. Breng de PEI-mix over in het buisje van 1,5 ml met de DNA-mix. Meng goed door minimaal 10x druppelsgewijs te pipetteren. Incubeer het DNA: PEI-mix bij RT gedurende 10 minuten.
    4. Gooi de media uit de putjes op de 96-well coverslip bodemplaten weg en was de cellen 3x met PBS. Voeg met een pipet het DNA:PEI voorzichtig druppelsgewijs toe aan de cellen en schud de plaat voorzichtig. Incubeer de cellen met 5% CO2 bij 37 °C gedurende 3 uur.
    5. Voeg na incubatie 200 μL vers Minimal Essential Medium toe aan de cellen, schud de plaat voorzichtig en incubeer gedurende 24 uur met 5% CO2 bij 37 °C.
      OPMERKING: PEI is cytotoxisch; Daarom wordt aanbevolen om cellen na transfectie niet langer dan 24 uur te incuberen.
    6. Gooi de media de volgende dag weg en was de cellen 2x met PBS. Voeg DMEM complete media met 500 μg/ml Geneticin (G418) en 1 μg/μL dox toe aan de cellen en incubeer gedurende 24 uur.
  3. Fixeren van de monsters voor confocale microscopie
    1. Om alle monsters te fixeren, wast u de cellen met 1x PBS 3x, voegt u 100 μL 4% paraformaldehyde toe aan de cellen en incubeert u gedurende 10 minuten bij RT.
    2. Was de cellen met PBS 3x. Voeg na het wassen 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe aan de cellen en incubeer bij RT gedurende 15 minuten in het donker.
    3. Was de cellen na incubatie 3x met PBS. Observeer de cellen onder een confocale microscoop op GFP-expressie en DAPI-kleuring.

8. Verwerving van getransfecteerde cellen door confocale microscopie en kwantificering

  1. Reinig de bodem van het dekglaasje van de putjes met een absorberend doekje. Schakel de bedieningselementen van de confocale laserscanmicroscoop in. Schakel vervolgens de compressor en de kwiklamp in.
  2. Om de machine te bedienen, moeten de microscoopbediening, de scankopbediening, de lasersleutel, de lasermodule, de lamp, de microscoopcontroller en de CPU achtereenvolgens zijn ingeschakeld.
  3. Open op de computer de software (Tabel met materialen) en klik op XY Stage Control inschakelen. Er wordt een pop-up geopend waarin wordt gevraagd om de reiniging van de 7S3 uit te voeren. Klik op Nee. Sluit de live grafiek en pas de instellingenschermen aan.
  4. Voeg aan het 60x-objectief een druppel immersieolie toe, plaats de bodemplaat van het afdekglaasje met 96 putjes op de tafel en verplaats de tafel in het X-Y-vlak om de objectiefpositie op de put aan te passen. Klik op het oculair en selecteer Alexa-488 Channel. Klik op Sluiter uit om de cellen op het oculair scherp te stellen. Stel het oculair af door kern- en fijne scherpstelling.
  5. Klik op Sluiter Aan aanwezig op de microscoopbedieningskast en verplaats het objectief om de positie aan te passen en het interessegebied scherp te stellen om de cellen in Differential Interference Contrast (DIC) te observeren. Schakel over naar de EPI-modus op de microscoopbedieningskast om de cellen in het Alexa-488-golflengtefilter te observeren voor GFP-expressie. De cellen moeten groen lijken.
  6. Klik op Sluiter uit, ga naar LSM-beeldvorming en kies de resolutie voor de afbeelding als 1,024 x 1,024. Klik op Fase toevoegen en sleep om een groen kanaal als fase toe te voegen.
  7. Klik in het Olympus-programma op LSM en klik verder op Live Button om de cellen in fasecontrast en Alexa 488nm-kanaal te observeren. Druk op Control en scrol om de cellen vanuit de software scherp te stellen voor het vastleggen van afbeeldingen.
  8. Pas de versterking en offset aan om de fluorescentie-intensiteit aan te passen die door de detector wordt vastgelegd. Klik op Vastleggen, geef de afbeeldingen een naam en klik op Opslaan.
  9. Klik in beeldvormingssoftware op Bestand, selecteer alle afbeeldingen met de extensie .oir en klik op Openen.
  10. Klik op Tile View om afbeeldingen in alle kanalen te visualiseren. Om een schaalbalk aan afbeeldingen toe te voegen, klikt u op Weergave en kiest u vervolgens de optie Schaalbalk .
  11. Als u afbeeldingen van afzonderlijke kanalen wilt opslaan als 16-bits grijstinten, klikt u op Bestand en selecteert u Afbeelding exporteren. Selecteer de afbeelding en controleer de vinkjes op alle kanalen. Kies op het tabblad Frame selecteren in de optie voor gesplitste weergave de optie Ja. Kies op het tabblad Uitvoer de 24-bits RGB-kleur met de optie voor inbrandinformatie en kies tiff als het bestandstype voor de afbeelding. Kies in de export naar map de juiste bestandslocatie om de afbeeldingen op te slaan en klik vervolgens op OK.
  12. Volg dezelfde stappen om samengevoegde afbeeldingen op te slaan, behalve dat u in de optie voor gesplitste weergave Nee kiest en op het tabblad Uitvoer de optie Samengevoegde kanalen met brandinfo.
  13. Om de expressie van GFP in cellen te analyseren, opent u Fiji in Windows en exporteert u het tiff-bestand. Selecteer de Kleur groen om de GFP-expressie te analyseren.
  14. Selecteer het celgebied met behulp van de gereedschapsoptie uit de vrije hand en klik op Analyseren om de fluorescentie-intensiteit te meten. Herhaal het proces voor 3 afbeeldingen.
  15. Exporteer de gegevens naar een analysesoftware en voer statistische tests uit op de gekwantificeerde gegevens.

9. Analyse van de parasietenbelasting

  1. Terwijl je de cellen op een confocale microscoop visualiseert, tel je het totale aantal parasieten dat aanwezig is in individuele macrofagen.
  2. Onderzoek willekeurig 100 macrofagen en noteer het aantal intracellulaire parasieten. Statistische test uitvoeren tussen geïnfecteerde en tijdstippen van IMTI-monsters om het effect van SDHA-expressie op het aantal parasieten te onderzoeken.

10. Kwantificering van IL-10 en IL-12 door middel van Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

  1. Bereid de monsters voor volgens de stappen 7.1 en 7.2 en verzamel de media in een buisje van 1,5 ml. Bewaar het medium op ijs of bewaar het bij -20 °C tot verder gebruik. Volg de instructies in de handleiding van de gebruikerskit en voer ELISA uit voor IL-10 en IL-12.

11. Cytokineprofilering met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie PCR (qRT-PCR)

  1. Bereid de monsters voor volgens de stappen 7.1 en 7.2. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en voeg 500 μl TRIzol-reagens toe en incubeer de cellen gedurende 2 minuten bij RT.
    OPMERKING: RNA-isolatiestappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkast als veiligheidsmaatregel tegen RNase-besmetting.
  2. Verzamel de monsters in een buisje van 1,5 ml, voeg er 100 μl chloroform aan toe en meng door de buisjes 5x-8x om te keren. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij RT. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  3. Er worden drie lagen waargenomen, verzamel de heldere waterige toplaag in een verse buis van 1,5 ml. Voeg 500 μL isopropanol toe aan de waterige laag, meng goed door 10x om te keren en incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij RT. Meng na elke 5 minuten de monsters opnieuw door de buisjes om te keren.
  4. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en was de pellet 2x met 75% ethanol gemaakt in 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC) met water gedurende 5 minuten en centrifugeer op 8.000 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: DEPC dat water bevat, breekt RNases af en daarom wordt aanbevolen om het te gebruiken voor RNA-isolatie.
  5. Laat ten slotte de pellet 5 minuten aan de lucht drogen bij RT, los deze op in 20 μL DEPC-houdend water en meet de concentratie van geïsoleerd RNA, 260/280 en 260/230 verhouding, met behulp van een spectrofotometer.
    OPMERKING: De 260/280-verhouding moet ongeveer 2,0 zijn, wat over het algemeen een indicatie is van een zuivere vorm van RNA, en de 260/230-verhouding moet tussen 2,0-2,2 liggen om te overwegen dat geïsoleerd RNA vrij is van ongewenste chemische verbindingen zoals TRIzol.
  6. Voor de bereiding van 20 μl van elk cDNA-monster, ontdooit u de reagentia op ijs en laat u ze 15 s kort draaien bij RT. Geef een korte draai aan alle reagentia en zelfs aan de RNA-monsters voor gebruik.
  7. Neem in een geautoclaveerde buis van 100 μL 0,8 μL 25x dNTP, 2 μL 10x Primer, 2 μL 10x buffer. Voeg een concentratie van 1 μg/μL RNA toe en voeg 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe. Vul het volume aan tot 20 μL met DEPC houdend water.
  8. Draai de cDNA-monsters 1 minuut kort rond bij RT. Bewaar de monsters op het ijs.
  9. Zet de thermische cycler aan, schroef het bovenpaneel los om de houder los te maken en plaats de monsters op het blok. Schroef na het plaatsen van de monsters het deksel stevig vast.
  10. Zodra het systeem is ingeschakeld, klikt u op Uitvoeren. Selecteer de optie Hoofd , ga vervolgens naar het menu Programma's en selecteer de CDNA-optie . Definieer het monstervolume als 20 μL en klik op RUN. De thermische cycler voert het programma in vier stappen uit. De eerste stap is 25 °C gedurende 10 minuten, de tweede is 37 °C gedurende 2 uur, de derde is 85 °C gedurende 5 minuten en de laatste stap is 4 °C voor altijd.
  11. Zodra de cyclus de vierde stap ingaat, klikt u op Enter en voltooit u de cyclus. Verzamel de monsters en ga verder met qRT-PCR. Bewaar RNA-monsters bij -80 °C en cDNA-monsters bij -20 °C.
  12. Voor detectie van cytokinen ontdooit u de vereiste reagentia 2x PCR Master-mix, cDNA en sondes voor TNF-α, IFN-γ, TGF-β en NFW op ijs.
    OPMERKING: Alle reagentia, reactiemengsels en monsters moeten op ijs worden bewaard.
  13. Bereid in een buisje van 100 μL een cDNA-monster voor door 1 μL cDNA en 3,5 μL NFW toe te voegen. Om de mastermix te bereiden, neemt u 5 μL mastermix en voegt u 0,5 μL sonde toe in een buisje van 100 μL. Meng de inhoud door een korte draai te geven. Bereken het aantal monsters en doelgenen en bereid de reactiemix dienovereenkomstig voor.
    NOTITIE: Voeg NFW en mastermix toe aan de bodem van de buis van 100 μL. Voeg uit voorzorg cDNA en sonde toe aan de wand van de centrifugebuis om ervoor te zorgen dat het volume wordt toegevoegd en om kruisvermenging van reagens te voorkomen.
  14. Plaats de strips met 8 putjes in de PCR-koeler. Breng 5,5 μl van het mastermengsel en de sondehoudende injectieflacon over naar de bodem van elk putje in de stroken met 8 putjes. Herhaal daarom de stap voor alle doelgenen.
  15. Breng 4,5 μl van het cDNA- en NFW-mengsel over naar de wand van de put in stroken met 8 putjes. Herhaal daarom de stap voor alle monsters.
  16. Sluit de strips af met de deksels en draai de genen en monsters in het putje kort 10 seconden om. Plaats de strip in de qRT-PCR-monstersleuf en sluit de sleuf.
  17. Start de software op het bureaublad en log in als gast. Er verschijnt een pop-up op het scherm. Klik op Doorgaan zonder verbinding.
  18. Klik in het menu Setup op Advanced Setup. Schrijf in Experimenteigenschappen de naam van het experiment op het tabblad Experimentnaam. In welk type experiment wilt u de optie instellen, selecteert u Kwantificering-Vergelijkende CT (ΔΔ CT).
  19. In Welke rampsnelheid wil je gebruiken in het instrument? , klik op Snel (~ 40 minuten om een run te voltooien). Definieer in het menu voor plaatinstellingen gennamen in de optie Doelen definiëren en typ de monsternamen in Monsters definiëren.
  20. Typ op het tabblad Uitvoeringsmethode 10 μl in Reactievolume per putje. Vlak voor het vasthouden van de fase klikt u op Fase toevoegen en selecteert u Fase vasthouden. Verander de temperatuur naar 50 °C en de tijd naar 2 min. Breng in de tweede wachtfase geen wijzigingen aan, die gedurende 1 s 95 °C zal zijn.
  21. Verander in de cyclusfase Stap 1 de temperatuur naar 95 °C en de tijd naar 3 s. Verander in stap 2 de temperatuur naar 60 °C en de tijd naar 30 s. Klik op Uitvoeren om de qRT-PCR-cyclus te starten.

12. Statistische analyse

OPMERKING: Voor alle gegevens wordt het gemiddelde weergegeven als een staaf en de standaarddeviatie vertegenwoordigt de foutbalk in een staafdiagram (p-waarde< 0,05 wordt als significant beschouwd).

  1. Open de data-analysesoftware en voer de verkregen gegevens van het confocale experiment in.
  2. Voor confocale microscopie-analyse past u gewone One-way ANOVA toe met Tukey's correctietest voor vergelijking met meerdere groepen voor GFP-expressie. Beschouw de gegevens met p < 0,05 als statistisch significant. Maak een grafische weergave van de gegevens met het gemiddelde weergegeven als een balk en de standaarddeviatie die de foutbalk vertegenwoordigt.
  3. Maak voor de analyse van de parasitaire belasting een nieuw blad en voer de gegevens van het aantal parasieten in voor 100 macrofagen. Pas gewone One-way ANOVA toe met Tukey's correctie tussen alle samples. Beschouw de gegevens met een p-waarde< 0,05 als statistisch significant.
  4. Voer voor ELISA tweerichtings-ANOVA uit met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. Voer voor qRT-PCR One-way ANOVA uit met de correctietest van Tukey.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rangschikking van genetische delen die het synthetische circuit vormen voor het tot expressie brengen van het synthetische circuit wordt weergegeven in (Figuur 1A). De overeenkomstige delen werden gekloond in de pEGFP-N1-vector op een orthogonale en modulaire manier, die wordt weergegeven in figuur 1B. De simulatie van het synthetische circuit onthulde oscillerende dynamica in zowel SDHA als de tetracycline-repressor. Deze waarneming suggereert een wederkerig expressiepatroon dat wordt gekenmerkt door periodieke golffuncties. De toename van de SDHA-concentratie kan worden toegeschreven aan de inductie van doxycycline, terwijl de expressie van TetR het gevolg kan zijn van dalende niveaus van doxycycline (Figuur 1C). Gezien de induceerbare oscillerende expressie van SDHA en TetR waargenomen in silico, werd een strategie voor de levering van synthetische circuits via pEGFP-N1-plasmidevector ontworpen en geïmplementeerd.

De iGEM-onderdelen die voor het onderzoek zijn geïdentificeerd, omvatten respectievelijk BBa_K1493803 voor TetO, BBa_K4344028 voor de Kozak-sequentie, BBa_C0040 voor TetR en BBa_K1537016 voor P2A. De NCBI-toetredings-ID voor SDHA is NM_025848. Deze componenten werden geassembleerd om een doxycycline-induceerbaar TetON synthetisch circuit te construeren, dat in totaal 1317 basenparen omvat (aanvullend bestand 1). Omdat TetO functioneert als een DNA-regulerend element, werd de sequentie ervan niet vertaald. Voor in silico validatie van de vertaling werd gekozen voor sequentie stroomafwaarts van de Kozak-sequentie, die zich uitstrekt van 5' TetR tot het 3'-uiteinde van P2A, stroomafwaarts van SDHA. Observatie toonde de afwezigheid van interne stopcodons aan, wat een ononderbroken translatie over de gehele sequentielengte garandeert (aanvullend bestand 2). De regulerende delen van een synthetisch circuit bestaande uit 1317 bp werden ingevoegd tussen NotI- en XhoI-restrictieplaatsen, die 5' stroomopwaarts van EGFP liggen (figuur 1B). Sequentieresultaten benadrukken dat de insert-sequentie is gekloond in het plasmide (aanvullend bestand 3).

De introductie van een immuno-metabool circuit in de E. coli DH5α-stam leidde tot de groei van getransformeerde kolonies die resistent waren tegen kanamycine, het antibioticum dat wordt gebruikt als selectieve marker tijdens bacteriële transformatie. De overvloedige aanwezigheid van getransformeerde kolonies op de selectieplaat was hoger, wat suggereert dat de competente cellen een hoog transformatiepotentieel vertoonden, wat een indicatie is van de efficiëntie van het gebruikte transformatieprotocol (Figuur 1D).

Een enkele kolonie werd geïsoleerd en gezaaid in 10 ml LB aangevuld met kanamycine voor isolatie van plasmide. De plasmideopbrengst afkomstig van een cultuur van 10 ml wordt gedetailleerd beschreven in tabel 1. Voor deze procedure werd een standaardmethode voor plasmide-isolatie gebruikt. Bufferoplossingen werden de dag voorafgaand aan de plasmide-isolatie vers bereid en de incubatieomstandigheden werden geoptimaliseerd om de plasmideopbrengst te maximaliseren. De verkregen plasmideconcentratie bedroeg meer dan 1 μg/μL, met 260/280 en 260/230 verhoudingen die respectievelijk 1,8 en 2,0 overtroffen. Deze bevindingen geven aan dat de geïsoleerde plasmiden van hoge zuiverheid waren en vrij van verontreinigingen zoals eiwitten, EDTA, koolhydraten en fenol.

De elektroforetische mobiliteitsverschuiving voor het geïsoleerde synthetische circuit werd geëvalueerd. Restrictievergisting werd uitgevoerd met behulp van NotI- en XhoI-restrictie-enzymen, omdat dat de restrictieplaatsen waren waar het synthetische circuit werd ingebracht. Er werden twee banden waargenomen op 1% agarosegel, één band in de buurt van 1500 bp en één tussen 4 kb en 5 kb. Aangezien de grootte van de insert 1317 bp is, komt de band bij 1500 bp waarschijnlijk overeen met de insert. De pEGFP-N1 vector heeft een grootte van 4,7 kb. Daarom wordt aangenomen dat de band in de buurt van 5 kb de pEGFP-N1-vector is. Bijgevolg werd geconcludeerd dat er een volledig en intact synthetisch circuit aanwezig was binnen de afgiftevector. Bovendien werd een band van ongeveer 6 kb gedetecteerd voor het onverteerde intacte synthetische circuit, wat aangeeft dat de pEGFP-N1-vector een insert van bijna 1,3 kb in de plasmidevector herbergt (Figuur 1E).

figure-results-1
Figuur 1: Ontwerp en validatie van synthetische circuits. (A) Weergave van synthetische circuits door de assemblage van genetische onderdelen en regulerende componenten. (B) Deterministische simulatiegrafiek die de periodieke expressie van SDHA en TetR toont in eenheden van 100 tijd. (C) Getransformeerde kolonies van E. coli DH5α resistent tegen kanamycine. De eenheid is een eenheid van 100 keer omdat het een deterministische simulatie is. (D) Agarosegelelektroforese van intact en restrictief verteerd synthetisch circuit met behulp van NotI- en XhoI-restrictie-enzymen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Concentratie van plasmide (μg/ml)260/280260/230
1248.51.952.45
1123.11.892.43
1155.81.872.41
1056.81.942.47

Tabel 1: Opbrengst van het synthetisch circuitconstruct verkregen na plasmide-isolatie. De tabel toont de concentratie van plasmide in μg/ml, hun verhouding van 260/280 en 260/230.

In de controle- en geïnfecteerde cellen was de waargenomen fluorescentie-intensiteit laag voor GFP. Er werd echter waargenomen dat transfectie van het synthetische circuit met een verhouding van 1:1 van plasmide en PEI met 500 μg/ml G418 en inductie met 1 μg/μL dox een hoge GFP-expressie in IMT-cellen induceerde. In 6 uur IMTI-cellen was de GFP-expressie ook significant hoger, hoewel de GFP-expressie lager was dan in de IMT-steekproef (Figuur 2A,B). Verder werd een toename van de GFP-expressie waargenomen in 12 uur IMTI, 18 uur IMTI en 24 uur IMTI-monsters. Deze toename kan te wijten zijn aan een toename van de tijd van infectie, wat mogelijk hogere metabole veranderingen in macrofagen heeft veroorzaakt door residentiële parasiet17. Intracellulaire SDHA-spiegels kunnen worden beïnvloed door een toename van de infectietijd18. Aangezien dox aan deze IMTI-monsters werd toegevoegd, kunnen de SDHA-niveaus via synthetische circuits zijn toegenomen, wat heeft geleid tot een toename van de expressie van SDHA.

DAPI-kleuring werd gedaan om het aantal residentiële parasieten in de macrofagen te identificeren. In 6 uur L. major geïnfecteerde macrofagen was het waargenomen aantal intracellulaire parasieten 6 cellen per macrofaag, wat hoger is in vergelijking met het 6 uur durende IMTI-monster, dat 1-2 intracellulaire parasieten per macrofaag had. Na transfectie en dox-inductie werd een significante vermindering van de intracellulaire parasietbelasting waargenomen op verschillende tijdstippen van infectie (Figuur 2C). Waarnemingen suggereerden dat synthetische circuits mogelijk parasiet-eliminerende effecten hebben veroorzaakt door SDHA-expressie te stimuleren.

figure-results-2
Figuur 2: Confocale laserscanmicroscopie. Afbeeldingen van controle-, geïnfecteerde, IMT- en IMTI-monsters. (A) Expressieanalyse van GFP in alle experimentele monsters met een schaalbalk van 50 μm voor controle, 6 uur geïnfecteerd en IMT, 20 μm voor 6 uur IMTI, 10 μm voor 12 uur IMTI, 18 uur IMTI en 24 uur IMTI. De gebruikte kanalen waren DIC, DAPI, GFP en samengevoegde afbeeldingen van alle kanalen. (B) One-way ANOVA met Tukey's correctietest van alle experimentele monsters (n=3) voor GFP-expressie (p < 0,05 wordt als significant beschouwd) Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. (C) One-way ANOVA met Tukey's correctietestanalyse van de parasietbelasting in 100 macrofaagcellen voor monsters van (A) (n=3) werd uitgevoerd (p < 0,05 wordt als significant beschouwd). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Detectie van IL-10- en IL-12-niveaus in de media van alle monsters onthulde dat de concentratie van IL-10 en IL-12 het hoogst was 6 uur na infectie met neerwaartse regulatie van cytokineniveaus na 24 uur infectie. Er was geen significant verschil in IL-10 en IL-12 niveaus bij transfectie en inductie van synthetische circuits. Ook was er een niet-significant verschil in IL-10- en IL-12-niveaus in IMTI-tijdpuntmonsters (Figuur 3). Er is al gemeld dat het 6 uur geïnfecteerde monster expressie van IL-10 en IL-1219,20 vertoont, het waarnemen van een niet-significant verschil in IL-10 en IL-12 zorgde ervoor dat we het effect van het synthetische circuit op andere cytokines onderzochten.

figure-results-3
Figuur 3: ELISA van IL-10 en IL-12 om hun secretoire niveaus in media van verschillende monsters te identificeren. Monsters (n=2) omvatten controle, 6 uur geïnfecteerd, 24 uur geïnfecteerd, IMT, 6 uur IMTI, 12 uur IMTI, 18 uur IMTI, 24 uur IMTI. Tweezijdige ANOVA met Tukey's correctietestanalyse werd uitgevoerd (p <,05 wordt als significant beschouwd). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Detectie van transcriptieniveaus van TNF-α, IFN-γ en TGF-β in 6 uur geïnfecteerde, IMT- en 24-uurs IMTI-monsters onthulde dat een significante toename van TNF-α tot 2,5-voudig werd waargenomen in 24-uurs IMTI-monsters in vergelijking met infectie- en IMT-monsters (Figuur 4). In de 24-uurs IMTI-steekproef werd een 35-voudige toename van de IFN-γ-niveaus waargenomen in vergelijking met infectie- en IMT-monsters. TGF-β niveaus, hoewel ze een significante opregulatie vertoonden tot 1,5-voudig in de 24-uurs IMTI-steekproef, was de relatieve vouwverandering lager in vergelijking met TNF-α en IFN-γ, wat suggereert dat pro-inflammatoire cytokines significant worden opgereguleerd in de 24-uurs IMTI-steekproef.

figure-results-4
Figuur 4: qRT-PCR-analyse van cytokines. (A) TNF-α, (B) IFN-γ en (C) TGF-β gedurende 6 uur geïnfecteerde, IMT- en 24-uurs IMTI-monsters (n=2). Er werd eenrichtings-ANOVA uitgevoerd met de correctietest van Tukey (p < 0,05 wordt als significant beschouwd). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Nucleotidesequentie van genetische onderdelen die zijn geassembleerd om het synthetische circuit te vormen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Vertaalde sequentie van synthetische schakelingen die TetR, P2A en SDHA tot expressie brengen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Sequentieresultaat van het gekloonde synthetische circuit in pEGFP-N1 plasmide. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verkregen resultaten onderstrepen de efficiëntie van de pijpleiding, die is gekanaliseerd voor het ontwerp en de implementatie van een synthetisch circuit. De bouw van dit synthetische circuit was een stap in de richting van de ontwikkeling van precisiegeneeskunde voor infectieziekten zoals leishmaniasis. Door middel van de in silico assemblage van genetische onderdelen en deterministische simulatie werd het onderscheidende modulerende effect van het TetON-systeem gemonitord. Het effect van de schakeling zou met name kunnen hebben geleid tot de wederzijdse bistabiele expressie van TetR en SDHA/GFP. De expressie van SDHA was periodiek, wat erop zou kunnen wijzen dat alleen in aanwezigheid van doxycycline de expressie ervan werd verhoogd. Om mogelijke veranderingen in expressiepatronen gedurende een periode waar te nemen, werd een tijdseenheid van 100 geselecteerd. Uit de resultaten blijkt dat het synthetische circuit periodiek gedrag vertoonde voor TetR en SDHA/GFP, waarschijnlijk toe te schrijven aan de orthogonale aard21. De assemblage van genetische onderdelen uit het iGEM-onderdelenregister speelde een cruciale rol, omdat het genetische componenten leverde die nodig waren voor het bouwen van synthetische circuits22. Modulaire rangschikking van genetische delen is essentieel, omdat de translatie en het functioneren van het circuit kunnen worden beïnvloed, wat kan leiden tot inefficiënte expressie en modulerend effect in cellen23.

De wisselplaatgrootte van het synthetische circuit was ongeveer 1,3 kb om ervoor te zorgen dat de grootte van de vector niet te groot is, wat de transformatie-efficiëntie mogelijk kan verminderen24. Het selecteren van een geschikte vector is een cruciale stap, omdat deze genetische delen moet bevatten, die essentieel zijn om het aantal kopieën in het bacteriële systeem te verhogen en een hoge plasmidekopie op te leveren, en de expressiemachinerie moet zich goed aanpassen aan het zoogdiersysteem25. De pEGFP-N1-vector is goed gekarakteriseerd in de RAW264.7-cellijn en bezit een compacte plasmidestructuur met een meervoudige kloonplaats26. In het laboratorium gestandaardiseerde bufferoplossingen werden gebruikt voor plasmide-isolatie om de productie van sterk geconcentreerd en zuiver plasmide te garanderen, dat werd gevalideerd door middel van spectrofotometrische schatting en AGE. De invoeging van het synthetische circuit in de pEGFP-N1-vector werd gevalideerd door middel van restrictievergisting en de monsters werden geanalyseerd op AGE en sequencing. De AGE-resultaten vertegenwoordigden een 1,3 kb-band van insert, 4,7 kb-band van pEGFP-N1-vector en 6 kb-band van het gehele synthetische circuit.

Transfectie met behulp van 1:1, 1:2 en 2:1 verhouding van DNA: PEI-verhoudingen werd uitgevoerd, waarbij de waargenomen verhouding van 1:1 het beste werkte zonder de celmorfologie te verstoren (gegevens niet getoond). Het wordt aanbevolen om een concentratie van 400 μg/ml - 1000 μg/ml G418 te gebruiken voor de selectie van getransfecteerde cellen27. Een 500 μg/ml G418 werd gebruikt voor de selectie van getransfecteerde cellen, omdat het de groei van niet-getransfecteerde cellen effectief onderdrukte zonder de celgroei of morfologie van getransfecteerde cellen in gevaar te brengen (gegevens niet getoond). Gezien het belang van het celfenotype voor de transfectie-efficiëntie, met name in macrofaagcellijnen, die differentiatie kunnen ondergaan en moeilijk te transfecteren kunnen worden, werd een laag passagegetal van de RAW264.7-cellijn gebruikt voor transformatie28. Het aantal celpassages kan ook een kritische factor zijn in de efficiëntie van transfectie. Een hoog passagegetal kan leiden tot inefficiënte transfectie29. Dox is de voorkeursinductor voor het Tet-ON-inductiesysteem vanwege de hoge bindingsefficiëntie aan TetR, gunstige weefselverdeling, lage toxiciteit en een halfwaardetijd van 24 uur30. Na transfectie werden cellen gedurende 24 uur geïnduceerd met dox en werden ze geobserveerd op GFP-expressie. Voor RAW264.7-cellen was de concentratie dox die werd gebruikt voor inductie van synthetische circuits 1 μg/ml, wat in het aanbevolen bereik van 1-2 μg/ml31 valt (gegevens niet weergegeven). De regulatie van de SDHA-concentratie na inductie was echter onbepaald. Over het algemeen zijn de bepaling en standaardisatie van het aantal celpassages, DNA: PEI-concentratie, concentratie van transfectieselectiemarkers van zoogdieren en doxycycline-inductieconcentratie cruciale factoren in het transfectieproces.

Na de inductie van het synthetische circuit na infectie op verschillende tijdstippen, werd een significante vermindering van de intracellulaire parasietbelasting waargenomen. Een vergelijking van de parasietbelasting tussen geïnfecteerde en IMTI-monsters onthulde een lagere belasting in cellen geïnduceerd met het synthetische circuit, waarschijnlijk toe te schrijven aan SDHA-expressie. Aangezien SDHA-expressie geassocieerd is met NO-productie, werd waargenomen dat IMTI-cellen een onregelmatige en ruwe morfologische vorm hebben, die optreedt in de RAW264.7-cellijn wanneer NO wordt geproduceerd32. IL-10- en IL-12-niveaus na infectie van 6 uur waren het hoogst, aangezien is gemeld dat beide cytokinen op dit tijdstip worden opgereguleerd, die verder fenotypische modificatie ondergaan om IL-10 meer te produceren danIL-12 19. Aangezien IL-10- en IL-12-niveaus de post-transfectie en in IMTI-monsters niet significant veranderden, werd cytokineprofilering uitgevoerd om pro-inflammatoire en ontstekingsremmende cytokineresponsen te detecteren.

Expressieniveaus van TNF-α, IFN-γ en TGF-β werden geïdentificeerd in 6 uur infectie, IMT en 24 uur IMTI-monsters. Om intracellulaire parasieten te elimineren, zijn TNF-α en IFN-γ voornamelijk essentieel omdat ze oxidatieve uitbarstingen induceren door NO-productie. M2 gepolariseerde macrofagen brengen TGF-β tot expressie, wat pro-inflammatoire cytokines naar beneden reguleert33. Het 24-uurs IMTI-monster vertoonde een verhoogde TNF-α- en IFN-γ-expressie dan TGF-β, wat suggereert dat de macrofagen, bij transfectie en infectie met L. major, mogelijk gepolariseerd zijn tot pro-inflammatoir cytokine dat fenotype tot expressie brengt. De studie geeft daarom inzicht in de fenotypische veranderingen die worden veroorzaakt door transfectie met een synthetisch circuit en benadrukt de infectiedynamiek. Het effect van de synthetische circuits als therapeutisch middel kan worden onderzocht, aangezien hun inductie de pro-inflammatoire cytokine-expressie aanzienlijk had verhoogd in vergelijking met ontstekingsremmend cytokine. De studie vestigde dus niet alleen de constructie en toedieningspijplijn van het synthetische circuit, maar toonde ook het therapeutisch potentieel ervan aan in een leishmaniasis-model door de opregulatie van pro-inflammatoire cytokines in door Leishmania uitgedaagde gastheercellen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de directeur van de Biotechnology Research and Innovation Council-National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS), Pune bedanken voor zijn steun aan ons onderzoek en de BRIC-NCCS Bioinformatics Facility.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 μL tipsTarson521050
10X restriction bufferBioLabsR0146SRestrictie digestie
1mL tipsTarson521016
1mL tubeEppendorf30121023
200 μL tipsTarson521010
25cm2 flaskCorning430639Voor celcultuur
4',6-diamidino-2-fenylindoolThermoFischer ScientificD1306nucleaire kleuring
50mL tubeCorning352070
60mm platenFalcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading bufferThermoFischer Scientific10488085Belasting monsters voor AGE
96 wel dekglas bodemplaatThermoFischer Scientific160376Voor confocale beeldvorming en transfectie
96 wel microtestplaat met platte bodemTarson941196
AgaroseSigmaA9539Voor AGE
Agarose gelelektroforese opstellingGeNei93Voor AGE
Bacterieel laminair stromingsveldESCO Lifesciences2120765Voor transformatie
CalciumchlorideMerckC4901Buffer /Reagens voorbereiding
Cell cultuur laminair luchtstroomThermoFischer Scientific1323TSVoor celcultuur
CelkrabberGenetix90020Voor celcultuur
CelverspreiderFischer Scientific12822775
Centrifuge voor 1.5mL buizenEppendorfEP5404000537
Centrifuge voor 50mL valkThermoFischer Scientific75004210
ChloorformFischer Scientific67-66-3Voor RNA-isolatie
CO2 incubatorThermoFischer Scientific3110Voor celcultuur
CuvetEppendorf6138000018Schatting van plasmideconcentratie
CYTIVA IQ 500 gel imagerCytiva29655893Voor AGE
DEPC BEHANDELD H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023Voor RNA-isolatie
DoxycyclineMerck33429Voor inductie van getransfecteerde cellen
Droge verwarmingsblokLabnetVoor transformatie en inactivatie van restrictie-enzymen
Dulbecco's Aangepast Eagle MediumNationaal centrum voor celwetenschapVoor celcultuur
EthanolSigma-Aldrich1.00983Buffer /Reagens voorbereiding
EthidiumbromideSigmaE7637Voor AGE
EthyleendiaminetetraazijnzuurFischer Scientific12635Buffer /Reagens voorbereiding
Evos brightfield microscoopThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/voor constructie van synthetische kring
Foetaal bovien serumGibco16000-044Voor celcultuur
FV31S-SW softwareOlypmusBeeldverwerving
GeneticineGibco1563411voor transfectie
Gibson-assemblagemethode voor kloneringBIOMATIKConstructie van synthetische kring
Graphpad prismGraphpadStatistische analyse
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFischer Scientific4368814voor cDNA-synthese
IsopropanolFischer Scientific13825Buffer /Reagens voorbereiding
KanamycineSigma60615Voor transformatie en kolonieselectie
Luria Bertini bouillonHimediaM1245Voor het kweken van E.coli
MagnesiumchlorideFischer ScientificBP214Buffer /Reagens voorbereiding
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLThermoFischer Scientific4358293Voor qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032Voor qRT-PCR
MicrogolfovenLGMC-7649DWVoor AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman probes
Muis ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614Voor ELISA
Muis ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616Voor ELISA
Multiskan Sky met touchscreen + μDrop PlateThermoFischer Scientific51119600DPVoor ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Aanpasbare 0-1500 rpm Laboratorium Shaker AgitatorDIAB
Nationaal centrum voor biotechnologie-informatiehttps://www.ncbi.nlm.nih.govvoor constructie van synthetische kring
Neubauer's kamerMarienfeld superior640010Voor celtelling
Niet-geventileerde 25cm2 flaskCorning353014Voor het kweken van parasiet
NotIBioLabsR3189MRestrictienezym
Nuclease-vrij waterBiodesign1QIAReagens voorbereiding
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 softwareOlypmusBeeldverwerking
Olympus FV 3000OlympusVoor confocale beeldvorming
OPTI-MEM mediaGibco319

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241(2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588(2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749(2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431(2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529(2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ImmunometabolismeSynthetische BiologieLeishmania infectieSynthetisch CircuitTetracycline induceerbaar SysteemSuccinaatdehydrogenaseTransfectie van MacrofagenPro inflammatoire CytokinenPolyplex nanodeeltjes

Gerelateerde artikelen