Hier laten we zien dat krachtige lasers van 375 nm en 405 nm Hoechst 33342 effectief kunnen exciteren en kunnen dienen als een levensvatbaar alternatief voor de 355 nm-laser voor celdetectie van zijpopulaties (SP), waardoor het bereik van beschikbare lasers in flowcytometrietoepassingen wordt uitgebreid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Effectieve detectie van Hoechst-zijpopulatiecellen door flowcytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zijpopulatiecellen (SP) worden geïdentificeerd door middel van Hoechst 33342-kleuring en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (FCM). De Hoechst SP-methode wordt gebruikt voor de isolatie van stamcellen op basis van de kleurstofeffluxeigenschappen van ATP-bindende cassette (ABC) transporters. De methode werd aanvankelijk gebruikt voor de identificatie en isolatie van hematopoëtische stamcellen (HSC's), maar is nu geëvolueerd om zich voornamelijk te richten op de identificatie en isolatie van kankerstamcellen (CSC's). De traditionele detectiemethode van FCM maakt gebruik van een laser van 355 nm om de kleurstof te exciteren om SP-cellen te detecteren. Door deze studie hebben we met succes alternatieve benaderingen voor kleurstofexcitatie geïdentificeerd die de detectie van SP-cellen met behulp van een 355 nm-laser effectief kunnen vervangen. Dit wordt bereikt door het gebruik van krachtige lasers van 375 nm of 405 nm. Dit stelt ons in staat om een verbeterde selectiviteit uit te oefenen bij de detectie van SP-cellen in plaats van alleen beperkt te zijn tot de 355 nm laserflowcytometrie.
Inleiding
De zijpopulatiecellen (SP) worden geïdentificeerd door middel van Hoechst 33342-kleuring en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (FCM). De SP-cellen worden gekenmerkt door het pompen van de fluorescerende DNA-kleurstof uit de cellen via hun ATP-bindende cassette (ABC) transporter 1,2. De methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor het isoleren van hematopoëtische stamcellen (HSC's) uit het muizenbeenmerg1. De SP-cellen van het beenmerg werden verrijkt met een populatie van HSC's die werden gekenmerkt door CD117+Sca-1+Lin-Thy1 lage expres....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten in deze studie gebruikten in totaal 10 C57BL/6 muizen in de leeftijd tussen 8 en 12 weken. Experimentele operaties werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Sichuan University (#201609309). Experimentele materialen en de parameters van flowcytometrie die in dit artikel worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel.
1. Isolatie en verzameling van beenmergcellen van muizen
- Euthanaseer muizen in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Om bewusteloosheid bij de muis op....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In figuur 2 werd de controlegroep behandeld met verapamil, dat ABC-transporters in stamcellen blokkeert om de eliminatie van Hoechst 33342 te voorkomen. Daarbij verdrijven de stamcellen van de niet-verapamilgroep Hoechst 33342 en vormen ze een negatieve celpopulatie die bekend staat als SP-cellen. De 355 nm laser heeft de Hoechst 33342 kleurstof effectief geëxciteerd, wat resulteert in een duidelijke waarneming van SP-cellen van het beenmerg (Figuur 2A). De SP-c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We gebruikten het beschreven protocol om drie experimenten uit te voeren, waarbij elke proef 3-4 muizen betrof, wat resulteerde in een totaal van 10 muizen. Het aandeel SP-cellen varieerde van 0,05% tot 0,76%. Het is belangrijk op te merken dat individuele variaties werden waargenomen bij de muizen. We gebruikten vier flowcytometers om de Hoechst-monsters te analyseren. Opgemerkt wordt dat de excitatie van Hoechst-kleurstof door een 20 mW 355 nm laser op de nieuwe versie van flowcytometrie gelijk is aan die van een 100 m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten gemeld.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de subsidies aan J.H. van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81800207). De hulp van Beckman Coulter, Inc. bij het bieden van ondersteuning voor flowcytometrie en parameterkalibratie wordt zeer op prijs gesteld. We danken Jiao Chen van het State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University en Yu Qi van Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, voor hun hulp bij het verzamelen van flowcytometriegegevens.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Automatische celteller | Countstar | 1M1200 | |
| Celfilter(100 µm) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| Dagelijkse kwaliteitscontrole fluorosferen | Beckman Coulter | B5230 | |
| Dulbecco's aanpassing van Eagle's Medium met 4,5g/L glucose (DMEM-medium) | CORNING | 10-013-CVRC | |
| Fetaal bovien serum | CORNING | 35-081-CV | |
| HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Propidiumjodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Rode bloedcel lysisbuffer | Beyotime | C3702 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
Referenties
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Zhou, S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
