Methodenartikel

Hoogwaardige aanvalsachtige activiteit van acute hersenplakjes met behulp van een complementair metaaloxide-halfgeleider micro-elektrode-array-systeem met hoge dichtheid

DOI:

10.3791/67065

⸱

27 september 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, Brigham Young University, 2Neuroscience Center, Brigham Young University, 3Department of Statistics, Brigham Young University, 4Department of Biology, Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy, Brigham Young University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier schetsen we een protocol voor het gebruik van complementaire metaaloxide-halfgeleider high-density micro-elektrode array-systemen (CMOS-HD-MEA's) om aanvalsachtige activiteit van ex vivo hersenplakjes vast te leggen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Complementaire metaaloxide-halfgeleider high-density micro-electrode array (CMOS-HD-MEA)-systemen kunnen neurofysiologische activiteit van celculturen en ex vivo hersenplakjes registreren in ongekend elektrofysiologisch detail. CMOS-HD-MEA's werden voor het eerst geoptimaliseerd om hoogwaardige neuronale eenheidsactiviteit van celculturen vast te leggen, maar er is ook aangetoond dat ze kwaliteitsgegevens produceren van acute retinale en cerebellaire plakjes. Onderzoekers hebben onlangs CMOS-HD-MEA's gebruikt om lokale veldpotentialen (LFP's) van acute, corticale hersenplakjes van knaagdieren vast te leggen. Een LFP van belang is epileptische activiteit. Hoewel veel gebruikers korte, spontane epileptiforme ontladingen hebben geproduceerd met behulp van CMOS-HD-MEA's, produceren maar weinig gebruikers op betrouwbare wijze hoogwaardige aanvalsachtige activiteit. Veel factoren kunnen bijdragen aan deze moeilijkheid, waaronder elektrische ruis, de inconsistente aard van het produceren van epileptische activiteit bij het gebruik van ondergedompelde opnamekamers en de beperking dat 2D CMOS-MEA-chips alleen opnemen vanaf het oppervlak van de hersenschijf. De technieken die in dit protocol worden beschreven, moeten gebruikers in staat stellen om met een CMOS-HD-MEA-systeem consequent hoogwaardige aanvalsachtige activiteit van acute hersenplakjes te induceren en vast te leggen. Daarnaast schetst dit protocol de juiste behandeling van CMOS-HD-MEA-chips, het beheer van oplossingen en brain slices tijdens experimenten en het onderhoud van apparatuur.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de handel verkrijgbare high-density micro-electrode array (HD-MEA)-systemen, waaronder een MEA-chip met duizenden registratiepunten 1,2 en een MEA-platform om de gegevens te versterken en te digitaliseren, zijn een opkomend hulpmiddel voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze HD-MEA-systemen maken gebruik van complementaire metaaloxide-halfgeleidertechnologie (CMOS) om elektrofysiologische gegevens met hoge gevoeligheid vast te leggen van celculturen en ex vivo hersenschijfpreparaten. Deze MEA-systemen bieden een ongekende ruimtelijke en temporele resolutie voor neurofysiologisch onderzoek via hoge elektrodedichtheid en hoogwaardige signaal-ruisverhoudingen3. Deze technologie is meestal gebruikt om extracellulaire actiepotentialen te bestuderen, maar het kan ook hoogwaardige lokale veldpotentialen (LFP's) van verschillende neuronale hersenschijfpreparaten vastleggen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Dankzij de bovengenoemde opnamemogelijkheid met hoge resolutie van CMOS-HD-MEA-systemen kunnen gebruikers elektrofysiologische activiteit met grote ruimtelijke nauwkeurigheid volgen 16,17,18. Deze mogelijkheid is met name relevant voor het volgen van propagatiepatronen van netwerk-LFP's 5,12,15,19,20,21. Daarom kunnen CMOS-HD-MEA-systemen een ongekend inzicht bieden in de voortplantingspatronen van fysiologische en pathologische activiteit van verschillende celkweek- en hersenplakpreparaten. Van bijzonder belang is dat deze mogelijkheden van CMOS-HD-MEA-systemen onderzoekers in staat kunnen stellen om aanvalspatronen van verschillende hersengebieden tegelijkertijd te contrasteren en te testen hoe verschillende anti-epileptische stoffen deze patronen beïnvloeden. Door dit te doen, biedt het een innovatieve methode voor het bestuderen van ictogenese en ictale propagatie en om te begrijpen hoe farmacologie pathologische netwerkactiviteit verstoort 7,10,14. Daarom kunnen deze nieuwe capaciteiten van CMOS-HD-MEA-systemen een belangrijke bijdrage leveren aan het onderzoek naar neurologische aandoeningen, en ook helpen bij het onderzoek naar de ontdekking van geneesmiddelen 5,7,11,22. We streven ernaar om details te verstrekken over het gebruik van CMOS-HD-MEA-systemen om aanvalsachtige activiteit te bestuderen.

Bij het gebruik van CMOS-HD-MEA-systemen om LFP's te bestuderen, zoals epileptiforme activiteit in acute hersenplakjes, kunnen gebruikers voor veel uitdagingen komen te staan, waaronder slopende elektrische ruis, het gezond houden van het plakje tijdens experimenten en het detecteren van een kwaliteitssignaal van een tweedimensionale (2D) CMOS-MEA-chip die alleen opneemt vanaf het oppervlak van het hersenplakje. Dit protocol beschrijft de basisstappen voor het correct aarden van het MEA-platform en andere apparatuur die bij experimenten wordt gebruikt, een cruciale stap die mogelijk individuele aanpassing vereist voor elke laboratoriumopstelling. Daarnaast bespreken we stappen om te helpen bij het gezond houden van de hersenplak tijdens lange opnames in de ondergedompelde kamers die worden gebruikt met CMOS-HD-MEA-systemen 23,24,25. Bovendien gebruiken de meeste CMOS-HD-MEA-systemen, in tegenstelling tot meer gebruikelijke elektrofysiologische opnamemethoden, die diep in het hersensegment opnemen, 2D-chips die niet in het plakje doordringen. Daarom hebben deze systemen een gezonde neuronale buitenlaag nodig om het merendeel van de geregistreerde LFP-signalen te produceren. Andere uitdagingen zijn onder meer het visualiseren van de enorme hoeveelheid gegevens die door duizenden elektroden worden gegenereerd. Om deze uitdagingen te overwinnen, raden we een eenvoudig maar effectief protocol aan dat de kans vergroot op het bereiken van hoogwaardige netwerkepileptiforme activiteit die zich over het hersensegment verspreidt. We voegen ook een korte beschrijving toe van een openbaar beschikbare grafische gebruikersinterface (GUI) die we hebben ontwikkeld met bijbehorende bronnen om te helpen bij gegevensvisualisatie10.

Eerdere publicaties hebben gerelateerde protocollen verstrekt voor het gebruik van MEA-registratiesystemen 26,27,28,29. Dit werk is echter bedoeld om onderzoekers te helpen die CMOS-HD-MEA-systemen met 2D-chips gebruiken, met name degenen die hoogwaardige epileptiforme activiteit van hersenplakjes willen bestuderen. Daarnaast vergelijken we twee van de meest voorkomende oplossingsmanipulaties voor inductie van aanvalsachtige activiteit, namelijk de paradigma's van 0 Mg2+ en 4-AP, om gebruikers te helpen de meest geschikte convulsieve media voor hun specifieke toepassing te identificeren. Hoewel het protocol in de eerste plaats gericht is op het genereren van aanvalsachtige activiteit, kan het worden aangepast om andere elektrofysiologische verschijnselen te onderzoeken met behulp van hersenplakjes.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures met muizen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Brigham Young University. Mannelijke en vrouwelijke (n = 8) C57BL/6 muizen van ten minste P21 oud werden gebruikt in de volgende experimenten.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische figuur van CMOS-HD-MEA experimenten. (A) De hersenplak wordt geprepareerd volgens de door hem gewenste snijmethode en onderontleed om op de MEA te passen. (B) Bereid de oplossingen en de CMOS-HD-MEA-chip voor. (C) Het sub-ontlede hersenplakje wordt op de elektrode-array geplaatst en gebaad in de juiste oplossingen. (D) Uit de verzamelde gegevens worden relevante kanalen geselecteerd. Gegevens worden vervolgens voorbereid voor analyse in het voorkeursprogramma van de gebruiker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NaamConcentratie (mM)g/L
Natriumchloride (NaCl)1267.36
Kaliumchloride (KCl)3.50.261
Diwaterstofnatriumfosfaat (NaH2PO4)1.260.151
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)262.18
glucose (C6H12O6)101.80
Magnesiumchloride (MgCl2)1 (vanaf 1 M voorraad)1 ml
Calciumchloride (CaCl2)2 (vanaf 1 M voorraad)2 ml

Tabel 1: aCSF-oplossing.

1. Oplossingen voorbereiden

  1. Bereid de experimentele oplossingen voor.
    1. Bereid 1 L kunstmatig hersenvocht (aCSF) voor (zie tabel 1 voor details).
    2. Bereid 1 L pro-convulsieve oplossing voor.
      OPMERKING: Oplossingen die in dit protocol worden gebruikt om aanvalsachtige activiteit te genereren, maakten gebruik van aCSF met 100 μM 4-aminopyridine (4-AP) of aCSF vrij van magnesiumionen.
    3. Carbogeneer alle oplossingen minimaal 10 minuten voor gebruik met behulp van poreuze stenen.
    4. Pak een beker voor het weggooien van oplossingen.
    5. Plaats 1 l aCSF, 1 l proconvulsieve oplossing en het weggooibekerglas op een oppervlak dicht bij het perfusiesysteem.
  2. Voorbereiding van de snij- en houdkameroplossingen
    1. Bereid 0,5 L aCSF voor, laat CaCl2 weg en voeg 3 mM MgCl2 toe (in plaats van 1 mM) om een unieke snijoplossing te creëren. Bewaar deze oplossing voor gebruik bij de bereiding van hersenplakjes van knaagdieren door deze in de buurt van het gebied voor de voorbereiding van acute hersenplakjes te plaatsen.
    2. Bereid 0,5 L aCSF voor en plaats het in een weefselbewaarkamer die zal worden gebruikt om plakjes te bewaren voor gebruik bij experimenten. Steek poreuze stenen in de weefselbewaarkamer en carbogeneer de oplossing gedurende ten minste 10 minuten voordat u de ondergesneden plakjes in de kamer plaatst.

2. Hersenplakjes van knaagdieren bereiden

  1. Bereid alle oplossingen voor zoals hierboven beschreven (zie hoofdstuk 1). Zorg ervoor dat alle oplossingen tijdens het bereidingsproces goed zijn gecarbogeneerd.
    OPMERKING: De snijoplossing (zie rubriek 1.2) wordt aanbevolen, maar andere snijoplossingen kunnen worden gebruikt om hoogwaardige hersenschijfjes te verkrijgen, zoals een sucrose-snijoplossing30.
  2. Gebruik een vibrerende microtoom om hersenplakjes van 350 μm knaagdieren te maken. Protocollen voor het gebruik van deze instrumenten zijn opgenomen in de referenties 30,31,32,33.
  3. Bereid de hersenplakjes van knaagdieren voor zodat ze op het gebied van de opname-elektrode van de MEA-chip passen (zie afbeelding 2). Gebruik een chirurgisch mes van maat 10 om de plakjes te subontleden, zoals weergegeven in afbeelding 1A en afbeelding 2A , door het mes voorzichtig heen en weer te rollen op de hersenschijf. Voer de subdissectie uit in de vibrerende microtoomsnijkamer. Wees voorzichtig om de sub-ontlede hersenplak niet te beschadigen.
  4. Leg de onderverdeelde plakjes in een weefselhoudende kamer gevuld met aCSF. Zorg ervoor dat de kamer ten minste 10 minuten is gecarbogeneerd voordat u de ondergesneden plakjes toevoegt.

3. Voorbereiding van de apparatuur

  1. Voorbereiding van de MEA-chips en het MEA-systeem (Figuur 2 en Figuur 3)
    OPMERKING: Harde materialen zoals kunststoffen en metalen kunnen de MEA-chip gemakkelijk beschadigen als ze goed met kracht in contact komen met de onderkant van de chip. Wanneer u pipetten gebruikt om de oplossing in of uit de chips over te brengen, mag u de bodem van de chipput niet in contact brengen met de pipet, met name de referentie-elektroden aan de zijkanten van de chipput en de opname-elektroden in het midden van de chipput (Figuur 2C). Voeg in plaats daarvan de oplossing toe door de muisaanwijzer over de bodem van de chipput te plaatsen of door contact te maken met de plastic randen van de chipput of deze te benaderen. Om alle oplossing er gemakkelijk uit te trekken, kantelt u de chip een beetje zodat de oplossing zich naar één kant van de chipput kan verzamelen en verwijdert u deze van de bovenkant van de gepoolde oplossing, of gebruikt u een antistatisch doekje om lichtjes te deppen op gebieden waar de oplossing nog is. Vervoer de chip niet door de chip goed vast te houden of de chippennen (Figuur 2C). De chipput kan ongeveer 4 ml oplossing bevatten. Vul de chip voor de volgende stappen goed met ongeveer 2 ml oplossing, tenzij anders aangegeven.
    1. Wijs transferpipetten aan voor verschillende taken voordat u begint met de spaanvoorbereiding. Label een transferpipet voor ethanol, een voor afval, een andere voor aCSF en andere voor eventuele resterende oplossingen om onbedoeld mengen te voorkomen.
    2. Vul het putje van de MEA-chip met 190-proof ethanol zodat de bodem van het chipputje volledig bedekt is (Figuur 3). Laat de ethanol 30-60 s zitten en verwijder deze vervolgens met een weggegooide pipet.
    3. Vul het putje van de MEA-chip met aCSF en verwijder het met een weggooipipet om de resterende ethanol goed uit de chip te spoelen. Voeg drie keer aCSF toe aan en verwijder deze uit de chipput, met behulp van de eerder aangewezen afvalstoffen en aCSF-pipetten. Nadat je de chip drie keer goed hebt gewassen, voeg je aCSF toe en laat je deze minimaal 30 s staan.
      OPMERKING: De opname-elektroden vertonen de minste hoeveelheid ruis van hydrofobe interacties wanneer aCSF ten minste 45 minuten in de kamer blijft na het spoelen met ethanol en aCSF.
    4. Voordat u de MEA-chip plaatst, maakt u een antistatisch doekje nat met 190-proof ethanol en gebruikt u het om de pinnen van de chip af te vegen (Figuur 2C).
    5. Schuif de MEA-chip voorzichtig in het MEA-platform en schakel het dockingmechanisme in om de chip op zijn plaats te vergrendelen.
    6. Controleer de opname- en referentie-elektroden op luchtbellen (Figuur 2C). Als er luchtbellen aanwezig zijn, neem dan een schone verfkwast en veeg lichtjes over de elektroden om ze te verwijderen.
    7. Controleer de chip op ruis met behulp van de CMOS-HD-MEA-software34 en scan de valse kleurenkaart visueel op bellen, niet-biologische oscillaties of pieken veroorzaakt door elektrische interferentie. Aard het MEA-systeem op de juiste manier om eventuele ruis teniet te doen.
      NOTITIE: De aardingsinstelling is afhankelijk van de opnameomgeving. Voor de experimenten in dit protocol werden het MEA-platform en het perfusiesysteem geaard.

figure-protocol-2
Figuur 2: Configuratie- en technologiediagrammen. (A) Diagram van de selectie van acute hersenplakjes van muizen die in het experiment zijn gebruikt, gemarkeerd door dit protocol. (1) Hippocampus gebied (2) Neocortex gebied. (B) De juiste plaatsing van een acuut hersenplakje en harp van een muis op de micro-elektrode Array (MEA). (C) De anatomie van een 3Brain Accura CMOS-HD-MEA chip. (D) De juiste configuratie van perfusie-inlaten en -uitlaten. De invoer moet zich diep in de chipput bevinden, terwijl de output zich aan de andere kant van de inlaat aan de bovenkant van de chipput moet bevinden om een constante stroom van verse, zuurstofrijke aCSF te garanderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Schematisch diagram van de spaanvoorbereiding en -plaatsing voor hersenschijfexperimenten. (A) Spoel de chip één keer goed af met ethanol en vervolgens drie keer met aCSF. (B) Veeg de pinnen af met ethanol met behulp van een antistatisch doekje. (C) Plaats de chip in het dock. (D) Plaats de hersenplak op de elektroden. (E) Plaats de harp op de hersenplak (zie figuur 2 voor de juiste plaatsingsrichtlijnen). (F) Dep de hoek van het putje van de opname-elektroden in de buurt van de hersenplak met een gedraaid antistatisch doekje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Experimenteren

  1. Het plaatsen van de hersenplak
    1. Plaats een platina harp in een weegboot (of een ander schoon oppervlak) in de buurt van het MEA-platform. Bedek de harp met ongeveer 3 ml aCSF om de hydrofobe neigingen te verminderen.
    2. Gebruik een schaar om het dunne uiteinde van een transferpipet te verwijderen. Snijd een derde, ongeveer 1,5 inch, van de pipetpunt af.
      OPMERKING: Deze aangepaste pipet zal de hersenplak niet vernauwen of beschadigen tijdens het verzamelen en transporteren.
    3. Verzamel een hersenplakje uit de kamer met de aangepaste pipet. Doseer de hersenplak en eventuele oplossing in de pipet voorzichtig in de chipput. Om het plakje goed te positioneren, laat u voorzichtig meer aCSF los uit een transferpipet om de positie van het hersenplakje te manipuleren of gebruikt u een zacht penseel om een stroom in de oplossing te creëren die het hersenplakje op opname-elektroden duwt. Beperk het contact met de opname-elektroden of hersenplak om schade tot een minimum te beperken.
    4. Plaats de harp met een pincet voorzichtig over de hersenplak met de draden naar beneden om de plak op de opname-elektroden te drukken. Vermijd contact met de elektrode-array met de harp. Richt de harp zo dat de zijde zonder frame naar de instroomnaald wijst en het frame van de harp geen contact maakt met een van de opname-elektroden (Figuur 2C, D).
    5. Neem een weggegooide pipet en verwijder overtollig aCSF. Neem een antistatisch doekje, draai een hoek om een punt te maken en gebruik het om de resterende aCSF rond de opname-elektroden op te zuigen zonder de opname-elektroden, hersenplak of harp aan te raken (Figuur 2).
    6. Voeg met behulp van een speciale aCSF-pipet snel voldoende gecarbogeneerde aCSF toe om het hersenschijfje te bedekken, ongeveer 2 ml.
    7. Herhaal stap 4.1.5. en 4.1.6. nog twee keer.
    8. Vul het putje met gecarbogeneerd aCSF tot het putje ongeveer 3/4 vol is, ongeveer 3 ml.
    9. Maak een foto van het hersenplakje op de MEA-chip met een microscoop of camera. Zorg ervoor dat de foto een resolutie heeft die hoog genoeg is om de grenzen van de opname-elektrode-array en de anatomie van de hersenschijf te zien.
  2. Het experiment uitvoeren
    1. Bediening van het perfusiesysteem
      1. Plaats de in- en uitstroombuizen in het bekerglas gevuld met aCSF en de in- en uitstroomnaalden in de spaanhouder. Plaats de instroomnaald dicht bij de onderkant van de chip, net buiten de opname-elektroden. Plaats de uitstroomnaald dicht bij de bovenkant van de chipput naar de rand toe, zodat de vloeistof bijna tot aan de rand van de chipput stijgt, ongeveer 4 ml, en de plak gedurende het hele experiment wordt ondergedompeld (Figuur 2D).
      2. Stel de perfusie-instroom in op 5 ml/min en de perfusie-uitstroom op 7 ml/min.
        OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de uitstroomsnelheid groter is dan de instroomsnelheid om te voorkomen dat de oplossing uit de chipput stroomt en om een oplossingsstroom over de hersenschijf te creëren.
      3. Zet de in- en uitstroom aan. Verwijder de instroomnaald uit de spaanput totdat de naald oplossing begint af te geven in plaats van lucht. Plaats de naald vervolgens terug op zijn plaats in de chipput zoals beschreven in stap 4.2.1.1.
      4. Gebruik een oplossingsverwarmer om de oplossing op of in de buurt van fysiologische temperatuur te houden, rond de 34-37 °C.
      5. Laat de aCSF gedurende 10 minuten over de hersenplak trekken. Hierdoor kan de slice zich aanpassen aan de opnameomgeving.
      6. Nadat er 10 minuten zijn verstreken, verplaatst u de uitstroomslang naar de weggooibeker. Verplaats vervolgens de instroomslang naar het bekerglas met de proconvulsieve oplossing. Laat de niet-convulsieve aCSF gedurende 10 minuten uit het perfusiesysteem in het wegwerpbekerglas worden gespoeld.
      7. Breng de uitstroomslang over in het bekerglas met de proconvulsieve oplossing.
      8. Laat de pro-convulsieve oplossing cyclus totdat het experiment is afgelopen.
      9. Als de opnameduur van de plak langer is dan 2 uur, overweeg dan om een andere pro-convulsieve oplossing te bereiden om het glucoseverbruik van de actieve hersenplak te compenseren.
    2. Hersenplakjes uitwisselen
      1. Zet de instroom uit. Schakel de uitstroom daarna 10-15 s uit.
      2. Gebruik een tang om de harp te verwijderen en plaats deze op een weegboot of ander oppervlak.
      3. Gebruik een aangepaste pipet om de hersenplak te extraheren en weg te gooien. Raak de referentie-elektroden of de opname-elektrode-array niet aan (Figuur 2C).
      4. Plaats de instroomslang in het bekerglas met de niet-convulsieve aCSF-oplossing. Plaats de uitstroomslang in de weggooibeker. Laat de in- en uitstroomnaalden in de spaanput zitten. Laat het perfusiesysteem 10 minuten draaien om alle resterende proconvulsieven uit de spaanput en het perfusiesysteem te verwijderen. Begin het experimenteerproces opnieuw met een nieuw hersenplakje (beginnend bij stap 4.1).
  3. Het experiment afronden
    1. Schoonmaken van de rig
      1. Haal respectievelijk de harp, het hersenplakje en de oplossing uit de put.
      2. Koppel de MEA-chip los, plaats deze op een schoon oppervlak en vul de chip goed met gedeïoniseerd water.
      3. Gooi het gedeïoniseerde water weg om eventuele zouten die achtergebleven zijn van de aCSF-oplossingen te verwijderen.
      4. Vul de chip met behulp van een transferpipet goed met een wasmiddeloplossing. Beweeg de punt van de transferpipet in de chipput en richt deze op de opname-elektroden. Knijp snel en herhaaldelijk het wasmiddel in de transferpipet en laat het los om het wasmiddel gedurende 1 minuut krachtig over de opname-elektroden te wassen. Laat het wasmiddel 5-10 minuten rusten.
      5. Verwijder het wasmiddel en spoel de chip vervolgens 4-6 keer goed af met gedeïoniseerd water om de wasmiddeloplossing en eventuele resterende opgeloste stoffen te verwijderen.
      6. Verwijder al het water uit de chipput, plaats vervolgens een antistatisch doekje over de MEA-chip en laat een nacht staan om de chip goed te laten drogen.
      7. Plaats een weegboot of een andere waterdichte plaat op het MEA-opnameplatform waar de MEA-chip eerder rustte. Plaats de harp in het midden van de plaat en plaats de instroom- en uitstroomnaalden aan weerszijden van de harp.
      8. Reinig het perfusiesysteem en de harp door respectievelijk 50 ml water, 50 ml 140-proof ethanol en 200 ml water door de slang in de weggooibeker te sturen.
        OPMERKING: Op dit moment kunnen de perfusiesnelheden worden verhoogd om de reinigingstijd te verkorten, maar de uitstroomsnelheid moet altijd hoger zijn dan de instroomsnelheid om overstroming te voorkomen.
      9. Maak de carbogeenstenen schoon door ze in een beker met gedestilleerd water te leggen en het carbogeen gedurende 5 minuten door de slang te sturen. Laat ze een nacht rusten op een droge, schone ondergrond en dek ze af om stofophoping te voorkomen.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: Er zijn verschillende analysepakketten die worden gebruikt voor het analyseren van elektrofysiologische gegevens die worden geproduceerd door CMOS-HD-MEA's, waaronder BrainWave van 3Brain, Yet Another Spike Sorter (YASS) en aangepaste Python-tools 34,35,36,37. We hebben gegevens geëxtraheerd uit het BrainWave-gegevensbestandsformaat voor gebruik in het Xenon LFP-analyseplatform om de gegevens te genereren die worden gepresenteerd in figuur 4 en figuur 5. Aangepaste Matlab-code werd gebruikt om de gegevens in figuur 6 te analyseren. Protocollen voor het Xenon LFP-analyseplatform zijn openbaar beschikbaar10. De volgende protocolstappen zijn specifiek voor opnames die zijn gemaakt met Brainwave 438; Raadpleeg voor andere systemen de ondersteunende documentatie met betrekking tot die systemen 34,35,36,37. Hieronder vindt u een overzicht van de analysestappen die zijn genomen om de gegevens met dit protocol te produceren. Zie39 voor volledige informatie over het exporteren, visualiseren en analyseren van gegevens, inclusief instructievideo's en alle relevante codebestanden.

  1. Exporteer het opnamebestand voor analyse.
    1. Maak een map voor de gegevensopnamebestanden die worden gedownsampled.
    2. Snijd de afbeelding die tijdens stap 4.1.9 is gemaakt bij om alleen de opnamearray met de hersenplakjes op te nemen.
    3. Open het ExportToHDF5-ChannelSelection.py bestand (dit codebestand is toegankelijk op GitHub onder xenon-lfp-analysis/code-files/3Brain-processing40) en kopieer en plak de URL die bovenaan het venster wordt vermeld in een internetbrowser.
    4. Voer het bestandspad voor het gegevensopnamebestand in en upload de bijgesneden afbeelding van de array die aan de opname is gekoppeld.
    5. Gebruik onder Kanalen selecteren voor export de lassoselectietool om de hippocampus- en neocorticale gebieden te selecteren die worden weergegeven op de bijgesneden afbeelding van de array.
    6. Stel zowel het aantal rijen dat moet worden overgeslagen als het aantal kolommen dat moet worden overgeslagen in op 2.
      OPMERKING: Opnamebestanden zijn vaak groot; Indien geschikt voor de gewenste analyse, kunnen de geëxporteerde gegevens worden gedownsampled. Er zijn opties om ruimtelijk (door rijen en kolommen met opname-elektroden over te slaan) en tijdelijk (door te downsamplen naar een lagere bemonsteringsfrequentie) te downsamplen. In de analyse worden elke 2 rijen en 2 kolommen overgeslagen; Dit maakt het mogelijk om de gegevens ruimtelijk te downsamplen zonder bevooroordeeld te zijn naar bepaalde kanalen. Elk kanaal ligt ver genoeg uit elkaar dat de verschillen in activiteit tussen hen aanzienlijk kunnen zijn; Daarom wordt er geen kanaalmiddeling uitgevoerd. Bij het overslaan van rijen en kolommen van de elektroden worden de gegevens van niet-geselecteerde kanalen niet opgenomen wanneer het uitvoerbestand wordt geëxporteerd.
    7. Stel de downsampling-frequentie in op 300 Hz.
    8. Klik op de knop Kanalen exporteren om het kanaalselectiebestand te genereren.
      OPMERKING: De software slaat het kanaalselectiebestand automatisch op in de map waarin het gegevensopnamebestand is opgeslagen.
    9. Open het ExportToHDF5-ExtractDownsample.py bestand (ook te vinden op GitHub onder xenon-lfp-analysis/code-files/3brain-processing40), plak het bestandspad van de map met de kanaalselectiebestanden en de gegevensopnamebestanden en druk op enter op het toetsenbord om de gedownsamplede versie van het gegevensopnamebestand te genereren.
  2. Gebruik van het analyseplatform
    1. Typ run_lfp_analysis in de opdrachtprompt van de computer en druk op enter om het analyseplatform te openen.
    2. Voer de bestandspaden van de afbeelding en het gedownsamplede opnamebestand in en klik op verzenden.
    3. Selecteer onder Selecteer een tijdbereik voor analyse de volledige opname.
    4. Markeer onder Kanalen voor plots selecteren de hippocampus als Groep-1 en de neocortex als Groep-2.
    5. Stel onder Kanaalraster de drempelwaarde in op 0.06 mV en de tijdsduur op 0.02 s.
    6. Klik op Instellingen toepassen en raster genereren.
    7. Gebruik de rasterplot om verschillende kanalen te verkennen die activiteitspatronen weergeven die van belang zijn.
      OPMERKING: Zie Figuur 4 voor voorbeelden van hoogwaardige aanvalsachtige activiteit (Figuur 4A-D) versus suboptimale activiteit (Figuur 4E-F).

figure-protocol-4
Figuur 4: Voorbeeld van evoluerende epileptiforme activiteit vanuit de 0 Mg, 2+ en 4-AP paradigma's. (A) Voorbeeld rasterplot van de toepassing van aCSF met 0 Mg2+ gedurende ongeveer 40 min. (B) Voorbeeld elektrofysiologische sporen genomen van de neocortex (blauw) en hippocampus (rood) die epileptiforme activiteit aantonen uit het 0 Mg2+ paradigma. (C) Voorbeeld rasterplot van de toepassing 100 mM 4-AP gedurende ongeveer 40 min. (D) Voorbeeld van elektrofysiologische sporen genomen van de neocortex (paars) en hippocampus (groen) die epileptiforme activiteit aantonen van de toepassing van 4-AP. (E) Voorbeeld rasterplot van de toepassing van aCSF met 0 Mg2+ gedurende ongeveer 40 minuten met barstactiviteit in tegenstelling tot aanvalsachtige activiteit zoals gevonden in de andere representatieve sporen. (F) Voorbeeld van elektrofysiologische sporen afkomstig van de neocortex (donkerpaars) en hippocampus (roest) die een suboptimale activiteit aantonen uit het 0 Mg2+ -paradigma, bedoeld om te worden vergeleken met de hoogwaardige aanvalsachtige activiteit die wordt aangetroffen in B en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-5
Figuur 5: Representatieve resultaten van epileptiforme ontladingen van zowel de 0 Mg2+ als 4-AP paradigma's. (A) Voorbeeldgrafieken van een typische neocorticale aanvalsachtige gebeurtenis geïnduceerd door het 0 Mg2+ -paradigma, inclusief (Ai) een spectrogram van een aanvalsachtige gebeurtenis, (Aii) het bijbehorende elektrofysiologische spoor, (Aiii) een 80 Hz hoogdoorlaatfilter toegepast op het spoor van Aii, (Aiiii) en een vergroot deel van het spoor van Aii. (B) Voorbeeldgrafieken van een typische epileptiforme uitbarsting in de hippocampus geïnduceerd door het 0 Mg2+ -paradigma, inclusief (Bi) een spectrogram van de epileptiforme uitbarsting, (Bii) het bijbehorende elektrofysiologische spoor, (Biii) een 80 Hz hoogdoorlaatfilter toegepast op het spoor van Bii, (Biiii) en een vergroot deel van het spoor van Bii (C) Voorbeeldgrafieken van een typische neocorticale aanval-achtige gebeurtenis veroorzaakt door het 4-AP-paradigma, waaronder (Ci) een spectrogram van epileptiforme activiteit, (Cii) het bijbehorende elektrofysiologische spoor, (Ciii) een 80 Hz hoogdoorlaatfilter toegepast op het spoor van Cii, (Ciiii) en een vergroot deel van het spoor van Cii (D) Voorbeeldgrafieken van een hippocampale epileptiforme uitbarsting onder het 4-AP-paradigma, inclusief (Di) een spectrogram van epileptiforme activiteit, (Dii) het bijbehorende elektrofysiologische spoor, (Diii) een 80 Hz hoogdoorlaatfilter toegepast op het spoor van Dii, (Diiii) en een vergroot deel van het spoor van Dii. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 6: Vergelijking van het percentage van het basisvermogen in de verschillende banden over paradigma en hersengebied tijdens stereotypische epileptiforme ontladingen. (A) Het vermogen tijdens epileptiforme ontladingen was significant verschillend tussen de paradigma's en hersengebieden voor de meeste frequentiebanden (2-weg ANOVA met Tukey-test, *P < 0,05, **P < 0,001, ***P < 0,0001). De middelste lijn voor elk vak vertegenwoordigt het gemiddelde, de grenzen van het vak ±1 standaardfout van het gemiddelde (SEM) en de buitenste lijnen ±2 SEM. (B) Zowel paradigma's als hersengebieden vertoonden een beperkt vermogen in banden die verband houden met hoogfrequente activiteit boven 150 Hz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals standaard is bij het visualiseren van activiteit van vele kanalen 1,4,5,10, vinden we het nuttig om eerst een rasterplot te genereren van de gegevens die we met de CMOS-HD-MEA verzamelen (Figuur 4A,C,E). Deze grafiek kan een vogelperspectief creëren van de activiteit in alle opnamekanalen in elk hersensegment door elk kanaal op de y-as en de tijd op de x-as weer te geven. In deze rasterplot vertegenwoordigt elk signaalpunt een kanaal dat de ingestelde LFP-spanningsdrempel heeft overschreden (zie stap 5.2.6 en een eerder gepubliceerd werk10). Dergelijke rasterdiagrammen geven aan wanneer en waar elektrofysiologische activiteit plaatsvindt in ruimte en tijd (Figuur 4A,C,E). Door de gegevens op deze manier te visualiseren, kan de gebruiker optimaal profiteren van de ruimtelijke en temporele resolutie van de mogelijkheden van het CMOS-HD-MEA-systeem. Representatieve neocorticale en hippocampussporen van kanalen die overeenkomen met de rasterplots laten zien hoe de specifieke LFP-gegevens voor elk kanaal ook kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 4B,D,F). Ingezoomde gebeurtenissen van epileptiforme ontladingen worden weergegeven voor verschillende hersengebieden en paradigma's in Figuur 5, en de vergelijking van de relatieve frequentiemachten die we hebben waargenomen van de 0 Mg2+ en de 4-AP paradigma's is samengevat in Figuur 6. Over alle weergegeven frequentiebanden (1-150 Hz) was de aanvalsachtige activiteit in zowel hippocampus- als neocorticale regio's met beide paradigma's significant groter dan de uitgangswaarde, na aftrek van alle 60 Hz elektrische ruis (AC-frequentie in Noord-Amerika) met een digitaal notch-filter.

Bij gebruik van het 0 Mg2+ of het 4-AP paradigma werd vaak krachtige elektrografische aanvalsachtige activiteit waargenomen in de neocorticale regio's. De hippocampusgebieden vertoonden meer variabiliteit tussen hersenplakjes, waarbij sommige hersenplakjes epileptische activiteit vertoonden en andere kortere (~1 s) voorbijgaande ontladingen vertoonden (Figuur 4 en Figuur 5). Het vermogen voor elke opname werd genormaliseerd naar een "rustige" basislijnsectie van 10 s aan het begin van elke opname waarin geen ontladingen werden waargenomen. Alle verdere bespreking van "vermogen" duidt op spectraal vermogen in vergelijking met een controlebasislijn in de steekproef. Neocorticale activiteit bleek krachtiger te zijn in meerdere frequentiebanden onder het 0 Mg2+ paradigma in vergelijking met het 4-AP paradigma. Dit gold voor de frequentiebanden delta (1-4 Hz), theta (4-8 Hz), laag gamma (30-60 Hz) en hoog gamma (60-150 Hz) (Figuur 6). Bovendien vertoonde de hippocampusactiviteit in het 0 Mg2+- paradigma een hoger vermogen in de hoge gammafrequentiebanden (60-150 Hz) in vergelijking met de neocortex in het 0 Mg2+ -paradigma en ook in vergelijking met beide hersengebieden die werden getest in het 4-AP-paradigma (Figuur 6). Hoewel het 4-AP-paradigma in onze onderzoeken minder kracht vertoonde in de meeste frequentiebanden, vergeleken met de 0 Mg2+ -omstandigheden, vertoonden de hippocampus 4-AP-monsters de neiging om meer algehele epileptiforme ontladingen te vertonen (Figuur 4D). We zagen geen verschil tussen hersengebieden of paradigma's bij het analyseren van hoogfrequente activiteit (Figuur 6B). Dit komt waarschijnlijk omdat de opnames zijn gemaakt op een 2D, niet-penetrerende opnamechip, wat betekent dat hoogfrequente activiteit mogelijk niet wordt opgepikt vanwege de afstand tussen de neuronen die de activiteit produceren en de opnameplaatsen van de elektrode. Alles bij elkaar genomen suggereren de hier gepresenteerde resultaten dat bij gebruik van de CMOS-HD-MEA-systemen met 2D CMOS-MEA-chips, men over het algemeen een groter totaal vermogen zal bereiken tijdens epileptiforme ontladingen met behulp van het 0 Mg2+- paradigma, waarbij kwaliteitsgegevens kunnen worden geregistreerd tot aan de hoge gammabanden (van 1 tot 150 Hz). Bovendien suggereren de hier gepresenteerde gegevens dat het 4-AP-model misschien geen goede keuze is met dit systeem als men informatie van de gammabanden met behulp van dit protocol wil bestuderen. Het biedt echter rijke gegevens in de lagere vermogensbanden, terwijl het ook veel epileptiforme ontladingen vertoont. Belangrijk is dat beide modellen met het bovenstaande protocol aanvalsachtige activiteit van hoge kwaliteit zullen vertonen.

Verschillen in de aanvalsmodellen resulteren waarschijnlijk in karakteristiek unieke patronen van geïnduceerde aanvalsachtige activiteit op basis van de cellulaire mechanismen van deze paradigma's en als gevolg van microanatomie van het hersengebied41. 4-AP blokkeert bijvoorbeeld bepaalde klassen van spanningsafhankelijke K+-kanalen (voornamelijk de Kv3-familie), waardoor de duur van neuronale prikkelbaarheid wordt verlengd en er binnen enkele minuten na blootstelling epileptiforme activiteit optreedt in de hippocampus 42,43,44,45,46. De neocortex heeft echter doorgaans een veel langer vertraagd begin van epileptiforme activiteit dan de hippocampus wanneer deze wordt blootgesteld aan 4-AP41. Aan de andere kant induceert het 0 Mg2+-paradigma epileptiforme activiteit voornamelijk door het Mg2+-blok van NMDA-receptoren in glutamaterge neuronen weg te spoelen, wat resulteert in vroege neocorticale epileptiforme activiteit 47,48,49,50. Hoewel er significante verschillen waren tussen hersengebieden en paradigma's voor veel van de gemarkeerde groepen, bleven er ook enkele belangrijke overeenkomsten tussen de paradigma's en hersengebieden. Het vermogen in zowel de alfa- als de bèta-frequentiebanden was vergelijkbaar tussen hersengebieden en paradigma's, en binnen hippocampusregio's vertoonden de paradigma's vergelijkbare prestaties in de deltaband (Figuur 6). Bovendien werd zoals verwacht een algehele toename van het vermogen waargenomen in vergelijking met de uitgangswaarde voor alle frequenties (1-150 Hz) tijdens epileptiforme activiteit (figuur 5 en figuur 6). Een laatste opmerkelijke observatie van de neocorticale gebieden tijdens blootstelling aan 4-AP was het gestreepte patroon dat werd waargenomen in de spectrogrammen die een grotere activiteit voor hogere frequenties afbeeldden tijdens de ictale start, gevolgd door een geleidelijke afname van de frequentie naarmate de activiteit vorderde (Figuur 5C), wat mogelijk wijst op een hoge interneuronale synchronie tijdens de ictale start.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol bevat specifieke richtlijnen met betrekking tot acuut beheer van hersenplakjes die veelvoorkomende problemen aanpakken waarmee CMOS-HD-MEA-gebruikers worden geconfronteerd, namelijk geluidsontwikkeling onder de hersenplak en het handhaven van een gezonde omgeving voor de hersenschijf. Ruisontwikkeling onder de slice treedt op wanneer de slice niet goed aan de array is gehecht; Als de hersenplak niet voldoende wordt gehecht, kunnen er luchtbellen onder de plak ontstaan, wat resulteert in ruis. Dit zal resulteren in het onvermogen om gegevens te verkrijgen. Om deze uitdagingen te verminderen, legt het protocol de nadruk op twee cruciale stappen: ten eerste, zorgen voor de juiste oriëntatie van de harp tijdens het plaatsen om verdringen door instroomperfusie te voorkomen (stap 4.1.4), en ten tweede, het gebruik van een antistatisch doekje om overtollig aCSF rond de elektroden te verwijderen, waardoor een effectieve plakhechting wordt bevorderd (stappen 4.1.5-4.1.7). Een ander veelvoorkomend probleem dat in het protocol wordt aangepakt, is de hydrofobiciteit van de chip, wat kan leiden tot luchtbelvorming en ruis kan veroorzaken tijdens opnames. Stappen zoals ethanolbehandeling gevolgd door spoelen met gedeïoniseerd water worden aanbevolen om deze problemen te verlichten (stappen 3.1.2, 3.1.3 en 3.1.6). Als het probleem zich echter blijft voordoen, zijn er aanvullende stappen die kunnen worden genomen. Vul de chip goed met 140-proof ethanol en gebruik een penseel om de array lichtjes te borstelen gedurende 30 s tot 60 s. Verwijder de ethanol en spoel de chip drie keer goed af met gedeïoniseerd water. Vul daarna het putje met aCSF en ga verder met het protocol bij stap 4.

Het handhaven van een gezonde omgeving voor het hersensegment is van vitaal belang en wordt beheerd door de juiste plaatsing van de in- en uitstroomnaalden en de stroomsnelheid van het perfusiesysteem (stap 4.2.1). Het is absoluut noodzakelijk om de plak op de juiste manier van zuurstof te voorzien en de meest effectieve perfusiesnelheid23,51 te vinden. Vanwege deze problemen worden interfacekamers vaak gebruikt voor opnames van acute hersenplakjes en zorgen ze voor een stabielere oxygenatie. Er is echter gemeld dat opname met interfacekamers de extracellulaire ruimte tussen neuronen comprimeert, wat de fysiologie van het plakje in de loop van de tijd kan veranderen 24,52,53. De dynamiek van de oppervlaktespanning van die veranderde fysiologie resulteert in een hogere elektrische gevoeligheid van de neuronen54. Deze extra prikkelbaarheid verhoogt de kans op epileptische gebeurtenissen en andere interessante LFP's. Ter vergelijking: ondergedompelde kamers, waarmee de meeste CMOS-HD-MEA-platforms werken, kunnen efficiënter medicijnen en glucose afleveren aan de plak23,51. Om een gezonde omgeving voor de plak te behouden tijdens een opnamesessie die meer dan 2 uur zou duren met CMOS-HD-MEA-platforms, is het nuttig om een andere pro-convulsieve oplossing te hebben voorbereid (stap 4.2.1.9). Dit zorgt ervoor dat het plakje voldoende glucose heeft om activiteit te blijven produceren.

Het gebrek aan ruimtelijke resolutie kan een grote beperking zijn in de elektrofysiologie23,55. Patch-clamping is bijvoorbeeld een techniek die vaak wordt gebruikt in de elektrofysiologie en die veel details kan geven over hoe een enkele cel zich gedraagt tijdens netwerkactiviteit; Een beperking van patch-clamping is echter dat de opname wordt uitgevoerd vanuit een enkele cel en standaard een enkele locatie. Patch-clamping kan worden gebruikt om netwerkactiviteit te bestuderen, maar het biedt een vrij beperkt ruimtelijk beeld van de netwerkactiviteit 41,56. Sommige beeldvormingstechnieken bieden een breed ruimtelijk detail van neuronale activiteit, zoals genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren; Ze doen dit echter ten koste van tijdelijke resolutie 57,58,59. Multimodale benaderingen, zoals enkel- of meerkanaals elektrode-opnames, kunnen worden gecombineerd met calciumbeeldvorming om een verhoogde spatiotemporele resolutie te bereiken; De ruimtelijke resolutie van de elektrofysiologische opname is echter nog steeds beperkt tot enkele locaties60,61. Bij correct gebruik stelt de CMOS-HD-MEA-technologie gebruikers in staat deze beperkingen te overwinnen door op te nemen met een hoge ruimtelijke dichtheid (elektroden worden doorgaans 20-200 μm uit elkaar geplaatst) vanuit meerdere hersengebieden tegelijk (Figuur 4). CMOS-HD-MEA-gegevens kunnen onderzoekers in staat stellen om de zich voortplantende activiteitspatronen in het hersensegment te differentiëren en te karakteriseren met meer detail dan de meeste andere opnametechnieken 10,62,63. Hoewel de CMOS-HD-MEA-technologie een uitstekend vermogen heeft om ruimtelijke kaarten te maken met hoge temporele details64, zijn er beperkingen, zoals het onvermogen om betrouwbaar op te nemen van afzonderlijke cellen met behulp van corticale plakjes vanwege het gebruik van niet-penetrerende 2D-arrays en het onvermogen om te worden gebruikt voor in vivo experimenten. CMOS-HD-MEA-systemen registreren doorgaans alleen lokale veldpotentialen van corticale plakjes; Ze kunnen echter extracellulaire actiepotentialen op sommige kanalen opvangen met hoogwaardige plakpreparaten, hoewel dit vermogen onbetrouwbaar kan zijn. De activiteit van eencellige eenheden kan worden onderzocht op de opgenomen kanalen van het CMOS-HD-MEA-systeem met behulp van een hoogdoorlaatfilter (~50 Hz hoogdoorlaat), gecombineerd met software voor het sorteren van spikes 65,66,67. Het is de moeite waard erop te wijzen dat het mogelijk is om micro-elektrode-opnames te combineren met CMOS-HD-MEA-systemen om mogelijk eencellige informatie te verkrijgen vanaf een paar locaties, gelaagd met de rijke CMOS-HD-MEA-informatie5. De huidige methode met niet-penetrerende 2D-chips wordt beperkt door de moeilijkheid om activiteit met een hogere frequentie (150-500 Hz) in corticale hersengebieden te detecteren. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de afstand tussen de neuronen die de activiteit produceren en de opname-elektroden (Figuur 6B). Deze uitdaging kan worden overwonnen door gebruik te maken van nieuwe doordringende 3D-CMOS-HD-MEA-chips, die opnemen vanuit het hersenplakje en niet alleen aan het oppervlak68.

Met behulp van het bovenstaande protocol hebben we voorbeeldgegevens gegenereerd om de hoogwaardige LFP-signalen in de vorm van aanvalsachtige activiteit aan te tonen die met deze instrumenten kunnen worden bereikt (Figuur 4 en Figuur 5). We hebben aangetoond dat epileptische activiteit kan worden waargenomen met verschillende registratieparadigma's (met name 4-AP en 0 Mg2+) met behulp van CMOS-HD-MEA-systemen, ondanks idiosyncratische verschillen tussen de paradigma's.

Samenvattend bieden het protocol en de voorbeeldgegevens die worden gepresenteerd met behulp van de CMOS-HD-MEA een routekaart waarmee high-fidelity ruimtelijke en temporele LFP-gegevens kunnen worden verzameld. Toekomstige toepassingen van deze techniek zijn onder meer het toepassen van dit protocol op aanvullende paradigma's die epileptiforme activiteit induceren en het integreren van CMOS-HD-MEA met aanvullende technieken, zoals beeldvorming. Deze studies zullen ongetwijfeld helpen bij ons begrip van menselijke epileptische aandoeningen met behulp van deze eenvoudige hersenplakmodellen69. Uitbreiding van dit protocol kan bijvoorbeeld een inzichtelijk kruisonderzoek bieden van elektrofysiologisch gedrag en genetische kartering van verschillende diermodellen van epilepsie met mutaties in klinisch relevante genen70. Hoewel we ons hebben gericht op epileptiforme activiteit, kan andere belangrijke netwerkactiviteit, zoals potentiëring op lange termijn, ook met ongekende ruimtelijke resolutie worden bestudeerd met behulp van CMOS-HD-MEA-systemen. We hopen dat dit protocol en deze technologie zullen worden geïmplementeerd om anderen in het veld te helpen de uitdagingen op het gebied van gegevensverzameling te overwinnen en nauwkeurigere onderzoeksmethoden te ontwikkelen om verschillende neurologische aandoeningen, zoals epilepsie, te begrijpen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn verbonden aan dit onderzoek.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken voormalige en huidige Parrish-lableden voor hun bewerkingen aan dit manuscript. We willen ook Alessandro Maccione van 3Brain bedanken voor zijn feedback op dit werk. Dit werk werd gefinancierd door een AES/EF Junior Investigator Award en door de Brigham Young University Colleges of Life Sciences and of Physical and Mathematical Sciences.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2D WorkbenchCloudrayLM04CLLD26B
4-AminopyridineSigma-Aldrich275875
Accura Chip3BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
AgaroseThermo Fisher ScientificBP160-100
Vibration isolation tableKinetic Systems91010124
Beaker for the slice holding chamber, 270 mLVWR10754-772
BioCam3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Brainwave Software3BrainVersion 4CMOS-HD-MEA software
Calcium ChlorideThermo Fisher ScientificBP510-500
CarbogenAirgasX02OX95C2003102
CarbogenAirgas12005
Carbogen StonesSupelco59277
CompresstomePrecissionaryVF-300-0Z
ComputerDellPrecission3650
Crocodile Clip Grounding CablesJWQIDIB06WGZG17W
DetergentMetrex10-4100-0000
D-GlucoseMacron Fine Chemicals4912-12
Dihydrogen Sodium PhosphateThermo Fisher ScientificBP329-500
DinoCamDino-LiteAM73915MZTL
EthanolThermo Fisher ScientificA407P-4
ForcepsFine Science Tools11980-13
Hot plateThermo Fisher ScientificSP88857200
Ice MachineHoshizakiF801MWH
Inflow and outflow needlesJensen GlobalJG 18-3.0X
Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27B
IsofluorineDechra08PB-STE22002-0122
Kim WipesThermo Fisher Scientific06-666
Magnesium ChlorideThermo Fisher ScientificFLM33500
MicropipetsGilsonF144069
Mili-Q Water FilterMili-QZR0Q008WW
PaintbrushDaler RowneyAF85 Round: 0
Paper FilterWhatmanEW-06648-24
ParafilmAmerican National CanPM996
Perfusion SystemMulti Channel SystemPPS2
PipetorThermo Fisher ScientificFB14955202
Platinum Harp3Brain3Brain
Potassium ChlorideThermo Fisher ScientificP330-3
Razor bladePersonnaBP9020
ScaleMetter ToledoAB204
ScissorsSolingen92008
Slice Holding ChamberCustomCustomCustom 3D Printer Design, available upon request
Sodium BicarbonateMacron Fine Chemicals7412-06
Sodium ChlorideThermo Fisher ScientificS271-3
Temperature Control BoxWarner InstrumentsTC344B
Transfer PipettesGenesee Scientific30-200
TubingTygonB-44-3 TPE
Vibratome VZ-300PrecissionaryVF-00-VM-NC
Weigh BoatElectron Microscopy Sciences70040

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Obien, M. E. J., Frey, U. Large-scale, high-resolution microelectrode arrays for interrogation of neurons and networks. Adv Neurobiol. 22, 83-123 (2019).
  2. Schroter, M., et al. Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays. MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).
  3. Miccoli, B., et al. High-density electrical recording and impedance imaging with a multi-modal CMOS multi-electrode array chip. Front Neurosci. 13, 641(2019).
  4. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471(2023).
  5. Ferrea, E., et al. high-resolution electrophysiological imaging of field potentials in brain slices with microelectronic multielectrode arrays. Front Neural Circuits. 6, 80(2012).
  6. Gagliano, G., et al. Non-linear frequency dependence of neurovascular coupling in the cerebellar cortex implies vasodilation-vasoconstriction competition. Cells. 11 (6), 1047(2022).
  7. Goodchild, S. J., et al. Molecular pharmacology of selective Na(V)1.6 and dual Na(V)1.6/Na(V)1.2 channel inhibitors that suppress excitatory neuronal activity ex vivo. ACS Chem Neurosci. 15 (6), 1169-1184 (2024).
  8. Hu, X., Khanzada, S., Klutsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834(2022).
  9. Kim, S., et al. Alteration of neural network and hippocampal slice activation through exosomes derived from 5XFAD nasal lavage fluid. Int J Mol Sci. 24 (18), 14064(2023).
  10. Mahadevan, A., Codadu, N. K., Parrish, R. R. Xenon LFP analysis platform is a novel graphical user interface for analysis of local field potential from large-scale MEA recordings. Front Neurosci. 16, 904931(2022).
  11. Medrihan, L., Ferrea, E., Greco, B., Baldelli, P., Benfenati, F. Asynchronous GABA release is a key determinant of tonic inhibition and controls neuronal excitability: A study in the synapsin II-/- mouse. Cereb Cortex. 25 (10), 3356-3368 (2015).
  12. Monteverdi, A., Di Domenico, D., D'Angelo, E., Mapelli, L. Anisotropy and frequency dependence of signal propagation in the cerebellar circuit revealed by high-density multielectrode array recordings. Biomedicines. 11 (5), 1475(2023).
  13. Obien, M. E. J., Hierlemann, A., Frey, U. Accurate signal-source localization in brain slices by means of high-density microelectrode arrays. Sci Rep. 9 (1), 788(2019).
  14. Thouta, S., et al. Pharmacological determination of the fractional block of Nav channels required to impair neuronal excitability and ex vivo seizures. Front Cell Neurosci. 16, 964691(2022).
  15. Tognolina, M., Monteverdi, A., D'Angelo, E. Discovering microcircuit secrets with multi-spot imaging and electrophysiological recordings: The example of cerebellar network dynamics. Front Cell Neurosci. 16, 805670(2022).
  16. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays. Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  17. Maccione, A., et al. Experimental investigation on spontaneously active hippocampal cultures recorded by means of high-density MEAs: Analysis of the spatial resolution effects. Front Neuroeng. 3, 4(2010).
  18. van Vliet, E., et al. Electrophysiological recording of re-aggregating brain cell cultures on multi-electrode arrays to detect acute neurotoxic effects. Neurotoxicology. 28 (6), 1136-1146 (2007).
  19. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2022, 3111-3114 (2022).
  20. Veleanu, M., et al. Modified climbing fiber/Purkinje cell synaptic connectivity in the cerebellum of the neonatal phencyclidine model of schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (21), e2122544119(2022).
  21. Giansante, G., et al. Neuronal network activity and connectivity are impaired in a conditional knockout mouse model with PCDH19 mosaic expression. Mol Psychiatry. , (2023).
  22. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), e51870(2014).
  23. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  24. Hill, M. R., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. J Neurosci Methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58 (Suppl 4), 40-52 (2017).
  26. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), 2056(2010).
  27. Lin, C. H., Lee, J. K., LaBarge, M. A. Fabrication and use of microenvironment microarrays (MEArrays). J Vis Exp. (68), 4152(2012).
  28. Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and modulation of epileptiform activity in rodent brain slices coupled to microelectrode arrays. J Vis Exp. 135, 57548(2018).
  29. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, site-specific transfection of adherent cells with siRNA using microelectrode arrays (MEA). J Vis Exp. 67, e4415(2012).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  31. Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining acute brain slices. Bio Protoc. 8 (2), e2699(2018).
  32. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. J Vis Exp. 132, 53825(2018).
  33. Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal hippocampal slices of the mouse brain. J Vis Exp. (163), 61753(2020).
  34. 3Brain. , Available from: https://www.3brain.com/ (2022).
  35. Bridges, D. C., Tovar, K. R., Wu, B., Hansma, P. K., Kosik, K. S. MEA Viewer: A high-performance interactive application for visualizing electrophysiological data. PLoS One. 13 (2), e0192477(2018).
  36. Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (27), 7337-7344 (2016).
  37. Maccione, A., et al. Microelectronics, bioinformatics and neurocomputation for massive neuronal recordings in brain circuits with large scale multielectrode array probes. Brain Res Bull. 119 (Pt B), 118-126 (2015).
  38. 3Brain. , BrainWave 4 https://www.3brain.com/products/software/brainwave4 (2022).
  39. Mahadevan, A. Xenon LFP Analysis. , https://xenon-lfp-analysis.readthedocs.io/en/latest/Installation.html (2022).
  40. Mahadevan, A. xenon-lfp-analysis github. , https://github.com/MicroBrew09/xenon-lfp-analysis (2022).
  41. Codadu, N. K., et al. Divergent paths to seizure-like events. Physiol Rep. 7 (19), e14226(2019).
  42. Kirsch, G. E., Drewe, J. A. Gating-dependent mechanism of 4-aminopyridine block in two related potassium channels. J Gen Physiol. 102 (5), 797-816 (1993).
  43. Levesque, M., Salami, P., Behr, C., Avoli, M. Temporal lobe epileptiform activity following systemic administration of 4-aminopyridine in rats. Epilepsia. 54 (4), 596-604 (2013).
  44. Myers, T. L., Gonzalez, O. C., Stein, J. B., Bazhenov, M. Characterizing concentration-dependent neural dynamics of 4-Aminopyridine-induced epileptiform activity. Epilepsy J. 4 (2), 128(2018).
  45. Perreault, P., Avoli, M. Physiology and pharmacology of epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 65 (4), 771-785 (1991).
  46. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
  47. Chen, Y., Chad, J. E., Cannon, R. C., Wheal, H. V. Reduced Mg2+ blockade of synaptically activated N-methyl-D-aspartate receptor-channels in CA1 pyramidal neurons in kainic acid-lesioned rat hippocampus. Neuroscience. 88 (3), 727-739 (1999).
  48. Fujiwara-Tsukamoto, Y., Isomura, Y., Takada, M. Comparable GABAergic mechanisms of hippocampal seizure-like activity in posttetanic and low-Mg2+ conditions. J Neurophysiol. 95 (3), 2013-2019 (2006).
  49. Swartzwelder, H. S., Anderson, W. W., Wilson, W. A. Mechanism of electrographic seizure generation in the hippocampal slice in Mg2+-free medium: the role of GABAa inhibition. Epilepsy Res. 2 (4), 239-245 (1988).
  50. Trevelyan, A. J., Graham, R. T., Parrish, R. R., Codadu, N. K. Synergistic positive feedback mechanisms underlying seizure initiation. Epilepsy Curr. 23 (1), 38-43 (2023).
  51. Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 103-111 (1998).
  52. Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. J Neurosci Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  53. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  54. Andrew, R. D., et al. The critical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37 (Suppl 1), 83-101 (2022).
  55. Devonshire, I. M., Dommett, E. J., Grandy, T. H., Halliday, A. C., Greenfield, S. A. Environmental enrichment differentially modifies specific components of sensory-evoked activity in rat barrel cortex as revealed by simultaneous electrophysiological recordings and optical imaging in vivo. Neuroscience. 170 (2), 662-669 (2010).
  56. Parrish, R. R., Codadu, N. K., Mackenzie-Gray Scott, C., Trevelyan, A. J. Feedforward inhibition ahead of ictal wavefronts is provided by both parvalbumin- and somatostatin-expressing interneurons. J Physiol. 597 (8), 2297-2314 (2019).
  57. Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Curr Opin Neurobiol. 50, 171-178 (2018).
  58. Yaksi, E., Jamali, A., Diaz Verdugo, C., Jurisch-Yaksi, N. Past, present and future of zebrafish in epilepsy research. FEBS J. 288 (24), 7243-7255 (2021).
  59. He, M. F., et al. Ex vivo calcium imaging for drosophila model of epilepsy. J Vis Exp. 200, 65825(2023).
  60. Driscoll, N., et al. Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale. Commun Biol. 4 (1), 136(2021).
  61. Parrish, R. R., Grady, J., Codadu, N. K., Trevelyan, A. J., Racca, C. Simultaneous profiling of activity patterns in multiple neuronal subclasses. J Neurosci Methods. 303, 16-29 (2018).
  62. Valderhaug, V. D., et al. Criticality as a measure of developing proteinopathy in engineered human neural networks. bioRxiv. , (2020).
  63. Multi-electrode array (MEASs) to investigate pathogenetic disease mechanisms and pharmacological properties in iPSC-derived neurons modelling neuropsychiatric diseases. Carleo, G., Lee, Y. -S., Secondo, A., Miceli, F., Taglialatela, M. 2022 IEEE International Conference on Metrology for Extended Reality, Artificial Intelligence and Neural Engineering (MetroXRAINE), , Rome, Italy. 667-672 (2022).
  64. Ruz, I. D., Schultz, S. R. Localising and classifying neurons from high density MEA recordings. J Neurosci Methods. 233, 115-128 (2014).
  65. Franke, F., Natora, M., Boucsein, C., Munk, M. H. J., Obermayer, K. An online spike detection and spike classification algorithm capable of instantaneous resolution of overlapping spikes. J Comput Neurosci. 29 (1-2), 127-148 (2010).
  66. Vollgraf, R., Obermayer, K. Improved optimal linear filters for the discrimination of multichannel waveform templates for spike-sorting applications. IEEE Signal Processing Letters. 13 (3), 121-124 (2006).
  67. Muller, J., et al. High-resolution CMOS MEA platform to study neurons at subcellular, cellular, and network levels. Lab Chip. 15 (13), 2767-2780 (2015).
  68. Mapelli, L., et al. implementation, and functional validation of a new generation of microneedle 3D high-density CMOS multi-electrode array for brain tissue and spheroids. bioRxiv. , (2022).
  69. Reddy, D. S., Kuruba, R. Experimental models of status epilepticus and neuronal injury for evaluation of therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 14 (9), 18284-18318 (2013).
  70. Parrish, R. R., Trevelyan, A. J. Stress-testing the brain to understand its breaking points. J Physiol. 596 (11), 2033-2034 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CMOS MEA systeemlokale veldpotentialenelektrofysiologische registratiestatus epilepticusacute hersensnijdepro convulsante oplossingnul magnesiumparadigma

Gerelateerde artikelen