Methodenartikel

Het opzetten van een varkensmodel om de dynamische conservering en transplantatie van de baarmoeder te bestuderen

706 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67357

⸱

20 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of plastic and reconstructive surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Gynecology and Obstetrics, CHU de Rennes, University of Rennes, 5Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital, 6Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 7SITI Laboratory, UMR1236 INSERM, Établissement Français du Sang, University of Rennes

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een gedetailleerd en reproduceerbaar varkensbaarmoedermodel beschreven, van chirurgische verkrijging tot het initiëren van machineperfusie, waardoor de studie van baarmoederconservering bij transplantatie mogelijk is.

Samenvatting

Tot op heden is baarmoedertransplantatie de enige optie voor vrouwen met absolute baarmoederonvruchtbaarheid, zoals vrouwen met het Rokitansky-syndroom, om zwanger te worden en te bevallen. Ondanks de groeiende belangstelling voor baarmoedertransplantatie in de afgelopen jaren, vereisen verschillende kwesties nog verder onderzoek, waaronder ischemie-reperfusieschade en de impact ervan op de kwaliteit en afstoting van het transplantaat. Recente literatuur heeft gewezen op een trombotisch complicatiepercentage tot 20% na baarmoedertransplantatie. Dit type complicatie kan het gevolg zijn van door hypoxie geïnduceerde endotheelcelbeschadiging, wat vaak leidt tot afstoting van het baarmoedertransplantaat. Hypoxie wordt geïnduceerd tijdens statische koude opslag, wat de gouden standaard blijft voor het behoud van transplantaten bij solide orgaantransplantatie. Onlangs is aangetoond dat dynamische conservering met behulp van machineperfusie de langdurige opslag van conventionele en marginale organen verbetert door ischemisch en hypoxisch letsel te verminderen. In dit protocol willen we elke chirurgische stap beschrijven die betrokken is bij het verkrijgen van baarmoeders bij varkens en dynamische conservering, op basis van beide baarmoedersteeltjes, om de verbinding en initiatie van het machineperfusieprotocol mogelijk te maken.

Inleiding

Baarmoedertransplantatie (UTx) heeft zich de afgelopen tien jaar aanzienlijk ontwikkeld, waarbij verschillende teams klinische onderzoeksprogramma's zijn gestart. Tot op heden is de belangrijkste indicatie van UTx absolute onvruchtbaarheid van de baarmoeder als gevolg van agenesie van de baarmoeder, waaronder het Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) -syndroom. Het MRKH-syndroom is een aangeboren aandoening met een prevalentie van één op de 5.000 levendgeborenen bijvrouwen1. UTx kan mogelijk aanvullende oorzaken van onvruchtbaarheid aanpakken, waaronder die als gevolg van hysterectomie als gevolg van kwaadaardige aandoeningen, postpartumbloeding, baarmoederfibromen, infectieuze gevolgen en verschillende aangeboren afwijkingen. Dit suggereert dat ongeveer 1 op de 500 vrouwen in aanmerking kan komen voor UTx.

De allereerste klinische UTx vond plaats in 2000 in Saoedi-Arabië2, maar vasculaire complicaties leidden drie maanden later tot een hysterectomie. Sindsdien zijn er verschillende gevallen van UTx uitgevoerd, gebaseerd op zowel levende als overleden donoren, wat resulteerde in meer dan 80 levendgeborenen 3,4. Net als op het gebied van solide orgaantransplantatie en gevasculariseerde samengestelde allotransplantaties (VCA), is immuunafstoting een belangrijke uitdaging in UTx. 5 Verschillende factoren kunnen leiden tot afstoting van het transplantaat, waaronder falen van de microbloedsomloop en veneuze stasis, die beide kunnen leiden tot trombotische complicaties. In een recent overzicht waarin baarmoedervascularisatie bij transplantatie werd bestudeerd, rapporteerden Kristek et al. tot 15% arteriële trombose en 5% veneuze trombose6. Bovendien zijn koude en warme ischemie kritieke factoren die moeten worden aangepakt voor een succesvolle transplantatie, aangezien ischemie-reperfusieschade (IRI) kan leiden tot transplantaatdisfunctie en acute afstoting 7,8. Myocyten reageren op ischemische stress door lactaat te produceren gedurende maximaal 6 uur9, waarna spiercelbeschadiging onomkeerbaar is. De impact van koude ischemie op het myometrium is gedocumenteerd in klinische studies, en het is aangetoond dat het gebruik van intracellulaire oplossing van de Universiteit van Wisconsin tijdens statische koude opslag (SCS) de conservering verbetert met een betere contractiele respons op prostaglandine en hogere ATP-concentraties in vergelijking met Ringer's acetaatoplossing10. De impact van warme en koude ischemie blijft echter slecht onderzocht in UTx.

SCS blijft de gouden standaard voor het behoud van VCA, inclusief de baarmoeder, en voor de meeste solide orgaantransplantaties. In de afgelopen jaren hebben aanzienlijke ontwikkelingen op het gebied van machineperfusiesystemen en conserveringsoplossingen echter geleid tot een paradigmaverschuiving. Er is nu sterk bewijs dat dynamische machineperfusie het behoud van gezonde en marginale vaste organen kan verbeteren en verlengen 11,12,13,14,15. Deze techniek wordt nu veel gebruikt in de klinische praktijk voor long-, hart-, lever- en niertransplantatie 14,16,17,18. Dynamisch orgaanbehoud toonde meerdere voordelen aan, waaronder het minimaliseren van koude ischemie en hypoxieletsels door een continue zuurstof- en nutriëntentoevoer te bieden, toxische metabolieten op te ruimen en de kwaliteit en levensvatbaarheidsparameters van het transplantaatte verbeteren 12,19. Er zijn meerdere modaliteiten ontwikkeld, variërend van onderkoelde tot normotherme machineperfusie (met of zonder zuurstofdragers), met verschillende perfusaten beschikbaar, maar slechts enkele zijn getest op de baarmoeder20. Om de substantiële bijdrage van dergelijke onderzoeksperspectieven te garanderen, zijn relevante preklinische chirurgische modellen van cruciaal belang.

In dit werk wordt subnormotherme machineperfusie (SNMP) gebruikt als een methode voor het behoud van zuurstofrijke dynamische organen bij kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) door een perfusaat door een rolpomp en een oxygenator te laten circuleren. Er wordt een varkensmodel gebruikt dat relevant is voor studies naar UTx en conservering vanwege de overeenkomsten met het menselijke voortplantingssysteem in termen van anatomie, fysiologie en vaatgrootte21,22. De baarmoeder wordt verkregen na dood van de bloedsomloop, wat relevant is voor donatie na hartdood en de mogelijkheid suggereert van een vertraging van de verkrijging na alle andere relevante vaste organen 23,24. Bovendien vergemakkelijkt dit model de ontwikkeling van studies naar baarmoederbehoud binnen gevestigde transplantatielaboratoria die zich richten op andere organen, waarbij de "3V's"-principes worden toegepast25. Het doel is om een nieuw conserveringsmodel op te stellen op basis van baarmoedersteeltjes en de betrouwbaarheid ervan te beoordelen voor dynamische conservering. Alle procedurestappen zijn gedetailleerd, van de hysterectomie tot de conservering, en omvatten de belangrijkste punten voor het gebruik van SNMP.

Het hieronder beschreven protocol ging vooraf aan een voorbereidend experiment op basis van een enkele pomp en een "Y-tubing" instroomsysteem voor beide baarmoederslagaders (aanvullende figuur 1). Na 4 h-SNMP won het orgaan meer dan 50% van zijn oorspronkelijke gewicht. Stroming, druk, weerstand en gewichtsvariatie worden weergegeven in aanvullende figuur 2. Een enkel perfusiesysteem dat in twee instromen was gescheiden, liet niet toe om elk debiet aan de druk van elke kant te moduleren. In dit geval leidde SNMP tot aanzienlijk oedeem in de helft van het orgaan (aanvullende figuur 3). Dit systeem bleek ongeschikt voor het baarmoedermodel, deels omdat het niet als een perfect symmetrisch model moet worden beschouwd. Daarom werden in dit protocol twee systemen van machineperfusie gebruikt, één voor elke baarmoederslagader.

Protocol

Alle dieren kregen humane zorg volgens de National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, en de protocollen werden goedgekeurd door het Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). In totaal werden 6 vrouwelijke Yucatan-minivarkens met een gewicht van 30-40 kg gebruikt voor het verkrijgen van baarmoeders, waarbij vier baarmoeders SNMP ondergingen. Alle dieren werden vóór euthanasie gehepariniseerd met één volledige dosis (100 IE/kg). Orgaanverkrijging vond postmortaal plaats met minder dan 60 minuten warme ischemie. Andere organen kunnen voor verschillende onderzoeken van dezelfde donor zijn geoogst, volgens de "3V's"-principes25. Zie de Materiaaltabel voor details over alle reagentia en apparatuur die in het protocol worden gebruikt.

1. Preoperatieve voorbereiding (dag voor de operatie)

  1. Bereid de perfusaatoplossing voor. Voor subnormotherme machineperfusie werd een voor VCA geoptimaliseerde Steen+ oplossing gebruikt26,27. Er werd één liter oplossing per baarmoeder gebruikt en de samenstelling wordt beschreven in tabel 1.
    OPMERKING: Een grote hoeveelheid natriumhydroxide wordt aan het perfusaat toegevoegd met als doel een pH van ongeveer 7,5-7,6 te bereiken. Deze waarde is uitdrukkelijk hoog, maar noodzakelijk omdat de pH de neiging zal hebben te dalen als de machine wordt gecirculeerd en van zuurstof wordt voorzien met een carlogeenmengsel (95% zuurstof; 5% kooldioxide).
  2. Stel het perfusiesysteem van de machine in (Afbeelding 1). Controleer op lekken en luchtbellen wanneer perfusaat wordt gecirculeerd.

2. Postmortale verkrijging van de baarmoeder

OPMERKING: Om donatie na hartdood en/of postmortale verkrijging te simuleren, moet het dier worden geëuthanaseerd volgens de lokale IACUC-richtlijnen. Verbloeding verdient de voorkeur boven intraveneuze injectie met pentobarbital om toxiciteit te voorkomen die het onderzoek zou kunnen verstoren.

  1. Plaats het geëuthanaseerde dier in rugligging. Schrob de buikstreek en plaats steriele gordijnen.
  2. Maak een mediane infra navelstrengincisie van 10 cm met een #20 mes.
  3. Open het onderhuidse weefsel en de aponeurose met een monopolaire elektrische scalpel.
    OPMERKING: Er moet op worden gelet dat de darmen niet worden beschadigd door het openen van de buikholte.
  4. Zet de dunne darm opzij met een chirurgisch gaasje en leg de baarmoeder bloot.
    OPMERKING: De anatomie van de baarmoeder van het gebruikte model wordt weergegeven in figuur 2A.
  5. Ga op dezelfde manier te werk voor de linker- en rechterkant als volgt:
    1. Identificeer de baarmoedervaten.
      OPMERKING: De baarmoederader bevindt zich lateraal ten opzichte van de baarmoederslagader (Figuur 3).
    2. Maak met een rechthoekige tang een opening in het brede ligament lateraal naar de baarmoederader.
    3. Breng door deze opening 2-0 zijden stropdassenhechtingen in om de eierstokvaten te binden en de baarmoeder los te maken van het omringende bindweefsel in het brede ligament met behulp van cauterisatie.
    4. Ligate de baarmoeder-eierstokvaten met 2-0 zijden stropdassen en verwijder de eierstok en buis.
    5. Skeletaliseer baarmoedervaten en verdeel ze zo dicht mogelijk bij de interne darmvaten.
      OPMERKING: Er moet op worden gelet dat de steel zo lang mogelijk wordt gehouden om canulatie te vergemakkelijken en te anticiperen op het terugtrekken van de pedikel nadat deze is doorgesneden.
    6. Herhaal stap 2.5.1-2.5.5 aan de andere kant.
  6. Verwijder de baarmoeder door de baarmoederhals door te snijden met een monopolaire elektrische scalpel.
    OPMERKING: Gebruik een lange contacttijd om een goede coagulatie van het baarmoederhalsvat te garanderen, waardoor lekkage tijdens perfusie wordt voorkomen.

3. Voorbereiding op perfusie

  1. Verwijd op een bijzettafel beide baarmoederslagaders met behulp van een microchirurgische dilatator en breng een angiokatheter in. Zet de cannulatie vast met 3-0 zijden stropdassen (Figuur 2B).
    OPMERKING: Hier werd een 18 G angiokatheter gebruikt voor alle slagaders. Er moet voor worden gezorgd dat de katheter niet te ver wordt ingebracht om selectieve canulatie te voorkomen, aangezien de vertakking relatief dichtbij is. De baarmoederaders worden niet gecanuleerd, omdat de veneuze uitstroom voldoende is om het lumen van deze bloedvaten open te houden, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden verzameld. Traumatische canulatie bespaart niet alleen tijd, maar kan ook leiden tot vasculaire schade en mogelijk de veneuze stroom beïnvloeden.
  2. Spoel beide baarmoederslagaders langzaam handmatig door met 20 ml heparineoplossing aan elke kant totdat alle bloedvaten zijn weggespoeld en de uitstroom vrij is.
    OPMERKING: Er moet op worden gelet dat u niet met hoge druk spoelt, wat kan leiden tot microvasculair letsel en perfusiefalen.
  3. Weeg de baarmoeder.

4. Subnormotherme machineperfusie

OPMERKING: Voor de baarmoeder zijn twee onafhankelijke systemen van machineperfusie vereist. Elke baarmoederslagader is verbonden met een perfusiesysteem dat bestaat uit een rolpomp, een oxygenator, een bellenvanger en een druksensor. Het perfusaat in een reservoir circuleert door siliconenbuisjes die zijn verbonden met de hierboven genoemde elementen voordat het door het orgaan via de baarmoederslagader naar de baarmoederader aan elke kant stroomt, waar het perfusaat naar buiten komt en in hetzelfde reservoir wordt vrijgegeven.

  1. Sluit de baarmoeder aan op de perfusiesystemen van de machine door de canules van de baarmoederslagader aan te sluiten op de instroomslang (Figuur 1).
  2. Stel met behulp van de rolpomp het debiet in op laag (2,5-4,0 ml/min) om een constante arteriële druk tussen 25-35 mmHg te behouden.
  3. Beoordeel de levensvatbaarheidsparameters op elk vooraf bepaald tijdstip in zowel instroom als uitstroom met behulp van een spuit van 1 ml en analyseer monsters met de bloedgassysteemmachine [bijv. bloedgasmetrieken (pH, pCO2, pO2, lactaat, basenovermaat, bicarbonaat), glucose, natrium, kalium, calcium, chloride].
    LET OP: In dit protocol duurt de perfusie 4 uur en worden er om de 30 minuten monsters van de in- en uitstroom genomen.
  4. Weeg de baarmoeder aan het einde van de perfusie.

Resultaten

Tijdens de perfusie werd het systeem aangesloten op een druksensor die de druk tijdens het experiment registreerde. De druk werd in eerste instantie geregistreerd voor een baarmoedervrij systeem, dat werd afgetrokken van drukregistraties tijdens baarmoederperfusie om de echte orgaandruk te verkrijgen. Het debiet werd aangepast om de druk binnen het gewenste bereik te houden en werd geregeld door de rolpomp. De weerstand werd berekend met behulp van de formule R = P / Q (R: weerstand (mmHg.mL.min-1); P: druk (mmHg); Q: debiet (ml/min)).

De evolutie van de perfusieparameters wordt weergegeven in figuur 4. Het gemiddelde initiële debiet was 5,2 (min 2,4, max 10,0) ml/min aan beide zijden en fluctueerde niet veel tijdens het experiment. Op basis van literatuur en eerdere experimenten werd de doeldruk vastgesteld op 25-35 mmHg. De gemiddelde initiële arteriële druk was 26 (min 10, max 36) mmHg aan de linkerkant van de baarmoeder en 27 (min 16, max 39) mmHg aan de rechterkant. Omdat de stroming en druk enigszins stabiel en laag waren, vertoonde het resulterende arteriële weerstandsprofiel ook een vlakke curve gedurende het hele experiment. De gemiddelde initiële vasculaire weerstand was 8,5 (min 1, max 13,3) mmHg.mL.min-1 aan beide zijden (Figuur 4).

SNMP-conservering werd geëvalueerd op basis van verschillende metabole parameters (Figuur 5): lactaatklaring (verschil tussen lactaatuitstroom en lactaatinstroom), gewichtsverandering, het verschil tussen de instroomglucose en de uitstroomglucose als gevolg van het glucoseverbruik en het zuurstofverbruik. Het zuurstofverbruik werd berekend met behulp van de formule O2verbruik = 0,0314 x Q x (pO2 instroom - pO2 uitstroom) / W (Q: debiet (ml/min), pO2: partiële zuurstofdruk (mmHg), W: gewicht (g) en 0,0314 Henry's constante in water bij 20 °C en 1 atm). De afname van het lactaatgehalte tijdens het eerste uur van perfusie geeft aan dat de machineperfusie lactaatklaring mogelijk maakte na accumulatie tijdens de warme ischemische fase. De gewichtsverandering toonde aan dat geen van de baarmoeders oedeem had. De curve benadrukte dat gewichtsverlies voornamelijk tijdens de eerste twee uur plaatsvond en dat het gewicht daarna de neiging had zich te stabiliseren. Het glucoseverschil tussen de instroom en de uitstroom nam af tijdens het eerste uur van perfusie alvorens zich te stabiliseren op lage waarden. Het zuurstofverbruik bleef constant tijdens de perfusie.

Na 4 uur SNMP werd angiografie uitgevoerd in elke baarmoeder, waarbij langzaam 20 ml contrastmiddel in elke baarmoederslagader werd gespoeld (Figuur 6), waardoor de vaatboom na de conserveringsfase kon worden beoordeeld. In alle organen werd het microvaatstelsel goed geïdentificeerd langs de baarmoederhals, het baarmoederlichaam en de hoorns.

figure-results-1
Figuur 1: Chirurgisch model en machineperfusiesysteem. (A) Diagram van het machineperfusiesysteem dat wordt gebruikt voor de SNMP van de baarmoeder. (B) Representatieve foto van een varkensbaarmoeder die SNMP ondergaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Diagram van de anatomie van de mens (links) en het varken (rechts) van de baarmoeder met de belangrijkste vascularisatie door de baarmoederslagader. De anatomische kenmerken van de baarmoeder van het varken zijn voornamelijk te danken aan de aanwezigheid van een klein lichaam dat is verdeeld in twee grote baarmoederhoorns. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Intra- en postoperatieve weergaven. (A) Intraoperatief beeld van de baarmoeder na identificatie van baarmoedervaten. (B) Postoperatieve beelden van de baarmoeder na bevalling en heparine-zoutoplossing spoeling. A: corpus; B: baarmoeder hoorns; C: baarmoederhals; D: baarmoederslagaders; E: baarmoederaders; F: buis; G: eierstok. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Profiel van de perfusieparameters tijdens 4 uur machineperfusie aan beide baarmoederzijden. (A) Debiet (ml/min). (B) Druk (mmHg). (c) berekende arteriële weerstand (mmHg.min.mL-1). De curven geven het gemiddelde voor elke kant van de baarmoeder aan en foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Monitoring van de belangrijkste hypoxiemarkers tijdens machineperfusie. (A) Lactaatklaring gedurende de eerste 90 minuten van de perfusie vóór stabilisatie. (B) Het gewicht neemt af tijdens de perfusie. (C) Verschil tussen instroom en uitstroom glucoseconcentratie. (D) Berekend O2 verbruik. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde voor beide zijden van elke baarmoeder en foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Representatieve angiografie van de baarmoeder vasculaire boom na subnormotherme conservering. (A) Vóór injectie van contrastmiddel. (B) Na injectie van contrastmiddel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van het onderdeelHoeveelheidNaam van het onderdeelHoeveelheid
Gedeïoniseerd water1LDextran lage fractie (~75 kDa)5 gr
NaCl5.026 grRunderserum albumine150 gr
Kcl0.343 grHydrocortison [50 mg/ml]0,2 ml
CaCl2 . 2H200,221 grDexamethason [1,6 g/100 mg]4 ml
NaH2PO40,187 grNatriumhydroxide [1 mol/ml]16 ml
NaHCO31,26 grHeparine met een laag moleculair gewicht200 IE
MgCl2 . 6H2O0,244 grInsuline200 IE
D-glucose4,3 grVancomycine1,5 gr
PEG (35 kDa)5 gr

Tabel 1: Samenstelling van de Steen+ oplossing. NaCl: natriumchloride; KCl: kaliumchloride; CaCl2. 2H20: calciumchloride dihydraat; NaH2PO4: natriumdiwaterstoffosfaat; NaHCO3: natriumbicarbonaat; MgCl2 . 6H2O: magnesiumchloride hexahydraat; PIN; Polyethyleenglycol.

Aanvullende figuur 1: Perfusiesysteem met één pomp. (A) Schema van de machineperfusie "Y-systeem" dat voor het voorbereidende experiment is gebruikt. (B) Representatieve foto van de opstelling voor het voorbereidende experiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Profiel van perfusieparameters tijdens 4,5 uur-SNMP voor het voorbereidende experiment. (A) Debiet (ml/min). (B) Druk (mmHg). (c) berekende arteriële weerstand (mmHg.min.mL-1). (D) Gewichtstoename tijdens de perfusie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Foto van de baarmoeder aan het einde van het voorbereidende experiment (4,5 h-SNMP). Een asymmetrische verdeling van oedeem is zichtbaar, voornamelijk in de rechterhoorn (rechts van de afbeelding). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Baarmoedertransplantatie, vaak beschouwd als onderdeel van VCA, heeft zich de laatste jaren snel ontwikkeld. Tegelijkertijd begon machineperfusie te worden onderzocht in VCA, omdat het robuust bewijs aantoonde voor het verbeteren van de conservering van vaste organen. Hypothermische en subnormotherme machineperfusie heeft het mogelijk gemaakt om tot 24 uur te bewaren in varkensmodellen van myocutane en botbevattende VCA 26,27,28. Aangezien de baarmoeder uitdagingen met zich meebrengt die vergelijkbaar zijn met bot- en huidbevattende VCA, is het van cruciaal belang om vergelijkbare technieken voor UTx te onderzoeken om de conserveringskwaliteit en langetermijnresultaten te verbeteren29. Naast het verbeteren van de orgaankwaliteit, is een potentieel voordeel van dynamische conservering met behulp van machineperfusie het vergroten van de pool van donoren30. Het ophalen van de baarmoeder bij levende donoren brengt aanzienlijke risico's met zich mee, zoals ureterletsel tijdens de dissectie van de baarmoederpedikel, maar ook hormonale verstoring en alle mogelijke risico's die gepaard gaan met een vroege menopauze als gevolg van de ovariëctomie die kan worden uitgevoerd31,32. Het doel om de kwaliteit van overleden donororganen te verbeteren, zou de noodzaak van een dergelijke operatie bij de aanschafprocedures voor levende donoren voorkomen. Het uiteindelijke doel zou zijn om baarmoederverkrijging mogelijk te maken bij zowel levende als overleden donoren om te voldoen aan de behoeften van vrouwen met absolute baarmoederonvruchtbaarheid33.

Dit artikel biedt een reproduceerbaar model voor het verkrijgen en bewaren van baarmoeders bij varkens met behulp van machineperfusie. Het verbeteren van de kwaliteit en duur van de conservering is relevant voor de uitbreiding van de donorpool door hersendode donoren in staat te stellen betrouwbare bronnen te zijn voor de verkrijging van baarmoeders. Klinisch werden de meeste UTx uitgevoerd op basis van levende donoren, meestal familieleden of goede vrienden. Ischemietijd is een kritische factor voor de uiteindelijke levensvatbaarheid van organen, vooral bij hersendode donoren. IRI wordt gedefinieerd door cellulaire schade veroorzaakt door een opeenvolging van ischemie (onderbreking van de bloedcirculatie in de orgaanvasculaire boom) en reperfusie (terugkeer van de zuurstoftoevoer), vaak geassocieerd met een temperatuurstijging, wat bijdraagt aan de celbeschadiging. Deze cascade van gebeurtenissen produceert reactieve zuurstofsoorten, wat uiteindelijk leidt tot chronische ontsteking, apoptose, afgifte van antigeen en afstoting van het transplantaat 7,8,34. Warme (WIT) en koude ischemietijden zijn kritische factoren in het IRI-proces, maar slechts een paar auteurs hebben het in de baarmoeder bestudeerd. In een onderzoek naar het effect van langdurige SCS-conservering bij muizen UTx, werd transplantatie uitgevoerd na 24 uur SCS, waarbij succesvolle zwangerschappen werden ontwikkeld bij vijf van de zes dieren. Na 48 uur SCS vertoonden alle transplantaties echter necrose35. In een andere studie waarin UTx werd vergeleken bij 14 ooien na 3 uur SCS (n = 7) en 24 uur SCS (n = 7), waren slechts 7 dieren 8 dagen na de transplantatie in leven, waarbij 35% van de baarmoeders als levensvatbaar werd beschouwd met betrekking tot oedeem en necrose, 2 baarmoeders in de 3 uur SCS-groep en 3 baarmoeders in de 24 uur SCS-groep36. Interessant is dat de samentrekking van het myometrium in levensvatbare baarmoeders werd gehandhaafd, maar de methodebeoordeling werd niet gespecificeerd. Dit benadrukt het cruciale belang van het bedenken dat een succesvolle baarmoedertransplantatie niet alleen een levensvatbaar transplantaat inhoudt, maar ook functionele menstruatie en een succesvolle zwangerschap. In dit opzicht is het verlagen van de IRI en de negatieve gevolgen daarvan van cruciaal belang om de kwaliteit van het transplantaat te verbeteren en de slagingspercentages bij levendgeborenen te verbeteren. Om de consistentie te garanderen, hebben we ervoor gezorgd dat alle organen na een vergelijkbare WIT worden geoogst. Alle bloedvaten in het brede ligament werden gecoaguleerd of afgeligd om een relevante drukmeting en een adequate capillaire perfusie naar het hele orgaan te garanderen. Katheterisatie is een ander cruciaal punt waar aandacht aan moet worden besteed om de canule vast te zetten en tegelijkertijd schade aan de bloedvaten te voorkomen.

Het voorbereidende experiment met een "Y-systeem" leidde tot de optimalisatie van twee onafhankelijke perfusiesystemen, waarbij elke baarmoederslagader afzonderlijk werd aangepakt. Een van de kritische parameters is inderdaad het debiet en de perfusiedruk26,27, die leiden tot het aanpassen van het debiet, dat de algehele vasculaire weerstand van het orgaan weerspiegelt. Geoptimaliseerde bilaterale instroom maakte lactaatklaring aan elke kant van het orgaan mogelijk, zoals benadrukt in onze resultaten (Figuur 5), evenals continue arterio-veneuze verschilmetingen voor alle metabole parameters. Bij subnormotherme temperatuur maakt cellulaire reoxygenatie door machineperfusie de eliminatie mogelijk van lactaten die zich hebben opgehoopt tijdens de anaërobe metabole fase geassocieerd met hypoxie en hypoperfusie tijdens afname en canulatie, waardoor de metabole activiteit laag blijft en lactaatrebound wordt voorkomen. Vergelijkbare resultaten zijn gevonden bij de achterpoten van ratten19. In een ander anatomisch model toonden Dion et al. een andere aanpak door de baarmoeder te oogsten met de aorta in hun hypothermische perfusiestudie37. Het zou van groot belang zijn voor toekomstige studies om op aorta gebaseerde enkelvoudige perfusie goed te vergelijken met het model dat in ons protocol is ontwikkeld.

Hoewel hier een reproduceerbaar model voor machineperfusie van de baarmoeder van varkens wordt beschreven, is een belangrijk punt van zorg de geschiktheid voor verdere transplantatie. Om de werkzaamheid van conserveringsprotocollen te bevestigen, is transplantatie van cruciaal belang, omdat het de klinische setting reproduceert. Hiervoor zijn arteriële en veneuze microchirurgische anastomosen nodig. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat de baarmoeder-eierstokader kan worden gebruikt in klinische UTx wanneer de baarmoederader van onvoldoende kaliber is om veneuze drainage te garanderen38,39. Een beperking in dit model is het gebrek aan behoud van de utero-ovariële ader. Er werd echter geen groot oedeem geregistreerd na 4 uur SNMP in alle geïncludeerde replicaten, en er werd een continue veneuze uitstroom uit alle baarmoederaders opgemerkt. Dit suggereert een verschil tussen het menselijke en het varkensmodel met een mogelijke vereenvoudiging van UTx-procedures bij minivarkens uit Yucatan. Verdere studies moeten onder meer betrekking hebben op het verlengen van de perfusietijd tot meer dan 4 uur om de grenzen van dynamische conservering te bepalen. Tot slot beschrijft dit artikel een reproduceerbaar baarmoedermodel van varkens voor het bestuderen van conservering op basis van machineperfusie en biedt het een waardevolle bron om IRI te targeten met als doel het totale aantal beschikbare organen voor UTx te vergroten.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben geen financieel belang aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het National Institute of Health onder award No R01AR082825 (BEU) en Shriners Children's 84308 (YB). HO en YB ontvingen financiering van de Fondation des Gueules Cassées. De steun van Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Frankrijk) en CHU de Rennes (Frankrijk) aan YB wordt zeer erkend.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Affinity Pixie Oxygenation SystemMedtronicBBP241Oxygenator
Bovin serum albumineSigma-AldrichA9647Perfusiecomponent
Calciumchloride dihydraatSigma-Aldrich223506Perfusiecomponent
Koolstofdioxide zuurstofAirgasUN3156Koolstofdioxide zuurstof mix gas
D-(+)-Glucose monohydraatSigma-Aldrich49159Perfusiecomponent
DexamethasonSigma-AldrichD2915Perfusiecomponent
DextraanThermo scientific406271000Perfusiecomponent
Heparine natriuminjectieEugia Pharma63739-953-25Perfusiecomponent
Humulin Regular Insulin mensLilly0002-8215-01Perfusiecomponent
Hydrocortison natriumsuccinaatPfizer0009-0011-03Perfusiecomponent
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-AldrichM9272Perfusiecomponent
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Rollerpomp
Polyethyleenglycol 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Perfusiecomponent
KaliumchlorideSigma-Aldrich7447-40-7Perfusiecomponent
Drukmonitor, Draagbaar, PM-P-1Living Systems InstrumentationPM-P-1Druksensor
Radnoti Bubble Trap Compliance ChamberRadnoti130149Beltrap
RAPIDPoint500Siemens500Bloedgassysteem
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761Perfusiecomponent
NatriumchlorideSigma-AldrichS9888Perfusiecomponent
NatriumhydroxideSigma-Aldrich72068Perfusiecomponent
Natriumfosfaat monobasisch dihydraatSigma-Aldrich71505Perfusiecomponent
Spuit 1 mLBD309659Steekproefverwerving
Vancomycine hydrochlorideSlate run pharmaceuticals70436-021-82Perfusiecomponent

Referenties

  1. Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2019).
  2. Fageeh, W., Raffa, H., Jabbad, H., Marzouki, A. Transplantation of the human uterus. Int J Gynaecol Obstet. 76 (3), 245-251 (2002).
  3. Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-277 (2017).
  4. Brännström, M., et al. Registry of the International Society of Uterus Transplantation: First report. Transplantation. 107 (1), 172-181 (2023).
  5. Van Dieren, V., et al. Acute rejection rates in vascularized composite allografts: A systematic review of case reports. J Surg Res. 298, 33-44 (2024).
  6. Kristek, J., et al. Human uterine vasculature with respect to uterus transplantation: A comprehensive review. J Obs Gynaecol Res. 46 (11), 1999-2007 (2020).
  7. He, J., Khan, U. Z., Qing, L., Wu, P., Tang, J. Improving the ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation: Clinical experience and experimental implications. Front Immunol. 13, 998952(2022).
  8. Ponticelli, C. Ischaemia-reperfusion injury: A major protagonist in kidney transplantation. Nephrol Dial Transplant. 29 (6), 1134-1140 (2014).
  9. Harris, K., et al. Metabolic response of skeletal muscle to ischemia. Am J Physiol. 250 (2 Pt 2), H213-H220 (1986).
  10. Wranning Almen, C., et al. Short-term ischaemic storage of human uterine myometrium--basic studies towards uterine transplantation. Hum Reprod. 20 (10), 2736-2743 (2005).
  11. Bodewes, S. B., et al. Oxygen transport during ex situ machine perfusion of donor livers using red blood cells or artificial oxygen carriers. Int J Mol Sci. 22 (1), 235(2020).
  12. Boncompagni, E., et al. Decreased apoptosis in fatty livers submitted to subnormothermic machine-perfusion respect to cold storage. Eur J Histochem. 55 (4), e40(2011).
  13. Czigany, Z., et al. Hypothermic oxygenated machine perfusion reduces early allograft injury and improves post-transplant outcomes in extended criteria donation liver transplantation from donation after brain death: Results from a Multicenter Randomized Controlled Trial (HOPE ECD-DBD). Ann Surg. 274 (5), 705-712 (2021).
  14. Markmann, J. F., et al. Impact of portable normothermic blood-based machine perfusion on outcomes of liver transplant: The OCS Liver PROTECT randomized clinical trial. JAMA Surg. 157 (3), 189-198 (2022).
  15. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New Eng J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  16. Roesel, M. J., Ius, F., Knosalla, C., Iske, J. The role of ex-situ perfusion for thoracic organs. Curr Opin Organ Transplant. 27 (5), 466-473 (2022).
  17. Michel, S. G., et al. Twelve-hour hypothermic machine perfusion for donor heart preservation leads to improved ultrastructural characteristics compared to conventional cold storage. Ann Transplant. 20, 461-468 (2015).
  18. Ghoneima, A. S., Sousa Da Silva, R. X., Gosteli, M. A., Barlow, A. D., Kron, P. Outcomes of kidney perfusion techniques in transplantation from deceased donors: A systematic review and meta-analysis. J Clin Med. 12 (12), 3221(2023).
  19. Charlès, L., et al. Effect of subnormothermic machine perfusion on the preservation of vascularized composite allografts after prolonged warm ischemia. Transplantation. 108 (5), e280-e290 (2024).
  20. Duru, Ç, et al. Review of machine perfusion studies in vascularized composite allotransplant preservation. Front Transplantation. 2, 103-111 (2023).
  21. Brännström, M., Diaz-Garcia, C., Hanafy, A., Olausson, M., Tzakis, A. Uterus transplantation: Animal research and human possibilities. Fertil Steril. 97 (6), 1269-1276 (2012).
  22. Wranning, C. A., et al. Auto-transplantation of the uterus in the domestic pig (Sus scrofa): Surgical technique and early reperfusion events. J Obstet Gynaecol Res. 32 (4), 358-367 (2006).
  23. Croome, K. P., et al. American Society of Transplant Surgeons recommendations on best practices in donation after circulatory death organ procurement. Am J Transplant. 23 (2), 171-179 (2023).
  24. Dickens, B. M. Legal and ethical issues of uterus transplantation. Int J Gynaecol Obstet. 133 (1), 125-128 (2016).
  25. Díaz, L., et al. Ethical considerations in animal research: The Principle of 3R's. Rev Invest Clin. 73 (4), 199-209 (2020).
  26. Goutard, M., et al. Machine perfusion enables 24-h preservation of vascularized composite allografts in a swine model of allotransplantation. Transpl Int. 37 (1), 102-111 (2024).
  27. Berkane, Y., et al. Towards optimizing sub-normothermic machine perfusion in fasciocutaneous flaps: A large animal study. Bioengineering (Basel). 10 (12), 1545(2023).
  28. Brouwers, K., et al. 24-hour perfusion of porcine myocutaneous flaps mitigates reperfusion injury: a 7-day follow-up study. Plast Reconstr Surg Glob Open. 10 (2), e4123(2022).
  29. Richter, O., et al. Extracorporeal perfusion of the human uterus as an experimental model in gynaecology and reproductive medicine. Human Reprod. 15 (6), 1235-1240 (2000).
  30. O'Neill, K., et al. Availability of deceased donors for uterus transplantation in the United States: Perception vs Reality. Transplantology. 5 (1), 27-36 (2024).
  31. Chan, J. K., Morrow, J., Manetta, A. Prevention of ureteral injuries in gynecologic surgery. Am J Obstet Gynecol. 188 (5), 1273-1277 (2003).
  32. Rocca, W. A., et al. Accelerated accumulation of multimorbidity after bilateral oophorectomy: A population-based cohort study. Mayo Clin Proc. 91 (11), 1577-1589 (2016).
  33. Dion, L., et al. Procurement of uterus in a deceased donor multi-organ donation National Program in France: A scarce resource for uterus transplantation. J Clin Med. 11 (3), 730(2022).
  34. Agarwal, A., et al. Clinicopathological analysis of uterine allografts including proposed scoring of ischemia reperfusion injury and t-cell-mediated rejection-dallas uterus transplant study: A pilot study. Transplantation. 106 (1), e10-e20 (2022).
  35. Díaz-García, L., et al. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Hum Reprod. 18 (10), 2142-2150 (2003).
  36. Tricard, J., et al. Uterus tolerance to extended cold ischemic storage after auto-transplantation in ewes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 214, 162-167 (2017).
  37. Dion, L., et al. Hypothermic machine perfusion for uterus transplantation. Fertil Steril. 120 (6), 1259-1261 (2023).
  38. Brännström, M., et al. Experimental uterus transplantation. Hum Reprod Update. 16 (3), 329-340 (2010).
  39. Ozkan, O., Ozkan, O., Dogan, N. U. The Ozkan technique in current use in uterus transplantation: from the first ever successful attempt to clinical reality. J Clin Med. 12 (8), 2812(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Baarmuttertransplantatiemachineperfusieischemie reperfusieuterine graftstatische koudebewaringendotheelcelschadeorgaanbewaringuterine procurement
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen