Methodenartikel

Een immunocompetent muizenmodel voor laser interstitiële thermische therapie van glioblastoom

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67381

⸱

15 november 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Glioblastoom is een verwoestende vorm van primaire hersenkanker en interstitiële thermische lasertherapie is in opkomst als een veelbelovend alternatief voor conventionele chirurgische resectie voor inoperabel glioblastoom. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd preklinisch muismodel dat kan worden gebruikt om behandelingseffecten of adjuvante en combinatorische behandelingen te bestuderen.

Samenvatting

Glioblastoom (GB), de meest agressieve vorm van primaire hersenkanker, is verantwoordelijk voor ongeveer de helft van alle hooggradige primaire hersentumoren bij volwassenen en is niet te genezen. Laser interstitiële thermische therapie (LITT) is een door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde behandeling voor GB en wordt gebruikt bij patiënten die mogelijk geen kandidaat zijn voor conventionele chirurgische resectie. Hoewel de klinische werkzaamheid van LITT is vastgesteld, is onderzoek dat verder gaat dan klinische casestudy's en casusreeksen beperkt en gehinderd door het ontbreken van een gevestigd diermodel. Dit protocol maakt gebruik van C57BL/6-muizen en syngene CT2A-glioomkankercellijn om menselijke GB nauwkeurig samen te vatten, terwijl ook een 1064 nm neodymium-gedoteerde Yttrium Aluminium Granaat (Nd:YAG) laser wordt gebruikt, zoals wordt gebruikt in een van de twee door de FDA goedgekeurde LITT-systemen, die een uitstekende preklinische relevantie biedt. De succesvolle opzet van dit LITT-muismodel zal een waardevol platform bieden voor het onderzoeken van de unieke kenmerken van LITT-ablatie en de effecten ervan op de micro-omgeving van de tumor, wat mogelijk kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.

Inleiding

Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak nummer één in Canada. Glioblastoom (GB), de meest voorkomende vorm van agressieve hersentumor, is verantwoordelijk voor 48% tot 60% van alle hooggradige primaire hersentumoren bij volwassenen1. De prognose voor GB is bijzonder grimmig met een 5-jaars nettooverleving van 4,8% met conventionele behandelingen, waaronder chirurgische resectie, chemo- en radiotherapie 1,2.

Laser Interstitial Thermal Therapy (LITT) is een door de FDA goedgekeurde procedure waarbij een laser wordt gebruikt voor hyperthermische in-situ tumorablatie bij patiënten met inoperabele hersentumoren en biedt een aantrekkelijk therapeutisch alternatief voor conventionele chirurgische resectie3. Een gedetailleerd en goed gekarakteriseerd muizenmodel voor LITT-behandeling van GB ontbreekt echter, wat preklinisch onderzoek belemmert.

Dit protocol is bedoeld om een geoptimaliseerd preklinisch muizenmodel voor GB-behandeling met LITT te demonstreren. We hebben ervoor gekozen om C57BL/6-muizen en de syngene glioomcellijn CT2A voor dit model te gebruiken, voornamelijk omdat CT2A nauw aansluit bij menselijke hoogwaardige GB met vergelijkbare histologische kenmerken, invasiviteit, chemo- en radioresistentie en stamachtige kenmerken met zelfvernieuwing en herstel van tumoren4. Deze kenmerken bieden een uitstekend platform voor een verscheidenheid aan onderzoeken met immuunresponsen of nieuwe therapeutische strategieën. Bovendien zijn de technische aspecten van dit LITT-protocol ook gemakkelijk aan te passen voor andere allo- en xenotransplantaatmodellen 4,5,6, die verder zullen worden besproken.

De voordelen van dit protocol zijn onder meer consistente resultaten met een eenvoudig maar effectief LITT-behandelingsparadigma. De 1064 nm neodymium-gedoteerde Yttrium Aluminium Garnet (Nd:YAG) laser die wordt gebruikt, is dezelfde als die klinisch wordt gebruikt in een van de twee momenteel door de FDA goedgekeurde systemen, waardoor experimenten mogelijk zijn die nauw aansluiten bij de klinische toepassing van LITT voor de behandeling van hooggradig glioom. Het belangrijkste nadeel van dit protocol is de uiterste zorg die moet worden betracht tijdens zowel de implantatie van tumorcellen als de LITT-behandeling om reproduceerbare resultaten te bereiken. Bovendien is het protocol vanwege de agressieve aard van de CT2A-cellijn zeer tijdgevoelig. De meeste experimenten moeten binnen maximaal 20 dagen worden afgerond, wat het onderzoek naar sommige adaptieve immuunresponsen of andere cellulaire en moleculaire mechanismen die zich over een langere periode voordoen, kan beperken.

Protocol

De dierethiek voor dit protocol is goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Manitoba in overeenstemming met de ethische richtlijnen die zijn opgesteld door de Canadian Council for Animal Care (CCAC). Dit protocol gebruikte 8-12 weken oude C57BL/6 immunocompetente muizen en syngene glioomcellijn CT2A voor een preklinisch model met een breed scala aan toepassingen, waaronder experimenten gericht op histologische analyse, immunologische veranderingen of combinatorische therapeutische interventies. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast aan andere muizensoorten of cellijnen op basis van de experimentele vereisten.

figure-protocol-1
Figuur 1: Grafisch schema van het experimentele basisontwerp. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Celvoorbereiding in het kort (dag 0)

  1. Voordat u met de celkweek begint, moet u ervoor zorgen dat de kast en alle benodigde pipetten volledig zijn gesteriliseerd met UV en ethanol.
  2. Verwarm de DMEM/F12 met 10% FBS-media, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsine tot kamertemperatuur (RT) met behulp van een waterbad.
  3. Pipetteer de media uit de T25-kolf en spoel de cellen kort met PBS. Voeg 1 ml trypsine toe aan de cellen en incubeer gedurende 30-60 s totdat de cellen loskomen van de kolf.
  4. Bevestig de losgeraakte cellen onder een lichtmicroscoop en voeg 4 ml media toe om de enzymatische activiteit van trypsine te stoppen.
  5. Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller.
    1. Meng 10 μl van de celsuspensie met 10 μl trypanblauw en voeg vervolgens 10 μl toe aan het dialetje voor het tellen van cellen.
    2. Plaats het dialetje in de celtelmachine en noteer het totale aantal cellen, het aantal levende cellen en het percentage levende cellen.

OPMERKING: Als er geen geautomatiseerde celtelmachine beschikbaar is, kan een handmatige telling worden uitgevoerd met behulp van een hemocytometer.

  1. Bereken de cellen die nodig zijn voor alle geplande injecties.
    OPMERKING: Voor CT2A wordt 5000 cellen per 1,5 μl geïnjecteerd volume en een minimum van 100 μl totaal volume voor elk preparaat aanbevolen.
  2. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 134 x g om de cellen te pelletiseren en zoveel mogelijk medium op te zuigen.
  3. Resuspendeer de celpellet met 5% basaalmembraanextract in PBS voor het volume dat nodig is in een microcentrifugebuis. Hoewel kleinere buisjes het meest geschikt zijn voor het voorbereiden van de celsuspensie, is een buisje van 2 ml beter voor opslag tijdens de operatie, omdat de cellen minder snel samenklonteren in de meer afgeronde bodem en gemakkelijk opnieuw verdelen met zacht tikken.
  4. Bewaar de cellen op ijs voor injectie en bereid indien nodig elke 4-5 uur verse celsuspensies.

2. Orthotope implantatie (dag 0)

  1. Bereid het operatiegebied voor en zorg ervoor dat alle benodigde instrumenten steriel en klaar voor gebruik zijn.
  2. Verdoof de muis met isofluraan (3% verdampt in 1 l/min O2) in een kamer terwijl u de ademhalingsfrequentie bewaakt (doel 60 bpm).
  3. Verkrijg en registreer het gewicht van het dier voor medicatiedosering.
  4. Scheer het operatiegebied voorzichtig om de ogen, oren en snorharen te vermijden.
  5. Breng het dier over naar een stereotactisch frame.
    1. Plaats de snijtanden in het gat van de bijtstang en stel de neuskegel af tot hij goed vastzit, draai de bevestigingsschroef vast om vast te zetten.
    2. Controleer de diepte van de anesthesie met bilaterale knijpen in de achterpoot en zet, indien nodig, de schedel vast met oorpennen en stel de kop van het dier in op een neutrale, vlakke positie.
    3. Bewaak de temperatuur van de kern van dieren met behulp van een gesmeerde rectale temperatuursonde en zorg voor extra verwarming bij 37 °C met behulp van een verwarmingskussen onder het lichaam.
      LET OP: Zorg ervoor dat u de neuskegel niet te strak aandraait, aangezien zelfs matige druk op het neusbot ademhalingsstilstand kan veroorzaken. Als er een elektrisch verwarmingskussen wordt gebruikt (bijv. een verwarmingskussen voor een terrarium), zorg er dan voor dat de temperatuurinstellingen nauwkeurig zijn en dat de ingestelde temperatuur constant blijft.
  6. Breng oogzalf royaal aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
  7. Dien profylactische injecties toe en controleer de diepte van de verdoving.
    1. Injecteer subcutane (s.c.) meloxicam of andere langwerkende pijnstillers volgens de richtlijnen van de lokale dierenfaciliteit (bijv. 5,0 mg/kg meloxicam) met behulp van een spuit van 28 G x 1/2".
    2. Dien een injectie toe van 20 mg/kg s.c. voorverwarmde normale zoutoplossing voor profylactische vloeistofondersteuning tijdens langere procedures.
    3. Verminder de verdoving tot 1,5%-2,0% isofluraan om de beoogde ademhalingsfrequentie te behouden.
  8. Met behulp van een aseptische techniek drapeert u het dier en bereidt u het operatiegebied voor.
    1. Breng met een steriel wattenstaafje povidon-jodium of chloorhexidine-desinfecterende oplossing aan. Begin mediaal op de incisieplaats en draai het wattenstaafje na elke passage, werk naar buiten toe en breng vervolgens met een vers steriel wattenstaafje 70% ethanol op de plaats aan op een vergelijkbare manier.
    2. Herhaal de scrub met jodium, gevolgd door 70% ethanol nog twee keer (3 keer in totaal, elk).
  9. Controleer de anesthesiediepte opnieuw voordat u doorgaat met de chirurgische blootstelling. Houd de ademhalingsfrequentie tijdens de procedure nauwlettend in de gaten en pas de verdoving indien nodig aan.
  10. Begin met de middellijn en iets achter de ogen en maak een incisie van 1-1,5 cm in het midden van de sagittale hoek in de caudale richting met behulp van een scalpel met #15 mes. U kunt ook een korte incisie in een scalpel verlengen met een irisschaar.
    OPMERKING: Incisies moeten beginnen bij de middellijn, maar voor unilaterale injecties kunnen ze iets lateraal worden gekanteld om gelijktijdige visualisatie en toegang van Bregma en de locatie van het braamgat te vergemakkelijken.
  11. Gebruik een steriel wattenstaafje om de wondranden te reflecteren om de schedel te visualiseren en wrijf voorzichtig al het bindweefsel uit het gebied weg.
    1. Gebruik indien nodig een steriel wattenstaafje gedrenkt in waterstofperoxide om het schedeloppervlak schoon te maken en de schedelhechtingen zichtbaar te maken.
  12. Zoek Bregma waar de linker en rechter coronale hechtingen samenkomen op de middellijn met de sagittale hechting (zie figuur 2).
    1. Gebruik een niet-giftige gekleurde acrylhars en een steriele houten tandenstoker of iets dergelijks om een heel klein merkteken op Bregma te maken.
      OPMERKING: In sommige gevallen spiegelen de linker en rechter coronale hechtingen elkaar niet; Gebruik in dergelijke gevallen een 'line-of-best-fit' om bij benadering aan te geven waar ze elkaar langs het midden van het sagittale vlak moeten kruisen.
  13. Zorg ervoor dat de koppositie van het dier niet gekanteld of gedraaid is (d.w.z. in een plat vlak).
    1. Nul stereotactische coördinaten bij Bregma. De x-coördinaat verwijst naar beweging in het mediaal-laterale (ML) vlak, de y-coördinaat in het anterieure-posterieure (AP) vlak en de z-coördinaat in het dorsaal-ventrale (DV) vlak.
    2. Zorg ervoor dat Lambda zich in hetzelfde DV-vlak bevindt als Bregma (d.w.z. z = 0 bij beide oriëntatiepunten). Evenzo, bij +2,0 mm (x = 2) en -2,0 mm (x = -2,0) lateraal van Bregma, zorg ervoor dat de schedel zich in hetzelfde vlak bevindt, waarbij de DV/z-coördinaat ongeveer gelijk is. Zorg ervoor dat de schedel goed vastzit en niet beweegt na aanpassingen.
  14. Boor een braamgat van +2,0 mm (ML) en +0,5 mm (AP) van Bregma (Figuur 3).
    1. Gebruik een stereotactisch boorhulpstuk om de punt van het bit voorzichtig te laten zakken totdat het contact maakt met Bregma en de coördinaten op nul te zetten.
    2. Til het bit iets op en stel de boor in op de juiste AP- en ML-coördinaten.
    3. Laat de boor langzaam zakken en zorg ervoor dat u alleen door de schedel braamt.
    4. Als alternatief kunt u met behulp van een microliterspuit in het stereotactische frame de naaldpunt laten zakken totdat deze contact maakt met Bregma en de coördinaten op nul zetten.
    5. Til de naald iets op en stel deze in op de juiste AP- en ML-coördinaten.
    6. Laat de punt zakken totdat deze de schedel raakt en noteer de exacte locatie.
    7. Til de naald iets op en maak een kleine markering op de doellocatie met een chirurgische marker.
    8. Til of draai de naalddrager uit de weg en gebruik een handboor om door de schedel te bramen, waarbij u ervoor zorgt dat de hersenen eronder niet worden beschadigd. LET OP: Over het algemeen hebben oudere mannelijke muizen relatief dikkere schedels en moeten ze uitgebreider worden geboord. Met de hand boren moet voorzichtig worden gedaan, met minimale druk, omdat plotselinge breuken door de schedel de onderliggende hersenvliezen en/of hersenen zullen beschadigen.
      OPMERKING: Een verlenging van het braamgat is nodig om plaats te bieden aan de thermokoppelsonde tijdens de LITT-procedure. Dit kan gemakkelijker worden gedaan tijdens de eerste injectieoperatie en vergemakkelijkt een snellere en meer gestroomlijnde LITT-operatie. Als alternatief kan het braamgat op dezelfde manier worden verlengd tijdens de LITT-operatie, wat het risico op extracraniële tumorgroei kan verminderen.
  15. Maak een tweede braamgat op +3,0 mm ML en +0,5 mm AP (1,0 mm lateraal van de injectieplaats) voor het thermokoppel.
    1. Volg de boorprocedure zoals beschreven in de vorige stap.
    2. Om problemen in verband met bothergroei te voorkomen, verwijdert u het bot tussen de twee gaten.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om +2,0 mm ML, +0,5 mm AP en -2,5 mm DV van Bregma te gebruiken als coördinaten voor tumorimplantatie. Deze locatie in het bovenste striatum levert een consistente tumorgroei op, die goed wordt verdragen door de dieren, maar het protocol kan worden aangepast aan andere locaties.
  16. Bereid CT2A muizenglioomcelsuspensie voor in een microliterspuit (5000 cellen in 1,5 μl).
    1. Verwijder de vooraf voorbereide microcentrifugebuis met cellen uit het ijs en veeg voorzichtig met een vingertop om opnieuw te suspenderen.
    2. Zuig voorzichtig 2 μl op in een spuit van 5 μl of 10 μl en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
    3. Druk 0,5 μL af om eventuele lucht te verwijderen en ervoor te zorgen dat de naald goed is geprimed en correct werkt.
    4. Veeg de naaldschacht af met een alcoholdoekje om de afgekolfde vloeistof en eventuele cellen aan de buitenkant te verwijderen (die leptomeningeale tumorgroei kunnen veroorzaken).
  17. Laad de spuit in een microinjectorspuitpomp (of handmatig stereotactisch hulpstuk) en laat de naald langzaam zakken.
    1. Laat de naald langzaam zakken tot de diepte (z = -3,0 mm) en pauzeer 1 minuut.
    2. Trek de naald langzaam 0,5 mm terug (z = -2,50 mm) en injecteer cellen (≤ 0,5 μL/min). Houd het gebied rond de spuit droog met een microchirurgische sponsspeer en zorg ervoor dat u de naald niet verstoort.
    3. Wacht minimaal 2 minuten nadat de injectie is voltooid en trek de spuit dan langzaam terug over een periode van 3-4 minuten. Zorg ervoor dat de eerste 4-5 retractie-intervallen 100 μm per retractie zijn om te voorkomen dat cellen losraken van hun oorspronkelijke injectieplaats.
    4. Veeg met een alcoholdoekje de buitenkant van de naald voorzichtig vrij van bloed of vloeistof en spoel en reinig de spuit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik PBS en gedestilleerd water tussen de injecties door om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt raakt. Wanneer de injecties zijn voltooid, spoelt u de naald royaal met 70% ethanol om eventuele resterende cellen van de naald te verwijderen.
      LET OP: Het niet doorspoelen van de naald na elke injectie kan leiden tot een verstopping. Als u meer dan één celtype injecteert, gebruik dan voor elk type een afzonderlijke naald om mogelijke kruisbesmetting te voorkomen.
  18. Benader de incisie opnieuw en zorg ervoor dat de wondranden iets naar voren worden gebracht zodat de onderliggende dermis elkaar raakt. Sluit de wond met een wondclip of 3 onderbroken hechtingen met een 5-0 hechtdraad. Breng povidon-jodiumoplossing aan op de gesloten wond.
  19. Haal het dier uit het stereotactische frame en plaats het in een met papier beklede herstelkooi op een warmhoudkussen dat is ingesteld op 37 °C. Zorg ervoor dat sternale lighouding is verkregen voordat u het dier terugbrengt naar de thuiskooi met een schaaltje nat voer op de vloer van de kooi.
  20. Controleer het dier minstens twee keer per dag, te beginnen op de dag van de operatie, gedurende de volgende 2 dagen. Lezenmeloxicam toedienen na 24 uur, 48 uur en 72 uur, of volgens de richtlijnen van de instelling.

figure-protocol-2
Figuur 2: Grafische illustratie van een muizenschedel en belangrijke anatomische oriëntatiepunten voor stereotactische chirurgie. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Grafische illustratie met de locaties van braamgaten en laserapparatuur. Illustratie met de relatieve posities van het Bregma-oriëntatiepunt, (A) het eerste braamgat voor de (A') laservezel en (B) het tweede, of verlengde, braamgat voor de (B') thermokoppelsonde. Aan de rechterkant is een uitgesneden afbeelding van de laservezel- en thermokoppelsondes te zien, die illustreert hoe de sondes zijn gestabiliseerd in een stereotactische eindvoet met voorgeboorde gaten op de gewenste grootte en afstand. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Monitoring tumorlast pre-LITT (dag 9)

  1. Voer T2-gewogen magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) uit, volgens institutionele richtlijnen, om de tumorgroei op de dag voorafgaand aan LITT te beoordelen.
    OPMERKING: Tumoren moeten een diameter hebben van ~1,5-2,0 mm.
    1. Verkrijg een geschikte coronale scan van het hele muizenbrein met behulp van de volgende parameters: snelle spin-echosequentie, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, echotreinen = 7, FOV = 30 x 30 mm2, matrixgrootte = 250 x 256, totaal aantal plakjes = 18, plakdikte = 0,3 mm, gemiddelden = 2.
      OPMERKING: Het wordt ook aanbevolen om een periodieke MRI uit te voeren vanaf ongeveer dag 6 na implantatie om succesvolle allotransplantatie te bevestigen en om de tumorgroei te controleren, vooral tijdens de eerste experimenten, aangezien zelfs subtiele wijzigingen in de procedure de tijdlijn kunnen veranderen. CT2A is zeer agressief en de dieren moeten nauwlettend in de gaten worden gehouden. Een T2-gewogen coronale scan werkt hiervoor goed. Het gebruik van fluorescerend gelabelde of luciferine-gelabelde CT2A-cellen in combinatie met een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) kan ook geschikt zijn wanneer toegang tot MRI van een klein dier niet beschikbaar is. De groeikinetiek en andere tumorkenmerken zullen echter afwijken van dit protocol.

4. LITT-operatie (dag 10)

  1. Zoals hierboven in sectie 2, herhaalt u stap 2.1-2.13 om het dier voor te bereiden op LITT.
    OPMERKING: Wondgenezing van de vorige operatie kan zich in verschillende stadia bevinden op basis van soorten en variaties in de experimentele tijdlijn. Houd rekening met dunner of gevoeliger weefsel bij het opnieuw maken van de incisie.
  2. Gebruik een steriel wattenstaafje om de schedel voorzichtig schoon te maken en verwijder al het weefsel dat Bregma of het eerder gemaakte braamgat verduistert. Boor indien nodig het braamgat opnieuw, hoewel vanwege de snelheid van CT2A-tumorvorming weinig of geen bothergroei wordt verwacht.
  3. Met het LITT-opzetstuk op zijn plaats in het stereotactische frame, zet je de coördinaten bij Bregma op nul voor de punt van de laservezel.
    LET OP: De laservezel is erg kwetsbaar en zal barsten als hij wordt gebogen. Zorg ervoor dat u stopt zodra de punt van de laservezel in contact komt met de schedel.
  4. Til de punt iets op en beweeg naar de gewenste ML- en AP-coördinaten, laat de sondes vervolgens langzaam zakken naar de doel-DV-coördinaat om bij het doel te komen (2.0 mm ML, 0.5 mm AP, -2.0 mm DV).
  5. Stel de LITT-behandelingsparameters in: Modus: continu; Vermogen: 1 W
  6. Schakel de laser van stand-by naar actief en schakel de laser 60 s in met het voetpedaal. Als de temperatuur boven de 46 °C stijgt, pauzeer dan kort en schakel hem dan weer in, in een poging de temperatuur zo dicht mogelijk bij 46 °C te houden.
  7. Trek de laserassemblage langzaam in en veeg de laservezel en het thermokoppel voorzichtig schoon met een alcoholdoekje. Draai het geheel uit de weg en zorg ervoor dat de sondes niet in contact komen met het frame.
  8. Sluit de wond en herstel het dier zoals beschreven in stap 2.18-2.20 na tumorimplantatie hierboven.

5. Post-LITT assessment (Dag 11)

  1. Voer post-LITT T2-gewogen MRI uit op de dag na de LITT-behandeling om te beoordelen of de LITT tumorablatie succesvol is met behulp van de sequentie en parameters uit stap 3.1 hierboven.
    OPMERKING: Bovendien kan een sequentie van vloeistofverzwakt inversieherstel (FLAIR) ook nuttig zijn bij het beoordelen van postoperatief oedeem.
  2. Voer vóór het einde van de studie vervolgscans uit om veranderingen na de behandeling of hergroei van tumoren te volgen.

6. Einde van de studie (dag 11/dag 15/dag 20)

  1. Euthanaseer dieren op de gekozen experimentele eindpunten volgens de richtlijnen van de instelling.
    OPMERKING: Eindpunten later dan dag 20 zijn niet haalbaar met CT2A, zelfs niet bij inoculaties met een extreem laag celaantal, aangezien controledieren (d.w.z. schijnoperatie of geen behandeling) en sommige dieren van de behandelingsgroep stervende kunnen zijn en euthanasie nodig hebben. Overweeg voor langere experimenten alternatieve glioomcelmodellen van muizen.
  2. Verzamel weefsels voor fixatie en verwerking.
    1. Voer hartperfusie uit met 4% paraformaldehyde (PFA) en verzamel de interessante weefsels.
    2. Fixeer het hersenweefsel na door onderdompeling in 4% PFA 's nachts bij 4 °C.
    3. Verwerk de monsters met behulp van standaardpraktijken voor formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) of vastgevroren analyse.

7. Beoordeling

  1. Verifieer succesvolle LITT-ablatie met behulp van T2-gewogen MRI en valideer met behulp van histologische basistechnieken zoals een hematoxyline- en eosinekleuring.
  2. Voer eventuele aanvullende analyses uit die nodig zijn voor de experimenten (bijv. immunohistochemie, immunofluorescentie).

Resultaten

Succesvolle CT2A-tumorimplantatie en LITT-behandelingen kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van T2-gewogen MRI, zoals weergegeven in Figuur 4, Figuur 5 en Figuur 6. MR-beelden werden verkregen met behulp van een 7T cryogeenvrije supergeleidende magneet met een boring van 17 cm en een kwadratuurspoel van muizenkop met behulp van de sequentieparameters die in het bovenstaande protocol worden beschreven. Zorgvuldige naleving van deze methode zou moeten resulteren in opnamepercentages van bijna 100%, consistente tumorlokalisatie en ruwweg bolvormige tumorvorming, zoals aangetoond in figuur 4. Deze eigenschappen vormen een optimale basis voor de daaropvolgende LITT-behandelingen en eventuele verdere analyses. Evenzo, zoals te zien is in figuur 5, moeten de LITT-ablaties ook consistent zijn in zowel grootte als locatie. De centrale kern van het geablateerde weefsel zal bestaan uit coagulatieve en liquefactieve necrose en gemakkelijk worden gevisualiseerd als een hypo-intensiteit (d.w.z. zwart) op de T2-gewogen MRI. In de dagen onmiddellijk na de LITT-behandeling is het ook typisch, afhankelijk van de uitgevoerde LITT-behandeling, om een hyperintens (d.w.z. wit) gebied in en rond de laesie te zien dat overeenkomt met peri-operatief oedeem. Figuur 6 toont een slecht resultaat en belicht enkele van de mogelijke valkuilen bij het uitvoeren van dit protocol.

figure-results-1
Figuur 4: T2-gewogen coronale MR-beelden van ideale CT2A-tumorvorming. Representatieve beelden van tumorvorming bij drie C57BL/6-muizen (A, B, C) 12 dagen na implantatie. Witte pijlen geven de tumorgrens aan. Let op de consistente tumorlocatie en ruwweg bolvormige vorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 5: T2-gewogen coronale MR-beelden van ideale LITT-ablatie (1 dag na LITT). Representatieve beelden van LITT-tumorablatie bij drie C57BL/6-muizen (A, B, C) 13 dagen na implantatie. Let op de consistente grootte en locatie van de kern van de necrotische laesie. Het iets eerder uitvoeren van pre-LITT MRI's en LITT-ablaties zou een betere balans opleveren tussen de optimale tumorgrootte voor lasertargeting en het vermogen om latere eindpunten na de behandeling te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 6: T2-gewogen coronale MR-beelden van vooraf geoptimaliseerde LITT-behandelingen. Beelden van drie C57BL/6-muizen (A, B, C) behandeld met identieke laserparameters en stereotactische doelen voorafgaand aan protocoloptimalisaties, als voorbeeld van een niet-ideaal resultaat. Witte pijlen geven de tumorgrens aan. Begrensde gebieden tonen het gebied van oedeem. Er wordt aanzienlijke variabiliteit gezien, waaronder minder uniforme tumorgroei en slechte laserablatiegerichtheid, wat resulteert in inconsistente weefselbeschadiging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Er is een snel groeiende hoeveelheid literatuur over LITT; Het is echter voornamelijk beperkt tot klinische casestudy's of casusreeksen bij mensen. Er zijn inderdaad verschillende potentiële voordelen voor LITT aangetoond, waaronder lagere postoperatieve complicaties en kosten, terwijl een vergelijkbare progressievrije overleving wordt verleend 7,8,9,10,11. Er is ook een vermindering van lokale recidieven met het grotere succes van systemische medicamenteuze behandeling, hoewel de redenen nog niet goed worden begrepen12. Bovendien omvatten veelbelovende resultaten voor klinische toepassingen buiten GB de behandeling van metastasen en andere tumortypen 3,12, stralingsnecrose13, refractaire epilepsie14, vasculaire misvormingen15 en zelfs obsessief-compulsieve stoornis16. Omgekeerd is onderzoek met een muizenmodel tot nu toe zeer beperkt, met enkele opmerkelijke uitzonderingen, en die kunnen moeilijk te repliceren zijn. In een recent onderzoek naar veranderingen in de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière na LITT-behandeling werd bijvoorbeeld een lasergenerator gebruikt die in Europa werd verkocht voor klinisch gebruik, maar dit instrument is niet goedgekeurd in Noord-Amerika17. Hoewel een dergelijk systeem zeer geschikt lijkt voor hun onderzoek, is het verkrijgen van het apparaat waarschijnlijk onbetaalbaar voor de meeste onderzoekers, en eventuele eigen of hoogtechnologische functies zijn moeilijk te repliceren. Als zodanig zal een gedetailleerd protocol van een toegankelijk en geoptimaliseerd preklinisch diermodel waardevolle onderzoeksmogelijkheden bieden.

Kritieke stappen in het protocol zijn onder meer de nauwkeurige identificatie van Bregma voor reproduceerbare targeting tijdens zowel de allotransplantatie als de daaropvolgende LITT-ablatieoperatie. Bovendien is speciale aandacht besteden aan de injectiestappen ten opzichte van de toedieningssnelheid en pauzes van het grootste belang voor succesvolle tumorceltransplantaten, en als u dit niet doet, neemt het risico op extracraniële tumorgroei en grotere tumorvariabiliteit aanzienlijk toe. Het is ook belangrijk om te benadrukken dat de LITT-operatie moet worden gepland terwijl de tumor nog relatief klein is (d.w.z. ~1,5-2,0 mm in diameter). Onze ervaring is dat de CT2A-tumoren vaak variabeler van vorm worden wanneer grote, en zeer grote tumoren verhogen ook de moeilijkheid om de hersenen te extraheren, vooral als de tumor door het corticale oppervlak is gegroeid. Er moet ook worden opgemerkt dat slechts 24 uur, zoals tussen de MRI vóór de behandeling en de LITT-operatie, voldoende tijd is voor een aanzienlijke hoeveelheid aanhoudende CT2A-glioomgroei.

Er kunnen eenvoudig verschillende wijzigingen in dit protocol worden aangebracht om het aan te passen aan andere experimentele ontwerpen. Dit protocol richt zich met name op de technische stappen die nodig zijn voor succesvolle orthotope implantatie en LITT-operaties in een C57BL/6 syngeen CT2A-muismodel. Het beschreven model kan echter gemakkelijk worden vervangen om tegemoet te komen aan verschillende experimentele doelen. Minder agressieve syngene kankercellijnen zoals K1491 kunnen worden gebruikt om experimenten uit te voeren die langere tijdstippen vereisen, zoals die met aangeboren en adaptieve immuunresponsen. Als alternatief, voor experimenten die niet gericht zijn op adaptieve tumor-gastheerresponsen, zijn van de patiënt afgeleide cellijnen of andere xenotransplantaatmodellen in immuungecompromitteerde muismodellen een andere haalbare optie. Voor de geïnteresseerde lezer geven Haddad et al. (2021) een uitgebreid overzicht van de sterke punten en beperkingen van verschillende veel voorkomende allotransplantaat- en xenotransplantaatglioommuismodellen4. Een andere eenvoudige wijziging, afhankelijk van de beschikbaarheid en richtlijnen van de instelling, is de vervanging van inhalatie-anesthetica door injecteerbare alternatieven zoals een combinatie van ketamine en xylazine ± acepromazine. Wanneer er echter inhalatiemiddelen en de benodigde apparatuur beschikbaar zijn (d.w.z. stereotactische neuskegel), raden we het gebruik ervan om verschillende redenen aan. Ten eerste zijn we van mening dat inhalatie-anesthetica het veiligere alternatief zijn, omdat ze geen intraperitoneale injectie vereisen, geen herhaalde dosering vereisen voor langere of meer uitdagende operaties en gemakkelijk kunnen worden getitreerd met een brede veiligheidsmarge18. Bovendien vereist inhalatie-anestheticum niet het gebruik van gereguleerde stoffen en zorgt het voor een snel ontwaken en herstel na de operatie.

Het oplossen van problemen met dit protocol zou minimaal moeten zijn, waarbij de meeste problemen voortkomen uit een slechte injectietechniek die resulteert in onregelmatige tumorvorming of extracraniële groei. LITT-richtproblemen kunnen worden verholpen met de juiste identificatie van de oriëntatiepunten, de juiste laservezelstabilisatie en zorgvuldige observatie van de laservezel tijdens het inbrengen om ervoor te zorgen dat deze de zijkant van het braamgat niet raakt en uit koers wordt geduwd.

Beperkingen van de methode zijn onder meer het gemiddelde tot gevorderde niveau van chirurgische en technische vaardigheden die nodig zijn om de procedures uit te voeren, toegang tot gespecialiseerde apparatuur zoals een MRI-machine voor kleine dieren en een langdurig orthotopisch implantatieprotocol, dat het aantal injecties dat op één dag kan worden uitgevoerd, beperkt. Aangezien dit protocol bedoeld is als een preklinisch model van hooggradig glioom, zijn er ook inherente beperkingen die verband houden met de agressievere aard van sommige glioomcellijnen, zoals CT2A. Inentingen met een laag celaantal, een diepe injectieplaats in het striatum, een zorgvuldige injectietechniek en vroege behandeling zullen deze problemen helpen verminderen, maar af en toe extracraniële of onregelmatige tumorgroei kan nog steeds optreden en korte experimentele ontwerpen zijn gerechtvaardigd. Zoals besproken, is aanpassing van dit protocol met een minder agressieve cellijn ook gemakkelijk te bereiken.

Aangezien dit protocol, voor zover wij weten, de enige gedetailleerde beschrijving is van een preklinisch muizenmodel voor LITT van GB, is het een belangrijke stap in de richting van een goed onderbouwd model voor toekomstig fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.

Openbaarmakingen

We zijn dankbaar voor de steun van Monteris Medical, inclusief de donatie in natura van laserapparatuur.

Dankbetuigingen

Financieringsbronnen voor dit project zijn onder meer de Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M en University of Manitoba Graduate Fellowship. CT2A glioomcellijn genereus gedoneerd door Dr. Peter Fecci aan de Duke University, Durham, NC. We willen ook het Histology Service Lab en de Small Animal and Material Imaging Core-faciliteit van de Universiteit van Manitoba bedanken voor hun uitstekende technische hulp bij dit project.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorbion SpearsFST18105-01Hemostatische sponzen.
Adson tissue forcepsFST11006-12
C57BL/6 muizenJackson LaboratoriesStrain #0006646 tot 12 weken oude mannetjes en vrouwtjes
Wattenstaafjes met katoen (6")Electron Microscopy Sciences72308
CT2A glioma cellijnVrijgegeven door Dr. Peter Fecci, Duke University.
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClearBiotechne, R&D systems3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Dual-chamber slides BIO-RAD1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mLEppendorf22363352
Ethyl Alcohol AnhydrousGreenfield GlobalP016EAANVerdun tot 70% met ddH2O
Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, CanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Seal plasticfolieAmazon.ca12587704417
HogesnelheidsboorKopf InstrumentsModel 1474
K & J Thermokoppel temperatuurmeterOmegaHH509R
Metacam (meloxicam)WDDC114424
Microinjectie pompWPIUMP3T-1
Microliter spuit (700 Serie)Hamilton87908Aangepaste naalden zijn beschikbaar. Een steile naaldbevel helpt bij nauwkeurige afgifte, en een kortere naaldlengte helpt bij stabiliteit.
Naalddriver/NaaldhouderFST12500-12Een fijne punt is het meest geschikt vanwege de beperkte werkruimte, maar veel stijlen zijn geschikt op basis van handgreekvoorkeur.
Opixcare Plus oftalmisch zalfWDDC135941
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x)Fisher bioreagentsBP399-4Verdun tot 1x met ddH2O
Povidon-jodiumThermoFisher Scientific3955-16In kleine buisjes verdelen voor gebruik met wattenstaafjes met katoen.
Zoutoplossing (normaal)WDDC126588
Scalpel, eenmalig gebruik (#15 Blad)FeatherFeather NO15
Schaar, fijn chirurgischFST91460-11Fijne studenten schaar, Iris, of Bonn zijn allemaal geschikt.
Stereotactisch frameKopf InstrumentsModel 940Met digitale display console en muis neuskoker en oorstangen.
Stereotactisch spuithouderKopf InstrumentsModel 1772-FIndien geen injectiepomp wordt gebruikt.
Hechtdraad (5-0 monofilament)EthiconMCP463GMonocryl violet monofilament met omgekeerde snijtip
Spuit, 28 G  (0,5 mL) BDBD 329461BD Lo-Dose U-100 Insuline Spuiten
TC20 geautomatiseerde celtellerBIO-RAD1450102
Thermokoppel sonde, fijne diameter (Type K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Trypsin-EDTA (0,25%), fenol roodGibco, ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond by 3M, veterinair weefselkleefstof WDDC126125
Wahl Peanut ClippersWDDC/Wahl100963Ook verkrijgbaar direct bij de fabrikant.
OpwarmingskussenBensen Medical70308/121873Elk soortgelijk item kan worden gebruikt.
Webcol Alcohol prepsElectron Microscopy Sciences71005-20Alcohol prep doekje, 2-laags, medium maat.

Referenties

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glioblastoom muismodelAblatie van hersentumorStereotactische chirurgieCT2A glioomcellenTumormicro omgevingThermische weefselablatieMRI beeldvormingTumorimplantatieWeefselnecrose

Gerelateerde artikelen