Methodenartikel

Op flowcytometrie gebaseerde isolatie en therapeutische evaluatie van tumor-infiltrerende lymfocyten in een muismodel van alvleesklierkanker

DOI:

10.3791/67413

⸱

17 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode om tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) van muizen te gebruiken door middel van flowcytometrie voor adoptieve celoverdracht. Dit protocol heeft tot doel de specifieke cytotoxiciteit van TIL's tegen tumoren in een syngene alvleesklierkanker muismodel te verifiëren en inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van adoptieve celtherapieën voor alvleesklierkanker.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alvleesklierkanker is een agressieve maligniteit met een sombere prognose en beperkte therapeutische opties. Adoptieve celtherapie, waarbij de eigen immuuncellen van een patiënt, zoals tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's), worden geïsoleerd en geactiveerd voordat ze opnieuw worden toegediend, vertegenwoordigt een veelbelovende experimentele benadering. Technieken voor adoptieve celoverdracht in preklinische modellen van alvleesklierkanker zijn echter niet goed ingeburgerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor adoptieve celtherapie met behulp van TIL's van een syngene alvleesklierkanker muismodel. De procedure omvat het implanteren van levende of bestraalde alvleesklierkankercellen van muizen in fluorescentie-gelabelde reportermuizen om de instroom van immuuncellen op gang te brengen, vervolgens lymfocyten te isoleren uit primaire tumoren via flowcytometrie sorteren en/of tumorreactieve T-cellen ex vivo te activeren en uit te breiden, en deze geactiveerde T-cellen adoptief intraperitoneaal over te brengen naar tumordragende muizen, gevolgd door toediening van interleukine-2. Bioluminescente tumorbeeldvorming maakt longitudinale monitoring van orthotope tumorgroei en respons op therapie mogelijk, met name het evalueren van de tumorspecifieke cytotoxische effecten. Deze benadering vat de logistiek samen die betrokken is bij de ontwikkeling van adoptieve celoverdrachtstherapieën voor patiënten met alvleesklierkanker. De resultaten tonen een verbeterde antitumorwerkzaamheid aan van adoptief overgebrachte tumorreactieve T-cellen in vergelijking met irrelevante lymfocytencontroles. Deze veelzijdige methodologie maakt het mogelijk om in vivo onderzoek te doen naar adoptieve immunotherapie bij alvleesklierkanker, evenals om de parameters voor celverwerking en combinatiebehandelingsregimes te optimaliseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunotherapie bij alvleesklierkanker staat nog in de kinderschoenen, met voortdurende preklinische exploratie en validatie, voornamelijk in muismodellen1. De huidige behandelingen voor alvleesklierkanker omvatten chirurgie, chemotherapie, radiotherapie en gerichte therapieën. Helaas slagen deze methoden er vaak niet in om tumorlaesies volledig uit te roeien, wat leidt tot recidief en progressie. Traditionele behandelingen richten zich op tumorcellen, maar zien vaak de tumormicro-omgeving (TME) over het hoofd, die zowel tumorcellen als geassocieerd stroma omvat dat bestaat uit tumor-infiltrerende lymfocyten (TI....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muizenkolonie is gehuisvest in een door AAALAC International geaccrediteerde faciliteit, die zich houdt aan alle relevante USDA-, HHS- en NIH-voorschriften en -normen. Het Tianjin Medical University Cancer Institute en het Hospital Animal Care and Use Committee hebben alle dierprocedures beoordeeld en goedgekeurd, inclusief de grondgedachte voor stamselectie, experimentele groepstoewijzingen en de statistische rechtvaardiging voor dieraantallen en randomisatie.

1. Tumor inductie

  1. Gebruik de KPC-Luc cellijn11 om orthotope pancreastumoren bij muizen te in....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontvangende muizen worden verdeeld in zeven groepen om de werkzaamheid van de TIL-overdracht grondig te evalueren: (a) Zoutoplossingcontrole (blancocontrole): muizen die zoutoplossinginjecties krijgen om als basislijn te dienen. b) alleen IL-2 (blancocontrole): muizen die IL-2-injecties krijgen om rekening te houden met de eventuele effecten van het cytokine alleen. c) Dezelfde enkelvoudige behandeling als voor de behandelde donormuizen (positieve cont.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potentiële immunotherapie voor alvleesklierkanker kan het immuunsysteem versterken om tumorcellen aan te pakken en te elimineren, waarbij adoptieve immunotherapie, immuuncheckpointremmers en tumorvaccins betrokken zijn12. TIL-therapie extraheert en expandeert lymfocyten uit tumoren, die vervolgens opnieuw bij patiënten worden toegediend. In vergelijking met andere adoptieve celtherapieën heeft TIL-therapie een diverse TCR-klonaliteit, een superieur vermogen om de .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben verklaard geen belangenconflicten te hebben. Tijdens het gebruik van ChatGPT en Claude-3 voor taalbewerking, hebben de auteurs de woorden en zinnen die door ChatGPT of Claude-3 zijn gegenereerd, zorgvuldig beoordeeld en gevalideerd voordat ze in het artikel werden opgenomen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC), subsidienummer 82272767 en 82072691 aan Y.M. De auteurs bedanken hun teamleden voor hun discussie en medewerking.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bioluminescent imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumVoor het monitoren van tumorgroei
Bovine Serum Albumin VSolarbioA8020Voor celresuspendering
Cell strainer (40 μm of 70 μm)JetCSS013040Voor het filteren van celsuspensies
CentrifugeEppendorf5810RVoor celcollectie en -voorbereiding
CO2 kamerTianjin LiliangN/AVoor het euthanaseren van muizen
CollagenaseSigma-AldrichC5138Voor de verteringsoplossing
CD3-APC antilichaamBiolegend100236Voor flow cytometry kleuring
CD45-APC/Fire750 antilichaamBiolegend100154Voor flow cytometry kleuring
C57BL/6 albino muizenJackson Laboratory58Donor- en ontvangende muizen
Dispase IIGibco17105-041Voor de verteringsoplossing
DNase ISparkJadeAC1711Voor de verteringsoplossing
D-Luciferine kaliumzoutBeyotimeST198-10gVoor live beeldvorming
Ethanol (75%)N/AVoor sterilisatie
Fc blockersBD Biosciences553142Voor flow cytometry kleuring
Fetaal runder serumGibcoA5669701Voor celcultuur
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria IIIVoor celsortering
IL-2 (Interleukine-2)PeproTech200-02Voor toediening na transfer
IsofluraanShandong AnteN/AVoor narcose
KPC-Luc cellijnPI lab gegenereerdN/AVoor het induceren van orthotopische pancreastumoren
Matrigel MatrixCorning356234Voor orthotopische implantatie
PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing)ServicebioG4207-500MLVoor het wassen en opnieuw suspenderen van cellen
RPMI 1640 mediumGibco11875093Voor het bereiden van verteringsoplossing
Steriele kapESCON/AVoor steriele tumorextractie en verwerking
Steriele schaar en pincetN/AVoor tumorextractie
Hechtdraad (4-0, PGA absorberbaar hechtdraad)Jinhuan MedicalR413Voor wondsluiting
SpuitJiangxi Fenglin1 mL 0.45 × 16RWLBVoor injectie
Weefselcultuurplaat 12 putjesJetTCP001012Voor tumorvertering

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adoptive Cell TherapyPancreatic Cancer ModelTIL IsolationTumor Reactive T CellsBioluminescent ImagingCell SortingInterleukin 2 AdministrationOrthotopic Tumor

Gerelateerde artikelen