Methodenartikel

Op flowcytometrie gebaseerde isolatie en therapeutische evaluatie van tumor-infiltrerende lymfocyten in een muismodel van alvleesklierkanker

DOI:

10.3791/67413

⸱

17 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode om tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) van muizen te gebruiken door middel van flowcytometrie voor adoptieve celoverdracht. Dit protocol heeft tot doel de specifieke cytotoxiciteit van TIL's tegen tumoren in een syngene alvleesklierkanker muismodel te verifiëren en inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van adoptieve celtherapieën voor alvleesklierkanker.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alvleesklierkanker is een agressieve maligniteit met een sombere prognose en beperkte therapeutische opties. Adoptieve celtherapie, waarbij de eigen immuuncellen van een patiënt, zoals tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's), worden geïsoleerd en geactiveerd voordat ze opnieuw worden toegediend, vertegenwoordigt een veelbelovende experimentele benadering. Technieken voor adoptieve celoverdracht in preklinische modellen van alvleesklierkanker zijn echter niet goed ingeburgerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor adoptieve celtherapie met behulp van TIL's van een syngene alvleesklierkanker muismodel. De procedure omvat het implanteren van levende of bestraalde alvleesklierkankercellen van muizen in fluorescentie-gelabelde reportermuizen om de instroom van immuuncellen op gang te brengen, vervolgens lymfocyten te isoleren uit primaire tumoren via flowcytometrie sorteren en/of tumorreactieve T-cellen ex vivo te activeren en uit te breiden, en deze geactiveerde T-cellen adoptief intraperitoneaal over te brengen naar tumordragende muizen, gevolgd door toediening van interleukine-2. Bioluminescente tumorbeeldvorming maakt longitudinale monitoring van orthotope tumorgroei en respons op therapie mogelijk, met name het evalueren van de tumorspecifieke cytotoxische effecten. Deze benadering vat de logistiek samen die betrokken is bij de ontwikkeling van adoptieve celoverdrachtstherapieën voor patiënten met alvleesklierkanker. De resultaten tonen een verbeterde antitumorwerkzaamheid aan van adoptief overgebrachte tumorreactieve T-cellen in vergelijking met irrelevante lymfocytencontroles. Deze veelzijdige methodologie maakt het mogelijk om in vivo onderzoek te doen naar adoptieve immunotherapie bij alvleesklierkanker, evenals om de parameters voor celverwerking en combinatiebehandelingsregimes te optimaliseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunotherapie bij alvleesklierkanker staat nog in de kinderschoenen, met voortdurende preklinische exploratie en validatie, voornamelijk in muismodellen1. De huidige behandelingen voor alvleesklierkanker omvatten chirurgie, chemotherapie, radiotherapie en gerichte therapieën. Helaas slagen deze methoden er vaak niet in om tumorlaesies volledig uit te roeien, wat leidt tot recidief en progressie. Traditionele behandelingen richten zich op tumorcellen, maar zien vaak de tumormicro-omgeving (TME) over het hoofd, die zowel tumorcellen als geassocieerd stroma omvat dat bestaat uit tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's), fibroblasten en extracellulaire matrix2. TIL's zijn immuuncellen binnen de TME, waaronder cytotoxische T-cellen, helper-T-cellen, regulerende T-cellen, B-cellen, NK-cellen, macrofagen en van myeloïde afgeleide suppressorcellen3. Deze cellen nemen deel aan immuunresponsen die de tumorgroei en therapeutische resultaten beïnvloeden4.

Adoptieve celtherapie (ACT) omvat het verzamelen van de immuuncellen van een patiënt, deze in vitro wijzigen en uitbreiden, en ze vervolgens opnieuw introduceren om tumorcellen te richten en te doden. TIL-therapie, een vorm van ACT, wordt onderzocht voor de behandeling van verschillende vormen van kanker, waaronder melanoom, longkanker en baarmoederhalskanker. Dit proces omvat het isoleren van lymfocyten uit de tumor, het kweken ervan met IL-2 in vitro en het opnieuw inbrengen ervan in de patiënt, vaak na lymfodepletie met chemotherapie of radiotherapie5.

Sinds de studie van Rosenberg uit 1986 de werkzaamheid van TIL's bij muizen aantoonde6, is immunotherapie met adoptieve celoverdracht een onderzoekshotspot geworden en veelbelovend gebleken bij de behandeling van kanker 7,8,9,10. We streven ernaar TIL's uit muizen te extraheren, ze te sorteren op specifieke T-cellen via flowcytometrie en hun tumordodende effecten te valideren door middel van adoptieve overdracht.

In dit protocol beschrijven we een methode om TIL's van muizen te gebruiken door middel van flowcytometrie voor adoptieve celoverdracht. Het doel is om de specifieke cytotoxiciteit van TIL's tegen tumoren te verifiëren in een syngene alvleesklierkanker muismodel, en inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van adoptieve celtherapieën voor alvleesklierkanker. Deze methode omvat het implanteren van levende of bestraalde alvleesklierkankercellen van muizen in fluorescentie-gelabelde reportermuizen om de instroom van immuuncellen op gang te brengen, het isoleren van lymfocyten uit primaire tumoren via flowcytometriesortering, of het activeren en uitbreiden van tumorreactieve T-cellen ex vivo, en het adoptief overbrengen van deze geactiveerde T-cellen naar tumordragende muizen. Daaropvolgende toediening van interleukine-2 en bioluminescente tumorbeeldvorming maakt longitudinale monitoring van orthotope tumorgroei en respons op therapie mogelijk, met name het evalueren van tumorspecifieke cytotoxische effecten. Deze benadering vat de logistiek samen die betrokken is bij de ontwikkeling van adoptieve celoverdrachtstherapieën voor patiënten met alvleesklierkanker. De resultaten tonen een verbeterde antitumorwerkzaamheid aan van adoptief overgebrachte tumorreactieve T-cellen in vergelijking met irrelevante lymfocytencontroles. Deze veelzijdige methodologie maakt de in vivo studie van adoptieve immunotherapie bij alvleesklierkanker mogelijk, evenals de optimalisatie van celverwerkingsparameters en combinatiebehandelingsregimes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muizenkolonie is gehuisvest in een door AAALAC International geaccrediteerde faciliteit, die zich houdt aan alle relevante USDA-, HHS- en NIH-voorschriften en -normen. Het Tianjin Medical University Cancer Institute en het Hospital Animal Care and Use Committee hebben alle dierprocedures beoordeeld en goedgekeurd, inclusief de grondgedachte voor stamselectie, experimentele groepstoewijzingen en de statistische rechtvaardiging voor dieraantallen en randomisatie.

1. Tumor inductie

  1. Gebruik de KPC-Luc cellijn11 om orthotope pancreastumoren bij muizen te induceren.
  2. Bereid een celsuspensie voor door de KPC-Luc-cellen te trypsiniseren, ze twee keer te wassen met PBS en ze opnieuw te suspenderen in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml in PBS met een 30% basaalmembraanmatrix (BMM).
  3. Verdoof de muis met isofluraan bij een inductiedosis van 4% en schakel vervolgens over op een onderhoudsdosis van 2%. Zorg voor thermische ondersteuning met behulp van een verwarmingskussen en monitor indien nodig. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
  4. Desinfecteer het operatiegebied meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel een scrub op basis van jodium als alcohol. Dien voorafgaand aan de operatie een subcutane injectie met carprofen 5 mg/kg toe als analgesie. Gebruik een steriel scalpelmes om een kleine incisie in de linkerbuik (0,5-1 cm) onder de linkerrib van de muis uit te voeren om de alvleesklier bloot te leggen.
  5. Gebruik een tang om de milt van de muis vast te houden en de alvleesklier van de muis bloot te leggen, meng cellen en injecteer ze in de alvleesklier van de muis met 50.000 cellen per muis. Injecteer 50 μL van de celsuspensie rechtstreeks in de alvleesklier met behulp van een naald van 29 G.
  6. Breng de alvleesklier van de muis terug en hecht achtereenvolgens het buikvlies en de huid met hechtingen.
  7. Laat de muis herstellen op een warm kussentje totdat hij volledig wakker is. Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe als analgesie na de operatie, dagelijks gedurende 3 dagen.
  8. Voer 7 dagen na de injectie live beeldvorming uit om de tumorgroei te controleren.
    OPMERKING: Behandelingen kunnen in deze stap worden toegediend.
    1. Injecteer de muis intraperitoneaal met D-luciferine-kaliumzout (150 μg/ml in PBS, 60 μl per muis).
    2. Plaats na isofluraan-anesthesie de muis in het in vivo beeldvormingssysteem voor detectie van bioluminescentie. Haal de muis na de beeldvorming uit het systeem en laat hem op natuurlijke wijze herstellen van de anesthesie.

2. Oogst tumoren

  1. Euthanaseer de donormuizen met behulp van een CO2 -kamer. Steriliseer het hele lichaam met 75% ethanol.
  2. Plaats de muis in een steriele kap. Gebruik een steriele schaar en pincet om de buikholte te openen.
  3. Verwijder de tumoren en plaats ze in PBS op ijs. Meet de tumorgrootte met een noniusschuifmaat en bereken het tumorvolume met behulp van de formule (π x lengte × breedte × breedte)/6.

3. Tumor spijsvertering

  1. Bereid de digestieoplossing voor door 0,125 mg/ml collagenase, 0,125 mg/ml Dispase II en 10 μg/ml DNase I in RPMI 1640 als 1x concentratie te maken. Voeg 1-2 ml digestieoplossing per putje toe in een plaat met 12 putjes.
  2. Hak de tumoren in kleine stukjes met een steriele schaar. Verteer de tumorstukjes bij 37°C en schud ze 30 minuten bij 70 tpm.

4. Cel verzameling

  1. Beëindig de spijsvertering door 2-4 ml 10% foetaal runderserum toe te voegen. Breng alle cellen over naar een verzamelbuisje.
  2. Was de putjes twee keer met PBS om eventuele resterende cellen te verzamelen. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 40 μm of 70 μm.
  3. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 5% BSA voor flowcytometriekleuring.

5. Voorbereiding van flowcytometrie

  1. Bereid milt of perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van niet-tumordragende muizen voor als controles.
    OPMERKING: Optioneel: PBMC's van tumordragende muizen kunnen ook als controles worden gebruikt.
  2. Kleur cellen met Fc-blokkers (<1 μg per miljoen cellen) en flow-antilichamen (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 in een verdunning van 1:100).
  3. Incubeer 30 minuten op ijs in het donker. Was tweemaal met koude PBS en suspendeer de cellen in 1% BSA in PBS.

6. Sorteren van cellen

  1. Sorteer CD45+CD3+-cellen met behulp van een flowcytometer. Gate live cellen op basis van FSC-A en SSC-A (P1). Gate vervolgens enkele cellen van P1 op basis van FSC-A en FSC-H (P2).
  2. Sorteer ten slotte CD45+CD3+ van P2 met behulp van CD45 en CD3 gating en verzamel ze in de verzamelbuizen. Zorg voor een goede resuspensie en behoud van de levensvatbaarheid van de cellen tijdens het sorteren.

7. Celvoorbereiding voor overdracht

  1. Centrifugeer gesorteerde cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in muizenserum in een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml. Houd de cellen op ijs.
    OPMERKING: Ex vivo kweek of activering van de gesorteerde cellen kan worden uitgevoerd.

8. Adoptieve overdracht

  1. Voer 7 dagen voor de overdrachtsdag tumorinductie uit voor de ontvangende muis.
  2. Injecteer 2 x 105 cellen per muis intraperitoneaal in de ontvangende muizen met behulp van een insulinespuit van 29 G x 1/2". Dien IL-2 (50 IE per muis) intraperitoneaal toe gedurende drie opeenvolgende dagen.

9. Tumor monitoring

  1. Voer live beeldvorming uit op dag 4 en dag 7 na de overdracht om de tumorgroei te beoordelen, met wekelijks aanvullende live beeldvorming met dezelfde procedure beschreven in stap 1.8.
  2. Follow-up van de overleving van de ontvangende muizen. Aan het einde van het experiment euthanaseert u de muis zoals hierboven beschreven. Gebruik een oogheelkundige schaar en tang om de tumoren te verwijderen en plaats ze vervolgens in PBS op ijs voor een snelle meting van de tumorgrootte en kan de daaropvolgende experimenten indien nodig voortzetten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontvangende muizen worden verdeeld in zeven groepen om de werkzaamheid van de TIL-overdracht grondig te evalueren: (a) Zoutoplossingcontrole (blancocontrole): muizen die zoutoplossinginjecties krijgen om als basislijn te dienen. b) alleen IL-2 (blancocontrole): muizen die IL-2-injecties krijgen om rekening te houden met de eventuele effecten van het cytokine alleen. c) Dezelfde enkelvoudige behandeling als voor de behandelde donormuizen (positieve cont...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potentiële immunotherapie voor alvleesklierkanker kan het immuunsysteem versterken om tumorcellen aan te pakken en te elimineren, waarbij adoptieve immunotherapie, immuuncheckpointremmers en tumorvaccins betrokken zijn12. TIL-therapie extraheert en expandeert lymfocyten uit tumoren, die vervolgens opnieuw bij patiënten worden toegediend. In vergelijking met andere adoptieve celtherapieën heeft TIL-therapie een diverse TCR-klonaliteit, een superieur vermogen om de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben verklaard geen belangenconflicten te hebben. Tijdens het gebruik van ChatGPT en Claude-3 voor taalbewerking, hebben de auteurs de woorden en zinnen die door ChatGPT of Claude-3 zijn gegenereerd, zorgvuldig beoordeeld en gevalideerd voordat ze in het artikel werden opgenomen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC), subsidienummer 82272767 en 82072691 aan Y.M. De auteurs bedanken hun teamleden voor hun discussie en medewerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bioluminescent imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumVoor het monitoren van tumorgroei
Bovine Serum Albumin VSolarbioA8020Voor celresuspendering
Cell strainer (40 μm of 70 μm)JetCSS013040Voor het filteren van celsuspensies
CentrifugeEppendorf5810RVoor celcollectie en -voorbereiding
CO2 kamerTianjin LiliangN/AVoor het euthanaseren van muizen
CollagenaseSigma-AldrichC5138Voor de verteringsoplossing
CD3-APC antilichaamBiolegend100236Voor flow cytometry kleuring
CD45-APC/Fire750 antilichaamBiolegend100154Voor flow cytometry kleuring
C57BL/6 albino muizenJackson Laboratory58Donor- en ontvangende muizen
Dispase IIGibco17105-041Voor de verteringsoplossing
DNase ISparkJadeAC1711Voor de verteringsoplossing
D-Luciferine kaliumzoutBeyotimeST198-10gVoor live beeldvorming
Ethanol (75%)N/AVoor sterilisatie
Fc blockersBD Biosciences553142Voor flow cytometry kleuring
Fetaal runder serumGibcoA5669701Voor celcultuur
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria IIIVoor celsortering
IL-2 (Interleukine-2)PeproTech200-02Voor toediening na transfer
IsofluraanShandong AnteN/AVoor narcose
KPC-Luc cellijnPI lab gegenereerdN/AVoor het induceren van orthotopische pancreastumoren
Matrigel MatrixCorning356234Voor orthotopische implantatie
PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing)ServicebioG4207-500MLVoor het wassen en opnieuw suspenderen van cellen
RPMI 1640 mediumGibco11875093Voor het bereiden van verteringsoplossing
Steriele kapESCON/AVoor steriele tumorextractie en verwerking
Steriele schaar en pincetN/AVoor tumorextractie
Hechtdraad (4-0, PGA absorberbaar hechtdraad)Jinhuan MedicalR413Voor wondsluiting
SpuitJiangxi Fenglin1 mL 0.45 × 16RWLBVoor injectie
Weefselcultuurplaat 12 putjesJetTCP001012Voor tumorvertering

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
  7. Leidner, R., et al. Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer. N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).
  8. Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. Science (New York, N.Y.). 375 (6583), 877-884 (2022).
  9. Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers. Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).
  10. Yossef, R., et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).
  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
  12. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  13. Mullard, A. FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers. Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238(2024).
  14. Morotti, M., et al. PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function. Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).
  15. Chupp, D. P., et al. A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).
  16. Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. Nat Med. 29 (6), 1336-1337 (2023).
  17. Wang, A. Z., et al. Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population. Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).
  18. Chen, Y., et al. A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy. Adv Mater. 36 (3), e2306736(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adoptive Cell TherapyPancreatic Cancer ModelTIL IsolationTumor Reactive T CellsBioluminescent ImagingCell SortingInterleukin 2 AdministrationOrthotopic Tumor

Gerelateerde artikelen