Methodenartikel

Spirometrie met hoge resolutie in een kamer met een klein volume

DOI:

10.3791/67442

⸱

25 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten we zien dat de kamer van 0,5 ml voor respirometrie met hoge resolutie resultaten laat zien die consistent zijn met die van de kamer van 2,0 ml als de juiste instrumentele O2-achtergrondcorrectie wordt toegepast. Er is minder monster nodig, wat gunstig is voor studies met een beperkte beschikbaarheid of een lage ademhalingscapaciteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van ademhalingsfluxen is doorslaggevend voor het begrijpen van de complexe wisselwerking tussen metabolische processen. Studies van cellen en weefsels met een beperkte beschikbaarheid van monsters en lage ademhalingsfrequenties kunnen baat hebben bij kleine experimentele volumes. We hebben onderzocht of de kamer van 0,5 ml resultaten oplevert die consistent zijn met de kamer van 2,0 ml bij identieke monsterconcentraties die worden gebruikt in respirometrie met hoge resolutie met de Oroboros. De achtergrondflux van O2 was 4 keer hoger in kamers van 0,5 ml dan 2,0 ml bij luchtverzadiging, maar was reproduceerbaar, waardoor een nauwkeurige achtergrondcorrectie mogelijk was. De optimale roersnelheid lag tussen 550 omwentelingen per minuut (tpm) en 750 tpm in de kamer van 0,5 ml. Respiratoire fluxen in levende cellen, gepermeabiliseerde cellen en geïsoleerde mitochondriën werden parallel gemeten in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml, met behulp van Substrate-Uncoupler-Inhibitor Titratieprotocollen met 14 tot 20 titraties. O2 fluxen in de verschillende kamertypen waren identiek binnen de detectiegrenzen. De kamer van 0,5 ml, waarvoor bijna vier keer minder monster nodig is dan de kamer van 2,0 ml, biedt een aanzienlijk voordeel voor onderzoeken met beperkte hoeveelheden monster of een lage ademhalingscapaciteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van mitochondriale ademhalingswegen is essentieel om licht te werpen op de metabole mechanismen die ten grondslag liggen aan verschillende ziekten, veroudering of reacties op stress, en zo potentiële doelen te bieden voor therapeutische interventies en de diagnostische mogelijkheden te verbeteren 1,2,3. Respirometrie met hoge resolutie (HRR) maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van de mitochondriale route en koppelingscontrole bij oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in een verscheidenheid aan monstertypes en preparaten4. Het volume van de experimentele kamer is een fundamenteel ontwerpkenmerk van respirometrische instrumenten. Het eerder vastgestelde kamervolume is 2,0 ml in de Oroboros. Dit volume is geoptimaliseerd om een lage instrumentale achtergrond-O2-flux met zich mee te brengen en homogeniteit van het geroerde medium te garanderen. Dit zijn enkele van de belangrijkste kwaliteitscriteria voor het nauwkeurig meten van de ademhaling bij zuurstofarme en hyperoxische omstandigheden die nodig zijn voor mitochondriale zuurstofkinetiek en gepermeabiliseerde spiervezels, respectievelijk 5,6,7,8,9. Bovendien hebben meerdere multisensorplaatsingen10 de ruimte van de kamer van 2,0 ml nodig (tabel 1).

In de huidige studie hebben we de haalbaarheid onderzocht van het verlagen van het kamervolume voor HRR van 2,0 ml naar 0,5 ml. Kunnen lagere celtellingen of hoeveelheden weefsel worden toegepast in respirometrische tests in een kleinere kamer zonder de nauwkeurigheid in gevaar te brengen? Verduidelijking van deze vraag is belangrijk voor het onderzoeken van biopten van menselijk weefsel en vloeistoffen, primaire cellen en langzaam groeiende celculturen1. Evenzo is een vermindering van het kamervolume potentieel voordelig bij studies van monsters met lage ademhalingsactiviteiten in defecte mitochondriën11 en mitochondriale routes met inherent lage capaciteiten, zoals vetzuuroxidatie in de hersenen12. De resolutie kan echter afnemen bij een kleine kamergrootte als gevolg van onevenredig toenemende artefacten van O 2-rugdiffusie en onnauwkeurige volumekalibratie13,14. Daarom analyseerden we de instrumentale prestaties van de Oroboros met de kamer met klein volume (sV) gekalibreerd op een minimaal experimenteel volume van 0,5 ml, vergeleken met de klassieke volumekamer (cV) gekalibreerd op 2,0 ml. In het bijzonder analyseerden we de instrumentale achtergrond O2 flux en optimale roersnelheid.

Substrate-uncoupler-inhibitor titratie (SUIT)-protocollen worden gebruikt om ademhalingsfrequenties en -toestanden in OXPHOS-analyse te beoordelen. SUIT-protocollen omvatten 14 tot 20 titraties per respirometrische test en omvatten respiratoire O2-fluxen, variërend van enkele pmol∙s-1∙mL-1 tot honderden pmol∙s-1∙mL-1. Koppelingscontroletoestanden omvatten de leksnelheid L, d.w.z. de dissipatieve component van de ademhaling, die niet beschikbaar is om adenosine-5'-difosfaat (ADP) te fosforyleren tot adenosine-5'-trifosfaat (ATP) en het gevolg is van protonlekkage, protonslip, kationencyclus en elektronenlek. De OXPHOS-capaciteit P is verantwoordelijk voor de ademhaling van mitochondriën wanneer elektronenoverdracht, gemeten als O2-consumptie (oxidatie) wordt gekoppeld aan ATP-synthese (fosforylering) in aanwezigheid van ADP. De elektronenoverdrachtscapaciteit E in ontkoppelde toestand wordt gekwantificeerd door titraties van een protonofoor in aanwezigheid van mitochondriale substraten15. Het restzuurstofverbruik rox wordt bepaald na toevoeging van de Complex I- en Complex III-remmers rotenon en antimycine A.

We maten de ademhaling van cellen en mitochondriale preparaten in de s, V en cV kamers. Bloedplaatjes zijn anucleate cytoplasmatische fragmenten van megakaryocyten en vertegenwoordigen een gemakkelijk verkrijgbare bron van menselijke mitochondriën. Daarom werden bloedplaatjes toegepast als model voor levende cellen (of celdeeltjes) met intacte plasmamembranen. Ademhaling van bloedcellen dient als een biomarker van systemische mitochondriale ziekten en correleert met de bio-energetische fitheid van metabolisch actieve organen 16,17,18,19, hoewel deze bevindingen niet kunnen worden gegeneraliseerd 20,21,22. Menselijke fibroblasten werden gekozen voor hun toepassing als een cellulair model van mitochondriale disfunctie 1,23,24,25. De intactheid van de plasmamembranen is noodzakelijk voor de levensvatbaarheid van de cellen, maar de selectieve permeabilisatie maakt de uitwisseling van moleculen tussen het cytosol en het omringende medium mogelijk. Daarom werden fibroblasten met chemisch gepermeabiliseerde plasmamembranen bestudeerd als een voorbeeld van gepermeabiliseerde cellen, vergeleken met geïsoleerde mitochondriën die werden gebruikt om de mitochondriale functie te beoordelen en die nodig waren om mitochondriale subpopulaties te scheiden26,27.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het onderzoek naar menselijke bloedplaatjes gaven acht vrijwilligers schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan het onderzoek, dat werd goedgekeurd door de Zweedse ethische beoordelingsautoriteit (nr. 2013/181). Twee fibroblastcellijnen van de menselijke huid van mannelijke pasgeborenen werden gekocht bij ATCC en gebruikt volgens de ethische goedkeuring van het Ministerie van Volksgezondheid van Tsjechië (project: AZV MZ CR NU22-07-00474). Procedures met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de Oostenrijkse wet op de dierproeven en in overeenstemming met het Europees Verdrag voor de bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (Tierversuchsgesetz 2012; Richtlijn 2010/63/EU; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Het 3V-principe werd toegepast om het aantal proefdieren te minimaliseren.

1. Kalibratie van het volume

  1. Monteer de kamers met een klein volume (sV) of de kamers met een klassiek volume (cV) op de Oroboros (Figuur 1A,B; Tabel 1).
  2. Zet de Oroboros aan en maak verbinding met DatLab.
  3. Droog de kamers.
  4. Pipetteer 0,54 ml H2O in de sV (0,50 ml effectief experimenteel volume plus 0,04 ml capillair dood volume) of 2,07 ml H2O in de cV (2,00 ml effectief volume plus 0,07 ml capillair dood volume).
    NOTITIE: Om vloeistofverlies tussen de bovenkant van de glazen cilinder en de polyoxymethyleen (POM) kamerhouder te voorkomen, steekt u de pipetpunt diep genoeg in om de wand van de glazen kamer te raken.
  5. Schakel de roerders in.
  6. Voordat u de kamer sluit, bevochtigt u de O-ringen van de stoppen terwijl u hun capillair droog houdt. Maak de volumekalibratieringen los en steek de stoppen naar beneden totdat de vloeistof de stop capillair vult en er een kleine druppel in de houder aan het bovenste uiteinde van het capillair verschijnt (Tabel 1).
  7. Draai de volumekalibratieringen vast om hun positie vast te zetten, zodat het gekalibreerde volume wordt verkregen bij het achtereenvolgens inbrengen van de stoppen.

2. Oroboros algemene instelling

  1. Start de DatLab software.
  2. Stel de experimentele temperatuur (37 °C) en de roerrotatiesnelheid in op 550 tpm (9.2 Hz of rotaties per s) in de kamer sV of 750 rpm (12.5 Hz) in de kamer cV. Stel het interval voor gegevensbemonstering in op 2 s met afvlakking over 80 s (40 datapunten) in instrumentele O2-achtergrondtests of 40 s (20 datapunten) voor respirometrie.
    OPMERKING: De magnetische roerstaafjes (AlNiCo gecoat met polyvinylideendifluoride [PVDF]; Tabel 1) worden geagiteerd door een gepulseerd roterend magnetisch veld met een veldsterkte van 3,5 mT ter hoogte van de roerder in de kamer.
  3. Voer luchtkalibratie28 uit in MiR05 of in hetzelfde incubatiemedium dat in latere experimenten wordt gebruikt.
  4. Voer af en toe zuurstofnulkalibraties uit, maar nooit direct voordat u met experimenten begint.
    1. Bereid een verse Na-dithionite stockoplossing door O2-Zero Powder op te lossen in 50 mM fosfaatbuffer (pH 8,0) tot een concentratie van respectievelijk 2,5 mM of 10 mM voor de sV of cV kamers.
    2. Titreer Na-dithioniet in overmaat om het ruwe signaal R0 of nulstroom [μA] te verkrijgen bij O2-concentratie 0 μM14,28.

3. Instrumentale O2 achtergrondtest

  1. Kamer sV
    1. Sluit na luchtkalibratie de kamer. Bewaak het zuurstofsignaal gedurende ongeveer 60 minuten totdat de O2-concentratie daalt van luchtverzadiging tot ongeveer 150 μM. Stel vier markeringen J°1 tot J°4 in op de grafiek 'O2 helling negatief'.
      OPMERKING: Voer deze instrumentale O2 achtergrondtest elke dag uit voordat u een experiment start.
    2. OPTIONEEL: Titreer met een Hamilton-spuit Na-dithioniet, bereid volgens stap 2.4.1, om een O2-concentratie van 100 μM te bereiken (figuur 1C).
      OPMERKING: In een ander protocol wordt Na-dithioniet in de kamer getitreerd met behulp van de titratie-injectiemicropomp (TIP2k; Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2) voor vergelijking met een standaardmethode voor het bepalen van de instrumentale achtergrond O2 flux28.
  2. Kamer cV
    1. Sluit na de luchtkalibratie de kamer, wacht tot de helling O2 is gestabiliseerd en plaats de J°1-markering op het perceel 'O2-helling neg.'28. Titreer Na-dithioniet bereid met een Hamilton-spuit volgens stap 2.4.1. in stappen van 0,7 μl om overeen te komen met het zuurstofregime van kamer sV en de O2-concentratie te verlagen tot 150 μM.
    2. Voeg nog een Na-dithioniettitratiestap toe (ca. 7 μl) om de O2-concentratie te verlagen tot 100 μM (figuur 1D).
  3. Instrumentele O2 analyse van achtergrondgegevens
    1. Bereken de instrumentale O2 achtergrondhelling in DatLab28. Selecteer Flux/Slope in het bovenste menu.
    2. Open het venster O2 achtergrondcorrectie . Selecteer Active File als bron van de O2-achtergrond en selecteer de J°-markeringen die moeten worden gebruikt voor de berekening van de lineaire regressie. Pas de O2 achtergrondcorrectie toe.

figure-protocol-1
Figuur 1: Kamers met een klein volume (sV) en een klassiek volume (cV) en instrumentale O2 achtergrondtest. (A) Kamers V. (B) Kamer cV. (C) Representatieve sporen van negatieve hellings- en J°1-markeringen, sV (0,5 ml; groen) en cV (2,0 ml; blauw). (D) Overeenkomstige zuurstofconcentratie en R1-markeringen. Drie handmatige Na-dithioniettitraties (ca. 0,7 μl, 10 mM aanvoeding; cV) en uiteindelijke 7,0 μl titratie van respectievelijk 2,5 mM en 10 mM in de sV en cV kamer. Pieken veroorzaakt door titraties werden geëlimineerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Toevoeging van het monster aan de Oroboros-kamers

OPMERKING: Het monster kan op twee manieren aan de kamer worden toegevoegd: gedeeltelijke volumevervanging (bloedplaatjes en fibroblasten in de huidige studie) of volledige volumevervanging (geïsoleerde mitochondriën in de huidige studie).

  1. Gedeeltelijke volumevervanging
    1. Verwijder de volledig ingestoken stop. Pipetteer en gooi deel Vuit MiR05 weg. Vout is 60-70 μL voor bloedplaatjes en 80-150 μL voor fibroblasten, berekend op basis van de celconcentraties in de stockcelsuspensie.
    2. Pipetteer hetzelfde volume VJ.i stockcelsuspensie (met bekende celconcentratie) in de kamer (figuur 2).
    3. Bereken de experimentele celconcentratie in het werkelijke volume V' (0,54 ml en 2,07 ml), groter dan het effectieve experimentele volume V (0,5 ml en 2,0 ml).
      OPMERKING: Concentraties van de stockcelsuspensie en experimentele celconcentratie moeten worden gepland om volumes van VJ.i = Vout te verkrijgen die compatibel zijn met een kleine titratiefout. In de experimenten met bloedplaatjes werd een prototype stop gebruikt voor de kamer sV met een capillair dood volume van 0,05 ml.
  2. Volledige volumevervanging
    1. Hevel het hele medium uit de kamer en vervang het door ten minste 0,54 ml of 2,07 ml geïsoleerde mitochondriënvoorraadoplossing bij de experimentele monsterconcentratie in respectievelijk de sV -of cv-kamers.
    2. Sluit de kamer en hevel de overtollige mitochondriale voorraadoplossing uit de stophouder.
      OPMERKING: Volledige volumevervanging sluit elke variabiliteit in mitochondriale concentratie uit die kan optreden door met een Hamilton-spuit in de gesloten kamer door het kurkcapillair te titreren. De laatste methode is van toepassing op monsters met een kleine diameter die zijn bereid in geconcentreerde bouillonsuspensies (bijv. geïsoleerde mitochondriën); het stelt echter fragiele cellen bloot aan mogelijke beschadiging van plasmamembranen door schuifkrachten die worden uitgeoefend in de 51 mm lange naald van de Hamilton-spuit (0,41 mm binnendiameter). Dit wordt voorkomen door de stop te verwijderen en het monster in de kamer te pipetteren door gedeeltelijke of volledige volumevervanging. Drie soorten mitochondriale preparaten werden bestudeerd. De monsterpreparaten worden beschreven in aanvullend dossier 1 1,26,29,30.
  3. Levende cellen: menselijke bloedplaatjes
    1. Steek de cryovials met bloedplaatjes in een waterbad van 37 °C en ontdooi de inhoud tot er weinig ijs overblijft.
    2. Open de cryovials en voeg langzaam 1 ml voorverwarmd medium (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) in druppels toe.
    3. Meng de bloedplaatjes voorzichtig en breng ze over in een centrifugebuis van 50 ml met een totaal volume van 10 ml voorverwarmd medium (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugeer bij 1000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) met behulp van een uitzwenkbare rotor (acceleratie 6, rem 2).
    4. Resuspendeer de bloedplaatjes in 0,25 ml DPBS + 10 mM EGTA (RT) en voeg ze toe aan de kamers door gedeeltelijke volumevervanging tot een initiële experimentele celconcentratie variërend van 157 · 106 tot 210 · 106 x·ml-1 in de kamer van 0,5 ml en vanaf 164 · 106 tot 220 · 106 x·ml-1 in de kamer van 2,0 ml (zie31 voor details over de elementaire eenheid x).
      OPMERKING: Eén Oroboros was uitgerust met de sV - encV-kamer in respectievelijk posities A en B, parallel gebruikt met een andere Oroboros die was uitgerust met de sV -en cv-kamer in respectievelijk posities B en A.
  4. Gepermeabiliseerde cellen: menselijke fibroblasten
    1. Voeg de cellen toe aan de Oroboros-kamers door gedeeltelijke volumevervanging tot een nominale celconcentratie van 0,75 · 106 x·ml-1 in beide kamertypes en bereken de werkelijke concentratie (stap 4.1.3).
      OPMERKING: Verschillende Oroboros-instrumenten werden parallel gebruikt, elk uitgerust met de sV - ofcv-kamers .
  5. Geïsoleerde mitochondriën: muizenhart
    1. Voeg 15 μL mitochondriale suspensie toe aan 5985 μL mitochondriaal ademhalingsmedium (MiR05), wat resulteert in een voorraad mitochondriale eiwitconcentratie variërend van 0,013-0,026 mg∙ml-1.
    2. Voeg de mitochondriale suspensie toe aan de Oroboros-kamers door volledige volumevervanging.
      OPMERKING: Eén Oroboros was uitgerust met de sV - encV-kamer in respectievelijk posities A en B, parallel gebruikt met een andere Oroboros uitgerust met de sV - encV-kamers in respectievelijk de posities B en A.

figure-protocol-2
Figuur 2: Toevoeging van de celsuspensie door gedeeltelijke volumevervanging. (A) Toevoeging in de kamer van 0,5 ml sV en (B) de kamer van 2,0 ml cV. (1) Gesloten kamer met volumes ademhalingsmedium V en gevulde stop capillaire Vstc, voor het meten van de instrumentele achtergrond O2 flux JO2°. (2) Stopper verwijderd, Vstc in de kamer afgevoerd, wat resulteert in totaal volume V'= V+Vstc. (3) Gedeeltelijke verwijdering van medium Vout = -V J.i. Een volume V''= V'+Vout blijft in de kamer. (4) Pipetteren van een submonster met volume V J.i respirometrische stockcelsuspensie in de kamer, resulterend in een totaal volume V# = V+Vstc verdunde celsuspensie. (5) Gesloten kamer met gevulde stopcapillair (dood volume Vstc) voor het meten van volumespecifieke O2-flux JV,O 2 in een experimenteel volume V. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Figuur 2A in Celtelling en normalisatie in HRR41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. SUIT-protocollen

  1. Titreer de voorraadoplossingen van de in aanvullende tabel 1 vermelde chemicaliën in de kamers met Hamilton-microspuiten en pas de titratievolumes aan om dezelfde experimentele concentraties in de sV - encV-kamers te verkrijgen (zie de legenda's van de figuren 6, 8 en 10).
  2. Selecteer protocol SUIT-003_D018 32,33 (voor bloedplaatjes in dit onderzoek).
  3. Selecteer protocollen SUIT-001_D004 4,15,34,35 en SUIT-002_D007 4,15,35,36 (voor fibroblasten in de huidige studie).
  4. Selecteer protocol SUIT-002_D005 4,15,35,37 (voor geïsoleerde mitochondriën in de huidige studie).

6. Analyse van SUIT-gegevens

  1. Stel in DatLab markeringen in om secties van geselecteerde plots te definiëren.
  2. Selecteer Flux/Slope in het bovenste menu. Open het venster Flux/Slope . Pas de titratievolumecorrectie toe voor verdunning van gesuspendeerde monsters bij elke titratie in het SUIT-protocol.
  3. Selecteer Markeringen in het hoofdmenu. Open Mark-statistieken om de mediaan van de gemarkeerde datapunten weer te geven, gecorrigeerd door het resterende zuurstofverbruik (rox) af te trekken.
  4. Bereken het snijpunt en de helling tussen de gepaarde resultaten verkregen in de sV en cV kamers door middel van omgekeerde regressieanalyse25,28 met behulp van een spreadsheet.
  5. Vergelijk de ademhalingsfrequenties in de rox-toestand (minimaal O2 fluxen) in de sV en cV kamers door middel van een gepaarde Student's t-test met behulp van de software jamovi 2.3.1338.
    OPMERKING: Aangezien de twee kamers in een Oroboros-instrument functioneel onafhankelijk zijn (met uitzondering van temperatuur- en DatLab-registratie-intervallen), kunnen metingen in elke kamer afzonderlijk worden beschouwd, vergelijkbaar met het gebruik van verschillende instrumenten. Eindresultaten kunnen worden gerapporteerd als medianen of gemiddelden van meerdere kamers met informatie over hun variabiliteit.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ruwe signalen R1 [μA] van de zuurstofsensoren (POS) zijn naar verwachting onafhankelijk van het volume van de waterfase in evenwicht met de gasfase van de lucht in de 'open' kamer, zoals bevestigd in Aanvullende tabel 2. In de gesloten kamer wordt echter de instrumentale achtergrond O2flux in de buurt van luchtverzadiging J°1[pmol∙s-1∙ml-1] is afhankelijk van het volume V (Aanvullende tabel 2). De O2Verbruik van de sensor [pmol∙S-1] kan worden voorspeld aan de hand van de elektronenstroom gemeten als het nulgecorrigeerde ruwe signaal R1-R0 [μA], het ladingsgetal 4 e-/MT2en de constante van Faraday F = 96 485,33 C∙mol-1. 1 μA komt overeen met een elektronenstroom (e-) van 10,36 pmol∙s-1. Delen door het ladingsgetal resulteert in een O2vloeien15,39 van 2.591 pmol∙s-1·μA-1. De geregistreerde mediaan van R1-R0 was 2,09 μA en 1,98 μA in respectievelijk de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml (Aanvullende tabel 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA in de sV en R0 = 0,004 ± 0,003 μA in de cV kamers), die theoretisch overeenkomen met O2Verbruikspercentages van 5,41 pmol∙S-1en 5,13 pmol∙s-1. De O2Debiet van de sensor wordt omgerekend naar de verwachte volumespecifieke flux bij luchtverzadiging (J°R1) als 5,41 pmol∙s-1/0,5 ml = 10,82 pmol∙s-1∙ml-1en 5,13 pmol∙s-1/2,0 ml = 2,56 pmol∙s-1∙ml-1in de SV en cV kamer, respectievelijk. Met hetzelfde type polarografische zuurstofsensoren in de kamer van 2,0 ml en 0,5 ml wordt de volumespecifieke achtergrond-O2flux - berekend op basis van de huidige R1-R0 (J°R1) - neemt theoretisch 4-voudig toe in omgekeerde verhouding tot het kamervolume. J°lucht (bij luchtverzadiging, waar de terugdiffusie nul is; vergelijk Tafel 2 en Aanvullende tabel 3) is berekend voor de O2concentratie bij luchtverzadiging van de lineaire regressie van de experimentele achtergrondtest (Figuur 3). J°lucht benaderde de theoretisch verwachte waarden J°R1 voor beide kamers (Tafel 2). De J°lucht / J°R1De verhouding was 0,85 ± 0,04 en 0,92 ± 0,12 in de SV en cV kamer, in overeenstemming met een onafhankelijke reeks van 52 metingen in de kamer van 2,0 ml, waarin deze verhouding 0,95 ± 0,12 (Aanvullende tabel 4). J°lucht was 3,9 keer hoger in de 0,5 ml dan in de kamer van 2,0 ml. De netto O2terug diffusie J°50, berekend bij 50 μM O2van de lineaire regressie van de experimentele achtergrondtest, was slechts drie keer hoger in de kamer van 0,5 ml (Tafel 2). De variabiliteit van instrumentale achtergrond O2fluxen waren bijna identiek in de twee verschillende kamervolumes, met standaarddeviatie (SD) van 0,5 en 0,3 pmol∙S-1∙ml-1voor J°lucht en 0,9 en 0,8 pmol∙s-1∙ml-1 voor J°50in de SV en cV kamer respectievelijk (Tafel 2). Ondanks de hogere instrumentale achtergrond O2hellingen in de kamer van 0,5 ml, de afhankelijkheid van achtergrond O2fluxen op cO2was zeer reproduceerbaar in beide kamertypen (Figuur 3D). Dit resulteert in lage waarden van de reststoffen <±1 pmol∙s-1∙ml-1voor beide kamers (Aanvullende tabel 5), in overeenstemming met de detectielimiet van de Oroboros28.

We kwantificeerden het effect van de roersnelheid op het kalibratie ruwe signaal R1 van de POS tussen 350 rpm (5,8 Hz) en 950 rpm (15,8 Hz) in stappen van 100 rpm (1,7 Hz) met de kamer in de 'open' configuratie. In deze configuratie is de in het medium opgeloste O2 in evenwicht met de gasfase; daarom weerspiegelen veranderingen in het ruwe signaal (microampère [μA]) als functie van de roersnelheid geen werkelijke verschillen in cO2. De zuurstofsensoren reageerden op een verandering in roersnelheid met een kleine afwijking van R1 bij het standaardtoerental van 750 tpm, onafhankelijk van het kamervolume (Figuur 4). In de "open" configuratie was de ruis van de O2-helling, gedefinieerd als SD voor elke stap na stabilisatie van het signaal, het laagst bij 850 tpm in beide kamertypen en nam toe wanneer de roersnelheid in beide richtingen van deze waarde afweek (Figuur 5A). Onder de 550 tpm overschreed het geluid van de O2-helling de drempel van ±4 pmol∙s-1∙mL-1, wat de minimale praktische roersnelheid definieerde. Vanwege technische beperkingen werd de bovengrens niet bereikt, waardoor 950 tpm de maximale praktische roersnelheid was (afbeelding 5A). Binnen dit bereik bedroeg de afwijking van het O2-signaal ten opzichte van R1 <2,5%. Het sluiten van de kamers veranderde niets aan de relatie tussen geluid en roersnelheid (Figuur 5B). De exponentiële tijdconstante τ was 2,53 ± 0,05 s bij 550 tpm en 2,50 ± 0,05 s bij 750 tpm voor de kamer van 0,5 ml (aanvullende figuur 3).

Het SUIT-003_D018 protocol dat wordt toegepast op bloedplaatjes omvat maximaal 14 titratiestappen. Het is ontworpen om de koppelingscontrole van levende cellen, ce en plasmamembraanpermeabiliteit te bestuderen als een index van de levensvatbaarheid van cellen32. De zuurstofstroom gemeten in de twee soorten kamers (Figuur 6) was in alle ademhalingstoestanden nauw op elkaar afgestemd (Figuur 7). Intermitterende reoxygenaties zijn nodig om functionele hypoxie te voorkomen of om de experimentele O2-concentratie te beperken tot een bepaald bereik. Reoxygenaties werden uitgevoerd door de kamer na titratie van Rot te openen naar de 'open' positie. Bij het sluiten van de kamer stabiliseerde de O2-flux zich binnen 4 minuten in de kamer van 2.0 ml, maar er was ongeveer 10 minuten nodig in de kamer van 0.5 ml voordat de stabilisatie en het instellen van de nieuwe markering werden ingesteld (Figuur 6 en aanvullende figuur 4). Reoxygenatie in de rox-toestand wanneer de O2-fluxen laag zijn, voorkomt een afname van de O2-concentratie gedurende de tijd die nodig is voor stabilisatie. Rotenon-geremd rox was 0,9 ± 0,6 en 2,0 ± 0,6 pmol∙s-1∙mL-1 bij 98 ± 17 en 94 ± 17 μM O2 (gemiddelde ± SD) in respectievelijk de sV-en cv-kamer. Rox nam toe met 3,1 ± 0,9 en 0,9 ± 0,4 pmol∙s-1∙mL-1 bij reoxygenatie tot respectievelijk 159 ± 8 en 147 ± 11 μM O2 in de sV-en cv-kamer. De zuurstofafhankelijkheid van rox waargenomen in bloedplaatjes komt overeen met de resultaten op menselijke fibroblasten en endotheelcellen van de navelstrengader40.

Voor OXPHOS-analyse in gepermeabiliseerde fibroblasten gebruikten we twee SUIT-protocollen met maximaal 17 en 20 titratiestappen (SUIT-001 en SUIT-002, respectievelijk35; Figuur 8); de correctie van het titratievolume is dan ook bijzonder belangrijk, aangezien aan het einde van SUIT-002 de verdunning in de kamer sV en cV maximaal 14 % en 10,5 % bedroeg. Fibroblastceltellingen van 0,35,106 x en 1,44,106 x in de kamers van respectievelijk 0,5 ml en 2,0 ml resulteerden in dezelfde celconcentratie van 0,75,106 x∙ml-1. De combinatie van SUIT-001 en SUIT-002 richtte zich op 20 ademhalingstoestanden, die allemaal nauw correleerden in de tweekamertypen (r2= 0,950 voor SUIT-001 en r2= 0,959 voor SUIT-002). In beide protocollen had Complex IV een relatief hoge spreiding (Figuur 9). Reoxygenatie was niet nodig in SUIT-001 vanaf een lage volumespecifieke O2-flux van 18,7 ± 7,0 pmol∙s-1∙mL-1 in de routinetoestand (gemiddelde ± SD), waardoor de O2-concentratie kon afnemen tot 56 μM tot aan het CIV-gekoppelde gedeelte van het protocol (Figuur 8A; 8Ama). In SUIT-002 werd echter reoxygenatie uitgevoerd vóór ontkoppelingstitraties, waardoor deO2-concentratie toenam van 100 μM naar 180 μM (Figuur 8B; 6Gp). Gezien de lange tijd die nodig is voor de stabilisatie van de flux na reoxygenatie, moet reoxygenatie tijdens ontkoppelingstitraties worden vermeden.

Een verkort SUIT-protocol werd toegepast op geïsoleerde mitochondriën (Figuur 10). De mitochondriale eiwitconcentratie werd bepaald na de respirometrische test, waardoor het onmogelijk was om vooraf de nauwkeurige monsterconcentratie in de kamer te bepalen. Volumespecifieke ademhalingsflux varieert als functie van de mitochondriale concentratie. Daarom werden de gegevens gepresenteerd als volumespecifieke en eiwitmassaspecifieke flux (Figuur 11). Beide weergaven tonen de nauwe correlatie tussen metingen verkregen in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml (Figuur 11).

Het resterende zuurstofverbruik rox gemeten na remming van Complex III door antimycine A kan worden gebruikt als een index van instrumentele prestaties bij zeer lage ademhalingsfrequenties. In alle experimentele reeksen was rox vergelijkbaar tussen de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml (bloedplaatjes: t(5) = -0,34, p = 0,74; fibroblast: SUIT-001: t(10) = 20,00, p = 0,06; PAK-002: t(10) = 11.00, p = 0.96; geïsoleerde mitochondriën: t(4) = -1,18, p = 0,27). De spreiding van de gegevens kwam grotendeels overeen met de instrumentele onzekerheid van ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28, zoals geïllustreerd in Figuur 12. De originele bestanden zijn beschikbaar voor open access in de Zenodo-repository: 10.5281/zenodo.11634408. 

figure-results-1
Figuur 3: Instrumentele achtergrond O2 flux voor de sV (0,5 ml; groen en zwart) en cV kamer (2,0 ml; blauw). O2 concentratiebereik van luchtverzadiging (ca. 180 μM) tot ca. 50 μM. Open symbolen: O2 concentraties verkregen zonder Na-dithioniet. Vaste symbolen: O2 concentraties gecontroleerd door handmatige titraties van Na-dithioniet. Zwarte cirkels: O2 concentraties gecontroleerd door titraties van Na-dithioniet met behulp van de TIP2k in de kamer van 0,5 ml (N = 8). Resultaten van instrumentele achtergrondtests werden samengevoegd van (A) Serie 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) voordat levende cellen (ce) werden gebruikt; (B) Reeks 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) vóór het gebruik van permeabiliseerde cellen (pce); (C) Serie 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) voordat geïsoleerde mitochondriën (imt) worden gebruikt. (D) Gesuperponeerde gegevens van panelen A-C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Effect van de roerrotatiesnelheid op het POS-signaal bij luchtverzadiging ('open' kamer) in de kamer van 0,5 ml (groen) en 2,0 ml kamer (blauw). Respons [%] ten opzichte van R0-gecorrigeerde luchtkalibratiesignalen R1-R0 [μA] bij 750 tpm (sV: N = 4; cV: N = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 5 : Ruis van de O2-helling als functie van de roerrotatiesnelheid. Geluid, uitgedrukt als de standaarddeviatie in (A) "open" kamer; (B) gesloten kamer (0,5 ml, groen; 2,0 ml, blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 6: Ø2 consumptie van gecryopreserveerde menselijke bloedplaatjes in de kamer van 0,5 ml. Representatieve sporen van O2-concentratie [μM] (blauwe lijnen) en O2-stroom per cel [amol∙s-1∙x-1] berekend als O2-flux [pmol∙s-1∙mL-1] gedeeld door celconcentratie van 157∙106 x∙mL-1 (rode lijnen, gecorrigeerd voor instrumentale achtergrondflux O2; pieken veroorzaakt door titraties werden geëlimineerd). De O2-concentratie werd boven 50 μM gehouden door intermitterende reoxygenaties (lucht, 'open' kamer, blauwe tint). Opeenvolging van respiratoire toestanden (titraties en frequenties; protocol SUIT-003_D018): ce1, routinematige ademhaling R van levende cellen. ce1P, pyruvaat 5 mM als uitwendig substraat. ce2Omy10 (paneel A), Omy titraties in stappen van 5 nM; lek ademhaling L. ce3U0,3 (paneel A) en ce3U0,1 (paneel B), ontkoppelde titraties tot een optimale CCCP-concentratie van respectievelijk 0,3 en 0,1 μM; ET capaciteit E. ce3Glc, glucose 11 mM; E geleidelijk geremd door ontkoppeling. ce4Rot, rotenon 0,5 μM remmend CI; restzuurstofverbruik rox. ce5S, succinaat 10 mM; het stimuleren van E in plasmamembraanpermeabele cellen. 1Dig15 (paneel A) en 1Dig10 (paneel B), digitoninentitraties in stappen van 5 μg·ml-1 tot optimale concentraties van respectievelijk 15 en 10 μg·ml-1 voor volledige plasmamembraanpermeabilisatie; succinaat-route ET capaciteit SE. 1c, cytochroom c 10 μM; Test van de integriteit van het mitochondriale buitenmembraan. 2Ama, antimycine A 2,5 μM remmend CIII; Rox. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 7: Correlatie van de ademhaling van gecryopreserveerde menselijke bloedplaatjes gemeten in de kamer van 0,5 ml en 2,0 ml. Rox-gecorrigeerde O2-stroom werd beoordeeld in protocol SUIT-003_D018 (Figuur 6); N = 6. a) met oligomycine Omy; (B) zonder Omy. Gemiddelde hellingen figure-results-6 en snijpunten figure-results-7 van omgekeerde kleinste kwadraten, regressie en determinatiecoëfficiënten r2 berekend op basis van alle gegevens. Stippellijnen zwarte lijnen vertegenwoordigen de lijnen van identiteit. Rode lijnen geven de berekende regressielijnen aan. O2 stromen in de toestand na de toevoeging van glucose werden uitgesloten (zie figuur 6). De protocollen met en zonder oligomycine zijn gescheiden in panelen A en B om overlapping van datapunten te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: O2 consumptie van fibroblasten in de kamer van 0,5 ml. Representatieve sporen van cO2 (blauwe lijnen [μM]) en O2 stroom per cel berekend als O2 flux [pmol∙s-1∙mL-1] gedeeld door celconcentratie (0,75·106 x∙mL-1), gecorrigeerd voor instrumentale achtergrond O2 flux (rode lijnen, pieken veroorzaakt door titraties werden geëlimineerd). De O2-concentratie werd boven 50 μM gehouden door intermitterende reoxygenaties (lucht, 'open' kamer, blauwe tint). Opeenvolging van ademhalingstoestanden (titraties en frequenties). (A) Protocol SUIT-001_D004: ce1, routineademhaling R. +Dig, digitonine 10 μg·mL-1 (ce tot pce), resterende endogene ademhaling ren. 13:00 uur, pyruvaat 5 mM & malaat 2 mM; N-route lek ademhaling NL. 2D, ADP 2,5 mM; N-route OXPHOS-capaciteit NP. 2c, cytochroom c 10 μM; Test van de integriteit van het mitochondriale buitenmembraan. 3U1.5, ontkoppelingstitraties tot optimale CCCP-concentratie 1,5 μM; NADH-gekoppelde ET-capaciteit NE. 4G, glutamaat 10 mM; N(PGM)E. 5S, succinaat 10 mM; NS-route ET capaciteit NSE. 6Rot, rotenon 0,5 μM; succinaat-route ET capaciteit SE. 7Gp, glycerofosfaat 10 mM; SGpE. 8Ama, antimycine A 2,5 μM; Rox. 9AsTm, ascorbaat 2 mM & TMPD 0,5 mM; substraten voor CIV-stimulatie; De kamer werd 20 minuten open gehouden om redoxevenwicht mogelijk te maken zonder uitputting van zuurstof4; O2 flux van de schaal na het sluiten van de kamer (205 amol·s-1·x-1). 10Azd, azide 100 mM; Zuurstofafhankelijke chemische achtergrondflux Chb. (B) Protocol SUIT-002_D007: ce1, R. +Dig, ren. +D, stimulerende ren. +M.1, malaat 0,1 mM en 1Oct, octanoylcarnitine 0,5 mM; F-route OXPHOS-capaciteit FP = J(1Oct)-J (+M.1). 1c. 2M2, malaat 2 mM ter ondersteuning van de anaplerotische N-route; F(N)P. 3P en 4G, progressieve activering naar FNP. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpP. 7U1.5, FNSGpE. 8Rot, SGpE. 9Ama, rox. 10AsTm O2 flux off scale 207 amol·s-1·x-1. 11Azd, chb. Over het algemeen is Complex IV-activiteit het verschil in snelheden, J(AsTm)-J(Azd) bij nauw overeenkomende O2-concentraties . Zie figuur 6 voor meer details. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Correlatie van de ademhaling van gepermeabiliseerde fibroblasten in de kamer van 0,5 ml en 2,0 ml. Rox-gecorrigeerde O2-stroom in (A) SUIT-001_D004 en (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Gemiddelde helling figure-results-10 en snijpunt figure-results-11 van omgekeerde kleinste kwadratenregressie en determinatiecoëfficiënt r2 berekend op basis van alle gegevens. De gestippelde zwarte lijn vertegenwoordigt de lijn van identiteit. Rode lijnen geven de berekende regressielijnen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-12
Figuur 10: O2 consumptie van geïsoleerde mitochondriën van het muizenhart in kamers van 0,5 ml (groen) en 2,0 ml (blauw). Representatieve sporen van (A) massaspecifieke O2-flux bij mitochondriale eiwitconcentratie 0,023 mg ∙mL-1 (gecorrigeerd voor instrumentele achtergrond O 2-flux, pieken veroorzaakt door titraties werden geëlimineerd) en (B) O2-concentratie [μM]. Volgorde van ademhalingstoestanden (titraties en frequenties) volgens het protocol SUIT-002_D005: imt, resterende endogene ademhaling. +D, ADP 2,5 mM; Stimulerende ren. +M.1, malaat 0,1 mM en 1Oct, octanoylcarnitine 0,5 mM; F-route OXPHOS-capaciteit FP = J(1Oct)-J (+M.1). 1c, cytochroom c 10 μM; Test van de integriteit van het mitochondriale buitenmembraan. 2M2, hoog malaat 2 mM ter ondersteuning van de anaplerotische N-route; F(N)P. 3P, pyruvaat 5 mM; FNP. 4G, glutamaat 10 mM; FNP. 5S, succinaat 10 mM; Tegen FNSP. 6Gp, glycerofosfaat 10 mM; FNSGpP. 7U0,5, ontkoppelingstitraties tot optimale CCCP-concentratie 0,5 μM; FNSGpE. 8Rot, rotenon 0,5 μM remmend CI; SGpE. 9Ama, antimycine A 2,5 μM remmende CIII; restzuurstofverbruik rox. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-13
Figuur 11: Correlatie van de ademhaling van geïsoleerde cardiale mitochondriën van muizen gemeten in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml. O2 flux in het protocol weergegeven in figuur 10 (N = 4). (A) Volumespecifieke O2-flux . (B) Rox-gecorrigeerde O2-flux gedeeld door de mitochondriale eiwitconcentratie (0,013 - 0,026 mg∙ml-1). Gemiddelde helling figure-results-14 en snijpunt figure-results-15 van omgekeerde kleinste kwadratenregressie en determinatiecoëfficiënt r2 berekend op basis van alle gegevens. Stippellijnen geven de lijn van identiteit weer. Rode lijnen geven de berekende regressielijn aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-16
Figuur 12: Restzuurstofverbruik rox in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml. Flux per volume gemeten na toevoeging van antimycine A, gecombineerd uit experimenten met levende cellen (ce, vierkanten), gepermeabiliseerde cellen (pce, cirkels) en geïsoleerde mitochondriën (imt, driehoeken). Gemiddelde helling figure-results-17 en snijpunt figure-results-18 van omgekeerde kleinste kwadratenregressie. Stippellijn: lijn van identiteit. Rode lijn: berekende regressielijn. Schaduw: instrumenteel resolutiebereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ModulesVcV
Experimenteel kamervolume V0,5 ml2,0 ml
Binnendiameter van glazen cilinder12,0 mm16,0 mm
Buitendiameter van glazen cilinder24,0 mm dik24,0 mm dik
Dikte van de glaswand6,0 mm4,0 mm
PVDF-gecoate roerstaaf11,5 x 6,2 mm15,0 x 6,0 mm
Stop, capillaire diameter1,00 mm1,30 mm
Stopper capillaire dwarsdoorsnede0,79 mm21,33 mm2
Stopper capillaire lengte50,64 mm48,86 mm
Stopper capillair volume39,8 μl64,9 μL
Stopper capillair dood volume Vstc inclusief een kleine druppela0,04 ml0,07 ml
Deel V' voor volumekalibratie0,54 ml2,07 ml

eenDe druppel moet overeenkomen met 5 μl voor de kamer cV en dicht bij 0 μl voor de kamer sV.
Tabel 1: Afmetingen van de modules met een klein volume (sV) en een klassiek volume (cV) met polyetheretherketon (PEEK) stoppen.

J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Experimenteel kamervolume V0,5 ml2,0 ml0,5 ml2,0 ml
Bedoelen9.222.37-3.17-1.17
Mediaan9.252.36-3.08-1.04
Standaarddeviatie0.490.340.930.83
Minimum8.201.79-5.11-3.72
Maximum10.413.42-0.820.67

Tabel 2 : J°air geëxtrapoleerd naar luchtverzadiging en J°50 berekend bij een concentratie van 50 μM O2 . Gepoolde gegevens van instrumentele achtergrondtests in serie 2 (pce) en 3 (imt) en vóór TIP2k-titraties (0,5 ml: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60).

Aanvullend dossier 1: Voorbeeld preparaten. Menselijke bloedplaatjes, menselijke fibroblasten en mitochondriën geïsoleerd uit muizenharten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Instrumentele O2 achtergrondtest met behulp van de TIP2k. Representatieve sporen van de test uitgevoerd met behulp van de TIP2k om Na-dithionite (2,5 mM) in de kamer van 0,5 ml te titreren. Medium: MiR05, temperatuur: 37 °C, roersnelheid: 750 rpm. Pieken veroorzaakt door titraties werden geëlimineerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Instrumentele achtergrond O2 flux J°1 als functie van de O2-concentratie . Kamer sV (0,5 ml; groen, N = 48) en kamer cV (2,0 ml; blauw, N = 60) in serie 2 (pce, cirkels) en 3 (imt, driehoeken), en vóór TIP2k-titraties in de kamer van 0,5 ml (zwarte cirkels, N = 8). Rode lijnen: mediaan ± SD. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Exponentiële tijdconstante τ als functie van de roerrotatiesnelheid. Individuele τ-waarden voor de kamer van 0,5 ml bij 37 °C (N = 2). In de kamer van 0,5 ml was τ 2,53 ± 0,05 s bij 550 tpm, 2,50 ± 0,05 s bij 750 tpm en 2,47 ± 0,04 s bij 850 tpm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: O2 consumptie van gecryopreserveerde menselijke bloedplaatjes in de kamer van 2,0 ml. Representatief spoor van het protocol SUIT-003_D018, inclusief oligomycine-titraties (Omy). Flux [pmol∙s-1∙mL-1] werd gecorrigeerd voor instrumentele achtergrondflux O2 en gedeeld door celconcentratie (164∙10,6 x∙mL-1). Pieken veroorzaakt door titraties werden geëlimineerd. cO2 werd boven 60 μM gehouden door intermitterende reoxygenaties (lucht, 'open' kamer, blauwe tint). Opeenvolging van respiratoire toestanden (titraties en frequenties): ce1, routinematige ademhaling R van levende cellen. ce1P, pyruvaat als uitwendig substraat. ce2Omy10, Omy-titraties in stappen van 5 nm; lek ademhaling L. ce3U2.0, ontkoppelde titraties tot optimale concentraties van 2 μM; ET capaciteit E. ce3Glc, glucose 11 mM; E geleidelijk geremd door ontkoppeling. ce4Rot, rotenon 0,5 μM remmend CI; restzuurstofverbruik rox. ce5S, succinaat 10 mM; het stimuleren van E in plasmamembraanpermeabele cellen. 1Dig20, digitonine-titraties tot optimale concentraties van 20 μg·ml-1, voor volledige plasmamembraanpermeabilisatie; succinaat-route ET capaciteit SE. 1c, cytochroom c 10 μM; Test van de integriteit van het mitochondriale buitenmembraan. 2Ama, antimycine A 2,5 μM remmend CIII; Rox. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Chemische stoffen die worden gebruikt in de SUIT-protocollen (substraatremmer-ontkoppeling-titratie). Afkortingen en concentraties van de stockoplossing voor de kamers s, V en c,V . Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Vergelijking van R1-R0 en J°1 in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml. Gepoolde gegevens van instrumentele achtergrondtests in serie 2 (pce) en 3 (imt) en vóór TIP2k-titraties (0,5 ml: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60). De gegevens werden alleen gemiddeld van experimentele serie 2 (pce) en 3 (imt), die werden uitgevoerd bij een gemiddelde barometrische druk van 94,9 kPa (Innsbruck, Oostenrijk), exclusief gegevens van serie 1 (ce) verkregen op zeeniveau. Hetzelfde type, maar verschillende individuele POS werden gebruikt in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml. Daarom moet bij het vergelijken van de sV- encV-kamers rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen sensoren. Terwijl J°1 = 2,26 ± 0,41 pmol∙s-1∙mL-1 experimenteel verkregen voor de 2,0-ml kamer nauw overeenkwam met de berekende waarde, was de experimentele J°1 = 8,48 ± 0,53 pmol∙s-1∙mL-1 voor de 0,5-ml kamer lager dan verwacht. Dit werd verklaard door de volgende observaties. Na het sluiten van de kamer verlaagt de hogere achtergrondflux O2 in de kamer van 0,5 ml de O2-concentraties bij de markeringen voor J°1 die met vergelijkbare tijdsintervallen zijn ingesteld (Figuur 1). De zuurstofconcentratie op J°1 was gemiddeld 4,06 % en 1,72 % lager dan de luchtverzadiging in respectievelijk de kamer van 0,5 ml en 2,0 ml (aanvullende figuur 2, aanvullende tabel 2). Bij een lagere cO2 vermindert het verminderde O2-verbruik door de sensor en een deel van de O2-rugdiffusie de experimenteel bepaalde J°1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Zuurstofconcentratie [μM] waarbij kalibratie (R1) en J°1 werden verkregen en hun % verschil. Gepoolde gegevens van instrumentele achtergrondtests in serie 2 (pce) en 3 (imt) en vóór TIP2k-titraties (0,5 ml: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 4: Gemeten en verwachte J°1 in de kamer van 2,0 ml. Onafhankelijke reeks instrumentele achtergrondtests met O2k-serie A (met titaniumstoppen13), V = 2,0 ml (37 °C, NaCl-oplossing met O 2-oplosbaarheidsfactor 0,92; N = 52). nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1. Gebaseerd op de aanname dat O2 rugdiffusie verwaarloosbaar is bij cO2,1, wat alleen waar is bij cO2,1 ~ cO2*. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 5: Lineaire regressieresiduen (absolute waarden [pmol O2∙s-1∙mL-1]) berekend voor elke instrumentele O2-achtergrondtest. Gepoolde gegevens van instrumentele achtergrondtests in serie 2 (pce) en 3 (imt) en vóór TIP2k-titraties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hoeveelheid monster die beschikbaar is voor respirometrie is vaak beperkt, bijvoorbeeld bij onderzoeken naar biopsieën, primaire cellen of langzaam groeiende celculturen met een laag celgetal1. Bovendien worden de ademhalingsactiviteiten onderdrukt als gevolg van mitochondriale verwondingen11 of bij het onderzoeken van mitochondriale routes met een lage capaciteit, zoals vetzuuroxidatie12. In deze gevallen biedt een laag respirometrisch kamervolume voordelen voor de resolutie van O2-flux. Instrumentele achtergrond O2-fluxen nemen echter toe bij lagere kamervolumes en veroorzaken fouten wanneer ze niet betrouwbaar worden gemeten en niet goed worden gecorrigeerd als functie van de O2-concentratie. De reproduceerbaarheid van instrumentele O2-achtergrondtests en achtergrondcorrecties zijn vooral belangrijk voor kleine kamervolumes. Bijna identieke waarden van de theoretische (J°R1) en experimentele (J°air) O2 flux leveren bewijs voor de nauwkeurigheid van de polarografische meting met 4 e-/O2 bij de kathodereactie van de POS. Het verschil tussen J°R1 en J°air was 1,64 ± 0,43 en 0,22 ± 0,31 pmol∙s-1∙mL-1 in respectievelijk de sV en cV kamer, wat wijst op een precisie in de metingen die binnen de detectielimiet van de 2,0-ml kamer valt (±1 pmol∙s-1∙mL-1)28. Met hetzelfde type polarografische zuurstofsensoren in de kamer van 2,0 ml en 0,5 ml nam de volumespecifieke achtergrond-O2-flux 4-voudig toe in omgekeerde verhouding tot het kamervolume, en de variabiliteit was bijna identiek in de twee kamervolumes, met SD van 0,5 en 0,3 pmol∙s-1∙mL-1 voor J°air en 0,9 en 0,8 pmol∙s-1∙mL-1 voor J°50 in de sV en c V kamer (Tabel 2). Bij minimale ademhalingsactiviteiten - waarvoor de kamer met een klein volume is ontworpen - worden zelfs kleine achtergrondeffecten significant (aanvullende tabel 3; Aanvullende figuur 2). Daarom is een routinematige beoordeling van de instrumentele achtergrondflux O2 (Figuur 1) vereist om de juiste correctie28 toe te passen.

Een hoge en constante roering van het medium is nodig om een homogeen systeem te behouden en een stabiel zuurstofsignaal te garanderen. De roersnelheid van 750 tpm is vastgesteld voor de kamer van 2.0 ml, maar de optimale snelheid was niet bekend in de kamer van 0.5 ml. De verschillende geometrieën van de glaskamer en de roerstaaf (tabel 2) vereisen een onafhankelijke evaluatie van de optimale roersnelheid. De zuurstofsensoren reageerden op veranderingen in de roersnelheid tussen 550 tpm en 950 tpm, met een kleine afwijking van het O2-signaal R1 bij 750 tpm, onafhankelijk van het kamervolume. De exponentiële tijdconstante τ die voor de kamer sV werd geëvalueerd, kwam overeen met τ die werd gerapporteerd voor de kamer van 2,0 ml bij dezelfde roersnelheid13. Deze resultaten suggereren dat roeren even effectief is in beide kamergeometrieën en dat de standaard roersnelheid van 750 tpm (kamer van 2,0 ml) kan worden toegepast op de kamer van 0,5 ml. In zowel de 'open' als de 'gesloten' kamerconfiguraties had de kamer van 0,5 ml een hogere signaal-ruisverhouding, wat een hogere nauwkeurigheid suggereert als een voordeel van de kamer van 0,5 ml (Figuur 5), hoewel het effect van individuele POS-variabiliteit niet kan worden uitgesloten. Aangezien het geluid niet toenam bij het verlagen van de roersnelheid van 750 tpm naar 550 tpm, kan het verlagen van de roersnelheid tot 550 tpm in de kamer van 0.5 ml nuttig zijn om schuifspanning te minimaliseren zonder de signaal-ruisverhouding in gevaar te brengen.

Bijna identieke O 2-verbruikssnelheden werden gemeten in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml in drie experimentele modellen wanneer de juiste achtergrondcorrectie werd toegepast. De resultaten verkregen met kleine bloedplaatjes met een diameter van 2 μm42, levende en gepermeabiliseerde fibroblasten en geïsoleerde mitochondriën suggereren dat consistente ademhalingsfrequenties kunnen worden verwacht in de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml in een breed scala van celtypen en mitochondriale preparaten. Gepermeabiliseerde spiervezels zijn echter niet getest in de huidige studie. Nauwkeurige meting van rox vereist controle van het zuurstofgehalte40 en een hoge instrumentele resolutie1. De volumespecifieke O2-flux van rox kan zo laag zijn als de detectielimiet. Reoxygenaties zijn niet nodig wanneer een laag celgetal of over het algemeen lage hoeveelheden monsters in een experiment worden gebruikt. Indien nodig wordt echter aanbevolen om reoxygenaties uit te voeren in respiratoire toestanden met een lage O2-flux om een snelle daling van de O2-concentratie te voorkomen tijdens de periode die nodig is voor stabilisatie van de O2-flux. Stabilisatie van de O2-flux na reoxygenatie duurt langer in de kamer van 0,5 ml.

Als bijdrage aan de kwaliteitscontrole moet bijzondere aandacht worden besteed aan de verdunning van het monster in suspensie tijdens de gedeeltelijke volumevervanging. Na verwijdering van de volledig ingebrachte stop wordt het totale volume V' van het ademhalingsmedium in de kamer gegeven door het experimentele volume V en het capillaire volume Vstc van de stop (tabel 2). Daarom wordt het voorraadvolume V J.i verdund in het werkelijke volume V', dat groter is dan V, wat resulteert in een verdunningsfactor V/V' van 0,5/0,54 = 0,926 en 2,0/2,07 = 0,966 in respectievelijk de kamers van 0,5 ml en 2,0 ml (Figuur 2). In de experimenten met bloedplaatjes werd een prototype van een stop gebruikt voor de kamer s V met een capillair dood volume van 0,05 ml, wat overeenkomt met een verdunningsfactor van 0,909.

Bijna vier keer lagere hoeveelheden levende cellen, gepermeabiliseerde cellen en geïsoleerde mitochondriën zijn vereist in de 0,5 ml dan in de kamer van 2,0 ml bij identieke monsterconcentraties (hoeveelheid per volume), wat kwantitatief vergelijkbare resultaten oplevert van respiratoire O2-consumptie genormaliseerd voor celtelling of eiwitmassa. Dit geeft aan dat de Kamer sV een waardevol hulpmiddel is voor studies waarbij de hoeveelheid beschikbare monsters beperkt is. Aan de andere kant verhoogt de toepassing van een identieke hoeveelheid monster in kamer sV de volumespecifieke O2-flux en vermindert zo de onzekerheid van metingen wanneer de ademhalingsactiviteiten laag zijn.

Het zuurstofregime in de huidige studie was beperkt tot het O2-bereik van luchtverzadiging tot 30 μM. Toepasbaarheid bij zuurstofniveaus buiten dit bereik vereist verdere evaluatie om de mitochondriale functie bij weefselnormoxie of hypoxie43 en permeabiliseerde weefsels bij hyperoxie9 te onderzoeken. Verschillende multisensorconfiguraties van de Oroboros NADH- en Q-modules; pH-, NO- en TPP+-elektroden10,44 - kunnen niet worden ondergebracht in dekamer s V en vereisen de kamer van 2.0 ml.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EL is een medewerker van Oroboros Instruments. EG is de oprichter en CEO van Oroboros Instruments.

LFGS was tijdens het project in dienst van Oroboros Instruments. EÅF en EE zijn werknemers van Abliva AB, Lund, Zweden, dat een commerciële overeenkomst heeft met Oroboros Instruments.

LR verklaart geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Manuela Passrugger voor het verzamelen van de gegevens over geïsoleerde mitochondriën, Patrizia Guerth voor technische ondersteuning bij het testen van de roerrotatiesnelheid en Mateus Grings voor de analyse van de tijdconstante van de roerderstests. Wij danken onze partner, WGT Elektronik GmbH & Co KG, Kolsass, Oostenrijk, voor informatie over de technische gegevens van de glaskamers, stoppers en magnetische veldsterkte. We danken Luiza HD Cardoso, Alejandra Romero-Martinez, Ondrej Sobotka, Alba Timon-Gomez en Jaime Willis voor hun commentaar. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 859770, NextGen-O2k-project. Bijdrage aan COST Action CA15203 MitoEAGLE met de financiële steun van Short-Term Scientific missions (LFGS, LR).

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/software
ADPMerck, Germany117105
Antibiotics-antimycotics 100xBiosera, FranceXC-A4110VOORZICHTIG H317 Kan een allergische huidreactie veroorzaken
Antimycin ASigma-Aldrich, USAA8674VOORZICHTIG H300  Dodelijk indien ingeslikt, H400 kortdurend (acuut) aquatisch gevaar 
AscorbaatSigma-Aldrich, USAA7631
ATPSigma-Aldrich, USA A 2383
BSA vetzuurvrijSigma-Aldrich, USAA 6003rundeserumalbumine
CaCO3Sigma-Aldrich, USAC 4830
CCCPSigma-Aldrich, USAC2759carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon CAUTIE H301 + H311 + H331 Giftig indien ingeslikt, in contact met de huid of indien geïnhaleerd
Countess geautomatiseerde celteller Thermo Fisher Scientific, USAAMQAX100
Cytochroom cSigma-Aldrich, USAC7752
DatLab Oroboros Instruments, AustriaVersie 7.4Software voor data-acquisitie en analyse
DatLab Oroboros Instruments, AustriaVersie 8.1Software voor data-acquisitie en analyse
DC Protein AssayBio-Rad, USA5000112Eiwittestkit; CAUTIE H314 Veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging
DigitoninSigma-Aldrich, USAD5628VOORZICHTIG H301 Giftig indien ingeslikt
DithiothreitolSigma-Aldrich, USAD 0632VOORZICHTIG H318 Veroorzaakt ernstige oogbeschadiging
DMEMPan Biotech, GermanyP04-05551Dulbecco’s gemodificeerd Eaglesmedium
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650dimethylsulfoxide
DPBSLonza Bioscience, SwitzerlandLONBE17-512FCalciumvrij Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing
EGTASigma-Aldrich, USAE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, USAA5256701foetaal bovien serum
GlucoseSigma-Aldrich, USA G7528
Glutamaat Sigma-Aldrich, USAG1626
GlycerofosfaatSanta Cruz Biotechnologysc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific, USAHM3Scentrifuge
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germany1701centrifuge
ImidazolHoneywell Fluka, Austria56750VOORZICHTIG H302 Schadelijk indien ingeslikt, H314 Veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, H360D Kan schade toebrengen aan het ongeboren kind
jamovi The jamovi projectVersie 2.3.13software
K+-MESSigma-Aldrich, USAM 8250
Leucosep buis Greiner Bio-One GmbH, AustriaZ642843-300EAcentrifugebuis met polyethyleenbarrière
Malaat Sigma-Aldrich, USAM1000VOORZICHTIG H319 Veroorzaakt ernstige oogirritatie.
MannitolSigma-Aldrich, USAM 4125
MgCl2 Scharlau, SpainMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, Austria60101-01mitochondriaal ademhalingsmedium
Mixer Swelab Instruments, Sweden440Sroterende tafel
Mr. Frosty vriescontainerThermo Fisher Scientific, USA5100-0001vriescontainer
OroborosOroboros Instruments, Austriade NextGen-O2k en de O2k worden collectief aangeduid met de term ‘Oroboros’
Oroboros Chamber cVOroboros Instruments, Austria23100-01klassieke volumekamer
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments, Austria33100-01kleine volumekamer
Oroboros TIP2k-moduleOroboros Instruments, Austria11100-03Titeratie-Injectie microPump
O2-Zero PoederOroboros Instruments, Austria26600-02 Na-dithioniet CAUTIE H251 Zelfontwarmend: kan vlam vatten, H302 Schadelijk indien ingeslikt, H319 Veroorzaakt ernstige oogirritatie
octanoylcarnitineBiotrend - APExBIO Technology, GermanyB6371
OligomycinSigma-Aldrich, USAO4876
FosfocreatineSigma-Aldrich, USAP 7936
PyrovaatSigma-Aldrich, USAP2256VOORZICHTIG H317 Kan een allergische huidreactie veroorzaken
RotenoneSigma-Aldrich, USAR8875VOORZICHTIG H300 Dodelijk indien ingeslikt
Huid fibroblast cellijnen  ATCC, USA
NatriumazietSigma-Aldrich, USAS2002VOORZICHTIG H300 + H310 + H330 Dodelijk indien ingeslikt, in contact met de huid of indien geïnhaleerd
Subtilisin ASigma-Aldrich, USAP 5380VOORZICHTIG H318 - Veroorzaakt ernstige oogbeschadiging, H334 - Kan allergie- of astmasymptomen of ademhalingsmoeilijkheden veroorzaken indien geïnhaleerd
SuccinaatSigma-Aldrich, USAS2378
SucroseSigma-Aldrich, USA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts. PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).
  2. Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).
  3. Meszaros, A. T., et al. The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation. Transplant International. 37, 12380(2024).
  4. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  5. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  6. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  7. Gnaiger, E. Oxygen Conformance of Cellular Respiration. Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).
  8. Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia. J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria. Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).
  11. Suomalainen, A., Nunnari, J. Mitochondria at the crossroads of health and disease. Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).
  12. Cardoso, L. H. D., et al. Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).
  13. Gnaiger, E. Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply. Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).
  14. Gnaiger, E. Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function. Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis. Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).
  16. Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study. Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).
  17. Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).
  18. Heimler, S., et al. Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women. Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).
  19. Palacka, P., et al. Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).
  20. Fischer, C., et al. Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver. Metabolites. 12 (3), 270(2022).
  21. JedIicka, J., et al. Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs. Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).
  22. Westerlund, E., et al. Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers. Heliyon. 10 (5), e26745(2024).
  23. Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts. Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).
  24. Yépez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).
  25. Gnaiger, E. Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts. MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).
  26. Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).
  27. Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).
  28. Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry. Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).
  29. Mela, L., Seitz, S. Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue. Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).
  30. Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration. Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).
  31. Gnaiger, E. The elementary unit — count and numbers in the International System of Units. BEC preprints. , (2025).
  32. Vernerova, A., et al. Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods. Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).
  33. Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018 (2024).
  34. Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004 (2024).
  35. Timón-Gómez, A., et al. Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation. Exp Physiol. , 1-33 (2025).
  36. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007 (2024).
  37. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005 (2024).
  38. The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , https://www.jamovi.org/ (2024).
  39. Gnaiger, E. Preface: A biologist´s view. Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).
  40. Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).
  41. Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR (2020).
  42. Williams, O., Sergent, S. R. Histology Platelets. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).
  43. Donnelly, C., et al. The ABC of hypoxia - what is the norm. Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).
  44. Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells. Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Meting van zuurstoffluxmitochondriale functiesubstraat ontkoppelingsmiddel inhibitor titratieOroboros respirometerachtergrondzuurstofcorrectierespiratie van levende cellenge soleerde mitochondri nrespiratie van bloedplaatjes

Gerelateerde artikelen