Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle in vivo voorspelling van geneesmiddelrespons met behulp van leukemieceltransplantaten in zebravisembryo's

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67451

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Charité-Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie/Hämatologie, 2German Cancer Consortium (DKTK), partner site Berlin, and German Cancer Research Center (DKFZ)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het genereren en oplossen van problemen met xenotransplantaten voor acute lymfatische leukemie (ALL) bij de mens uit cellijnen en vers patiëntenmateriaal in kortstondig immunosuppressie-zebravisembryo's, samen met richtlijnen voor de beoordeling van de geneesmiddelrespons met behulp van flowcytometrie. De experimentele pijplijn kan ook worden aangepast voor solide tumoren.

Samenvatting

Xenotransplantatie van zebravissen is een cruciale techniek voor het onderzoeken van de pathogenese van kanker bij de mens en het voorspellen van individuele geneesmiddelreacties. Dit document introduceert een gestroomlijnd protocol (ZefiX) voor het uitbreiden van primaire B-cel precursor acute lymfoblastische leukemie (BCP-ALL) patiëntenmonsters of onsterfelijke cellijnen in voorbijgaande immunosuppressieve zebravisembryo's, waarbij gebruik wordt gemaakt van flowcytometrie voor single-cell analyse met hoge resolutie van behandelingsresponsen. In vergelijking met solide tumorimplantaties profiteren leukemiecellen significant van een op morfolino-antisense oligonucleotiden gebaseerde onderdrukking van macrofaag- en neutrofielendifferentiërende factoren tijdens de test. Flowcytometrie-analyse van gedissocieerde transplantaatcellen maakt een nauwkeurige evaluatie van het aantal cellen, de proliferatiesnelheid en de vitaliteit na behandeling per cel mogelijk. Deze aanpak is gevalideerd met behulp van gerichte therapieën zoals venetoclax en dasatinib, waarbij de behandelingsresultaten zijn vergeleken met klinische dossiers van gerelateerde patiëntenmonsters en traditionele 2D-kweekcontroles. Het protocol is met name binnen 7 dagen voltooid, in overeenstemming met de tijdlijnen voor klinische besluitvorming. De methodologie is aanpasbaar voor het testen van geselecteerde geneesmiddelen bij verschillende soorten kanker, waaronder solide tumoren, waardoor gepersonaliseerde therapeutische strategieën worden ondersteund. Er moet echter rekening worden gehouden met beperkingen op het aantal geneesmiddelen dat kan worden beoordeeld, waarschijnlijk als gevolg van farmacokinetische beperkingen in zebravisembryo's.

Inleiding

Xenotransplantatie van zebravissen is een cruciaal in vivo model geworden voor het begrijpen van de pathogenese van kanker en het voorspellen van geneesmiddelreacties 1,2,3,4,5. Diermodellen blijven van cruciaal belang voor preklinische geneesmiddelentests, en het zebravismodel biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere in vivo systemen, waaronder een hoge doorvoer en kostenefficiëntie 6,7,8.  Dit model kan ook helpen bij gepersonaliseerde voorspellingen van de behandelingsrespons, waaronder moleculair gerichte therapieën en CAR-T-celtherapie 9,10,11,12.

BCP-ALL kan met name baat hebben bij xenotransplantatie van zebravissen, aangezien het uitbreiden van primaire patiëntcellen in kweek een uitdaging blijft13. Er is een onmiskenbare behoefte aan nieuwe behandelingsbenaderingen bij ALL. Ondanks een hoog remissiepercentage van 80%-85% bij kinderen met BCP-ALL, variëren de overlevingspercentages op lange termijn voor patiënten met recidiverende of refractaire ziekte slechts tussen ongeveer 30%-60%14,15,16. In dergelijke gevallen zou het testen van geneesmiddelen met behulp van de voorgestelde pijplijn kunnen worden geïntegreerd in de klinische setting om de optimale patiëntspecifieke therapie te identificeren14,15. Deze gepersonaliseerde aanpak kan cruciaal zijn bij het omgaan met meerdere geneesmiddelresistenties, waardoor de behandelingslast voor patiënten aanzienlijk wordt verminderd door ineffectieve of suboptimale geneesmiddelen met ernstige bijwerkingen te vermijden.

Verschillende kenmerken maken zebravisembryoxenotransplantatie tot een geschikt model. De genetische overeenkomsten tussen mensen en zebravissen - 70% genetische homologie en 84% gedeelde ziektegebonden genen - ondersteunen studies naar gen-geneesmiddelinteracties17. Het gebruik van een transgeen gastheerembryo kan dus genetische aanleg onthullen die de gevoeligheid voor geneesmiddelen beïnvloedt18. Als alternatief kunnen cellen met specifieke genetische modificaties worden getransplanteerd om te evalueren of de gevoeligheid of resistentie van het geneesmiddel overeenkomt met in vitro bevindingen. Xenotransplantaten van zebravisembryo's geven ook inzicht in de mogelijke systemische effecten van medicijnen. Hoewel de orgaanontwikkeling in embryo's van 2-3 dagen oud niet volledig volgroeid is, zijn de organen correct gelokaliseerd en delen ze gedeeltelijk de cellulaire samenstelling met hun volwassen tegenhangers19.

Verdere voordelen van dit model zijn onder meer dat er slechts een paar kankercellen nodig zijn voor implantatie, het onderhouden van gastheerembryo's is eenvoudig, omdat er geen voeding nodig is binnen de eerste 5 dagen van het leven, en het succes van de injectie kan snel worden beoordeeld vanwege de transparantie en grootte van de embryo's. Een uniek kenmerk is dat in dit ontwikkelingsstadium alleen aangeboren immuniteit actief is, wat een efficiënte implantatie mogelijk maakt20. In het ZefiX-protocol dat hier wordt beschreven (zie samenvatting in figuur 1), wordt immunodeficiëntie verder versterkt door het aangeboren immuunsysteem gedurende de eerste 4 dagen van het leven te onderdrukken met behulp van stabiele morfolino-antisense-oligonucleotiden gericht tegen spi1 en csf3r, die de differentiatie van macrofagen en neutrofielen blokkeren 21,22,23.

Dit protocol verschilt ook van eerdere xenotransplantatieprotocollen voor zebravissen, die in de eerste plaats zijn ontwikkeld voor solide tumortransplantaten en doorgaans gebruik maken van op beeldvorming gebaseerde beoordelingsmethoden voor de respons op basis van hele mounts. ZefiX is geoptimaliseerd voor vloeibare kankercellen, zoals BCP-ALL-cellen, en is met succes gebruikt om vers of vers ingevroren patiëntenmateriaal te expanderen21. ZefiX kan ook worden aangepast voor aanhangende kankercellen door geschikte enzymen te selecteren voor weefseldissociatie.

Een ander groot voordeel is de stroomafwaartse analyse met behulp van flowcytometrie, die verschillende voordelen biedt: (i) een groot aantal transplantaatcellen kan snel worden verwerkt, waardoor een robuuste statistische analyse op het niveau van één cel mogelijk is, (ii) de proliferatiesnelheid en levensvatbaarheid kunnen gelijktijdig worden beoordeeld in individuele cellen, en (iii) flowcytometers zijn algemeen beschikbaar in klinische onderzoeksomgevingen, het mogelijk maken om binnen enkele uren de geneesmiddelrespons van transplantaatcellen op celniveau te evalueren. Om de reproduceerbaarheid te garanderen, biedt dit protocol een gestandaardiseerde pijplijn van voorbereiding via transplantatie tot flowcytometrie-analyse, waardoor de geneesmiddelrespons binnen een week in ALLE cellen kan worden voorspeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle zebravisexperimenten voldoen aan de richtlijnen en officiële instanties van de Charité-Universitätsmedizin Berlin Research Institutes for Experimental Medicine. Alle onderzoeken hadden betrekking op < 6 dagen na de bevruchting (dpf), waardoor ze werden vrijgesteld van de Wet op de Bescherming van Dieren. Zebravissen (Danio rerio) werden grootgebracht en onderhouden in de dierenkliniek van Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlijn, Duitsland, volgens standaardprotocollen. Ze werden gehuisvest bij 28 °C met een lichtcyclus van 14 uur en een donkercyclus van 10 uur. Voor alle experimenten werden wildtypevissen van AB- of TüLF-stammen gebruikt.

OPMERKING: Het vaststellen van optimale behandelingsomstandigheden voor elk gewenst geneesmiddel voorafgaand aan de toepassing van ZefiX omvat verschillende noodzakelijke stappen. Bepaal eerst de halfmaximale remmende concentratie (IC50) van elk geneesmiddel met behulp van een geschikte cellijn binnen een conventioneel 2D-kweeksysteem. Op basis van eerdere ervaringen kunnen de effectieve geneesmiddelconcentraties voor behandeling met ZefiX 5x - 50x hoger zijn dan die welke worden gebruikt onder typische celkweekomstandigheden21,24. Voorafgaand aan de behandeling van getransplanteerde embryo's is het essentieel om de toxiciteit binnen de niet-getransplanteerde gastheerembryo's te beoordelen met behulp van het vastgestelde concentratiebereik. Na evaluatie van de toxiciteit worden cellijn-geëntte embryo's blootgesteld aan een verscheidenheid aan geneesmiddelconcentraties rond de 50x de IC50-waarde die eerder is bepaald in 2D-cultuur. Als de getransplanteerde cellen geen respons vertonen op doseringen tot 100x de IC50, kan het medicijn als ineffectief worden beschouwd voor ZefiX. Om de werkzaamheid mogelijk te verbeteren, is een optie om transplantaatcellen kort voor hun transplantatie in embryo's voor te bereiden met het medicijn25. Zie Tabel 1 voor alle oplossingen die hier worden gebruikt.

1. Dag 1: Voorbereiding op het experiment

  1. E3 medium voorbereiding: Bereid 2 L geautoclateerd E3 medium voor voor gebruik voor het onderhoud van het embryo.
  2. Preparaat van morfolino-antisense-oligonucleotiden (MO): Bereid een stockoplossing van 50 μM die beide MO's bevat in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met nucleasevrij water. Bewaar de stockoplossing bij kamertemperatuur (RT). Bereid de MO's voor op injectie door de oplossing gedurende 10 minuten op een verwarmingsblok bij 65 °C te incuberen.
    OPMERKING: De MO's zijn gericht tegen spi1 en csf3r om de differentiatie van macrofagen en neutrofiele cellen te remmen, zoals beschreven in referenties 22,23,26.
  3. Voorbereiding van injectieplaten
    1. Om 4-5 borden te bereiden, lost u 1% agarose op in E3-medium om een oplossing van 100 ml te creëren. Giet voor transplantatieplaten ~20 ml van de oplossing in elk petrischaaltje van 10 cm en zorg ervoor dat ze voor de helft gevuld zijn. Draai om de vloeistof gelijkmatig te verdelen.
    2. Voor Morpholino-injectieplaten plaatst u de spuitgietmatrijs op de vloeibare agarose in twee petrischaaltjes, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Dek de schalen af door de deksels te kantelen en laat ze op RT staan totdat de agarose is gestold. Eenmaal gestold, verwijdert u de vorm en bewaart u de platen ondersteboven bij 4 °C in een afgesloten plastic zak.
  4. Voorbereiding van injectienaalden
    1. Voor morfolino-injecties: Genereer naalden uit haarvaten van 10 cm met behulp van een naaldtrekker en breek de uiteinden af om een geschatte diameter van 10 μm te bereiken (zoals beschreven in27).
    2. Voor celtransplantatie: Gebruik in de handel verkrijgbare voorgetrokken injectienaalden met stompe uiteinden met een buitendiameter van 20 μm.
  5. Transplantaatcelcultuur: Gesplitste cellen (bijv. Nalm6) gericht op een doeldichtheid van 70%-80% op dag 4 in een T175-celkweekkolf met RPMI-medium aangevuld met 10% FCS en 1% P/S (RPMI-compleet). Splits de cellen 3-4 keer voor gebruik om een goede proliferatiesnelheid te garanderen.
    OPMERKING: Voor het klaarmaken van vers of vers/ingevroren patiëntenmateriaal voor transplantatie vindt u de instructies in stap 4.3. Cellen worden vervolgens op de dag van de transplantatie voorbereid.
  6. Zebravissen fokken: Zet 's middags wildtype zebravissen op in kweekbakken en houd mannetjes en vrouwtjes gescheiden.
    OPMERKING: Zebravissen werden grootgebracht en geënsceneerd zoals beschreven in de referentie28. Tijdsaanduidingen (hpf of dpf) geven uren of dagen na de bevruchting aan.

2. Dag 2: Morpholino-injectie

  1. Vul 500 ml geautoclaveerd E3-medium aan met 1% penicilline/streptomycine (E3/P/S) en vul twee petrischaaltjes van 10 cm. Haal de injectieplaat uit de koelkast om voor te verwarmen bij RT.
  2. Spreid de opening van de kweektanks zodat de bevruchting slechts in een fractie van de tanks tegelijk kan plaatsvinden (afhankelijk van de injectiesnelheid) om tijdige micro-injecties van Morpholino-oplossing in zebravisembryo's in het eencellige stadium te garanderen28,29. Begin met het openen van een of twee poorten, afhankelijk van de snelheid van de injector, wanneer de ene partij eieren gemakkelijk wordt geïnjecteerd, opent u een andere poort of twee poorten, enzovoort.
  3. Breng de bevruchte eieren in batches van 100 met zo min mogelijk vloeistof over in de eerder gemaakte injectieplaat. Lijn de embryo's uit in de groeven van de plaat.
  4. Injecteer 1 nL van een 50 μM mengsel van beide Morpholino's in de cel of de dooierzak net onder de cel tijdens de één-cel fase29. Injecteer voldoende eieren voor volgende procedures (bijv. voor één plaat met 96 putjes, injecteer tot 200 eieren om voldoende back-up te hebben voor mogelijke uitval vóór transplantatie).
  5. Breng de geïnjecteerde eieren over in petrischaaltjes met E3/P/S. Broed de geïnjecteerde eieren uit bij 28 °C. Bewaar niet-geïnjecteerde eieren als controlevis voor flowcytometrie-analyse bij 5 dpf. Bewaar de resterende E3/P/S medium bij 4 °C.

3. Dag 3: De-chorionatie

  1. De-chorionatie van zebravisembryo's: Handmatig de-chorionaat embryo's wanneer ze ouder zijn dan 24 hpf met behulp van twee precisietangen29.
    1. Verwijder alle dode embryo's die geen hartslag of beweging vertonen en ondoorzichtig lijken of embryo's met onregelmatige vormen uit de schaaltjes met een pasteurpipet.
    2. Knijp in het chorion met een precisietang om het op zijn plaats te houden. Knijp vlak naast de punt van de precisietang en houd het embryo op zijn plaats met de tweede tang en trek het chorion voorzichtig uit elkaar om het embryo vrij te geven
      OPMERKING: Om embryo's jonger dan 24 hpf te dechorioneren, moeten ze op een met agarose beklede schaal worden bewaard om te voorkomen dat ze aan het plastic blijven plakken. Handmatige de-chorionatie heeft de voorkeur omdat dit zachter is voor de embryo's. Een alternatieve enzymatische de-chorionatiemethode wordt elders beschreven30.
  2. Incubeer de ontchorioneerde embryo's 's nachts bij 28 °C.

4. Dag 4: Xenotransplantatie en medicamenteuze behandeling

  1. Bereiding van gastheerembryo's: Haal de voorbereide agaroseplaten en E3/P/S uit de koelkast en laat ze RT bereiken. Screen embryo's voor het juiste ontwikkelingsstadium bij 48 hpf met behulp van een stereomicroscoop. Neem alleen goed geënsceneerde en morfologisch typische embryo's op in de workflow, zoals elders beschreven29. Tel alle gezonde embryo's en plan verdere behandeling. Bewaar niet meer dan 100 embryo's per 10 cm petrischaaltje bij 28 °C om ongelijkmatige ontwikkelingssnelheden als gevolg van zuurstoftekort te voorkomen.
    OPMERKING: Volg stap 4.2. voor cellijnen. Ga voor vers/bevroren materiaal direct verder met stap 4.3.
  2. Voorbereiding van cellijnen
    1. Om fluorescerend gelabelde BCP-ALL-cellen voor te bereiden op flowcytometrie en transplantatie, wast u de cellen (vanaf stap 1.5.) met 1x PBS: centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten en suspendeer opnieuw in 20 ml PBS.
    2. Tel cellen en breng 3 x 105 ongekleurde cellen over in een FACS-buisje voor dag 0 (0 dagen na injectie, dpi) flowcytometrie-analyse. Bewaar op ijs.
    3. Plaat 3 x 105 cellen in 3 ml RPMI-compleet in één putje van een plaat met 6 putjes en op 37 °C houden voor 3 dpi controle.
    4. Breng 1 x 107 cellen over in een centrifugebuis van 15 ml voor CTV-labeling. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT, giet het bovenstaande eruit (gebruik een pipet voor de rest) en suspendeer de pellet opnieuw in 2,5 ml PBS (RT) met 1 μl CTV-stockoplossing.
    5. Incubeer gedurende 5 minuten in het donker bij 37 °C, stop de reactie met 12,5 ml RPMI-compleet en incubeer vervolgens 10 minuten in het donker bij 37 °C.
    6. Centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten bij RT en was eenmaal met 10 ml RPMI-compleet. Centrifugeer opnieuw en suspendeer opnieuw in 10 ml RPMI-compleet.
    7. Filtreer de cellen met behulp van een filter van 10 μm door gedurende 5 minuten te centrifugeren op 350 x g . Resuspendeer de pellet, tel de cellen en breng 3 x 105 CTV-gelabelde cellen over in een FACS-buisje. Plaat 3x 10^5 cellen met 3 ml RPMI-compleet in één putje van een plaat met 6 putjes en houd op 37°C voor proliferatiecontrole van 3 dpi. Bewaar de resterende cellen in 1 ml PBS op ijs tot transplantatie.
  3. Bereiding van vers/diepgevroren patiëntenmateriaal
    1. Verwarm twee centrifugebuisjes van 15 ml met elk 10 ml RPMI-compleet voor bij 37 °C. Ontdooi een injectieflacon met 5-10 x 106 cellen in een waterbad van 37 °C.
    2. Zodra er nog maar een kleine hoeveelheid ijs over is, brengt u de cellen over naar de centrifugebuis met het voorverwarmde medium. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in de tweede tube voorverwarmd RPMI-complete.
    3. Tel levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw. Aliquot 1x 10^5 cellen in een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer dit aliquot cellen in een FACS-buis bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in 300 μl PBS.
    4. Bewaar het geresuspendeerde aliquot op ijs als een onbehandelde controle voor flowcytometrieanalyse.
      OPMERKING: Als voldoende steekproefomvang het toelaat, handhaaf dan een onbehandelde controle in de kweek voor flowcytometriemeting op dag 7.
    5. Voeg 1 μL van de CTV-voorraadoplossing toe aan 2,5 ml PBS (RT) voor elke 1 x 106 cellen. Pas het volume van de CTV-voorraadoplossing aan als er minder cellen beschikbaar zijn.
    6. Incubeer cellen met CTV gedurende 5 minuten bij 37 °C in het donker, stop de reactie door 12,5 ml voorverwarmd (37 °C) RPMI-compleet toe te voegen en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij 37 °C.
    7. Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT en was de cellen eenmaal met 10 ml RPMI-compleet. Centrifugeer opnieuw bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT en suspendeer de cellen opnieuw in 10 ml RPMI-compleet.
    8. Filtreer de celsuspensie in een verse centrifugebuis van 50 ml met behulp van een filter van 10 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten op 350 x g .
    9. Gooi de supernatant niet weg. Resuspendeer de pellet en tel de cellen. Breng 3 x 105 cellen met CTV-label over in één FACS-buisje.
    10. Centrifugeer de resterende cellen bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de resterende cellen in 1 ml PBS en bewaar ze op ijs tot gebruik bij transplantatie.
      OPMERKING: Als er voldoende CTV-positieve cellen overblijven, kunnen ze in 2D-cultuur parallel aan de xenotransplantaten worden gehouden voor het vergelijken van de proliferatiesnelheid.
  4. Meting van flowcytometrie
    OPMERKING: Flowcytometrie bij 0 dpi moet door een tweede persoon worden uitgevoerd om de tijd dat cellen op ijs blijven vóór transplantatie te minimaliseren. Vóór de eerste flowcytometriemeting met behulp van het aangewezen kleuringspaneel (CTV, CD19-Alexa488, APC-Annexin V en 7AAD), voert u een compensatietest uit volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Bereid twee FACS-buisjes als volgt voor: Buis 1: Ongekleurde controlecellen; Buis 2: Cellen gekleurd met CTV, CD19, 7AAD en Annexine.
      OPMERKING: Kleuring en labels: CellTrace Violet (CTV) identificeert gelabelde transplantaatcellen versus gastheerviscellen en beoordeelt de proliferatiesnelheid na 3 dagen. CD19-antilichaam, een marker op het celoppervlak, dient als een extra marker voor het identificeren van menselijke BCP-ALL-transplantaatcellen. Voor andere soorten kanker kunnen alternatieve markerantilichamen nodig zijn. Annexine V markeert apoptose in een vroeg stadium voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen. 7AAD markeert apoptose of necrose in een laat stadium voor beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen.
    2. Centrifugeerbuisjes (één met CTV-gekleurde cellen en de andere niet-gekleurde cellen) bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het bovenstaande uit buis 1. Resuspendeer de pellet in 310 μl Annexin Binding Buffer (ABB).
    3. Buis 2: Voer antilichaam- en levensvatbaarheidskleuring uit zoals hieronder beschreven.
      OPMERKING: Dit kleuringsprotocol is geoptimaliseerd voor CD19 B-celkleuring. Voor andere menselijke antilichamen die worden gebruikt voor het labelen van verschillende celtypen, moet het protocol mogelijk worden aangepast.
      1. Voeg 98 μL ABB toe aan buis 2 (met CTV-gelabelde cellen). Voeg 2 μL CD19-Alexa488 antilichaam (1:50 verdunning) toe aan de 98 μL ABB toegevoegd. Meng goed.
      2. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 4 °C en voeg 500 μl ABB toe om de reactie te stoppen. Centrifugeer de buis 5 minuten bij 350 x g bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande middel en herhaal de wasstap.
      3. Resuspendeer de celpellet in 100 μl ABB en ga over tot 7AAD en APC-Annexin V kleuring. Voer 7AAD- en APC Annexin V-kleuring en flowcytometriemeting uit zoals hieronder beschreven.
      4. Voeg 5 μl 7AAD en 5 μl APC-Annexine V toe aan de geresuspendeerde cellen. Draai voorzichtig om te mengen. Incubeer de buis gedurende 15 minuten in het donker bij RT. Voeg 200 μL ABB toe om een eindvolume van 310 μL te bereiken.
      5. Voer flowcytometrie-analyse uit op de dag van transplantatie in de volgende volgorde om kruisbesmetting te voorkomen: Ongekleurde controlecellen (buis 1), CTV-gelabelde cellen gekleurd met Alexa488-CD19, APC-annexine V en 7AAD (buis 2). Registreer ten minste 10.000 gebeurtenissen per monster voor voldoende analyse.

5. Transplantatie

  1. Transplantatieplaat: Zet twee petrischaaltjes van 10 cm gevuld met E3/P/S klaar en plaats ze minstens 30 minuten in de broedmachine bij 28 °C om voor te verwarmen.
  2. Bereiding van de cellen: Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT, gooi het bovenstaande weg en verwijder de resterende vloeistof met behulp van een micropipet. Voeg PBS toe om een eindvolume van 20 μl te bereiken. Bewaar de geconcentreerde celsuspensie op ijs.
    OPMERKING: Cellen mogen tijdens de transplantatieprocedure niet langer dan 2 uur op ijs blijven liggen.
  3. Transplantatienaald en preparaat van gastheerembryo's
    1. Breng 25-30 embryo's over naar een van de voorverwarmde petrischaaltjes met E3/P/S met behulp van een glazen pasteurpipet om als controle te dienen. Laad 4 μL van de celsuspensie in de transplantatienaald met behulp van een microladerpunt.
      OPMERKING: Het laden zou binnen 1-2 minuten soepel moeten verlopen. Als dit niet het geval is, voeg dan voorzichtig meer PBS toe aan de celsuspensie.
    2. Kalibreer de injectiedruk en pulslengte door de microinjector aan te passen. Pas aan totdat één injectie ongeveer 1.000 ALLE cellen of 2 nL celsuspensie verdrijft (voor 1x 107 cellen in 20 μL). Om 1.000 cellen te schatten, verdrijft u een volume van de suspensie op een agaroseoppervlak dat bedekt is met medium. Tel 100 cellen in een klein gebied, extrapoleer hun verdeling naar de totale celpopulatie en schat het totale aantal.
    3. Bereid 50 ml E3 met tricaïne (eindconcentratie: 80 mg/l). Breng de gastheerembryo's over in de tricaïne-oplossing en incubeer gedurende ten minste 2 minuten om een goede anesthesie te garanderen. Het embryo wordt op de juiste manier verdoofd als er geen motorische respons waarneembaar is
      OPMERKING: Een microloader tip of pincet kan worden gebruikt om het embryo voorzichtig te benaderen en/of aan te raken.
    4. Breng 15-20 gedechorioneerde embryo's over op een met agarose omhuld injectieschaaltje (zie eerdere bereidingsinstructies) met zo min mogelijk vloeistof om te voorkomen dat embryo's wegglijden.
    5. Schik de embryo's zoals geïllustreerd in figuur 2A. Injecteer ongeveer 1.000 CTV-positieve BCP-ALL-cellen in de pericardiale holte. Breng de naald in een hoek van 45° vanuit de dorso-caudale richting, zoals weergegeven in figuur 2B , om de cellen te injecteren.
      OPMERKING: Gebruik in de handel verkrijgbare voorgetrokken naalden met stompe uiteinden met een openingsdiameter van 20 μm, speciaal ontworpen voor kleine leukemiecellen (zie materialenlijst). Als de naald verstopt raakt, knip deze dan zo nodig af, maar kalibreer daarna het injectievolume en het aantal cellen opnieuw.
    6. Zodra alle 15-20 embryo's zijn geïnjecteerd, brengt u ze over naar het voorverwarmde petrischaaltje gevuld met E3/P/S en houdt u ze op 28 °C.
    7. Herhaal de stappen totdat ongeveer 100 - 150 embryo's zijn getransplanteerd voor één medicamenteuze behandelingstest, die drie geneesmiddelconcentraties en één controle moet omvatten.
    8. Incubeer zowel de getransplanteerde embryo's als de niet-getransplanteerde controles gedurende 1-3 uur bij 28 °C voordat u met de medicamenteuze behandeling begint.
  4. In vivo medicamenteuze behandeling (plaat met 96 putjes)
    1. Met behulp van fluorescerende stereomicroscopie worden embryo's gescreend om een succesvolle implantatie te bevestigen (Figuur 2C). Zorg ervoor dat de dooier intact is, aangezien de dooieromgeving giftig kan zijn voor transplantaatcellen21. Gooi embryo's met cellen in de dooier weg.
    2. Bereid 2,5 ml van een 2x geconcentreerde oplossing voor elke geneesmiddelconditie die moet worden getest in E3/P/S met 0,5% DMSO. Bereid bovendien een voertuigcontroleoplossing van 5 ml voor die 0,5% DMSO in E3/P/S bevat.
    3. Voeg 100 μL E3/P/S + 0,5% DMSO toe aan elk putje van een plaat met 96 putjes. Deze stap voorkomt de onbedoelde overdracht van minimale hoeveelheden geneesmiddel tussen putten.
    4. Breng voorzichtig een getransplanteerd embryo over in elk putje. Gebruik een glazen pasteurpipet om elk embryo op te pakken in zo min mogelijk E3-medium.
    5. Laat het embryo naar de bodem van de pipetpunt zinken door de pipet voorzichtig te kantelen en laat deze met behulp van capillaire krachten in het putje los. Raak het medium in het putje niet aan tijdens het overbrengen.
    6. Voeg geneesmiddeloplossingen toe aan de plaat: Vul 24 putjes (2 rijen) van de plaat met 96 putjes met 100 μl van de voertuigcontroleoplossing of een van de drie 2x geconcentreerde geneesmiddeloplossingen.
      OPMERKING: Effectieve geneesmiddelconcentraties moeten worden bepaald in eerdere experimenten die specifiek zijn voor elk geneesmiddel dat wordt getest.
    7. Bewaar embryo's gedurende 72 uur op 35 °C, inclusief de niet-getransplanteerde embryo's, die op dag 7 als controle zullen dienen voor flowcytometrie-analyse.

6. Dag 7

  1. Dissociatie van embryo's/transplantaten
    1. Screen de plaat met 96 putjes met behulp van stereomicroscopie om gezonde zebravisembryo's te identificeren en te selecteren. Verzamel willekeurig 10 gezonde gastheerembryo's van elke aandoening in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml (idealiter resulterend in 2 buisjes per aandoening).
    2. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit elk embryobevattend buisje en offer de embryo's door middel van een hypothermische schok door de buisjes 1 uur op ijs te incuberen.
    3. Voeg 500 μL calcium- en magnesiumvrije Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) toe aan elke buis. Dissocieer de embryo's en transplantaatcellen mechanisch door trituratie met behulp van een micropipetpunt van 200 μl, waarbij ongeveer 15x op en neer wordt gepipetteerd.
    4. Pellet de weefselfragmenten door centrifugatie bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT. Bereid in de tussentijd FACS-buisjes voor met een fijnmazige zeefdop van 35 μm die 2 ml PBS per toestand bevat (4 buisjes in totaal).
    5. Resuspendeer elke pellet in 500 μL enzymenmix (0,01% papaïne, 0,1% dispase II, 0,01% deoxyribonuclease I en 12,4 mM MgSO4 in calcium- en magnesiumvrije HBSS) voor enzymatische dissociatie. Incubeer 15 minuten bij RT.
    6. Piket het mengsel tijdens de incubatie elke 5 minuten op en neer en gebruik dezelfde pipetpunt voor elke afzonderlijke buis om weefselverlies te voorkomen.
  2. Meting van flowcytometrie
    1. Breng de gedissocieerde cellen over in de zeefdop van 35 μm fijnmazig filter van de FACS-buisjes en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g .
    2. Bereid tijdens het centrifugeren een mastermix voor CD19 B-cel-oppervlaktekleuring. Combineer 98 μL ABB met 2 μL Alexa Fluor 488 anti-humaan CD19-antilichaam voor elke aandoening.
    3. Gooi het bovenstaande uit de gedissocieerde celpellet weg en suspendeer de pellet in 100 μl van het CD19-kleuringsmastermengsel.
    4. Voer het CD19-, 7AAD- en APC Annexin V-kleuringsprotocol uit voor alle ZefiX-monsters, inclusief 3 x 105 CTV-positieve cellen uit parallelle celcultuur, indien beschikbaar.
    5. Voer een flowcytometrie-analyse uit volgens de volgorde en noteer het aantal gebeurtenissen dat wordt beschreven in tabel 2. Voer alle monsters met gastheer- en transplantaatcellen zo volledig mogelijk uit om het totale aantal transplantaatcellen te evalueren.
  3. Analyse van resultaten met behulp van commerciële software.
    1. Poortstrategie voor celkweekmonster: Open de software en laad de FCS-bestanden in de werkruimte. Maak een dot plot met CD19 en CTV om ervoor te zorgen dat het signaal overlapt en om de aanwezigheid van de kankercellen te bevestigen. Maak vervolgens een puntdiagram met FSC-A (x-as) en SSC-A (y-as) om intacte cellen (Q2) te onderscheiden van puin (Q4; Figuur 3A').
    2. Gebruik de populatie Intacte cellen om een nieuwe grafiek te maken met SSC-H (x-as) en SSC-A (y-as) om afzonderlijke cellen te identificeren (Figuur 3A'').
    3. Maak nog een puntdiagram met Annexin V (x-as) en 7AAD (y-as) met behulp van de populatie met enkele cellen (Figuur 3A'''). Onderscheid cellen in vier populaties: Levensvatbare cellen: Annexine V negatief, 7AAD negatief (Q4); Vroege apoptotische cellen: Annexine V positief, 7AAD negatief (Q3); Late apoptotische/necrotische cellen: Annexine V positief, 7AAD positief (Q2); Necrotische cellen: Annexine V negatief, 7AAD positief (Q1).
    4. Herhaal deze stappen voor voorbeelden van 3 dpi (Afbeelding 3B).
    5. Afschermingsstrategie voor transplantaat- en gastheerembryocellen
      1. Scheid menselijke transplantaatcellen van gastheercellen met behulp van een puntdiagram met CTV (x-as) en CD19 (y-as). Identificeer en isoleer CTV/CD19 dubbel-positieve transplantaatcellen (Figuur 3C).
      2. Pas dezelfde poortstrategie toe als beschreven voor 3 dpi-kweekcellen (Figuur 3B' - B''') op de transplantaatcelpopulatie. Kopieer de poortstrategie voor consistentie.
      3. Voeg alle Annexine V- en 7AAD-negatieve celpopulaties samen tot een histogram met CTV-waarden op de x-as (Figuur 3D). Bereken het geometrisch gemiddelde voor alle vijf de steekproeven om de proliferatiesnelheid te bepalen.
  4. Berekeningen voor de evaluatie van de respons op de behandeling
    1. Om het aantal celdelingen na 3 dagen te bepalen, gebruikt u de formule:
      n = log2 (I0/I)
      Waarbij I0 = initiële CTV-fluorescentie-intensiteit (geometrisch gemiddelde, 0 dpi), I = CTV-fluorescentie-intensiteit bij 72 uur, n = aantal celdelingen.
      Voorbeeld: Vers ingevroren patiëntcellen 2,6x gedeeld in ZefiX log2 (88317/14644) = 2,6
      en 2,8x in 2D cultuur log2(88317/12992) = 2,8
    2. Om het totale aantal transplantaatcellen per vis na 3 dagen te bepalen, deelt u het totale aantal kankercellen (inclusief apoptotische cellen maar exclusief puin) door het aantal vissen dat in het monster is verzameld (meestal n = 10).
    3. Gebruik de formule om de levensvatbaarheid van CTV-positieve transplantaatcellen na 3 dagen te bepalen:
      V = (C/100) x A
      Waarbij: V = levensvatbaarheid, C = fractie intacte afzonderlijke cellen zonder puin (als percentage), A = fractie van annexine V- en 7AAD-negatieve cellen (als percentage).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor een gedetailleerde wetenschappelijke evaluatie van het ZefiX-protocol, inclusief de xenotransplantaat en medicamenteuze behandeling van vers ingevroren, primaire BCP-ALL-celmonsters, verwijzen wij u naar het eerder gepubliceerde manuscript21. Goedkeuring voor het gebruik van patiëntenmonsters in onderzoek voor preklinische geneesmiddelentests werd verleend als onderdeel van aanvullende studies aan de ALL-REZ BFM 2002-studie (NCT00114348) en het ALL-REZ BFM-re...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zebravisembryo's zijn een steeds populairder xenotransplantaatmodel geworden voor geneesmiddelenscreening en kankeronderzoek vanwege hun hoge doorvoercapaciteit en kosteneffectiviteit. Deze xenotransplantaten zijn veelbelovend als een cruciale pijler van translationele geneeskunde, die preklinisch onderzoek en besluitvorming ondersteunt 9,21. Xenotransplantaatmodellen van zebravissen voor de uitbreiding en behandeling van menseli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Stichting voor Onderzoek) binnen het Collaborative Research Center CRC1588, projectnummer 493872418 en de Dr. Kleist Stiftung, Berlijn, evenals door de Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03/2016), de Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) en het Duitse Kankerconsortium (DKTK, Joint Funding Call 2016). Met dank aan Julia Köppke en Mareike Wolff voor hun kritische lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Petrischaaltje  (10 cm)GreinerP7237
7-AAD levensvatbaarheidskleuringsoplossing Invitrogen00-6993-50
Agarose (LE, analytische kwaliteit)Biozym 840004
LuchtdrukinjectorNarishigeIM400 met externe gastoevoer
Alexa Fluor 488 anti-mens CD19-antilichaam Biolegend302219
Annexine-binding bufferBiolegend422201Of zie oplossingen voor bereiding
APC annexine V Biolegend640941
Capillairen (10 cm, OD 1,0 mm, met filamenten)WPIINCTW100F-41.0 OD; 0.75 ID
Cellencultuurflesje (T-175)Sarstedt83,39,12,002
CellTrace Violet InvitrogenC34557
Dimethylsulfoxide (DMSO)RothA994.1
Dispase II Sigma AldrichD4693-1g
DNase IAppliChem GmbHA3778
Eppendorfbuisjes (1,5 ml)Eppendorf30120086
FACS-buis (Polystyreen ronde bodembuis met Celzeefdop, 5 ml)Falcon352235
Falconbuizen (50 ml)Falcon352070
Foetaal runderserum (FCS)Sigma AldrichC8056
Fijnmazige filter (10 µm)PluriStrainer435001050
Fijnmazige filter (20 µm)PluriStrainer431002040
Flowcytometer Becton DickinsonBD LSRFortessa X-20
Fluorescentie-stereomicroscoopLeica
Fluorescentie-stereomicroscoop met cameraLeicaM165 FCCamera: DFC7000 T
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, calcium- en magnesiumvrij)Sigma Aldrich88284
Injectievorm (Zebrafish MI/Transplant KIT)World Precision Instruments Z-MOLDS
Injectienaalden (zonder filament)Biomedical instrumentsVZIPbl-20-10-55Zebrafish injectiepipet, stomp, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glas: BM100T-10P
Macro-centrifugeEppendorf
Micro-centrifuge
Morpholino (csf3r)Gene Tools LLCcsf3r (GAAGCACAAGCGA
GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)Gene Tools LLCspi1(GATATACTGATAC
TCCATTGGTGGT)
PapaïneSigma AldrichP3125
Penicilline-Streptomycine (Penstrep; 10.000 U/ml)Gibco15140122
Platen (4-well)Greiner Bio one 657160
Platen (96-well)Greiner Bio one 657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco21875-034
Tricaine  (MS-222)Sigma AldrichE10521-50GEthy-3 aminobenzoaat methaansulfenaat

Referenties

  1. Fontana, C. M., Van Doan, H. Zebrafish xenograft as a tool for the study of colorectal cancer: a review. Cell Death Dis. 15, 1-12 (2024).
  2. Sturtzel, C., et al. Refined high-content imaging-based phenotypic drug screening in zebrafish xenografts. NPJ Precis Oncol. 7 (1), 1-16 (2023).
  3. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24, 2288(2023).
  4. Gamble, J. T., Elson, D. J., Greenwood, J. A., Tanguay, R. L., Kolluri, S. K. The zebrafish xenograft models for investigating cancer and cancer therapeutics. Biology. 10 (4), 252(2021).
  5. Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models. Cells. 9 (2), 293(2020).
  6. Wang, W., et al. Progress in building clinically relevant patient-derived tumor xenograft models for cancer research. Animal Model Exp Med. 6 (5), 381-398 (2023).
  7. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trend Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  8. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nat Rev Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  9. Costa, B., et al. Zebrafish avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer. Nat Comm. 15 (1), 4771(2024).
  10. Grissenberger, S., et al. Chapter 8 - Preclinical testing of CAR T cells in zebrafish xenografts. Method Cell Biol. 167, 133-147 (2022).
  11. Yan, C., et al. Single-cell imaging of T cell immunotherapy responses in vivo. J Exp Med. 218 (10), 20210314(2021).
  12. Pascoal, S., et al. A preclinical embryonic zebrafish xenograft model to investigate CAR T cells in vivo. Cancers. 12 (3), 567(2020).
  13. Pal, D., et al. Long-term in vitro maintenance of clonal abundance and leukaemia-initiating potential in acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia. 30 (8), 1691-1700 (2016).
  14. Beneduce, G., et al. Blinatumomab in children and adolescents with relapsed/refractory B cell precursor acute lymphoblastic leukemia: A real-life multicenter retrospective study in seven AIEOP (Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica) Centers. Cancers. 14 (2), 426(2022).
  15. Xie, J., et al. Short-course blinatumomab for refractory/relapse precursor B acute lymphoblastic leukemia in children. Front Pediatr. 11, 1187607(2023).
  16. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  17. Howe, K. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  18. Lee, H. C., Lin, C. Y., Tsai, H. J. Zebrafish, an in vivo platform to screen drugs and proteins for biomedical use. Pharmaceuticals. 14 (6), 500(2021).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Miao, K. Z., Kim, G. Y., Meara, G. K., Qin, X., Feng, H. Tipping the scales with zebrafish to understand adaptive tumor immunity. Front Cell Dev Biol. 9, 660969(2021).
  21. Gauert, A., et al. Fast, in vivo model for drug-response prediction in patients with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Cancers. 12 (7), 1883(2020).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Current Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  24. Wijk, R. C. V., et al. Mechanistic and quantitative understanding of pharmacokinetics in Zebrafish larvae through nanoscale blood sampling and metabolite modeling of paracetamol. J Pharmacol Exp Ther. 371 (1), 15-24 (2019).
  25. Lázaro-Navarro, J., et al. Inhibiting casein kinase 2 sensitizes acute lymphoblastic leukemia cells to venetoclax via MCL1 degradation. Blood Advances. 5 (24), 5501(2021).
  26. Rhodes, J., et al. Interplay of pu.1 and gata1 determines myelo-erythroid progenitor cell fate in zebrafish. Developmental Cell. 8 (1), 97-108 (2005).
  27. Zakaria, Z. Z., Eisa-Beygi, S., Benslimane, F. M., Ramchandran, R., Yalcin, H. C. Design and microinjection of Morpholino antisense oligonucleotides and mRNA into zebrafish embryos to elucidate specific gene function in heart dvelopment. J Vis Exp. (186), e63324(2022).
  28. ZFIN: Zebrafish Book: Contents. , https://zfin.org/zf_info/zfbook/cont.html (2025).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. Hasegawa, E. H., Gist H Farr, I. I. I., Maves, L. Comparison of pronase versus manual dechorionation of zebrafish embryos for small molecule treatments. J Dev Biol. 11 (2), 16(2023).
  31. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: the hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Adv. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  32. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukocyte Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
  33. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
  34. Nguyen-Chi, M., et al. TNF signaling and macrophages govern fin regeneration in zebrafish larvae. Cell Death Dis. 8 (8), e2979-e2979 (2017).
  35. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Dis Models Mech. 13 (1), dmm041889(2020).
  36. Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Comm Biol. 3 (1), 1-13 (2020).
  37. Pringle, E. S., et al. The zebrafish xenograft platform-A novel tool for modeling KSHV-associated diseases. Viruses. 12 (1), 12(2020).
  38. Pype, C., et al. Incubation at 32.5 °C and above causes malformations in the zebrafish embryo. Reprod Toxicol. 56, 56-63 (2015).
  39. Xu, X., et al. Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy for glioblastoma. Cancer Cell Int. 21 (1), 76(2021).
  40. Siebert, J., et al. Rhabdomyosarcoma xenotransplants in zebrafish embryos. Pediat Blood Cancer. 70 (1), e30053(2023).
  41. van Bree, N., et al. Development of an orthotopic medulloblastoma zebrafish model for rapid drug testing. Neuro-Oncol. noae210, (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Xenotransplantatie in zebravissenflowcytometrieBCP ALL cellensingle cell analysemorpholino injectiecelproliferatiepati ntafgeleide cellengepersonaliseerde therapie
Snelle in vivo voorspelling van geneesmiddelrespons met behulp van leukemieceltransplantaten in zebravisembryo's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.