De voorgestelde opstelling maakt gecontroleerde mechanische ventilatie en magnetische resonantiebeeldvorming van 3D-thoraxbewegingen bij muizen en ratten mogelijk. We hebben deze opstelling gebruikt om de pathofysiologie te bestuderen die ten grondslag ligt aan door mechanische ventilatie geïnduceerde ademhalingsspierdisfunctie.
Methodenartikel
3D Cine magnetische resonantie beeldvorming van ademhalingsbeweging bij mechanisch geventileerde muizen en ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De pathofysiologie van diafragmadisfunctie bij mechanisch beademde patiënten moet nog volledig worden begrepen en er zijn adequate diermodellen nodig om verder onderzoek mogelijk te maken. Mechanische ventilatie-instellingen, zoals het niveau van positieve eind-expiratoire druk (PEEP), spelen een cruciale rol. Het doel was om een methode te ontwikkelen om 3D-thoracale beweging in beeld te brengen tijdens mechanische beademing van muizen en ratten bij verschillende ademhalingsdrukinstellingen. Ratten (Wistar) en muizen (C57BL/6) werden verdoofd met een mix van ketamine, atropine en dexmedetomidine. De anesthesie werd gehandhaafd door continue infusie via een peritoneale katheter. Vervolgens werd een tracheostomie uitgevoerd om mechanische ventilatie van de dieren mogelijk te maken. Dieren werden in een 7T MR-systeem geplaatst terwijl ze werden geventileerd met een MR-compatibel beademingsapparaat. 3D cine-beeldvorming van de thorax werd uitgevoerd met behulp van een 3D-gradiënt-echosequentie met pseudo-spiraalvormige k-ruimtevulling. Een navigatorsignaal, gegenereerd door de slice-selectie-rewindergradiënt, werd elke TR geregistreerd. Retrospectieve binning en reconstructie van de gegevens in 12 respiratoire cine-tijdsbestekken werd uitgevoerd met behulp van in-house ontwikkelde software. We hebben met succes de thoracale beweging in 3D gevisualiseerd in beide soorten tijdens mechanische beademing, waardoor het mogelijk is om veranderingen in de thoraxgeometrie tijdens de ademhalingscyclus op verschillende PEEP-niveaus te onderzoeken. We ontdekten dat retrospectieve binning van ademhalingsframes sterk werd vergemakkelijkt door de vaste ademhalingsfrequentie. Het hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om de cardiale en thoracale geometrie en beweging bij mechanisch beademde muizen en ratten te bestuderen.
Inleiding
Mechanische beademing is de hoeksteen van de behandeling van acuut respiratoir falen op de intensive care. Helaas kan het ook letsel veroorzaken. Door beademing geïnduceerd longletsel, beademingsgerelateerd hersenletsel en door beademing geïnduceerde middenrifdisfunctie zijn voorbeelden van iatrogene complicaties die verband houden met acute mechanische beademing 1,2,3. De pathofysiologie die aan deze mechanismen van letsel ten grondslag ligt, blijft slecht begrepen. Experimenteel werk bij dieren heeft belangrijke mechanismen geïdentificeerd die ten grondslag liggen aan complicaties van mechanische ventilatie, waardoor vertaling naar de klinische praktijk mogelijk is door de toepassing van nieuwe ventilatiestrategieën4. Een recent voorbeeld is het onderzoek naar de impact van ventilatordyssynchronieën op de middenriffunctie in ARDS-modellen van varkens5. Dergelijk onderzoek in mechanisch geventileerde diermodellen is van vitaal belang om de mechanismen van letsel op te helderen, zelfs met de huidige neiging om af te stappen van dierproeven. Studies naar de effecten van mechanische beademing vereisen een intact cardiopulmonaal systeem en het vermogen om pathofysiologie te simuleren die vaak wordt gezien op de ICU4. Grote diermodellen worden vaak gebruikt omdat ze de menselijke fysiologie beter nabootsen dan knaagdieren en kunnen worden beademd met machines die op de ICU4 worden gebruikt. De belangrijkste nadelen zijn de hoge kosten die gepaard gaan met het gebruik van grote dieren en het ontbreken van genetisch gemanipuleerde grote diermodellen om moleculaire mechanismen van ziekten te onderzoeken 6,7. Daarom zijn experimenten met mechanisch geventileerde knaagdieren onvermijdelijk zolang er geen alternatieven, zoals geavanceerde weefselculturen of organ-on-a-chip-modellen, beschikbaar zijn.
Verschillende interventies die de resultaten bij dieren verbeterden, vertaalden zich niet naar mensen 4,6, wat het belang onderstreept van het begrijpen hoe veelgebruikte diermodellen van mechanische ventilatie verschillen van mensen. De effecten van beademingsinstellingen op het ademhalingssysteem worden bepaald door een overvloed aan factoren die soortspecifiek kunnen zijn, zoals weefselelastantie, spiertonus en variatie in de respons op veelgebruikte anesthetica 8,9,10,11. Deze verschillen kunnen leiden tot contrasterende effecten op de thorax- en longbeweging en geometrie die de ongelijkheid tussen mens en dier kunnen verklaren. Onderzoek naar het effect van ventilatie-instellingen op de geometrie en beweging van het cardiopulmonale systeem kan verschillen tussen soorten ophelderen en kan helpen bij de vertaling van pathofysiologische concepten die zijn afgeleid van dierstudies naar de klinische setting. De technische vooruitgang van bewegingsopgeloste cardiovasculaire magnetische resonantie beeldvorming heeft beeldvorming van het kloppende hart in knaagdiermodellen mogelijk gemaakt, wat inzicht geeft in vorm, functie en pathofysiologie in knaagdiermodellen van hart- en vaatziekten12,13. Deze methoden worden onderbenut om de thorax en beweging tijdens de ademhalingscyclus in beeld te brengen bij mechanisch geventileerde dieren.
Hier presenteren we een methode om de thoraxgeometrie en bewegingen bij mechanisch geventileerde knaagdieren te bestuderen met behulp van 3D cine MRI. Dit maakt het mogelijk om de acute effecten van talrijke beademingsinstellingen of andere ingrepen op de thoraxgeometrie en beweging bij mechanisch geventileerde knaagdieren te bestuderen. We pasten een nieuwe pseudo-spiraalvormige, respiratoire-gated 3D cine MRI-acquisitie toe voor geventileerde kleine dieren13,14. In deze eerste studie onderzochten we de effecten van positieve eind-expiratoire druk (PEEP), maar deze methode kan ook worden gebruikt om het effect van andere interventies of ademhalingsinstellingen te bestuderen, zoals I:E-ratio, ademvolume en ademhalingsfrequentie. Deze methode zal een scala aan mogelijkheden openen voor preklinische beeldvorming van knaagdiermodellen die mechanische beademing vereisen op het gebied van intensive care-onderzoek en daarbuiten.
Protocol
Alle beschreven procedures zijn uitgevoerd volgens de EG-richtlijn 86/609 van de Europese Unie. De experimenten zijn goedgekeurd door de Raad voor de Ethiek Dieren van Amsterdam UMC, locatie VUmc en AMC. C57BL/N-muizen en Wistar-ratten werden verkregen uit Charles River-laboratoria. Mannelijke en vrouwelijke muizen van 3-6 maanden met een gewicht van 25-32 g en mannelijke en vrouwelijke ratten van 3-6 maanden met een gewicht tussen 200-400 g werden voor alle experimenten gebruikt. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Alle dieren zijn minimaal 1 week voor aanvang van de experimenten geacclimatiseerd.
1. Voorbereiding van de installatie
- Bereid de anesthesiemedicatie voor volgens de doseringen vermeld in stap 2.
- Kalibreer de mechanische ventilator door door het ventilatormenu te scrollen en te klikken op Setup > More Ventilator > Calib&Tests. Voer alle vier de tests en kalibraties uit die daar worden vermeld: Lektest, Slang zuiveren, Dode ruimte meten en Slang pursen.
- Plaats de MR-compatibele mechanische ventilator in de MR-ruimte en trek de kabels die zijn aangesloten op de MR-compatibele ventilator door de boring van de MR-machine. Men kan een testlong (bijvoorbeeld een kleine ballon) gebruiken om de ventilatie van het MR-compatibele beademingsapparaat te controleren.
- Sluit de MR-compatibele mechanische ventilator aan op de compressor en een bron van zuurstofstroom.
- Bereid een PEEP-kolom voor door een meetkolom van 10 ml met water te vullen en de diepte van het water in centimeters te markeren. Plaats de uitademingsslang van de MR-compatibele ventilator in de PEEP-kolom. Een overzicht van de opstelling wordt weergegeven in figuur 1.
- Plak een ademhalingskussen losjes vast aan de MR-wieg op de plaats waar de borstkas van het dier komt te liggen.
2. Anesthesie en het begin van mechanische beademing
- Begin met de verdoving van het dier (muis of rat) door het in een gaskamer te plaatsen die gevuld is met 4% isofluraan in 100% O2.
- Weeg het dier om de dosis anesthesie te bepalen. Injecteer de operatieplaats (strottenhoofdgebied) met 3 mg/kg bupivacaïne en breng oogzalf aan in beide ogen.
- Plaats het dier op een verwarmingskussen terwijl u spontaan 2%-4% isofluraan in 100% zuurstof inademt via een neuskegel. Zorg voor bewaking van de hartslag, zuurstofverzadiging en temperatuur door een pulsoximeter op een van de poten van het dier te plaatsen en de sonde van de rectale thermometer in te brengen.
- Test op afwezigheid van reflexen vóór incisie. Til de huid die het strottenhoofd en de luchtpijp bedekt op met een chirurgische tang en maak een incisie met een gebogen schaar.
- Ontleed botweg de speekselklieren en onderliggende spieren totdat de luchtpijp zichtbaar is.
- Ontleed met een gebogen, scherpe tang de dorsale zijde van de luchtpijp en plaats een tang onder de luchtpijp om een niet-resorbeerbare gevlochten zijden hechtdraad (maat 6/0) rond de luchtpijp te trekken.
- Pak de luchtpijp vast aan een kraakbeenring en open de luchtpijp direct onder de ring met behulp van een veerschaar.
- Kanuleer de luchtpijp met een 20G (muis) of 14G (rat) Abbocath, gesneden op ongeveer 1-1,5 cm lengte. Bind de hechtdraad rond de gecanuleerde luchtpijp om een luchtdichte afsluiting te garanderen.
- Start de ventilatie van het dier met een ademvolume van 7 ml/kg, frequentie van 150 BPM voor muizen en 80 BPM voor ratten, 2 cmH2O PEEP met 3% isofluraan in 100% zuurstof.
- Voer een intraperitoneale injectie uit van de inductiedosis injectie-anesthesie (muis: ketamine 126 mg/kg, dexmedetomidine 0,1 mg/kg, atropine 0,5 mg/kg; rat: ketamine 90 mg/kg, dexmedetomidine 0,25 mg/kg, atropine 0,05 mg/kg) en verlaag na 5 minuten geleidelijk de isofluraanstroom (3% tot 0% in 10 minuten) om een soepele overgang van gas- naar injectie-anesthesie mogelijk te maken.
- Plaats 24G Abbocath intraperitoneaal en sluit aan op perfusor met de volgende snelheden muis: ketamine 36 mg/kg/u, dexmedetomidine 0,02 mg/kg/u, atropine 0,075 mg/kg/uur; Rat: ketamine 30 mg/kg/uur, dexmedetomidine 0,015 mg/kg/uur, atropine 0,075 mg/kg/uur. Start infusie.
OPMERKING: We hebben een tracheostomie uitgevoerd om de dieren te beademen in plaats van orale intubatie, omdat we hierdoor een hechtdraad rond de luchtpijp konden plaatsen. Dit was nodig om luchtlekkage te voorkomen, wat cruciaal is voor het behoud van voldoende PEEP.
3. MRI onder mechanische beademing
- Plaats het dier in de daarvoor bestemde MR-wieg in rugligging en plaats er de juiste MR-spoel voor muizen of ratten overheen terwijl u de tracheotomiebuis in de gaten houdt.
- Stop en koppel de mechanische ventilator los die wordt gebruikt in 1.2 en de anesthesiepomp en transporteer het dier naar de MR-kamer. Sluit het dier weer aan op de MR-compatibele ventilator en begin te ventileren met een ademvolume van 10 ml/kg en een frequentie van 150 BPM voor muizen en 80 BPM voor ratten. Het ademvolume is groter dan bij het beademingsapparaat dat in 1.2 wordt gebruikt om longweefsel te rekruteren dat mogelijk tijdens het transport is ingeklapt.
- Sluit de anesthesiepomp opnieuw aan met de bovengenoemde snelheden om de diepte van de anesthesie te behouden. Afhankelijk van het MR-systeem plaatst u de anesthesielijnen binnen of buiten de MR-boring.
- Plaats de sensor van de saturatie- en hartslagmeter op de achterpoot van het dier en plaats de sonde van de rectale thermometer. Sluit het ademhalingsbewakingssysteem aan op het ademhalingskussen. Controleer alle signalen en zorg ervoor dat de hartslag, zuurstofverzadiging en temperatuur binnen het fysiologische bereik liggen.
OPMERKING: Ademhalingsmonitoring moet de ademhalingsfrequentie aangeven die is ingesteld op de MR-compatibele ventilator en wordt alleen gebruikt om ademhalingsinspanning van het dier te detecteren. In het geval van ademhalingsinspanning van het dier vertoont de ademhalingscurve extra pieken. Dit vereist de toediening van een extra dosis anesthesie (1/3 van de initiële inductiedosering). - Plaats het dier in de MR-scanner met de spoel gecentreerd over de thorax en sluit de radiofrequente kabels aan op de spoel. Er is een aparte spoel en wieg om het verschil in grootte tussen muizen en ratten op te vangen (rattenspoel en wieg hebben een grotere diameter in vergelijking met de muizenspoel). Dompel de uitademingsslang 6 cm onder in de waterkolom en dien 6 cmH2O PEEP toe.
- Titreer het teugvolume tot 7-9 ml/kg, afhankelijk van de zuurstofverzadiging (ga voor het laagste teugvolume dat mogelijk is bij een verzadiging van 100%).
4. Scannen acquisitie
OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van de scaninstellingen.
- Gebruik door de leverancier gespecificeerde methoden om RF-kalibratie en shimming uit te voeren.
- Verkrijg een SCOUT met vijf afbeeldingen in coronale en axiale oriëntatie en zorg ervoor dat de volledige thorax zich in het gezichtsveld (FOV) bevindt. Een SCOUT is een snelle scan die wordt gebruikt voor het plannen van de andere beeldvlakken en bestrijkt meestal een groter gezichtsveld dan de andere afbeeldingen. Pas indien nodig de positie van het dier in de wieg aan en voer de SCOUT opnieuw uit.
- Plan de 2D-scans (zie Tabel 1 en Figuur 2) op de SCOUT-beelden. Zorg ervoor dat het coronale en sagittale vlak de volledige thorax bedekken.
OPMERKING: Het sagittale vlak wordt op de bovenkant van het rechterhalfrif geplaatst om het deel van het hart binnen het gezichtsveld te beperken. Door de SCOUT op 6 cmH2O PEEP te verkrijgen, zorgen we ervoor dat het diafragma in beeld wordt gebracht op de meest caudale positie. - Verkrijg de 2D-scans op 6 cmH2O PEEP en reconstrueer onmiddellijk de beelden om de positionering van het dier te controleren en de beeldkwaliteit te garanderen (volg stap 6). Pas indien nodig de positionering van het gezichtsveld of het dier aan en voer de scans opnieuw uit.
- Plan de 3D-scan (Figuur 2) door het gezichtsveld rond de volledige thorax te plaatsen en de 2D-scans af te dekken. Zorg ervoor dat ongeveer 20% van het gezichtsveld in de snijrichting zich buiten het dier bevindt om vouwartefacten te voorkomen.
LET OP: De 2D-scans zijn toegevoegd aan het protocol omdat de acquisitietijd korter is dan bij de 3D-scans, waardoor ze geschikt zijn om het effect van interventies snel te testen. - Verkrijg de 3D-scan met het vereiste pseudo-spiraalvormige k-ruimte-bemonsteringsschema (Figuur 3), waardoor robuuste retrospectieve binning van gegevens en visualisatie van ademhalingsbeweging mogelijk is14.
- Herhaal de 2D en 3D scans bij 3 en 0 cmH2O PEEP. De totale scantijd was 2,5 minuut per 2D-scan en 15 minuten per 3D-scan.
LET OP: In dit geval hebben we PEEP aangepast tijdens de experimenten. We hebben 0, 3 en 6 cmH2O PEEP geselecteerd omdat we uit experimenten (eerder onderzoek en lopende studies) met langdurig geventileerde dieren weten dat deze PEEP-niveaus resulteren in relevante veranderingen in de geometrie van het middenrif en de thorax15. Daarnaast hebben we ervoor gekozen om in dit werk nul, een gemiddeld en een hoog niveau van PEEP te gebruiken om het effect van PEEP te laten zien. Afhankelijk van de onderzoeksvraag zijn andere interventies mogelijk. Zo kunnen bijvoorbeeld de effecten van spierverslappers of andere medicijnen op de thoraxgeometrie worden bestudeerd. Het protocol stelt ons in staat om de effecten van de interventie binnen het onderwerp te bestuderen.
Figuur 1: Overzicht van de opstelling. (A) Een schematisch overzicht van de opstelling, (B) de spoelopstelling voor een muis, (C) de spoelopstelling voor een rat, met een grotere boring dan de muizenspoel, (D) spoelopstelling ten opzichte van de MR-scanner, (E) de PEEP-kolom met uitademingsslang geplaatst op 3 cmH2O PEEP en (F) een close-up van de klep die de ventilatie regelt, het aangeven welke buisjes in de PEEP-zuil geplaatst moeten worden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Planning van de MR-beelden voor de 2D- en 3D-films. Figuur die laat zien hoe het gezichtsveld was ingesteld voor de 2D-scans in sagittale en coronale oriëntatie (bovenste en middelste rij) en 3D-scans in sagittale oriëntatie (onderste rij). De linkerkolom vertegenwoordigt een van de plakjes van de SCOUT in axiale oriëntatie op hartniveau, de middelste kolom toont een plak van de SCOUT in coronale oriëntatie en de rechterkolom toont een plak in axiale oriëntatie ter hoogte van de lever. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: MR pseudo-spiraalvormig bemonsteringspatroon. Het bemonsteringspatroon is in de richting van de ky/kz-fasecodering, waarbij de matrixgrootte 80 x 80 is geoptimaliseerd voor binning van respiratoire bewegingen achteraf. Spiralen worden gemaakt door te beginnen in het midden van de k-ruimte en dan naar buiten en weer naar binnen te draaien, waardoor elke spiraal wordt herhaald. Het volledige bemonsteringspatroon wordt uitgevoerd met 25 herhalingen om voldoende gegevens te genereren binnen elk ademhalingsframe. Elke spiraal heeft een andere kleur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Einde van het experiment
- Nadat u klaar bent met alle scans, haalt u het dier uit de scanner. De dieren kunnen het experiment niet overleven door de tracheostomie. Euthanaseer muizen met cervicale dislocatie en ratten door verbloeding.
- Sla alle onbewerkte en gereconstrueerde MR-bestanden op.
| Type scan | Gradiënt Echo SCOUT | Verloop Echo 2D | Gradiënt Echo 3D |
| Oriëntatie | Coronaal en sagittaal | Coronaal en sagittaal | Sagittaal |
| k-Space bemonsteringsschema | Cartesiaans | Cartesiaans | Pseudo-spiraal |
| Aantal plakjes | 10 | 1 | 80 |
| Dikte plak (mm) | 1 (Muis) | 1 (Muis) | 0.38 (Muis) |
| 1 (Rat) | 1 (Rat) | 0.81 (Rat) | |
| Snij-opening (mm) | 2 (Muis) | 0 (Muis) | 0 (Muis) |
| 5 (Rat) | 0 (Rat) | 0 (Rat) | |
| Bemonstering van plakjes* | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| FOV (lees x fase x plak; mm) | 35 x 35 (muis) | 30 x 23 (muis) | 30 x 23 x 30 (muis) |
| 80 x 80 (Rat) | 65 x 49 (Rat) | 65 x 49 x 65 (Rat) | |
| Matrixgrootte (freq x fase) | 256 x 192 cm | 256 x 192 cm | 211 x 80 x 80 |
| TR / TE (mevrouw) | 45328 | 45330 | 45328 |
| Draaihoek (°) | 15 | 15 | 10 |
| Aantal herhalingen | 80 | 70 | 25 |
| Respiratoire triggering | Nee | Ja, met terugwerkende kracht | Ja, met terugwerkende kracht |
| Beeldvormingstijd (min:s) | 2:02 | 2:23 | 16:00 |
| PEEP-niveaus (cmH2O) | 6 | 6, 3, 0 | 6, 3, 0 |
Tabel 1: Acquisitieparameters voor alle scans. * Segmentbemonstering geeft aan welk percentage van de segmentselectiepuls wordt gebruikt voor beeldvorming
6. Reconstructie van het beeld
- Gebruik voor het uitvoeren van beeldreconstructie de intern ontwikkelde software die beschikbaar is op GitHub16. Voer deze stappen uit voor alle scans met een navigator waarvoor retrospectieve ademhalingsopening nodig is.
OPMERKING: Het werd eerder beschreven door Daal et al., maar dat werk was gericht op cardiale beeldvorming13. Hier beschrijven we een methode voor het reconstrueren van respiratoire gated beelden van de hele thorax. - Laad het bestand met onbewerkte gegevens door op MRD laden te klikken. Dit visualiseert het onbewerkte navigatorsignaal en het spectrum ervan in het linkerbovenpaneel. Als het ademhalingssignaal niet duidelijk zichtbaar is, pas dan de primaire navigator aan in het tabblad Instellingen.
- Vul in Hart-/ademhalingsfilters de ademhalingsfrequentie in die is ingesteld op de MR-compatibele mechanische ventilator en stel de breedte in op 15. De instellingen in de andere vakken zijn niet relevant voor dit type reconstructie. Druk op Filter om de instellingen toe te passen, wat resulteert in een gated navigator-signaal, zoals weergegeven in afbeelding 4. Zorg ervoor dat het rode signaal in het vak Ademhaling navigator en Ademhaling frequentie het blauwe, ruwe navigatorsignaal volgen.
- Selecteer in Cine de Respiratory Movie en stel het aantal frames in op 12 en het aantal dynamieken op 1. Schakel in het tabblad Geometrie de PCA (niveau 8) en het Belfilter in. Druk op Sort k-space om de instellingen toe te passen.
- Pas in CS reco-parameters de volgende instellingen toe: WVxyz 0,0010, TVxyz 0,0000, LLRxyz 0,0050, TVcine 0,015, TVdyn 0,000. Druk op Reco Movies om de reconstructie te starten.
- Inspecteer de reconstructie in het paneel rechtsonder door door de kaders en (indien van toepassing) plakjes te scrollen. Exporteer de gereconstrueerde afbeeldingen door op Export DCM en/of Export GIF te drukken.
7. Analyse van het beeld
OPMERKING: Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen uit de cine-beelden verschillende uitkomstparameters worden berekend. Hier richten we ons op parameters die de thoraxgeometrie, het longvolume en de excursie kwantificeren.
- Open een geschikte DICOM-viewer, bijvoorbeeld de software die wordt vermeld in de Materiaaltabel en laad een 2D-cine door op Bestand > Openen te klikken en de 2D-cinebestanden te selecteren. Identificeer het frame met de hoogste diafragmapositie (eind-expiratoire frame). Selecteer het frame en open het in de DICOM-viewer.
- Meet de afmetingen anterieure-posterieure en craniocaudale long (Figuur 5) in de sagittale 2D cine en de links-rechts dimensie in de coronaal georiënteerde 2D cine handmatig met behulp van de meetknop in microdicom. Herhaal deze metingen voor alle PEEP-niveaus of andere interventies. Deze metingen kunnen ook in één frame van de 3D-film worden uitgevoerd, afhankelijk van de keuze van de scans.
- Laad de 3D-film in het 3D-beeldanalyseprogramma en plaats de afbeelding in de juiste richting door op Extra > Afbeelding heroriënteren te klikken. Vul SPL in als RAI-code. Selecteer het eind-expiratoire frame door door de dynamiek te scrollen op Tools > Layer Inspector en verhoog vervolgens het componentnummer.
- Initialiseer de segmentatie door het middelste deel van de longen handmatig in twee plakjes te contouren voor elke oriëntatie (Figuur 6). Gebruik de penseelmodus en pas indien nodig de grootte van het penseel aan.
- Start de 3D-segmentatie door op Actieve contour in de hoofdwerkbalk te drukken. Zorg ervoor dat de rode doos (ROI) de volledige thorax bedekt. Schakel Initialiseren met huidige segmentatie in en druk op Segment 3D.
- Selecteer Drempelwaarde als voorsegmentatiemodus en gebruik alleen een bovenste drempel door de meest rechtse drempelmodus te selecteren. Druk op Volgende. Sla vervolgens de stap van het toevoegen van bubbels over door nogmaals op Volgende te drukken. Omdat de segmentatie al bij stap 7.5 is geïnitialiseerd, is het niet nodig om bubbels toe te voegen.
- Begin met actief contouren door op de afspeelknop te drukken en pauzeer deze zodra de segmentatie de randen van de long bereikt. Blader door de afbeeldingen om de segmentatie te controleren. Druk op Voltooien om de segmentatie te voltooien.
- Druk op Update om de 3D-segmentatie in het deelvenster linksonder te visualiseren en te inspecteren en te roteren.
- Sla de segmentatie op als NiFTI door te klikken op Segmentatie > Segmentatieafbeelding en STL-meshbestand opslaan door op Segmentatie te klikken > Segmentatiemesh exporteren.
- Noteer het longvolume dat te vinden is bij Segmentatie, Volume en Statistieken.
- Registreer de beelden van de andere ademhalingstoestanden voor de end-expiration dynamiek met behulp van het script in Aanvullend coderingsbestand 1. Pas de berekende transformaties toe op de segmentatie, wat resulteert in een segmentatie voor elke dynamiek. Gebruik deze segmentaties om uitkomstparameters te berekenen, zoals excursies in alle richtingen.
Resultaten
Met behulp van het protocol dat in deze studie wordt beschreven, hebben we een groep van 8 gezonde C57BL/6 WT-muizen en 8 Wistar WT-ratten met succes gescand met behulp van een 7 Tesla MRI-scanner. We waren in staat om de dieren mechanisch te ventileren op verschillende niveaus van PEEP en de fysiologische basisparameters tijdens het scannen te monitoren (Figuur 7).
In Figuur 5 wordt een voorbeeld getoond van drie 2D-scans in het eind-expiratoire frame van een muis en een rat in sagittale oriëntatie. Zoals te zien is, introduceert PEEP bij beide dieren een caudale verplaatsing van het middenrif, maar bij muizen gaat dit ook gepaard met een verbreding van de thorax, wat blijkt uit een toename van de anterieure-posterieure diameter.
Deze hoogwaardige scans laten zien dat we met deze techniek de grootte van de verschillende delen van de thorax kunnen meten en de effecten van verschillende beademingsinstellingen op de beweging van de thorax en het middenrif kunnen laten zien. De korte scantijd maakt het mogelijk om binnen de proefpersonen de uitkomstparameters waarin men geïnteresseerd is te vergelijken, waardoor het vereiste aantal dieren wordt verminderd. Tabel 2 toont de uitkomstparameters van alle dieren.
Figuur 8 toont de longsegmentaties van de eind-expiratoire dynamiek op drie PEEP-niveaus met het bijbehorende longvolume. Zoals verwacht resulteerde een toenemende PEEP in een toename van het longvolume. De 3D-films worden ook als film weergegeven in Aanvullende Video 1 en Aanvullende Video 2.
Figuur 4: Screenshot van de software die is gebruikt om de afbeeldingen te reconstrueren met retrospectieve gating van de gegevens. De gating van de gegevens is gebaseerd op het navigatorsignaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van 2D-beelden in een rat en een muis op drie PEEP-niveaus, met de afmetingen van de anterieure-posterieure en cranio-caudale long. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Screenshot van de software die is gebruikt om de longen in de 3D-cines te segmenteren. In het linkerbovenpaneel wordt een axiaal beeld van de 3D-cine getoond met de long in rood gesegmenteerd. In het rechterbovenpaneel wordt een sagittaal beeld weergegeven met de long in rood gesegmenteerd. In het linker onderpaneel wordt een 3D-weergave van de gesegmenteerde long getoond. In het links-rechtspaneel wordt een coronale weergave weergegeven met de long in rood gesegmenteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Vitale parameters van de dieren tijdens de experimenten. N = 8 muizen (blauw), N = 8 ratten (oranje). Gegevens worden weergegeven als gemiddeld met SD. Let op de daling van de hartslag wanneer de dieren een chirurgisch vlak van anesthesie ingaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: 3D Segmentatie van de longen op drie PEEP-niveaus met de bijbehorende longvolumes. Segmentatie van een rattenlong op PEEP 0 (linkerkolom), PEEP 3 (middelste kolom) en PEEP 6 (rechterkolom). In de bovenste rij is de achterkant van de longen weergegeven. In de middelste rij is de voorste kant van de longen te zien. De volumes die in de onderste rij worden weergegeven, worden gemeten binnen de 3D-gerenderde longen die in deze figuur zichtbaar zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: 3D-film van een muis. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende Video 2: 3D cine van een rat. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: Script om de segmentaties naar andere acquisities te registreren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie toont aan dat 3D MR-beeldvorming met retrospectieve gating het mogelijk maakt om de thoraxbeweging in twee diermodellen te meten tijdens mechanische beademing. Deze technieken hebben het potentieel om te worden gebruikt in toekomstig onderzoek met cardiale en thoracale beeldvorming bij mechanisch beademde muizen en ratten. We ontdekten dat vanwege de vaste ademhalingsfrequentie retrospectieve binning zeer robuust was.
Een cruciale stap van het protocol is het instellen van de juiste positionering van de dieren binnen de MR-spoelen. Tijdens het scannen is het niet mogelijk om de dieren te verplaatsen. Bovendien is het handhaven van normothermie erg belangrijk om ervoor te zorgen dat metingen worden uitgevoerd onder fysiologische omstandigheden, aangezien anesthetica onderkoeling kunnen veroorzaken door perifere vasodilatatie en de radiofrequente pulsen van dit MRI-protocol hyperthermie kunnen veroorzaken17,18. In figuur 7 zijn fluctuaties in de lichaamstemperatuur te zien gedurende de korte periode rond de overdracht van de dieren naar de scanner (rond de 1 uur) waarin geen warmte wordt toegediend van een externe bron. Een andere cruciale stap is de titratie van anesthesie, vooral bij muizen. Het anesthesievlak waar de muizen geen ademhalingsinspanning vertonen maar stabiele vitale parameters behouden, is smal en vereist een zorgvuldige monitoring van het ademhalingssignaal en aanpassing van de anesthesie-infusiesnelheden. Bij ratten hadden we dergelijke problemen niet binnen het bereik van de gebruikte sedatie. De beeldkwaliteit zal negatief worden beïnvloed als er ademhalingsinspanningen van het dier zijn vanwege de retrospectieve reconstructie van de beelden op basis van de ingestelde ademhalingsfrequentie. Het is mogelijk om een ander anesthesieregime te gebruiken, zoals inhalatie-anesthesie met isofluraan of alternatieve injectie-anesthetica die meer onderdrukking van de ademhalingsinspanning veroorzaken. De CWE-MRI-1 ventilator voor kleine dieren die in dit protocol wordt gebruikt, is compatibel met inademingsanesthetica19.
Er zijn drie cruciale stappen voor het reproduceren van de MRI-methode die in dit onderzoek wordt voorgesteld. Eerst moet dezelfde basis-MRI-sequentie (d.w.z. 3D FLASH) worden gebruikt. Zo'n sequentie is beschikbaar op vrijwel alle MRI-systemen. Ten tweede kan het k-space-traject dat in dit werk wordt genoemd (pseudo-spiraal) een softwarepatch vereisen die door de gebruiker gedefinieerde k-space-trajecten kan uitvoeren. We nodigen lezers uit om contact op te nemen met de corresponderende auteur als ze de aanwinst willen repliceren. Er is ervaring met het implementeren van dit soort acquisitie op systemen van andere leveranciers. Ten slotte is de reconstructiepijplijn die we delen als open-source software leveranciersneutraal en daarom van toepassing op alle preklinische systemen.
We hebben om verschillende redenen gekozen voor retrospectieve triggering en binning boven prospectieve triggering. In de eerste plaats bieden retrospectieve triggering en k-space data binning volledige flexibiliteit in het aantal gereconstrueerde respiratoire CINE-frames, waardoor we de temporele resolutie, ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding kunnen optimaliseren. Bovendien introduceert prospectieve triggering een dode tijd aan het einde van elke ademhalingscyclus terwijl de scanner wacht op de volgende trigger, wat de stabiele toestand kan verstoren en kan resulteren in een onvolledige cyclus. Bij mechanische ventilatie is deze dode tijd minimaal maar nog steeds aanwezig.
De belangrijkste beperking van dit protocol is het onvermogen om de druk van de luchtwegen of slokdarmen te meten. Voor zover wij weten, zijn er geen MR-compatibele long- of slokdarmdruksensoren voor kleine dieren op de markt. Een andere beperking is het ontbreken van continue bloeddrukmetingen binnen de MRI. Het anesthesieprotocol was gebaseerd op eerder institutioneel onderzoek. Atropine werd toegevoegd vanwege de hoge prevalentie van bradycardie en hypotensie die eerder werd waargenomen. Hoewel continue bloeddrukcontrole niet mogelijk was vanwege de beperkingen van de MR-omgeving, is hypertensie onwaarschijnlijk, aangezien er geen tachycardie werd waargenomen (Figuur 7). De monitoring die in dit protocol werd gebruikt, bestond uit hartslag, zuurstofverzadiging, temperatuur en een ademhalingssignaal op basis van beweging van de thoracale wand. Met behulp van deze metingen kan een overzicht van de vitale parameters van de dieren als leidraad dienen voor de toediening van anesthesie, maar het laten meten van de bloeddruk kan voorkomen dat dieren een overdosis krijgen die ademhalingsinspanning vertoont. Er zijn geen andere MRI-studies gepubliceerd over de respiratoire fysiologie van mechanisch beademde knaagdieren, maar deze methode kan worden gebruikt voor een breed scala aan onderzoeksvragen buiten het respiratoire onderzoek. Het reconstructieprogramma dat in het manuscript wordt genoemd (Retrospective) kan ook worden gebruikt om beelden gedurende de hele hartcyclus te reconstrueren, waardoor de onderzoeker beelden met een hoge resolutie van het hart en de bloedvaten kan verkrijgen zonder bewegingsartefacten. Dit protocol kan worden toegepast in elk project dat mechanische ventilatie van ratten of muizen vereist tijdens het scannen. Men kan bijvoorbeeld overwegen om de relatie tussen mechanische ventilatie-instellingen en de hartfunctie te bestuderen. Andere opties zijn het afbeelden van dieren met een open borstkas of na operaties waarvoor mechanische beademing nodig is.
Openbaarmakingen
Ruslan Garipov is een werknemer van MR Solutions Ltd., Guildford, Verenigd Koninkrijk.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door ZonMW Grant 09120011910004 (GS, CO, LH) en NIH-subsidie 5R01HL121500 (CO).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 11 Plus Digital Dual Syringe Pump | Harvard apparatus (USA) | 229193-2 | dual syringe pump with programmable features for laboratories |
| AccuSens single and multi-channel signal conditioner | Opsens solutions inc. (Canada) | ACS-P4-N-62SC | Used with fiber optic temperature sensor to monitor body temperature |
| Fiber optic temperature sensor | Opsens solutions inc. (Canada) | OTP-M | |
| Mouse cradle | Équipment Vétérinaire Minerve (France) | ||
| Mousestat Jr. | Kent-scientific (USA) | MSTAT-JR | The MouseSTAT Jr. provides accurate pulse oximetry in both mice and rats. |
| MR Scanner | MR Solutions Lt. (United Kingdom) | MRS-7024 | |
| MR-compatible Monitoring & Gating System for Small animals | SA Instruments, Inc. (USA) | 1030 | RT Module (respiratory interface module), ERT Control/ Gating Module, battery pack |
| MRI-1 compatible ventilator | CWE (USA) | 12-07000 | Mechanical ventilator suitable for ventilating small animals in magnetic resonance environments. It ventilates with a volume-controlled, flow x time based principle using pneumatic valves. |
| Multistation temperature control unit and High Flow PCA | Équipment Vétérinaire Minerve (France) | ||
| PEEP column | Repurposed fluid measuring column | ||
| Physiosuite Mechanical Ventilator | Kent-scientific (USA) | Mechanical ventilator suitable for ventilating small animals. It ventilates with a volume-controlled, pressure-regulated principle. | |
| Pulse Oximeter Paw Sensors, MRI-Compatible | Kent-scientific (USA) | SPO2-MSE-MRI | MRI-compatible paw sensor for Mousestat Jr. |
| Rat cradle | Équipment Vétérinaire Minerve (France) | ||
| RF coil, Mouse | MR Solutions Lt. (United Kingdom) | 38mm mouse volume RF coil for mouse body studies | |
| RF coil, Rat | MR Solutions Lt. (United Kingdom) | 65mm rat volume RF coil for rat body studies | |
| Surgical tools | |||
| Abbocath 14G, 20G, 22G, 24G | Abbocath | 14G, 20G, 22G for use as endotracheal tube, 24G for intraperitoneal infusion of anesthesia | |
| Ethilon 3-0 FD-1 suture with needle | Ethicon (USA) | 663H | |
| Forceps #55 | Dumont (Switzerland) | 55 | |
| Metzenbaum Scissors | Fine science tools (Germany) | 14017-14 | |
| Needle holder | Fine science tools (Germany) | 12005-15 | |
| Nonabsorbable braided silk suture 6/0 | Fine science tools (Germany) | 18020-60 | |
| Spring Scissors | Fine science tools (Germany) | 15033-09 | |
| Stevens tenotomy scissors | Fine science tools (Germany) | 14064-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine science tools (Germany) | 18025-10 | |
| Tape medipore | 3M (USA) | ||
| Medication | |||
| Atropine 0.25 mg/mL | |||
| Dexmedetomidine 0.5 mg/mL Dexdormitor | Orion pharma (Finland) | ||
| Duratears eye ointment | Alcon Nederland BV (Netherlands) | ||
| Isoflurane | AST pharma (France) | ||
| Ketamine 100 mg/mL Ketexx | Alfasan (Netherlands) | ||
| Vaseline petroleum jelly | Unilever (Netherlands) | ||
| Software | |||
| Elastix | Image Sciences Institute, UMC Utrecht (Netherlands) | ||
| Itksnap | University of Pennsylvania (USA) | ||
| Matlab 2019a | Wolfram Research Inc (USA) | ||
| Microdicom | Microdicom (Bulgaria) | ||
| Retropective | Amsterdam UMC (Netherlands) |
Referenties
- Bassi, T., Taran, S., Girard, T. D., Robba, C., Goligher, E. C. Ventilator-associated brain injury: A new priority for research in mechanical ventilation. Am J Respir Crit Care Med. 209 (10), 1186-1188 (2024).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-induced lung injury. N Engl J Med. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Levine, S., et al. Rapid disuse atrophy of diaphragm fibers in mechanically ventilated humans. N Engl J Med. 358 (13), 1327-1335 (2008).
- Silva, P. L., Scharffenberg, M., Rocco, P. R. M. Understanding the mechanisms of ventilator-induced lung injury using animal models. Intensive Care Med Exp. 11 (1), 82(2023).
- Damiani, L. F., et al. Impact of reverse triggering dyssynchrony during lung-protective ventilation on diaphragm function: An experimental model. Am J Respir Crit Care Med. 205 (6), 663-673 (2022).
- Guillon, A., et al. Preclinical septic shock research: why we need an animal ICU. Ann Intensive Care. 9 (1), 66(2019).
- Larsson, L. Experimental animal models of muscle wasting in intensive care unit patients. Crit Care Med. 35 (9), S484-S487 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Leith, D. E. Comparative mammalian respiratory mechanics. Am Rev Respir Dis. 128 (2 Pt 2), S77-S82 (1983).
- Vinegar, A., Sinnett, E. E., Leith, D. E. Dynamic mechanisms determine functional residual capacity in mice, Mus musculus. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (5), 867-871 (1979).
- Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
- Li, H., et al. Technical aspects of small animal CMR imaging. Front Phys. 8, ARTN 183(2020).
- Daal, M. R. R., et al. Quantification of mouse heart left ventricular function, myocardial strain, and hemodynamic forces by cardiovascular magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (171), e62595(2021).
- Gottwald, L. M., et al. Pseudo-spiral sampling and compressed sensing reconstruction provides flexibility of temporal resolution in accelerated aortic 4D flow MRI: A comparison with k-t principal component analysis. NMR Biomed. 33 (4), e4255(2020).
- Sudy, R., et al. Different contributions from lungs and chest wall to respiratory mechanics in mice, rats, and rabbits. J Appl Physiol (1985). 127 (1), 198-204 (2019).
- Strijkers, G. J. Retrospective-v9.7: Self-gated cine MRI reconstruction. , Available from: https://github.com/Moby1971/Retrospective-v9.8 (2023).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (5), 577-583 (2013).
- Tang, M., Yamamoto, T. Progress in Understanding Radiofrequency Heating and Burn Injuries for Safer MR Imaging. Magn Reson Med Sci. 22 (1), 7-25 (2023).
- Munting, L. P., et al. Influence of different isoflurane anesthesia protocols on murine cerebral hemodynamics measured with pseudo-continuous arterial spin labeling. NMR Biomed. 32 (8), e4105(2019).
Herprints en machtigingen
