Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Afleiding van een organoïde van het menselijk brein met microglia-ontwikkeling

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67491

⸱

17 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol om een menselijke hersenorganoïde met residente microglia te genereren door geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) op te nemen in de ontwikkeling van organoïden.

Samenvatting

Driedimensionale (3D) hersenorganoïdeculturen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) bieden een belangrijk alternatief in vitro hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkeling van de menselijke hersenen en de pathogenese van neurologische aandoeningen. Het gebrek aan opname van microglia in de organoïden van de menselijke hersenen is echter nog steeds een grote hindernis voor 3D-modellen van neuro-inflammatie. De huidige benaderingen omvatten ofwel de integratie van volledig gedifferentieerde microglia in volwassen hersenorganoïden of de inductie van microgliale differentiatie vanaf het vroege stadium van iPSC-afgeleide embryoïde lichamen (EB's). De eerste benadering mist het stadium waarin microgliale differentiatie interageert met de aangrenzende neurale omgeving, en de latere benadering is technisch uitdagend, wat resulteert in inconsistentie tussen de uiteindelijke organoïden in termen van de kwantiteit en kwaliteit van microglia. Om hersenorganoïden te modelleren met microglia om de vroege interacties tussen microgliale en neuronale ontwikkeling te bestuderen, werden zeer zuivere hematopoëtische voorlopercellen (HPC) gedifferentieerd van menselijke iPSC's opgenomen in iPSC-afgeleide EB's om hersenorganoïden te maken. Met behulp van immunokleuring en single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analyse hebben we bevestigd dat HPC's werden opgenomen in de 3D-organoïden, die zich uiteindelijk ontwikkelden tot hersenorganoïden met zowel microglia als neuronen. Vergeleken met hersenorganoïden zonder HPC's, produceert deze aanpak een significante microgliale opname in de hersenorganoïden. Dit nieuwe 3D-organoïdemodel, dat bestaat uit zowel microgliale als neurale ontwikkelingseigenschappen, kan worden gebruikt om de vroege interacties tussen de ontwikkeling van het aangeboren immuunsysteem en het zenuwstelsel te bestuderen en mogelijk als model voor neuro-inflammatie en neuro-infectieuze aandoeningen.

Inleiding

Microglia zijn residentiële immuuncellen in de hersenen, die een cruciale rol spelen in zowel de ontwikkeling van de hersenen als de homeostase 1,2. De activering van microglia resulteert in de productie van pro-inflammatoire factoren, verhoogde fagocytose en reactieve oxidatieve stress, waardoor de binnendringende ziekteverwekkers en gecompromitteerde cellen worden verwijderd. Aan de andere kant kan overactivering of langdurige activering van microglia echter neurodegeneratie veroorzaken als een mechanisme van pathogenese bij veel neurologische aandoeningen, waaronder de ziekte van Parkinson 3,4. Het is belangrijk dat microglia worden opgenomen in de relevante modellen voor het bestuderen van menselijke neurologische aandoeningen. In de afgelopen jaren zijn menselijke stamcellen gebruikt om 3D-organoïden te ontwikkelen als in vitro modellen als alternatief voor diermodellen en studies met menselijke proefpersonen5. Idealiter vormen menselijke organoïden meerdere celtypen en weefselstructuren die vergelijkbaar zijn met de overeenkomstige menselijke organen, en vertegenwoordigen ze de menselijke fysiologie en pathogenese beter dan diermodellen, maar zonder de ethische bezwaren die rechtstreeks gepaard gaan met studies van menselijke individuen. Ze kunnen de toekomst vertegenwoordigen van het modelleren van ziekten bij de mens voor de studie van pathogenese en de ontwikkeling van geneesmiddelen en voor de begeleiding van geïndividualiseerde therapieën6. 3D-organoïden van de menselijke hersenen, afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), hebben bijvoorbeeld de overhand gehad op het gebied van neurowetenschappelijk onderzoek, waarbij neurale infectieziekten worden gemodelleerd, waaronder ZIKA, SARS-CoV-27 en neurodegeneratieve ziekten, waaronder amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Alzheimer 8,9. Conventionele 3D neurale organoïden die dual-SMAD-remming gebruiken om neuronale differentiatie te induceren10 produceren echter hersenorganoïden zonder microglia, omdat ze zijn afgeleid van voorlopers die uit het bloed zijn gerekruteerd in plaats van de neuro-ectoderm-afstamming waar neuronen van zijn11,12. Zonder de aanwezigheid van microglia zijn de organoïden ontoereikend om CZS-infecties, ontstekingen en de daarmee gepaard gaande neurodegeneratie te modelleren.

Om dit kritieke probleem aan te pakken, zijn pogingen ondernomen om gedifferentieerde microglia in de hersenorganoïden op te nemen13 of om vanaf het begin microgliale differentiatie binnen organoïden te induceren met behulp van alternatieve benaderingen in plaats van dual-SMAD-remming13. Door gedifferentieerde microglia in de hersenorganoïden op te nemen, worden de vroege interacties tussen neuronale en microgliale ontwikkeling echter gemist. Dit kan belangrijk zijn bij de ontwikkeling van het CZS of de pathogenese van neuro-infectieuze aandoeningen gericht op de ontwikkeling van de hersenen van baby's, zoals bij ZIKA-virusinfectie14. Aan de andere kant brengt het differentiëren van aangeboren microglia binnen iPSC-afgeleide hersenorganoïden zonder intermitterende stadia een langdurig proces met zich mee en heeft het een grotere variabiliteit binnen de eindproducten15. In dit gerapporteerde protocol hebben we de iPSC-afgeleide hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) in de iPSC's opgenomen om embryoïde lichamen (EB's) te maken, die verder werden gedifferentieerd in 3D-organoïden, waaronder zowel neuronen als microglia.

Ons protocol biedt een eenvoudige benadering die kan worden toegepast om het menselijke centrale zenuwstelsel te bestuderen met vroege neuron-microgliale interacties en de pathogenese van neurale infectiestoornissen en neuro-inflammatie waarbij microgliale activering betrokken is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De originele bloedmonsters van gezonde volwassen donoren werden verzameld bij de Transfusion Medicine Blood Bank van de NIH en ondertekende formulieren voor geïnformeerde toestemming werden verkregen in overeenstemming met de NIH Institutional Review Board.

1. Productie van hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) uit menselijke iPSC's

OPMERKING: Menselijke iPSC-cellen 510 en 507 werden gebruikt om de representatieve resultaten te produceren. De methoden voor het genereren en onderhouden van de iPSC's zijn te vinden in een eerdere publicatie16.

  1. Dag 0: Smeer een celplaat met 12 putjes in door 500 μL/putje ijskoude Matrigel (basaalmembraanmatrix [BMM]) oplossing verdund in DMEM/F12-medium toe te voegen en incubeer het gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  2. Verwijder het bovenstaande coatingmiddel volledig en vervang het door 1 ml E8 Flex-medium per putje.
  3. Controleer de iPSC-cultuur in een plaat met 6 putjes onder de microscoop om te bevestigen dat de iPSC's van hoge kwaliteit zijn en geen tekenen van differentiatie vertonen. Kies een middelgrote kolonie door deze met een markeerstift onder de bodem van de plaat te markeren.
  4. Verwijder het medium uit de iPSC-cultuur en voeg 500 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) iPSC-dissociatiebuffer (0,5 mM EDTA, 0,45 g/L NaCl in DPBS) toe aan het putje.
  5. Kijk onder een microscoop of er tekenen van celdissociatie zijn wanneer drie tot vier rijen cellen vanaf de randen van de kolonie beginnen te krimpen, waarbij er lege ruimte tussen de cellen ontstaat. Dit duurt meestal 1-3 minuten.
  6. Gooi de EDTA-oplossing volledig weg. Maak de gemarkeerde iPSC-kolonie los door er 1 ml E8 Flex medium krachtig en rechtstreeks op te pipetteren. Zorg ervoor dat de kolonie na 1-3 keer pipetteren volledig loskomt in celpleisters met elk 20-50 cellen.
  7. Verzamel het bovenstaande dat celpleisters bevat en voeg het toe aan het eerste putje van de gecoate putjes in de plaat met 12 putjes.
  8. Meng het putje door een of twee keer te pipetteren en breng 1 ml cellen over in het tweede putje dat 1 ml medium bevat.
  9. Herhaal stap 1.8 twee keer om serieel verdunde iPSC-culturen te maken in in totaal vier putjes.
  10. Incubeer de plaat in een 37 °C, 5% CO2-incubator.
  11. Controleer na 24 uur, op dag 1, de kolonies onder de microscoop en tel het aantal kolonies door continu alle velden in een put te doorzoeken. Kies een put die 10-20 iPSC-kolonies bevat.
  12. Vervang het medium door 1 ml medium A uit de hematopoëtische kit. Plaats de plaat 48 uur terug in de broedmachine.
  13. Verwijder op dag 3 500 μL gebruikt medium en voeg 500 μL vers medium A toe.
  14. Observeer op dag 4 onder de microscoop en merk significante celgroei en differentiatie van de iPSC-kolonies op. Vervang het medium door 1 ml medium B.
  15. Bewaak de celdifferentiatie onder de microscoop en voer om de dag een half-mediumverandering uit met 500 μL Medium B. De HPC-achtige cellen verschijnen op dag 6-7.
  16. Observeer op dag 10 onder de microscoop heldere enkelvoudige ronde cellen met de morfologie van normale HPC's die in het medium zweven of losjes vastzitten aan de enkele onderste laag platte cellen, met enkele losse celaggregaten.
    OPMERKING: De gedifferentieerde HPC's zijn klaar om te worden verzameld voor karakterisering of verder experiment.
  17. Verzamel alle gedifferentieerde HPC's door drie keer op en neer te pipetteren met een pipetpunt van 1 ml om de celaggregaten te breken en de HPC's los te maken van het plaatoppervlak.
  18. Voeg de cellen toe aan een buis van 15 ml en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g . Verwijder het bovenstaande en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml medium B.
  19. Tel de cellen en pas de concentratie aan op 1 miljoen cellen/ml. In dit stadium worden meer dan 1 miljoen HPC's gegenereerd. Zorg er bij controle met flowcytometrie voor dat de zuiverheid meer dan 85% is van die van cellen met CD34+/CD43+. Zorg ervoor dat er geen significante dode cellen (meer dan 5%) worden opgemerkt.

2. Ontwikkeling van embryoïde lichamen uit gemengde iPSC's en HPC's

  1. Zorg er op dezelfde dag van het verzamelen van de HPC's voor dat een iPSC-cultuur ook 80% samenvloeiing bereikt in één putje in een plaat met 6 putjes (of twee putjes in een plaat met 12 putjes).
  2. Behandel een putje van de microtiterkweekplaat voor EB-vorming met 500 μL spoeloplossing tegen kleefkracht door deze toe te voegen om luchtbellen te minimaliseren.
  3. Draai de plaat 5 minuten op 2000 x g in een zwenkende emmerrotor die is uitgerust met plaathouders om eventuele luchtbellen te verwijderen.
  4. Verwijder de spoeloplossing volledig door te pipetteren en was de putjes twee keer met 1 ml DPBS en vervolgens 1 ml DMEM/F12 zonder luchtbellen te genereren.
  5. Dissocieer de iPSC's van de plaat door de cellen te behandelen met 1 ml Accutase-oplossing.
  6. Kijk onder de microscoop totdat de cellen tekenen van scheiding vertonen maar nog steeds aan de bodem vastzitten. Dit gebeurt meestal binnen 1-3 minuten na de behandeling met Accutase. Vertis de iPSC's niet te veel.
  7. Verwijder de Accutase-oplossing volledig zonder de cellen te verstoren en voeg 1 ml DMEM/F12-medium toe aan de putjes. Dissocieer de cellen verder in afzonderlijke cellen door een paar keer op en neer te pipetteren met een tip van 1 ml.
  8. Verzamel de cellen in een buis van 15 ml en vul deze tot 5 ml met DMEM/F12-medium. Draai de cellen 5 minuten op 300 x g .
  9. Verwijder het bovenstaande door pipetteren en suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml E8 Flex-medium. Tel de cellen en pas de celconcentratie aan tot 1 miljoen cellen per ml in het E8 Flex-medium.
  10. Meng iPSC's met HPC's in een verhouding van 2:1 door 1 miljoen iPSC's (1 ml) en een half miljoen HPC's (500 μl) samen te voegen. Voeg alle gemengde cellen toe aan het eerder behandelde putje van de microtiterkweekplaat.
  11. Voeg 1 μl gesteenteremmer Y27632 stockoplossing (1 mM) per 1 ml medium toe aan het supernatant. Schud de plaat een paar keer heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen.
  12. Draai de microtitercultuurplaat gedurende 5 minuten op 300 x g in een zwenkende emmerrotor met plaathouders. Kijk onder de microscoop of de cellen zich in de microwells hebben genesteld. (Aanvullende figuur 1A).
  13. Zonder de cellen te verstoren, plaatst u de plaat in een couveuse met 5% CO2 -cellen van 37 °C.
  14. Observeer op dag 2, 48 uur later, de cellen onder de microscoop op de vorming van EB's. Wanneer de EB's duidelijk zijn gevormd, gaat u verder met de volgende stap (aanvullende figuur 1B).
  15. Behandel een celkweekplaat met 24 putjes gedurende 15 minuten met anti-aanhechtingsspoelbuffer (500 μL) om een lage hechtingsplaat te maken.
  16. Verwijder de spoelbuffer volledig en was de putjes twee keer met 1 ml DPBS en voeg vervolgens 1 ml E8 Flex-medium toe aan de putjes.
  17. Resuspendeer de EB's in de microtiterkweekplaat door ze een paar keer te pipetteren met een pipetpunt van een opening van 1 ml breed.
  18. Verzamel voor elk putje van de met 24 putjes behandelde platen met lage hechting 100 μl medium met EB's en voeg dit toe. Dit resulteert in 10-20 EB's per put. Voeg E8 Flex medium toe aan de oude put met de overgebleven EB's als back-up.
  19. Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een incubator met 5% CO2 -cellen van 37 °C.

3. 3D inductie, proliferatie en rijping van neurale organoïden

  1. Op dag 2 na de vorming van EB worden de hoeveelheden BMM gedurende ten minste 30 minuten op ijs ontdooid.
  2. Gebruik een voorgekoelde 20 μL tip, en voeg 15 μL ijskoude BMM druppel wijselijk toe op de medium om de EB's te coaten. Dit maakt een film van BMM waar EB's zich aan zullen hechten en op zullen groeien.
  3. Plaats de plaat in een incubator met 5% CO2 -cellen van 37 °C.
  4. Verwijder op dag 4, na de EB-vorming, voorzichtig 500 μL medium zonder EB's weg te gooien en herhaal de BMM-coating door stap 3.2 te volgen.
  5. Begin onmiddellijk met neurale inductie door 500 μL PSC Neural Induction Medium bovenop de cellen toe te voegen.
  6. Voer op dag 6 en 8 een halve mediumwissel uit door voorzichtig 500 μL medium te verwijderen zonder de cellen aan te raken en 500 μL neuraal inductiemedium toe te voegen.
  7. Voer op dag 10, 12 en 14 een halve mediumverandering uit met neurale stamcellen (NSC) media: Knockout DMEM/F12 + 1x Glutamax-supplement + 1x Neuraal supplement + bFGF + EGF.
  8. Breng op dag 15 het hele putje van bolletjes met medium over op een nieuwe plaat met 12 putjes die is behandeld met een anti-aanhechtingsspoeloplossing zoals eerder beschreven. Voeg 500 μL neuronaal rijpingsmedium (DMEM/F12 + 1x N2 supplement + 1x B27 supplement + 1x antibiotica-antimycoticum) toe aan de top van de cultuur.
  9. Voer om de dag een half-medium verandering uit met neuronaal rijpingsmedium.
  10. Als er tijdens de rijpingsfase tekenen zijn van uitputting van de voeding, zoals kleurverandering van het medium, verplaats de organoïde dan naar platen met 6 putjes, die tot 3 ml medium per putje bevatten.
  11. Optioneel wordt het rijpingsmedium 17 dagen na de EB-vorming gedurende 6 dagen aangevuld met cytokines (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) om de microgliale rijping te vergemakkelijken.
  12. Verzamel op dag 23 de resulterende neurale organoïden voor karakterisering of verdere experimenten.

4. Klaring en immunokleuring van 3D neurale organoïden

  1. Fixeer tot 10 organoïden door onderdompeling in 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C gedurende 24 uur.
  2. Breng de organoïden per putje over op een doorzichtige bodemplaat met 96 putjes en was met 200 μL DPBS 2 keer gedurende 1 uur telkens onder voorzichtig schudden.
  3. Permeabiliseer organoïden door ze één keer te wassen in 50% methanol in DPBS, 80% methanol in dubbel gedestilleerd (dd) water en 100% droge methanol gedurende elk 10 minuten, op 4 °C met zacht schudden.
  4. Was de organoïden serieel in 20% DMSO/methanol, 80% methanol in dd-water, 50% methanol in DPBS, in 100% DPBS, vervolgens in DPBS met 0,2% Triton X-100, elk gedurende 10 minuten op 4 °C met zacht schudden. Doe uw best om de resterende buffer na elke wasbeurt volledig te verwijderen.
  5. Incubeer in permeabiliserende buffer (DPBS met 0,2% Triton X100, 0,3 M glycine en 20% DMSO) met zacht schudden gedurende 40 minuten bij RT.
  6. Blokkeer in blokkeerbuffer (DPBS met 0,2% Triton X100, 6% geitenserum en 10% DMSO) gedurende 1 uur bij 37 °C met voorzichtig schudden op een shaker bij 80 tpm.
  7. Incubeer met antilichamen in antilichaamverdunningsbuffer (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubuline, 1:1000, 100 μL /well in DPBS met 0,2% Tween 20, 100 μg/ml heparine, 3% geitenserum en 5% DMSO) bij 37 °C gedurende 2 uur of in een koude ruimte met zacht schudden bij 80 rpm gedurende 3 dagen.
  8. Was met DPBS met 0,2% Tween 20, 100 μg/ml Heparine 5 keer, elk 10 minuten bij RT met zacht schudden op een shaker bij 80 tpm.
  9. Incubeer met secundair antilichaam (1:200 geit anti-muis Alexa488) bij 37 °C gedurende 1 uur, gevolgd door RT 's nachts met zacht schudden op een shaker bij 80 tpm.
  10. Voer voor nucleaire contrastkleuring DAPI-kleuring uit samen met antilichaamincubatie of in een wasbuffer.
  11. Was de organoïden 10 keer in een wasbuffer, telkens 10 minuten op 37 °C, met zacht schudden.
  12. Observeer onder een microscoop. Als de achtergrond nog hoog is, blijf hem dan 5 keer wassen.
  13. Gooi het bovenstaande zoveel mogelijk weg. Voeg 200 μL organoïde klaringsoplossing toe en incubeer deze gedurende 5 minuten voordat u deze observeert en maak foto's met een confocale microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ons protocol volgt een schema om HPC's te onderscheiden van iPSC's en vervolgens de HPC's te mengen met iPSC's om EB's te maken, gevolgd door neurale inductie, differentiatie en rijping (Figuur 1). Een hoge kwaliteit van HPC-differentiatie is van cruciaal belang voor het succes van EB-vorming en latere organoïde-differentiatie. Een seriële verdunningskweektechniek wordt gebruikt om de juiste aantallen en grootte van iPSC-kolo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het maken van 3D neurale organoïden die aangeboren microglia bevatten uit EB's afgeleid van gemengde iPSC's en iPSC-gedifferentieerde HPC's. Het is een relatief korte en gemakkelijke aanpak waarbij alleen celkweektechnieken en -apparatuur worden gebruikt die algemeen beschikbaar zijn in de meeste laboratoria.

De meest kritische factor voor het succes van dit protocol is de kwaliteit van HPC-differentiati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door NINDS intramurale onderzoeksfondsen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 well cell culture platesCorning #3512
24 well cell culture plateSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400 plateStemcell technologies#34411Referred to as microwell culture plate 
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibodyLife techniologiesA110011:400 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibodyLife techniologiesA110121:400 dilution
Allegra X-30R Centrifuge with rotor S6069Beckman Couler
Anti- Adherence  Rinsing solutionStem Cell Technologies#07010
anti-CD34 antibodyStem Cell Technologies#600131:100 dilution
anti-Human CD43 antibodyStem Cell Technologies#600851:100 dilution
anti-IBA1 rabbbit antibodyFujifilm019-197412.5 µg/mL
anti-TREM2  rat pAbRD Systemsmab172912.5 µg/mL
Antibiotic-antimycoticGibco15240-0621x
B27 supplementLife technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311 100 ng/mL
CryoTube vialsThermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31 100 ng/mL
DAPISigmaD95421 µg/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex medium kitThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0.5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Auto MicroscopeThermoFluorescence microscope 
FastStart Universal SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Goat serumSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34 100 ng/mL
ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25 25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Basement membrane matrix (BMM)
Mouse anti-βIII-tubulin antibodyPromegaG712A1:1000 dilution
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
N2 supplementLife technologies17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484%
PSC Neural Induction MediumGibcoA1647801
Rock inhibitor Y27632Stemcell technologies#723041 mM stock
RT LTS 1000 ul pipette tipsRAININ#30389218 for transferring organoids
STEMdiff Cerebral Organoid KitStem Cell Technologies#08570
STEMdiff Hematopoietic KitStemCell Technologies#5310Referred to as hematopoietic Kit
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Referred to as neural supplement
TGF-β1Peprotech100-2150 ng/mL
Total RNA Purification Plus KitNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Contains organoid clearing solution HISTO-M, washing buffer
Zeiss LSM 510-META Confocal MicroscopeZeiss

Referenties

  1. Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
  2. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  3. Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation. J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).
  4. Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy. J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Fakıoğlu, D. M., Altun, B. New therapeutic approaches in cystic fibrosis. Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).
  7. Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. Human microglial models to study host-virus interactions. Exp Neurol. 363, 114375(2023).
  8. Scopa, C., et al. Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8021(2023).
  9. Tamaki, Y., et al. Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids. PLoS Genet. 19 (2), e1010606(2023).
  10. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  11. Kim, S. H., Chang, M. Y. Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases. Int J Mol Sci. 24 (15), 12528(2023).
  12. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  13. Ormel, P. R., et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 9 (1), 4167(2018).
  14. Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. medRxiv. , (2024).
  15. Wei, Z., et al. Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection. Exp Neurol. 364, 114386(2023).
  16. Wang, T., et al. Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).
  17. Mcquade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Mol Neurodegener. 13 (1), 67(2018).
  18. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  19. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 7302(2021).
  20. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  21. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  22. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hersenorgano denge nduceerde pluripotente stamcellenhematopo tische progenitorcellenembryo de lichamenneurale inductiemicrogliale incorporatiesingle cell RNA sequencingneuro inflammatiemodelneuronale rijping
Afleiding van een organoïde van het menselijk brein met microglia-ontwikkeling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.