Methodenartikel

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

24 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Samenvatting

CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in (KI)-technologie zorgt voor eenvoudigere fluorescerende eiwitlabeling in zebravissen (Danio rerio), een geprefereerd modelorganisme voor in vivo beeldvorming vanwege de transparantie tijdens de vroege ontwikkelingsfase. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van zeer efficiënte fluorescentie-gen KI, snelle screening op KI-oprichters en eiwitopsporing met een lage abundantie in zebravislarven, wat een cruciale basis zal leggen voor latere fysio-pathologische studies in zebravissen. Het huidige protocol omvat volledige stappen voor het sgRNA-ontwerp voor het gen van belang, sgRNA in vitro transcriptie, Cas9 mRNA in vitro transcriptie, in vivo sgRNA-screening voor degene met de hoogste efficiëntie, ontwerp en constructie van donorplasmide, micro-injectie in zebravislarven, KI-oprichtersscherm en live beeldvorming van zebravissen. Kritieke stappen, tips voor het oplossen van problemen, methoden voor kwaliteitscontrole en voordelen en toepassingen van dit protocol worden opgenomen en besproken. Dit protocol zorgt voor snelle en nauwkeurige resultaten tegen lage kosten en is gevalideerd door meerdere onderzoeken.

Inleiding

Als een algemeen geaccepteerd modelorganisme wordt zebravis (Danio rerio) veel gebruikt in wetenschappelijk onderzoek naar ontwikkeling, regeneratie, tumorigenese, infectie en immuniteit, enz. 1,2,3,4,5. Zebravissen zijn vooral geschikt voor in vivo live beeldvorming wanneer ze worden behandeld met PTU (1-fenyl 2-thiourea), een giftige chemische verbinding die melanogenese remt en zebravislarven relatief lang transparant maakt6. Genetisch gemodificeerde transparante zebravisstammen, zoals de casper7 en de crystal8, zijn ook beschikbaar, waardoor live visualisatie en afstammingstracering mogelijk zijn tot de volwassenheid. Naast deze inspanningen om pigmentatie te overwinnen voor een betere live visualisatie bij volwassen vissen, richt ons onderzoek zich ook op het ontwikkelen van krachtige strategieën voor het bewerken van genen om fluorescerende eiwittagging efficiënter en minder kunstmatig te maken.

CRISPR/Cas9-gemedieerde microhomologie-gemedieerde end joining (MMEJ)-gebaseerde KI-technologie wordt nu op grote schaal toegepast bij genetische modificaties in meerdere organismen, waaronder zebravissen, vanwege de relatief hoge KI-efficiëntie 9,10,11,12. Om succesvolle in vivo beeldvorming te bereiken, moeten twee uitdagingen worden aangepakt. Een daarvan zijn de indels of littekens die worden geïntroduceerd door het proces van recombinatie; De andere is dat sommige doelwitgenen endogeen tot expressie komen op een laag niveau, wat leidt tot zwakke signalen van de co-tot expressie gebrachte fluorescentietag en het falen van in vivo detectie. Met het oog op efficiënte en nauwkeurige eiwitlabeling en het minimaliseren van de interferentie van endogene genexpressieniveaus, rapporteerde een recent werk een geoptimaliseerde strategie die een fluorescentiesignaalversterkende "VH"-taggingmethode combineert met een verfijnde kiembaanschermworkflow13, die meer geschikt is voor fluorescentielabeling van genen met een lage expressie en efficiënter is dan eerdere methoden door de donorruggengraat te optimaliseren en polymerasekettingreactie (PCR) en fluorescentieverificaties te combineren om kiembaanscreening te implementeren tegen de laagste kosten van tijd en moeite. Hier presenteren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor de gerapporteerde methode, inclusief stappen van embryovoorbereiding en zebravishouderij, sgRNA-ontwerp, in vitro transcriptie van sgRNA's, in vitro transcriptie van Cas9-mRNA, micro-injectie van zebravisembryo's, in vivo screening voor sgRNA's met de hoogste efficiëntie, ontwerp en constructie van donorplasmide, genotypering van KI-zebravissen, KI-kiembaanscreening en beeldvorming en fenotypering van KI-zebravissen. Dit alles-in-één protocol, dat een state-of-the-art fluorescentie-etiketteringsmethode biedt, zou ongetwijfeld studies met zebravissen op verschillende wetenschappelijke gebieden bevorderen en lezers met verschillende academische achtergronden ten goede komen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle houderijen en experimenten van zebravissen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Laboratory Animal Management and Ethics Committee van de Universiteit van Xiamen en waren in strikte overeenstemming met de goede dierpraktijken zoals gedefinieerd door het Xiamen University Laboratory Animal Center. De studie voldeed aan alle relevante ethische voorschriften voor diergebruik.

OPMERKING: Alle volwassen en larvale zebravissen werden gehouden volgens standaardprotocollen bij 28,5 °C met een licht/donkercyclus van 13/11 uur in het zebravisaquariumsysteem van de Universiteit van Xiamen. De embryo's werden bewaard in de embryobuffer (tabel 1) in een gecontroleerde couveuse (temperatuur: 28 ± 0,5 °C; licht, 13 uur licht/11 uur donkercyclus). Het voeren en de algemene monitoring van alle zebravissen werden tweemaal daags uitgevoerd (9.00 uur en 16.00 uur). De wild-type (WT) stam die in dit onderzoek werd gebruikt was Tübingen (Tü).

1. Het kiezen van genen van belang en het ontwerpen van het gids-RNA

  1. Ken de informatie van het gen van belang. Zoek in de database (https://zfin.org/) en zorg ervoor dat het aantal genvarianten bekend is. Beslis welke variant u wilt manipuleren en download informatie over doelgenen van Ensembl (https://www.ensembl.org/), inclusief genoomsequentie, cDNA-sequentie en coderende sequentie (CDS). Markeer exonen, introns, UTR's, start codons en stop codons in de sequenties.
  2. Kies niet meer dan 200 bp CDS stroomopwaarts van het stopcodon (TAA, TAG of TGA) van het doelgen als het sgRNA-doelgebied.
    OPMERKING: Het is beter om ervoor te zorgen dat dit gebied geen single nucleotide polymorfismen (SNP's) heeft door middel van DNA-sequencing.
  3. Gebruik de CRISPRscan-website (https://www.crisprscan.org/) om kandidaat-sgRNA's binnen het gekozen doelgebied te ontwerpen en de efficiëntie van sgRNA te voorspellen.
    1. Voer de DNA-sequentie in het ontwerpframe in.
    2. Selecteer de bijbehorende informatie, inclusief soorten, maximale mismatch(en) in off-targets, endonuclease en promotor. Kies in dit geval voor Zebrafish-Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG en in vitro T7-promotor.
    3. Klik op SgRNA's ophalen om enkele sgRNA's te verkrijgen. Selecteer 5-7 sgRNA's met een hoge CRISPRscan-score en een lage off-target-score voor het in vivo scherm.
  4. Ontwerp PCR-primers die de sgRNA-doelwitten flankeren waarvan het product ongeveer 500 bp is voor daaropvolgende PCR-amplificatie, enzymatische digestietest en sequencing om de knock-outefficiëntie na sgRNA/Cas9-micro-injectie te verifiëren. Selecteer een sequentie van ongeveer 20 bp in upstream- en downstream-regio's en zorg ervoor dat het GC-gehalte ongeveer 50% is en dat de Tm-waarde varieert van 50-55°C.
    OPMERKING: Ontwerp twee stroomopwaartse primers en twee stroomafwaartse primers als het nodig is om combinaties uit te voeren.

2. Bereiding van sgRNA's

OPMERKING: De gemeenschappelijke sgRNA-scaffoldsequentie (Figuur 1) is gekloond in een plasmide (Materiaaltabel).

  1. PCR amplificeert de T7-promotor-sgRNA-conjugaatsequentie met behulp van primers en PCR-mix die respectievelijk in tabel 2 en tabel 3 worden weergegeven. Voer het PCR-programma uit in tabel 4. Run gel-elektroforese (Agarose-gel, 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 5 min) met 2 μL van de PCR-producten om er zeker van te zijn dat de producten correct zijn (de MW is ongeveer 150 bp).
  2. Zuiver de PCR-producten met behulp van een zuiveringskit (materiaaltabel) of andere in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Vanaf nu moeten RNase-vrije reagentia en materialen worden gebruikt en moeten procedures met speciale voorzichtigheid worden uitgevoerd om RNase-besmetting te voorkomen (zie Discussie).
    1. Voeg de bindingsbuffer toe aan de PCR-producten in een volumeverhouding van 5:1 en meng. Breng het mengsel aan op de kolom die in een opvangbuis van 2 ml is geplaatst. Centrifugeer bij 17.900 × g gedurende 1 minuut bij 25 °C. Gooi de doorstroom weg en plaats de kolom terug in dezelfde opvangbuis.
    2. Voeg 750 μL van de wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer op 17.900 × g gedurende 1 minuut op 25 °C. Gooi de doorstroom weg en plaats de kolom terug in dezelfde opvangbuis. Centrifugeer bij 17.900 × g gedurende 2 minuten bij 25 °C. Plaats de kolom in een schone buis van 1,5 ml.
    3. Voeg 20 μL nucleasevrij water toe aan de kolom, centrifugeer bij 17.900 ×g gedurende 2 minuten bij 25 °C bij 17.900 g om het DNA te elueren en meet de concentratie met behulp van een spectrofotometer.
  3. Gebruik het T7 RNA-productiesysteem in een materiaaltabel of gelijkwaardige kits om in vitro 250 ng van het gezuiverde DNA te transcriberen. RNase-vrije bewerkingen en voorwaarden zijn vereist.
    1. Bereid de reactie voor in PCR-buisjes (RNase-vrij) volgens tabel 3 en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in een metalen bad.
    2. Voeg 0,5 μL DNase I (RNase-vrij) toe en meng voorzichtig. Incubeer bij 37 °C in een metalen bad gedurende 15-20 minuten.
    3. Ethanol precipitatie
      1. Voeg RNase-vrij water toe aan elke reactie om het uiteindelijke volume 20 μL te laten bereiken en breng de monsters over in buisjes van 1,5 ml.
      2. Voeg 50 μL 100% ethanol (2,5 V, RNase-vrij) toe, meng goed, zet het mengsel 10 minuten op ijs en centrifugeer 15 minuten bij 21.000 × g bij 4 °C.
      3. Gooi het bovenstaande weg, was de pellet met 500 μL 75% ethanol (RNase-vrij) en centrifugeer op 21.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      4. Gooi het bovenstaande weg, droog de pellet bij 45 °C in een metalen bad en los op met 40 μL RNasevrij water.
        OPMERKING: Voor KI moeten sgRNA's LiCl-geprecipiteerd worden (zie hieronder), maar voor KO is dit niet nodig.
    4. Gebruik agarosegels (Agarosegel: 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 5 min) met 1-2 μL van het RNA om de kwaliteit te schatten en vervolgens de concentratie te meten met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: sgRNA's kunnen worden bewaard bij -20 °Cor -80 °C voor verder gebruik.

3. Bereiding van Cas9-mRNA

  1. Voer de enzymatische vertering van het Cas9-plasmide (Materiaaltabel) gedurende meer dan 1,5 uur uit met behulp van XbaI volgens de instructies van de fabrikant (voor het reactiemengsel, zie Tabel 3). Test door middel van gelelektroforese (Agarosegel: 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 10 min) met 1 μL om te controleren of de spijsvertering grondig is.
  2. Zuiver de producten op dezelfde manier als sgRNA PCR-producten (stappen 2.2.1-2.2.3). Vanaf hier zijn RNase-vrije materialen en bewerkingen vereist.
  3. Gebruik de T3-transcriptiekit (Table of Materials) of gelijkwaardige kits voor in-vitrotranscriptie van Cas9-mRNA.
    1. Bereid de reactie voor in RNase-vrije PCR-buisjes volgens tabel 3 en meng voorzichtig. Incubeer bij 37 °C gedurende meer dan 2,5 uur.
    2. Voeg 1 μl RNase-vrije Turbo DNase toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15-20 min.
    3. LiCl neerslag
      1. Breng de monsters over in buisjes van 1,5 ml, voeg 30 μl LiCl (1,5 V) toe en meng voorzichtig.
      2. Zet het mengsel ongeveer 30 minuten op -20 °C en centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 21.000 × g bij 4 °C.
      3. Gooi het bovenstaande weg, was de pellets met 500 μL 75% ethanol (RNase-vrij) en centrifugeer bij 21.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      4. Gooi het bovenstaande weg, droog de pellet bij 45 °C en los deze op in 40 μL RNasevrij water.
  4. Meet de concentratie van het Cas9-mRNA met behulp van een spectrofotometer. Gebruik agarosegels (Agarosegel: 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 10 min) met 1-2 μL van het RNA om de concentratie en kwaliteit te controleren.
    OPMERKING: Een OD 260/280 moet hoger zijn dan 2.0 en de concentratie moet rond of hoger zijn dan 1000 ng/μL. Cas9-mRNA kan worden bewaard bij -20 °Cor -80 °C voor verder gebruik.

4. Voorbereiding op de micro-injectie

  1. Bereid de zebravis voor: Plaats de avond voor de micro-injectie een gezonde vrouwelijke zebravis en twee gezonde mannelijke zebravissen in een paringstank, waarbij u een scheidingswand gebruikt om de mannetjes en vrouwtjes te scheiden om ze voor te bereiden op de paring.
  2. Bereid 4% agarose, lysisbuffer en embryobuffer (pH 8,0) (Tabel 1).
  3. Bereid capillaire glazen naalden voor op de micro-injectie (Materiaaltabel).
  4. Bereid micro-injectieplaten voor: Giet 35 ml van de gesmolten 4% agarose in een petrischaal van 10 cm en leg voorzichtig een plastic vorm om troggen in de vorm van een wig te maken. Vermijd luchtbellen door zachtjes op de vorm te tikken. Nadat het is gestold, voeg je er wat dubbel gedestilleerd water (ddw) aan toe en plaats je de plaat op 4 °C voor later gebruik.

5. sgRNA-efficiëntietest door middel van micro-injectie

  1. Bereid op de dag van de micro-injectie het micro-injectiemengsel zoals vermeld in tabel 5 op ijs in een RNase-vrije omgeving.
  2. Laad de micro-injectieoplossing in de naald met behulp van een RNase-vrije pipetpunt (Materiaaltabel). Pas op dat u geen bubbels meeneemt.
  3. Plaats de geladen naald in een micromanipulator die aan een micro-injector is bevestigd. Knip de punt van de injectienaald onder de microscoop met het puntige pincet en knijp voorzichtig in de punt van de naald om deze te breken. Pas vervolgens de injectiedruk aan totdat de naald consequent een druppel van 1 nL uitwerpt, die wordt gekwantificeerd met behulp van een fasemicrometer en een capillair.
  4. Verwijder de verdeler en laat de vissen ongeveer 6 minuten broeden. Verzamel en breng de embryo's in het 1-celstadium over in een petrischaaltje met embryobuffer.
    1. Onderzoek de gezondheid van de embryo's onder de lichtmicroscoop en verwijder onbevruchte eieren of puin. Zet 20 gezonde embryo's opzij als niet-geïnjecteerde controles in een apart petrischaaltje en etiket.
  5. Breng gezonde embryo's in het 1-celstadium over en leg ze voorzichtig op de groeven van de micro-injectieplaat die met een kleine borstel is opgewarmd tot kamertemperatuur (RT). Verwijder overtollige buffer.
  6. Voer alle volgende bewerkingen uit onder een stereomicroscoop. Gebruik de naaldpunt om de positie van het embryo voorzichtig aan te passen, zodat de dierenpaal naar de naald wijst. Injecteer 1 nL van de gemengde oplossing in de dierenpaal.
  7. Ongeveer de injectie van 100 embryo's is voldoende voor één sgRNA. Spoel de embryo's na de injectie voorzichtig af in een plaat met zes putjes met embryobuffer. Plaats de schaal in een incubator met constante temperatuur van 28,5 °C. Onderzoek ongeveer 10 uur na de bevruchting (hpf) de embryonale ontwikkeling onder een stereomicroscoop en verwijder dode embryo's.
  8. Verzamel bij 24 hpf embryo's in buisjes van 1,5 ml voor genotypering (3 buisjes per sgRNA en 5 embryo's per buisje). Gooi het extra water voorzichtig weg met een pipet, voeg 100 μL lysisbuffer met proteïnase K (in een eindconcentratie van 0,5 mg/ml) toe aan elke buis en incubeer bij 56 °C gedurende 1 uur en vervolgens 95 °C gedurende 15 min.
  9. Voeg 200 μL ethanol (2V) toe, meng goed en centrifugeer op 19.000 × g gedurende 10 minuten bij RT.
  10. Gooi het bovenstaande weg, was de pellet met 500 μL 70% ethanol en centrifugeer op 19.000 × g gedurende 3 minuten bij RT.
  11. Gooi het bovenstaande weg, droog de pellet bij RT en los deze op met 50 μL ddw. Gebruik vervolgens 1 μL van de extracten om het reactiemengsel voor de PCR te bereiden (Tabel 3) (voor PCR-primers, zie stap 1.4).
  12. Gebruik agarosegels (Agarosegel: 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 10 min) met 2 μL van de PCR-producten om te bevestigen dat de PCR succesvol is, en vervolgens enzymatische digesties uit te voeren (Tabel 3) om de efficiëntie van de sgRNA's te bepalen. Meng de enzymatische spijsverteringsmix voorzichtig. Incubeer bij de temperatuur gedurende de door de fabrikant voorgestelde periode.
  13. Gebruik agarosegels voor de verteerde producten (Agarosegel: 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 10 min) met de niet-verteerde PCR-producten als controle om te bevestigen of de vertering plaatsvindt.
    OPMERKING: De Cas9-splitsingsplaats bevindt zich ongeveer 3 bp stroomopwaarts van de PAM, dus de herkenningsplaats van het restrictie-enzym is het beste voor het bedekken van 6 bp stroomopwaarts van PAM. Als de sgRNA-efficiëntie hoog is, zullen knippen en verkeerd repareren leiden tot indels, dus de kans is groot dat het restrictie-enzym de snijplaats niet meer kan herkennen. Als het sgRNA inefficiënt is en de herkenningsplaats van het restrictie-enzym intact is, kan de enzymatische vertering normaal plaatsvinden. Door middel van agarosegelelektroforese kan men onderscheiden of enzymatische vertering heeft plaatsgevonden.
  14. Als er geen geschikte herkenningsplaats voor restrictie-enzymen is, sequentie dan de PCR-producten en analyseer de sgRNA-efficiëntie aan de hand van TIDE (https://tide.nki.nl/). Vergeet niet om PCR uit te voeren en ook WT genomisch DNA te sequencen als controle.
    1. Open de website en klik op Start TIDE. Voer de gidssequentie van sgRNA in het frame onder Gidssequentie in.
    2. Klik op Bladeren onder Besturingsvoorbeeldchromatogram (.ab1 of .scf) om het sequentieresultaat voor het WT-besturingselement in te voeren en klik op Bladeren onder Testvoorbeeldchromatogram (.ab1 of .scf) om het volgorderesultaat voor het bewerkte monster in te voeren.
    3. Klik op Weergave bijwerken. De website geeft een percentage van het verschil tussen de twee sequenties. Een groter percentage duidt op een hogere sgRNA-efficiëntie. Een sgRNA met een knock-outefficiëntie van meer dan 80% is geschikt voor volgende KI-procedures.

6. Donorplasmideconstructie voor fluorescerende eiwitlabeling

  1. Ontwerpsequenties die eerst in het plasmide worden gekloond en vervolgens verder in het genoom van de vis worden ingevoegd als Figuur 2: een sequentie van 25 bp stroomopwaarts van de voorspelde Cas9-splitsingsplaats is ontworpen als de linker homologie-arm, en een 25-bp-sequentie stroomafwaarts van de voorspelde Cas9-splitsingsplaats is de rechter homologie-arm. Introduceer CDS tussen de sgRNA-doellocatie en het stopcodon in de donor om de integriteit van het endogene gen te behouden.
    OPMERKING: De 5' van de gecomplementeerde CDS (element 4 in figuur 2) moet synoniem gemuteerd zijn om secundaire splitsing van het recombinante genoom door het sgRNA/Cas9-complex te voorkomen.
  2. Gebruik ligatie-onafhankelijk klonen (LIC)14 met behulp van exonuclease III (Table of Materials) voor de constructie van het donorplasmide. Andere methoden, zoals de Gibson-assemblage, zijn ook haalbaar. Primers voor het klonen worden geïllustreerd in figuur 2. Elementen "1", "2", "3" en "4" worden gedragen door de primers:
    1. Ontwerp Primer F1, die is samengesteld uit een overlappende reeks met de vector, element "1" en een deel van element "2".
    2. Design Primer R2, die is samengesteld uit een deel van element "1", element "2" en element "3".
    3. Ontwerp Primer F2, die is samengesteld uit de elementen "3", "4" en de 5'-sequentie van de CDS die de sgRNA-doellocatie volgt.
    4. Ontwerp Primer R1, die is samengesteld uit de 3'-sequentie van de CDS van het gen en een overlappende sequentie met de vector.
    5. Gebruik zebravis cDNA als sjabloon en voer PCR's uit met behulp van de primers.
      OPMERKING: De aanbevolen overlap tussen primers of tussen de primer en de vector is 15-20 bp. Deze primers zijn doelgenspecifiek en een voorbeeld van de primers voor cx39.9 en cx44.1 wordt gegeven in tabel 2. Dit ontwerp is met succes toegepast zoals eerder beschreven13. Gedetailleerde plasmidekaarten zijn te vinden in aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2. De ontworpen DNA- en eiwitsequenties van cx39.9 en cx44.1 zijn opgenomen in aanvullend bestand 3.
    6. Zuiver de PCR-producten op dezelfde manier als sgRNA PCR-producten (stappen 2.2.1-2.2.3).
  3. Verteer de donorvector (Figuur 3 en Tabel 6) met de juiste restrictie-enzymen. In dit voorbeeld zijn de enzymen PciI en Acc65I (Table of Materials). Voer de uit volgens de instructies van de fabrikant (tabel 3). Zuiver de verteerde donorvector op dezelfde manier als sgRNA PCR-producten (stappen 2.2.1-2.2.3).
  4. Kwantificeer de gezuiverde PCR-fragmenten en de verteerde donorvector door middel van DNA-gelelektroforese (DNA-gel: 1,2% agarose in TAE-buffer; TAE-buffer [Tabel 1]; 200 V; ongeveer 10 min). Bereid het reactiemengsel voor LIC voor volgens tabel 3.
    OPMERKING: Alle buizen en componenten van de reactie moeten op ijs worden geplaatst en de reactie en alle manipulaties moeten op ijs worden uitgevoerd. Voeg 1 μL Exo III (20 eenheden) toe aan de reactie als laatste component en pipetteer dan onmiddellijk op en neer om alle componenten goed te mengen. Vergeet niet om één reactiemengsel zonder PCR-fragmenten op te nemen als controle om het potentieel van zelfgloeien van de verteerde vector aan te tonen.
  5. Plaats het reactiemengsel onmiddellijk op ijs en incubeer gedurende 60 minuten.
  6. Voeg 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) toe om de reactie te stoppen, pipetteer op en neer om goed te mengen en incubeer vervolgens 5 minuten bij 60 °C en vervolgens 5 minuten op ijs.
  7. Transformeer competente cellen, zoals de DH5α, met behulp van de LIC-producten en kweek de bacteriën op LB-platen (Tabel van materialen en Tabel 1) met de juiste antibiotica (ampicilline in dit geval) gedurende 16 uur.
  8. Zorg ervoor dat er ordes van grootte verschillen zijn tussen het aantal kolonies op de PCR-fragmentbevattende platen en dat op de controleplaat. Kies enkele kolonies uit de LIC-platen voor enzymatische spijsverteringsanalyse en DNA-sequencing.
  9. Extraheer en zuiver de juiste donorplasmiden met een zuiveringskit op dezelfde manier als sgRNA PCR-producten (stappen 2.2.1-2.2.3). Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie hoger is dan 300 ng/μL.

7. Micro-injectie van zebravisembryo's voor gen KI

  1. Voer alle hierboven beschreven micro-injectiemanipulaties uit, behalve het bereiden van de micro-injectieoplossing volgens tabel 7.

8. Screening en identificatie van nageslacht met een fluorescerend eiwitlabel

  1. Observeer fluorescentie onder een stereofluorescentiemicroscoop 12-48 uur na micro-injectie.
  2. Pas een nieuw vastgestelde screeningsmethodetoe 13. Als er duidelijke fluorescentie wordt waargenomen, kies dan de fluorescerende larven en kweek ze. Als er slechts een spoor van fluorescentie of zelfs geen fluorescentie wordt waargenomen, worden alle geïnjecteerde larven opgefokt.
  3. Verdoof op de leeftijd van 1 maand de microgeïnjecteerde zebravis met 0,02% tricaïne (tabel 1). Verzamel voor elke zebravis een klein stukje van de staartvin in een gelabeld PCR-buisje en bewaar de bijbehorende verdoofde zebravis in een putje van een plaat met zes putjes met UV-gesteriliseerd gefilterd water (pH 7,2) met hetzelfde etiket.
  4. Gebruik de alkalische lysismethode (lysisbuffer in tabel 1)15 voor genomische DNA-extractie, gevolgd door de 5'-junctie PCR. Ontwerp de voorwaartse primer stroomopwaarts van de linker homologie-arm en de omgekeerde primer op de insert (Figuur 4). De grootte van het PCR-product is ongeveer 500 bp. Voor voorbeelden van de primers, zie Tabel 2.
    LET OP: Voor de fluorescerende zebravis wordt deze PCR gebruikt om de nauwkeurigheid van de KI te verifiëren, zodat het PCR-product vervolgens wordt onderworpen aan sequencing. Voor zebravissen zonder fluorescentie wordt deze PCR gebruikt om te verifiëren of KI optreedt. Kies de PCR-positieve vissen en voed ze op tot volwassenheid als F0.
  5. Onderzoek F 1-embryo's verkregen door paring van de gescreende F0 met WT op GFP-expressiepatronen en gegenotypeerd door junctie-PCR.
    OPMERKING: Als het inbrengen van het doel plaatsvindt in F1 (perfect of niet), wordt de corresponderende F0 gedefinieerd als erfelijke F0, waarvan het PCR-product vervolgens wordt gesequenced. Als de invoeging nauwkeurig is, wordt de corresponderende F0 gedefinieerd als de gewenste F0.
  6. Wanneer de gewenste F0 is verkregen, gebruikt u het nageslacht voor beeldvorming om het doeleiwit te observeren en te volgen.

9. Beeldvorming en gegevensverwerking

  1. Bepaal de ontwikkelingsfase die in beeld moet worden gebracht. Bereid de vis van tevoren voor. Voeg verdund 1-fenyl-2-thioureum (PTU; 0,003%, Table of Materials) toe aan de vis om de pigmenten zo nodig te verwijderen.
    OPMERKING: PTU zou minder effectief zijn als het na 24 hpf wordt toegepast. In dit voorbeeld werd PTU vóór 24 hpf aan de embryobuffer toegevoegd en in de buffer gehouden tot 48 hpf toen de zebravislarven werden verwerkt voor beeldvorming.
  2. Voeg 2 ml gesmolten 4% agarose (tabel 1) toe aan een schaaltje van 35 mm en laat het opzij staan om te stollen. Breng de vissen over in de embryobuffer die 0,02% tricaïne bevat (tabel 1).
  3. Verdun 200 μL gesmolten 4% agarose in 1 ml ddw. Breng de verdoofde vis over in de verdunde agarose met behulp van een pipet van 1 ml wanneer de agarose is afgekoeld. Meng de visklimmende agarose voorzichtig en breng deze over in de schaal met gestolde 4% agarosegel, bereid in stap 9.2.
  4. Plaats de vis zo dat het deel van belang zich aan de bovenkant bevindt.
  5. Gebruik een rechtopstaande confocale fluorescentiemicroscoop voor beeldvorming en gegevensverwerking volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gap junctions bestaande uit polymere eiwitten, connexines genaamd, zijn essentieel voor de uitwisseling van metabolieten en ionen met een laag moleculair gewicht tussen contactcellen. De hierboven beschreven fluorescerende eiwitlabelmethode werd gebruikt om respectievelijk connexine 39.9 (Figuur 5A) en connexine 44.1 (Figuur 5B) te labelen. De juiste KI werd geverifieerd door junctie-PCR's (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om dit experiment soepel en succesvol uit te voeren, moet men meer aandacht besteden aan enkele belangrijke aspecten. Het optimale ontwikkelingsstadium van zebravissen voor injectie moet het eencellige stadium zijn. Het voltooien van de injectie in deze fase kan ervoor zorgen dat alle cellen die door daaropvolgende deling worden geproduceerd, de noodzakelijke componenten voor KI bevatten, waardoor de kans op gelijktijdig optreden van KI in alle cellen toeneemt en het algehele slagingsper...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen in dit artikel.

Dankbetuigingen

We danken Lu Zhou (Xiamen University) voor het proeflezen en redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie 82388201 aan J.H.; subsidie 31801158 aan Y.Z.), het National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 aan J.H.), het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 aan J.H.), de Fujian Province Central to Local Science and Technology Development Special Program (2022L3079 aan J.H.), en het FuXia-Quan Zi-Chuang District Cooperation Program (3502ZCQXT2022003 naar J.H.). De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, publicatiebeslissingen of de voorbereiding van manuscripten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1000 µL  tipsElk merkN/AVoor alle manipulaties
1.5 mL tubesElk merkN/AVoor opslag en centrifugatie van verschillende oplossingen
1.5 mL tubes (RNase-free)Elk merkN/AVoor opslag en centrifugatie van RNase-vrije oplossingen
10 µL tipsElk merkN/AVoor alle manipulaties
10 µL tips (RNase-free)Elk merkN/AVoor RNase-vrije manipulaties
1000 µL  tips (RNase-free)Elk merkN/AVoor RNase-vrije manipulaties
1-fenyl 2-thioureum (PTU)SigmaP7629Om melanogenese te remmen en de larven transparant te houden
200 µL tipsElk merkN/AVoor alle manipulaties
200 µL tips (RNase-free)Elk merkN/AVoor RNase-vrije manipulaties
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR voor sgRNA efficiëntietests
35-mm schalenCorning430165Voor beeldvorming
6-well platenElk merkN/AVoor het tijdelijk en individueel kweken van zebravissen
Acc65INEBR0599SVoor enzymatische vertering
AzijnzuurSigma695092Voor TAE-bufferbereiding
AgarBiofroxx8211GR500Voor LB-platen
Ampicilline, natriumzoutSangonA610028Voor LB-platen
CaCl2SigmaC5080Voor embryobufferbereiding
Capillaire buizenHarvard Apparatus30-0016Voor het genereren van naalden voor injectie
Capillaire buizenElk merkID (binnendiameter) = 0,1 mmVoor het kwantificeren van een 1-nL druppel
CRISPRscanCRISPRscan http://www.crisprscan.org/Voor sgRNA-ontwerp
DH5αTIANGENCB101Voor transformatie
EDTASigmaE6758Voor lysisbuffer en TAE-bufferbereiding
EnsemblEnsembl https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexOm geninformatie te vinden
EthanolHUSHI64-17-5Voor DNA-zuivering en extractie
Exonuclease IIITakara2170ALIC
Gas-aangedreven micro-injectorWarner InstrumentsPLI-100AVoor micro-injectie
GelelektroforesesysteemWIXWIX-EP3000Voor gelelektroforese
HandschoenenElk merkN/AVoor alle manipulaties
Glucosesgdbio10010518Voor LB-platen
GlycerolSangonA501745Voor LB-platen
gRNA-pMD19-TChina Zebrafish Resource Center (CZRC)CZP3sgRNA-plasmide dat sgRNA-scaffold bevat
KClSigmaP5405Voor embryobufferbereiding
Lithiumchloride precipitatie oplossingThermofisherAM9480Precipitatie van sgRNA's, RNase-vrij
Lag smeltende agaroseSangonA600015Voor bereiding van 4% agarosegels
Magnesiumsulfaatsgdbio20025118Voor LB-platen
MetaalbadElk merkN/AVoor incubatie op constante temperatuur
MethyleenblauwSigmaM9140Voor embryobufferbereiding
MicroinjectievormZelfgemaaktN/AVoor het genereren van groeven om embryo's vast te houden tijdens micro-injectie
Microloader, tip voor het vullen van Femtotips en andere glazen microcapillairen, steriel, 0,5 – 20 µL, 100 mm, lichtgrijs, 192 stuks. (2 houders × 96 stuks.)Eppendorf5242956003Om de micro-injectieoplossing in de injectienaald te laden, RNase-vrij
MicropipettrekkerSutter InstrumentP-97Voor het genereren van naalden voor injectie
MicropipettenEppendorfN/AVoor alle manipulaties
MicrogolfElk merkN/AVoor het gieten van injectieplaten en agarosegels
MinElute PCR-zuiveringskit (50)QIAGEN28004Om PCR-producten en digestieproducten te zuiveren, RNase-vrij
mMESSAGE mMACHINE T3 TranscriptiekitInvitrogenAM1348In-vitro transcriptie van Cas9 mRNA, RNase-vrij
N2Elk merkN/AVoor micro-injectie
NaClSigmaS5886Voor embryobuffer en lysisbufferbereiding
NaHCO3SigmaS5761Voor embryobufferbereiding
NaOHSangonA100173Voor TAE-bufferbereiding
Nuclease-vrij waterThermofisherR0581RNA-gerelateerde manipulaties, RNase-vrij
PciINEBR0655SVoor enzymatische vertering
PCR-machineElk merkN/APCR-amplificatie
PCR stripbuizenElk merkN/AVoor PCR
PCR-buizenFEITONGKANGblp-200Voor PCR
PetrischaalElk merkN/AVoor het kweken van zebravislarven enz.
FenolroodSigmaP0290Voor micro-injectie, RNase-vrij
Pipet

Referenties

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebravis imagingCRISPR knock ingen taggingmicro injectie zebravissgRNA ontwerpconstructie van donorplasmidenlive imaging zebraviseiwit tracing

Gerelateerde artikelen