Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in (KI)-technologie zorgt voor eenvoudigere fluorescerende eiwitlabeling in zebravissen (Danio rerio), een geprefereerd modelorganisme voor in vivo beeldvorming vanwege de transparantie tijdens de vroege ontwikkelingsfase. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van zeer efficiënte fluorescentie-gen KI, snelle screening op KI-oprichters en eiwitopsporing met een lage abundantie in zebravislarven, wat een cruciale basis zal leggen voor latere fysio-pathologische studies in zebravissen. Het huidige protocol omvat volledige stappen voor het sgRNA-ontwerp voor het gen van belang, sgRNA in vitro transcriptie, Cas9 mRNA in vitro transcriptie, in vivo sgRNA-screening voor degene met de hoogste efficiëntie, ontwerp en constructie van donorplasmide, micro-injectie in zebravislarven, KI-oprichtersscherm en live beeldvorming van zebravissen. Kritieke stappen, tips voor het oplossen van problemen, methoden voor kwaliteitscontrole en voordelen en toepassingen van dit protocol worden opgenomen en besproken. Dit protocol zorgt voor snelle en nauwkeurige resultaten tegen lage kosten en is gevalideerd door meerdere onderzoeken.
Inleiding
Als een algemeen geaccepteerd modelorganisme wordt zebravis (Danio rerio) veel gebruikt in wetenschappelijk onderzoek naar ontwikkeling, regeneratie, tumorigenese, infectie en immuniteit, enz. 1,2,3,4,5. Zebravissen zijn vooral geschikt voor in vivo live beeldvorming wanneer ze worden behandeld met PTU (1-fenyl 2-thiourea), een giftige chemische verbinding die melanogenese remt en zebravislarven relatief lang transparant maakt6. Gen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle houderijen en experimenten van zebravissen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Laboratory Animal Management and Ethics Committee van de Universiteit van Xiamen en waren in strikte overeenstemming met de goede dierpraktijken zoals gedefinieerd door het Xiamen University Laboratory Animal Center. De studie voldeed aan alle relevante ethische voorschriften voor diergebruik.
OPMERKING: Alle volwassen en larvale zebravissen werden gehouden volgens standaardprotocollen bij 28,5 °C met een licht/donkercyclus van 13/11 uur in het zebravisaquariumsysteem van de Universiteit van Xiamen. De embryo's werden ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gap junctions bestaande uit polymere eiwitten, connexines genaamd, zijn essentieel voor de uitwisseling van metabolieten en ionen met een laag moleculair gewicht tussen contactcellen. De hierboven beschreven fluorescerende eiwitlabelmethode werd gebruikt om respectievelijk connexine 39.9 (Figuur 5A) en connexine 44.1 (Figuur 5B) te labelen. De juiste KI werd geverifieerd door junctie-PCR's (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om dit experiment soepel en succesvol uit te voeren, moet men meer aandacht besteden aan enkele belangrijke aspecten. Het optimale ontwikkelingsstadium van zebravissen voor injectie moet het eencellige stadium zijn. Het voltooien van de injectie in deze fase kan ervoor zorgen dat alle cellen die door daaropvolgende deling worden geproduceerd, de noodzakelijke componenten voor KI bevatten, waardoor de kans op gelijktijdig optreden van KI in alle cellen toeneemt en het algehele slagingsper.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen in dit artikel.
Dankbetuigingen
We danken Lu Zhou (Xiamen University) voor het proeflezen en redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie 82388201 aan J.H.; subsidie 31801158 aan Y.Z.), het National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 aan J.H.), het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 aan J.H.), de Fujian Province Central to Local Science and Technology Development Special Program (2022L3079 aan J.H.), en het FuXia-Quan Zi-Chuang District Cooperation Program (3502ZCQXT2022003 naar J.H.). De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzam....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1000 µL tips | Elk merk | N/A | Voor alle manipulaties |
| 1.5 mL tubes | Elk merk | N/A | Voor opslag en centrifugatie van verschillende oplossingen |
| 1.5 mL tubes (RNase-free) | Elk merk | N/A | Voor opslag en centrifugatie van RNase-vrije oplossingen |
| 10 µL tips | Elk merk | N/A | Voor alle manipulaties |
| 10 µL tips (RNase-free) | Elk merk | N/A | Voor RNase-vrije manipulaties |
| 1000 µL tips (RNase-free) | Elk merk | N/A | Voor RNase-vrije manipulaties |
| 1-fenyl 2-thioureum (PTU) | Sigma | P7629 | Om melanogenese te remmen en de larven transparant te houden |
| 200 µL tips | Elk merk | N/A | Voor alle manipulaties |
| 200 µL tips (RNase-free) | Elk merk | N/A | Voor RNase-vrije manipulaties |
| 2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) | Vazyme | P213-03 | PCR voor sgRNA efficiëntietests |
| 35-mm schalen | Corning | 430165 | Voor beeldvorming |
| 6-well platen | Elk merk | N/A | Voor het tijdelijk en individueel kweken van zebravissen |
| Acc65I | NEB | R0599S | Voor enzymatische vertering |
| Azijnzuur | Sigma | 695092 | Voor TAE-bufferbereiding |
| Agar | Biofroxx | 8211GR500 | Voor LB-platen |
| Ampicilline, natriumzout | Sangon | A610028 | Voor LB-platen |
| CaCl2 | Sigma | C5080 | Voor embryobufferbereiding |
| Capillaire buizen | Harvard Apparatus | 30-0016 | Voor het genereren van naalden voor injectie |
| Capillaire buizen | Elk merk | ID (binnendiameter) = 0,1 mm | Voor het kwantificeren van een 1-nL druppel |
| CRISPRscan | CRISPRscan | http://www.crisprscan.org/ | Voor sgRNA-ontwerp |
| DH5α | TIANGEN | CB101 | Voor transformatie |
| EDTA | Sigma | E6758 | Voor lysisbuffer en TAE-bufferbereiding |
| Ensembl | Ensembl | https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index | Om geninformatie te vinden |
| Ethanol | HUSHI | 64-17-5 | Voor DNA-zuivering en extractie |
| Exonuclease III | Takara | 2170A | LIC |
| Gas-aangedreven micro-injector | Warner Instruments | PLI-100A | Voor micro-injectie |
| Gelelektroforesesysteem | WIX | WIX-EP3000 | Voor gelelektroforese |
| Handschoenen | Elk merk | N/A | Voor alle manipulaties |
| Glucose | sgdbio | 10010518 | Voor LB-platen |
| Glycerol | Sangon | A501745 | Voor LB-platen |
| gRNA-pMD19-T | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | CZP3 | sgRNA-plasmide dat sgRNA-scaffold bevat |
| KCl | Sigma | P5405 | Voor embryobufferbereiding |
| Lithiumchloride precipitatie oplossing | Thermofisher | AM9480 | Precipitatie van sgRNA's, RNase-vrij |
| Lag smeltende agarose | Sangon | A600015 | Voor bereiding van 4% agarosegels |
| Magnesiumsulfaat | sgdbio | 20025118 | Voor LB-platen |
| Metaalbad | Elk merk | N/A | Voor incubatie op constante temperatuur |
| Methyleenblauw | Sigma | M9140 | Voor embryobufferbereiding |
| Microinjectievorm | Zelfgemaakt | N/A | Voor het genereren van groeven om embryo's vast te houden tijdens micro-injectie |
| Microloader, tip voor het vullen van Femtotips en andere glazen microcapillairen, steriel, 0,5 – 20 µL, 100 mm, lichtgrijs, 192 stuks. (2 houders × 96 stuks.) | Eppendorf | 5242956003 | Om de micro-injectieoplossing in de injectienaald te laden, RNase-vrij |
| Micropipettrekker | Sutter Instrument | P-97 | Voor het genereren van naalden voor injectie |
| Micropipetten | Eppendorf | N/A | Voor alle manipulaties |
| Microgolf | Elk merk | N/A | Voor het gieten van injectieplaten en agarosegels |
| MinElute PCR-zuiveringskit (50) | QIAGEN | 28004 | Om PCR-producten en digestieproducten te zuiveren, RNase-vrij |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcriptiekit | Invitrogen | AM1348 | In-vitro transcriptie van Cas9 mRNA, RNase-vrij |
| N2 | Elk merk | N/A | Voor micro-injectie |
| NaCl | Sigma | S5886 | Voor embryobuffer en lysisbufferbereiding |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Voor embryobufferbereiding |
| NaOH | Sangon | A100173 | Voor TAE-bufferbereiding |
| Nuclease-vrij water | Thermofisher | R0581 | RNA-gerelateerde manipulaties, RNase-vrij |
| PciI | NEB | R0655S | Voor enzymatische vertering |
| PCR-machine | Elk merk | N/A | PCR-amplificatie |
| PCR stripbuizen | Elk merk | N/A | Voor PCR |
| PCR-buizen | FEITONGKANG | blp-200 | Voor PCR |
| Petrischaal | Elk merk | N/A | Voor het kweken van zebravislarven enz. |
| Fenolrood | Sigma | P0290 | Voor micro-injectie, RNase-vrij |
| Pipet |
Referenties
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
