Vaststelling en vergelijking van op fluorescentie gebaseerde T6SS-activiteitsdetectiemethoden in Acinetobacter baumannii

Summary

Hier stellen we een kwantitatieve detectiemethode voor op basis van fluorescerende labeling (vooral Luciferase) om de activiteit van bacterieel T6SS efficiënt en nauwkeurig te beoordelen, wat geschikt is voor high-throughput analyse van klinische stammen.

Abstract

Het Type VI Secretie Systeem (T6SS) is een cruciaal mechanisme dat intercellulaire interacties bemiddelt in Gram-negatieve bacteriën, met name in pathogene soorten zoals Acinetobacter baumannii. Eerdere studies hebben aangetoond dat het grote plasmide pAB3 in de A. baumannii ATCC 17978-stam codeert voor een TetR-achtig eiwit dat de expressie van de kern van T6SS-genen remt. Daarentegen kan de WT^R-stam , die pAB3 mist, het T6SS-effectoreiwit Hcp stabiel tot expressie brengen en afscheiden en vertoont het vermogen om E. coli te doden. Het tssM-gen , een van de kerngenen van T6SS, is essentieel voor zijn activiteit; de verwijdering ervan leidt direct tot de inactivering van T6SS. Traditionele methoden voor het detecteren van T6SS-activiteit, zoals killing assays, hebben echter te kampen met een lage doorvoer en onvoldoende gevoeligheid. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we kwantitatieve detectiemethoden ontwikkeld op basis van fluorescerende labeling.

Om de detectie van T6SS-activiteit te verbeteren, hebben we drie fluorescerende labelingsmethoden ontwikkeld: (1) Een kwantitatieve detectiemethode op basis van Luciferase-labeling, die wordt gekenmerkt door een hoge specificiteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid, waardoor deze geschikt is voor analyse met hoge doorvoer; (2) Een detectiemethode op basis van etikettering van groen fluorescerend eiwit (GFP), die, ondanks dat ze gevoelig is voor omgevingsinterferentie, het voordeel biedt van een hoge doorvoer; (3) Detectie van flowcytometrie, die de levensvatbaarheid van bacteriën kwantitatief kan beoordelen, maar operationeel complex en kostbaar is. Na een uitgebreide vergelijking bleek de op Luciferase gebaseerde etiketteringsmethode de meest nauwkeurige, gevoelige en gebruiksvriendelijke te zijn. Bij toepassing op 20 klinische isolaten van A. baumannii werd bevestigd dat deze methode de T6SS-activiteit snel en nauwkeurig evalueert.

Introduction

Het Type VI Secretie Systeem (T6SS) is een belangrijk eiwitsecretiesysteem in Gram-negatieve bacteriën, dat op grote schaal betrokken is bij bacteriële competitie, antagonisme tegen eukaryote gastheren en regulatie van immuunresponsen van de gastheer ^1,2. Door toxische effectoreiwitten in naburige bacteriën of eukaryote cellen te injecteren, helpt T6SS bacteriën een concurrentievoordeel te behouden in complexe omgevingen. In de afgelopen jaren heeft de belangrijke rol van T6SS in bacterieel aanpassingsvermogen, pathogeniteit en microbiële interacties het tot een onderzoekshotspot gemaakt, vooral bij multiresistente pathogenen, waar zijn functies potentiële doelen bieden voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële strategieën ^3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) is een Gram-negatieve opportunistische ziekteverwekker die op grote schaal wordt verspreid in ziekenhuisomgevingen. Vanwege zijn hoge resistentie tegen geneesmiddelen en zijn sterke aanpassingsvermogen is het wereldwijd een belangrijke nosocomiale ziekteverwekker geworden ^6,7,8. Het overleven van A. baumannii in complexe microbiële omgevingen is afhankelijk van meerdere secretiesystemen, waaronder T6SS een sleutelrol speelt in de concurrentie met andere microben en interacties met de gastheer. Met zijn sterk geconserveerde T6SS-gencluster en goed gedefinieerde functies is A. baumannii een ideaal model geworden voor het bestuderen van T6SS-mechanismen. Bovendien biedt de unieke structuur van de T6SS in A. baumannii een onderscheidend perspectief om de diversiteit en functies van T6SS verder te onthullen.

De T6SS-gencluster van A. baumannii bevat 12 kerneiwitgenen (zoals tssA-tssM, zonder tssJ) en verschillende genen met onbekende functies (zoals tagX, tagN, tagF, enz.)^2,9,10. Onder hen is het hemolysine gecoreguleerde eiwit (Hcp) een belangrijk onderdeel van T6SS en de secretie ervan wordt beschouwd als een kenmerk van functioneel T6SS. Studies hebben aangetoond dat het grote plasmide pAB3 in A. baumannii de expressie van T6SS remt door te coderen voor een TetR-achtig regulerend eiwit. Daarentegen kunnen stammen die pAB3 hebben verloren (zoals WT^R-) stabiel Hpp tot expressie brengen en afscheiden, waarbij ze significante T6SS-activiteit vertonen¹¹. Het tssM-gen is een van de kerngenen van T6SS en de deletie ervan leidt direct tot de inactivatie van T6SS.

Traditionele methoden voor het detecteren van T6SS-activiteit (zoals dodingstests) hebben echter beperkingen zoals een lage doorvoer, slechte reproduceerbaarheid en onvoldoende gevoeligheid, die de diepgaande studie en wijdverbreide toepassing van T6SS⁵ ernstig beperken. Daarom is de ontwikkeling van efficiënte en nauwkeurige methoden voor het detecteren van T6SS-activiteit een dringende behoefte geworden in het huidige onderzoek. Deze studie heeft tot doel T6SS-activiteitsdetectiemethoden vast te stellen en te vergelijken op basis van fluorescerende labeling om de tekortkomingen van traditionele methoden te verhelpen. Door middel van fluorescerende labeltechnologie hebben we realtime, kwantitatieve monitoring van T6SS-activiteit bereikt, waardoor een nauwkeuriger en betrouwbaarder hulpmiddel wordt geboden voor de studie van bacteriële interacties. Deze studie heeft de effectiviteit van fluorescerende labelmethoden gevalideerd en heeft, door de voor- en nadelen van verschillende fluorescerende labelstrategieën te vergelijken, nieuwe perspectieven en methodologische ondersteuning geboden voor toekomstig onderzoek. Het biedt niet alleen nieuwe technische middelen voor T6SS-onderzoek, maar legt ook een wetenschappelijke basis voor het begrijpen van de complexe mechanismen van bacteriële interacties en het ontwikkelen van nieuwe antibacteriële therapeutische strategieën.

Protocol

1. Bronnen van stammen en plasmiden

1. Gebruik A. baumannii standaard stam ATCC 17978, E. coli (pZY01), en de klinische stam van A. baumannii geïsoleerd uit de afdeling Laboratoriumgeneeskunde van het First Hospital van Jilin University.
2. Gebruik het plasmide pZY01-GFP (drager van een kanamycine-resistentiegen, dat in staat is tot stabiele expressie in A. baumannii), dat in het laboratorium is gemodificeerd en bewaard, en het commercieel gekochte plasmide pGEN-luxCDABE (met een ampicillineresistentiegen).
3. Kweek A. baumannii en E. coli in Luria-Bertani (LB) medium of een minimaal medium met: 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,2% (w/v) natriumsuccinaat als enige koolstofbron, en 0,01% (w/v) gistextract¹². Voeg indien nodig antibiotica toe in de volgende concentraties: E. coli: ampicilline (100 μg/ml) en kanamycine (50 μg/ml); A. baumannii: streptomycine (100 μg/ml).
   OPMERKING: E. coli (pZY01) en E. coli (pZY01-GFP) brengen kanamycineresistentie tot expressie. E. coli (pZY01) heeft geen fluorescerende marker, dus het kan in de volgende tekst worden aangeduid als E. coli .

2. Bereiding van bacteriestammen voor het experiment

1. Haal de bacteriestammen 2 dagen voor het experiment uit de vriezer van -80 °C. Inoculeer de bacteriestammen op LB-agarplaten die de bijbehorende antibiotica bevatten. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat alle cellen de plasmiden aan het begin van het experiment behouden.
2. Pluk 1 dag voor het experiment twee onafhankelijke afzonderlijke kolonies van elke bacteriestam. Inoculeer elke kolonie afzonderlijk in twee afzonderlijke buisjes met 5 ml LB vloeibaar medium. Incubeer de culturen een nacht bij 37 °C en schud ze bij 200 tpm. Gebruik deze culturen voor latere experimenten.
   OPMERKING: Optimaliseer de incubatietijd op basis van de bacteriegroeisnelheid om ervoor te zorgen dat er voldoende bacteriële biomassa wordt verkregen.

3. Preparaat van E. coli (GFP)/ E. coli (Luciferase) stammen

1. Transformatie
   1. Voeg 50 ng plasmide-DNA (pZY01-GFP of pGEN-luxCDABE, gekwantificeerd via NanoDrop op A260/A280) toe aan respectievelijk 100 μL E. coli DH5α-competente cellen en meng voorzichtig.
   2. Incubeer 30 minuten op ijs, schok gedurende 60 s bij 42 °C en plaats onmiddellijk 30 s op ijs.
   3. Voeg 700 μL antibioticavrije LB-bouillon toe en incubeer bij 37 °C met schudden bij 180 rpm gedurende 2 uur.
2. Plateren en kweken
   1. Centrifugeer bij 420 × g gedurende 2 min, gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 100 μL antibioticavrije LB-bouillon.
   2. Verdeel het pZY01 (GFP)-transformatieproduct op LB-agarplaten die 50 μg/ml kanamycine bevatten.
   3. Verdeel het pGEN-luxCDABE-transformatieproduct op LB-agarplaten die 100 μg/ml ampicilline bevatten. Incubeer een nacht bij 37 °C.
3. Verificatie van positieve klonen
   1. Kies enkele kolonies en extraheer DNA als polymerasekettingreactie (PCR) sjablonen de volgende dag. Voer PCR-amplificatie uit en verifieer door middel van agarosegelelektroforese.
   2. Bevestig positieve stammen en label ze als E. coli (GFP) en E. coli (Luciferase).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de kwaliteit van competente cellen hoog is voor een efficiënte transformatie. Vermijd overmatige bacteriële vloeistof tijdens het plateren om interferentie met de isolatie van een enkele kolonie te voorkomen.

4. Western blotting

1. Voorbereiding van het monster
   1. Verzamel bacterieculturen en centrifugeer (1500 × g, 10 min, 4 °C) om de celpellet en het supernatant te scheiden.
   2. Voeg een geschikte hoeveelheid laadbuffer toe aan zowel de celpellet als het supernatant. Kook 10 minuten bij 100 °C in een metalen bad. Centrifugeer (1500 g, 10 min, 4 °C) en verzamel de bovenstaande middelen als eiwitmonsters.
   3. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchoninezuur (BCA) of Bradford-methode en pas aan op dezelfde concentratie.
2. Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE)
   1. Bereid SDS-PAGE-gels voor in de juiste concentraties (bijv. 12% scheidingsgel, 5% stapelgel)¹³.
   2. Laad 20 μg eiwitmonsters in de gelputjes samen met een voorgekleurde eiwitmarker van 1-2 μl. Voer elektroforese uit bij 100-120 V totdat de broomfenolblauwe indicator de bodem van de gel bereikt.
      OPMERKING: Lopende buffer: Tris 25 mM, Glycine 192 mM, SDS 0,1% (w/v), gedestilleerd water tot 1 L.
3. Overdracht (Western Blotting)
   1. Verwijder de gel van de glasplaten en week deze in de overdrachtsbuffer. Bereid een polyvinylideendifluoride (PVDF) of nitrocellulose (NC) membraan voor, activeer het PVDF-membraan met methanol en week het vervolgens in de overdrachtsbuffer.
      OPMERKING: Overdrachtsbuffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% Methanol
   2. Monteer het transferapparaat in een "sandwich"-structuur (filterpapier-gel-membraan-filterpapier). Overdracht bij 100 V gedurende 60-90 minuten (pas de tijd aan op basis van het molecuulgewicht van het eiwit; Gastheerceleiwitten (HCP) hebben een molecuulgewicht van ongeveer 17 kDa).
      NOTITIE: Plaats de transfertank in ijswater en voeg ijspakken toe om een lage temperatuur te behouden. Als de overdrachtstijd lang is, vervangt u de koelelementen halverwege.
4. Blokkeren
   1. Plaats na de overdracht het membraan in een 5% magere melkblokkerende oplossing. Blokkeer bij kamertemperatuur (RT) op een shaker gedurende 1 uur of een nacht bij 4 °C.
5. Incubatie van primaire antilichamen
   1. Was het membraan driemaal met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween 20 (TBST) buffer, telkens 5 minuten. Incubeer het membraan met verdunde primaire antilichamen (anti-Hcp-antilichaam van muizen, verdunning 1:1000; anti-isocitraatdehydrogenase (ICDH)-antilichaam van muizen, verdunning 1:1000) bij 4 °C 's nachts of RT gedurende 2 uur.
6. Incubatie van secundaire antilichamen
   1. Was het membraan met TBST-buffer 3 keer, elk 5 minuten. Incubeer het membraan met verdund secundair antilichaam (mierikswortelperoxidase [HRP]-geconjugeerd anti-muis IgG, 1:3000 verdunning) bij RT gedurende 2 uur.
7. Opsporing
   1. Was het membraan met TBST-buffer 3 keer, elk 5 minuten. Bereid ECL chemiluminescerend substraat voor en breng het gelijkmatig aan op het membraan.
   2. Detecteer signalen met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem en leg beelden vast (HCP-eiwit heeft een molecuulgewicht van ongeveer 17 kDa, ICDH is een cytoplasmatisch metabool enzym met een verwacht molecuulgewicht van ongeveer 45 kDa in A. baumannii).
      OPMERKING: ICDH is een belangrijke kwaliteitscontrolemarker die alleen kan worden gedetecteerd in de celpelletfractie (die intacte bacteriën bevat) en niet in de bovenstaande fractie (die uitgescheiden eiwitten bevat), waardoor wordt aangetoond dat er geen cellyse heeft plaatsgevonden tijdens de voorbereiding van het monster. Hcp-secretie (17 kDa) zou alleen zichtbaar moeten zijn in supernatanten van T6SS-actieve stammen.

5. Bereiding van platen met 96 putjes met LB-agarmedium

1. Voeg snel geautoclaveerd antibioticavrij LB-agarmedium, voorverwarmd, toe aan een steriele plaat met 96 putjes, 50 μL per putje. Laat de plaat minstens 1 uur op RT staan om volledige stolling van het medium te garanderen.
2. Gebruik zwartwandige platen met een transparante bodem voor het detecteren van GFP-fluorescentie.
3. Gebruik lichtdichte platen met 96 putjes voor het detecteren van Luciferase-fluorescentie om fluorescentie-interferentie met kruisputten te voorkomen.
   OPMERKING: Vermijd het genereren van luchtbellen bij het toevoegen van het medium om een uniforme geldikte te garanderen, wat een optimaal bacteriecontact en groei bevordert.

6. A. baumannii dodingstest

1. Standaard dodingstest
   1. Kweek WT^R- en ΔtssM-mutante stammen 's nachts bij 37 °C met schudden in LB-medium aangevuld met 100 μg/ml streptomycine, kweek E. coli afzonderlijk in LB-medium dat 50 μg/ml kanamycine bevat onder identieke omstandigheden.
   2. Was de bacterieculturen twee keer met steriel PBS en suspendeer ze opnieuw in vers antibioticavrij LB-medium. Stel de OD₆₀₀ in op 1.0 voor standaardisatie.
   3. Meng WT^R- en ΔtssM-mutante stammen met E. coli in een verhouding van 1:1.
   4. Spot 10 μL van de gemengde bacteriële suspensie op antibioticavrije LB-agarplaten en incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C.
   5. Schraap de bacteriële vlekken en suspendeer ze opnieuw in 1 ml PBS. Voer vijf 10-voudige seriële verdunningen uit.
   6. Spot 10 μl van de verdunde bacteriële suspensies op LB-platen die kanamycine bevatten en incubeer een nacht bij 37 °C.
   7. Analyseer de T6SS-afhankelijke antibacteriële activiteit van WT^R- en ΔtssM-mutante stammen op basis van kolonietelling.
      OPMERKING: Zorg voor een grondige menging van bacteriële suspensies om experimentele fouten te voorkomen. Voer ten minste drie onafhankelijke replicaten uit voor elk monster om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.
2. Kwantitatieve detectie van T6SS-activiteit met behulp van luciferase-labeling
   1. Standaardiseer de OD₆₀₀ van E. coli (Luciferase), WT R-, ΔtssM-mutanten en andere stammen (bijv. ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) naar 1.0. Voeg 5 μL bacteriële suspensie toe aan een plaat met 96 putjes met antibioticavrije LB-agar. Meet na het drogen aan de lucht in het donker op luciferase gebaseerde bioluminescentie om de luminescentiespecificiteit van E. coli (Luciferase) te verifiëren.
   2. Voer een 5-voudige seriële verdunning van E. coli (Luciferase) uit. Spot 10 μL van de verdunde bacteriële suspensie op een plaat met 96 putjes met LB-agar en een lege plaat met 96 putjes (beide lichtdicht). Meet op luciferase gebaseerde bioluminescentie om de gevoeligheid van de op luciferase gebaseerde detectiemethode te evalueren en te bevestigen of LB-agar het luminescentiesignaal verstoort.
   3. Meng E. coli (Luciferase) met WT R-, ΔtssM-mutanten en 20 klinische stammen (OD₆₀₀ gestandaardiseerd op 1,0) in een verhouding van 1:1. Verdun 10-voudig, voeg 5 μL toe aan een plaat met 96 putjes en zet drie technische replicaten op.
   4. Meet na het drogen aan de lucht in het donker de bioluminescentie. Incubeer 4-6 uur bij 37 °C in het donker en meet dan opnieuw de bioluminescentie (emissiegolflengte: 562 nm).
   5. Beoordeel kwantitatief de T6SS-afhankelijke antibacteriële activiteit door bioluminescentiewaarden voor en na co-cultuur te vergelijken.
      OPMERKING: Zorg voor een grondige menging van bacteriële suspensies om experimentele fouten te voorkomen. Voer ten minste drie onafhankelijke replicaten uit voor elk monster om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen. Gebruik de t-toets van de student voor statistische analyse.
3. Detectie van T6SS-activiteit met behulp van GFP-labeling
   1. Volg dezelfde procedure als het Luciferase-labelexperiment: (excitatiegolflengte: 480 nm, emissiegolflengte: 509 nm).
   2. Meng E. coli (GFP) met WT^R- en ΔtssM-mutanten (OD₆₀₀ gestandaardiseerd op 1,0) in een verhouding van 1:1. Spot 10 μL op antibioticavrije LB-agarplaten. Na het drogen aan de lucht bij RT, legt u beelden vast met behulp van het GFP-fluorescentiekanaal (Alex488-programma, excitatie: 488 nm, emissie: 509 nm) van een multifunctioneel beeldvormingssysteem.
   3. Incubeer 4-6 uur in het donker bij 37 °C en maak dan opnieuw foto's. Beoordeel de T6SS-activiteit op basis van veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van bacteriële vlekken.
      OPMERKING: Voer alle stappen in het donker uit om interferentie met fluorescentiesignalen te voorkomen. Zorg voor een grondige menging van bacteriële suspensies om experimentele fouten te voorkomen. Voer ten minste drie onafhankelijke replicaten uit voor elk monster om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.
4. Detectie van flowcytometrie
   1. Meng WT R- met E. coli (GFP) en ΔtssM-mutanten met E. coli (GFP) in een verhouding van 1:1. Neem een geschikte hoeveelheid van de gemengde bacteriële suspensie en verdun deze tot een geschikte concentratie (meestal OD₆₀₀ van 0,1-0,5) met behulp van steriele PBS of 1× buffer.
      OPMERKING: 1× buffer verwijst naar Flow Cytometry Staining Buffer (1×), de ingrediënten zijn onder meer: 1× PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4), aangevuld met: 2-5% (v/v) door warmte geïnactiveerde FBS (of 1% BSA als alternatief), 2 mM EDTA.
   2. Centrifugeer de verdunde gemengde bacteriële suspensie gedurende 2 minuten bij 300 x g en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet in 1 ml steriele PBS- of 1×buffer en meng voorzichtig. Filtreer de geresuspendeerde oplossing door een celzeef van 35 μm om aggregaten te verwijderen en zorg voor een eencellige suspensie.
   3. Zet de flowcytometer aan, verwarm de laser voor en kalibreer het instrument.
      1. Stel de detectieparameters in: gebruik een laser van 488 nm om GFP op te wekken. Detectiekanaal: FL1 (meestal een filter van 530/30 nm voor GFP-fluorescentiedetectie). Stel parameters voor voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) in om bacteriële cellen te onderscheiden.
      2. Gebruik niet-gelabelde E. coli als negatieve controle, pas de spanning en versterking aan en zorg ervoor dat de GFP-negatieve populatie zich op de basislijn van het fluorescentiesignaal bevindt.
   4. Meng het gefilterde monster voorzichtig en breng 100 μL over in een flowcytometriebuisje.
      1. Analyseer de monsters met behulp van de volgende instrumentinstellingen: Stel de FSC-H-drempel in op 19.000 om vuil uit te sluiten, met versterkingswaarden van 100 (FSC), 110 (SSC) en 80 (FITC).
      2. Voor gating moet in eerste instantie puin en niet-doelsignalen worden uitgesloten in het FSC-A vs. SSC-A-spreidingsdiagram, gevolgd door populatieanalyse in het FITC-kanaal. Verkrijg minimaal 10.000 gebeurtenissen uit de doelpopulatie (gedefinieerd door FSC/SSC-kenmerken) voor elke steekproef.
   5. Analyseer de gegevens met behulp van flowcytometriesoftware (bijv. FlowJo, BD, FACSDiva).
      1. Zet FSC versus SSC-spreidingsdiagrammen uit om de beoogde bacteriepopulatie te bepalen. Zet FL1-fluorescentiehistogrammen in kaart om GFP-positieve en GFP-negatieve populaties te onderscheiden.
      2. Bereken het percentage GFP-positieve cellen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI).
   6. Centrifugeer de resterende gemengde bacteriële suspensie bij 300 g gedurende 2 minuten en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 10 μL steriel water en spot deze op antibioticavrije LB-agarplaten.
   7. Incubeer 5 uur in het donker bij 37 °C, schraap vervolgens de bacteriële vlekken en suspendeer ze opnieuw in 500 μl 1× PBS. Neem 100 μl van de geresuspendeerde oplossing, verdun op de juiste manier en voer flowcytometriedetectie uit, waarbij u de stappen 6.4.4-6.4.5 herhaalt.
   8. Vergelijk het percentage GFP-positieve cellen en de fluorescentie-intensiteit voor en na co-cultuur. Evalueer het dodende effect van WT^R- en ΔtssM-mutanten op E. coli (GFP).
      OPMERKING: Zorg voor een suspensie met één cel om te voorkomen dat celaggregatie de detectieresultaten beïnvloedt. Kalibreer het instrument vóór detectie om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van fluorescentiesignalen te garanderen. Stel monsters tijdens het experiment niet bloot aan sterk licht om GFP-fluorescentie-afschrikking te voorkomen. Voer ten minste drie replicaten uit voor elk monster om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.

Results

Traditionele methoden voor het detecteren van T6SS-activiteit omvatten doorgaans het gelijktijdig kweken van roofdier- en doelwitstammen op antibioticavrije LB-agarplaten gedurende 5 uur, gevolgd door het schrapen van de bacteriële vlekken, het opnieuw suspenderen ervan en het uitvoeren van seriële verdunningen. De verdunde bacteriële suspensie wordt vervolgens op selectieve agarplaten gespot. Door de kolonies van de doelspanning op de platen de volgende dag te tellen, kan de T6SS-activi...

Discussion

Het Type VI Secretion System (T6SS) is een complexe multi-eiwitmachine waarvan de functies voornamelijk worden gerealiseerd door de secretie van effectoreiwitten. Deze effectoreiwitten bemiddelen interbacteriële competitie door andere bacteriesoorten te doden of te remmen, waardoor de gastheerbacterie een concurrentievoordeel krijgt in microbiële gemeenschappen¹⁵. Naast zijn rol in de competitie hebben studies aangetoond dat T6SS betrokken is bij verschillende cel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% SDS-PAGE Gel Preparation Kit	Epizyme	PG112
-20 °C Freezer	Haier	HYCD-290
37 °C Incubator	Bluepard	181254254
4 °C Refrigerator	Haier	HYC390
-80 °C Freezer	Haier	DW-86L726G(726L)
96-well plate	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
Ammonium Persulfate (APS)	Thermo	7727-54-0
Biological Safety Cabinet	ESCO	AC2-4S1
Electronic Balance	Sartorius AG	BSA124S-CW
Electrophoresis apparatus	BIO-RAD	POWER PAC1000
Flake Ice Machine	GRANT	XB70
Flow Cytometer	BECKMAN COULTER	AW38143
Flow Cytometry Staining Buffer	proteintech	PF00018
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
High-speed Centrifuge	Eppendorf	5405IN106358
HRP-conjugated Rabbit/Mouse Secondary Antibody	proteintech	SA00001-2
LB Broth	Solarbio	L8291
Low Temperature High Speed Centrifuge	Thermo	17R
Methanol	Thermo	R40121
Micro UV-Vis Spectrophotometer	Thermo	Nanodrop one
Microcentrifuge	allsheng	Mini-6k
Microplate Reader	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Sample Buffer	Thermo	NP0007
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Sample Loading Buffer	Beyotime	poo15L
Skim Milk Powder	Thermo	LP0033B
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Zike	zk6885
Thermostatic Water Bath	JingHong	DK-420S
Transfer Apparatus	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Zike	ZK-L2557
Vertical Electrophoresis Apparatus	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra