Methodenartikel

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

DOI:

10.3791/67823

⸱

21 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Center for Nano Science and Technology, Istituto Italiano di Tecnologia, 3Disease Biophysics Group, John A. Paulson School of Engineering and Applied Science, Harvard University, 4Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering “Giulio Natta”, Politecnico di Milano, 5Department of Physics, Politecnico di Milano, 6Department of Physics and Astronomy, University of Bologna

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro cardiale microfysiologische modellen zijn zeer betrouwbaar voor wetenschappelijk onderzoek, de ontwikkeling van geneesmiddelen en medische toepassingen. Hoewel algemeen aanvaard door de wetenschappelijke gemeenschap, zijn deze systemen nog steeds beperkt in levensduur vanwege de afwezigheid van niet-invasieve stimulatietechnieken. Fototransducers bieden een efficiënte stimulatiemethode en bieden een draadloze benadering met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, terwijl invasiviteit in stimulatieprocessen wordt geminimaliseerd. In dit manuscript presenteren we een volledig optische methode voor het stimuleren en detecteren van de activiteit van een in vitro cardiaal microfysiologisch model. In het bijzonder hebben we gemanipuleerde gemanipuleerde laminaire anisotrope weefsels gefabriceerd door door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) te zaaien die zijn gegenereerd in een 3D-bioreactorsuspensiecultuur. We gebruikten een fototransducer, een amfifiel azobenzeenderivaat, genaamd Ziapin2, voor stimulatie en een Ca2+ kleurstof (X-Rhod 1) voor het monitoren van de respons van het systeem. De resultaten tonen aan dat Ziapin2 Ca2+- responsen in het gebruikte systeem kan fotomoduleren zonder de integriteit, levensvatbaarheid of het gedrag van het weefsel in gevaar te brengen. Bovendien hebben we aangetoond dat de op licht gebaseerde stimulatiebenadering een vergelijkbare resolutie biedt in vergelijking met elektrische stimulatie, de huidige gouden standaard. Over het algemeen opent dit protocol veelbelovende perspectieven voor de toepassing van Ziapin2 en materiaalgebaseerde fotostimulatie in cardiaal onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van licht voor het stimuleren van levende cellen en weefsels is in opkomst als een belangrijke game-changer in biomedisch onderzoek, met contactloze stimulatiemogelijkheden met een nauwkeurige temporele en ruimtelijke resolutie 1,2,3,4,5,6. Een van de belangrijkste technieken die worden gebruikt om cellen gevoelig te maken voor licht is optogenetica, waarbij cellen genetisch worden gemodificeerd om lichtgevoelige ionenkanalen of pompen tot expressie te brengen 7,8. Deze aanpak heeft een indrukwekkende effectiviteit aangetoond bij het reguleren van cellen in levend weefsel; De afhankelijkheid van virale genoverdracht heeft echter de wijdverbreide acceptatie ervan in onderzoek en klinische toepassingen belemmerd.

Om deze beperking te overwinnen, zijn organische en anorganische materialen gebruikt als lichtgevoelige transducers om niet-genetische, op materiaal gebaseerde lichtgemedieerde stimulatietechnieken te ontwikkelen 9,10. Organische nanogestructureerde fototransducers 11,12,13,14,15 hebben onlangs opmerkelijk succes aangetoond bij het op gang brengen van cellulaire reacties in diverse toepassingen, waaronder neuronen, cardiomyocyten en skeletspiercellen.

Hierin stellen we Ziapin216,17,18 voor, een azobenzeenderivaat, voor het onderzoeken van de voortplanting van Ca2+ in gemanipuleerde laminaire hartweefsels. De amfifiele structuur van het molecuul zorgt voor een nauwkeurige targeting van het plasmamembraan van de cel, terwijl de azobenzeenkern door licht geïnduceerde isomerisatie mogelijk maakt, wat leidt tot de conformatieverandering 16,17,18. In hartcellen verandert deze trans-naar-cis-isomerisatie de dikte van het plasmamembraan, waardoor een cascade van effecten wordt geïnduceerd die een actiepotentiaal genereert, die op zijn beurt het excitatie-contractieproces op gang brengt 19,20,21.

Daarnaast beschrijven we het fabricageproces van een gemanipuleerd platform voor de anisotrope groei van hartweefsel22 en beschrijven we de experimentele opstelling die wordt gebruikt voor het optisch triggeren en monitoren van de activiteit ervan, met een bijzondere focus op het verkrijgen van Ca2+-dynamiek binnen het weefsel23,24. Ten slotte vergelijken we de verkregen signalen met de signalen die worden verkregen via elektrische stimulatie, die als de referentiestandaard wordt beschouwd. Over het algemeen benadrukt dit protocol de toepassing van een nieuwe lichtresponsieve transducer bij het vergroten van ons begrip van cardiaal cellulair gedrag, vooral in de context van gemanipuleerde weefsels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gebruikte cultuur van menselijke pluripotente stamcellen (hiPSC) is een wildtype menselijke mannelijke iPSC-lijn die een doxycycline (Dox)-induceerbaar CRISPR/Cas9-systeem herbergt, gemaakt door CAGrtTA::TetO-Cas9 in de AAVS1-locus te introduceren (Addgene: #73500). De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Boston Children's Hospital Institutional Review Board. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten voorafgaand aan hun deelname aan het onderzoek. De generatie van hiPSC-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) werd geïnduceerd zoals eerder beschreven25,26. Het protocol wordt kort samengevat in het volgende gedeelte:

1. Generatie en bereiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

  1. Was hiPSC's die worden gekweekt in T75-kolven één keer met PBS. Maak de cellen los door ze 10-15 minuten te incuberen met het chelaatvormer Versene en zaai ze in bioreactorvaten die zijn voorbehandeld met 1% oplossing van niet-ionische oppervlakteactieve stof met een dichtheid van 50 miljoen IPSC's/vat in 100 ml E8-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y-27632.
  2. Stel de volgende bioreactorparameters in: agitatie 60 tpm, temperatuur 37 °C, pH 7 en overlay-begassing (O2 en CO2) bij 3 standaard L/h.
  3. Bevestig na 1 dag in kweek dat de diameter van het embryoïde lichaam (EB) 100-300 μm heeft bereikt en behandel de cellen met basisch RPMI-medium (RPMI 1640-medium aangevuld met B27 minus insuline), dat 7 μM CHIR99021 gedurende 24 uur bevat, gevolgd door mediaverandering naar RPMI gedurende nog eens 24 uur. Voeg basisch RPMI-medium met 5 μM IWR-1-endo toe gedurende nog eens 48 uur om het differentiatieproces naar de cardiale lijn te starten. Verander na 48 uur het medium terug naar de basis RPMI.
  4. Op dag 7 van de differentiatie worden cellen gekweekt in een basisch RPMI-medium aangevuld met 1:1.000 (v/v) humane insuline. Vernieuw de media elke 2 dagen of elke dag met een mediumverandering van 50% als het zuurstofverbruik meer dan 30% bereikt.
  5. Dissocieer op dag 15 de bioreactorcellen enzymatisch gedurende 3 uur met behulp van een Collagenase II-oplossing die HBSS, Collagenase II (200 eenheden/ml), HEPES (10 mM), ROCK-remmer Y-27632 (10 μM) en N-benzyl-p-tolueensulfonamide (BTS, 30 μM) bevat. Was hiervoor eerst de gedifferentieerde hiPSC-CM EB's 2x met voorverwarmde HBSS en incubeer ze in Collagenase II-oplossing (200 μl volume EB's / 12 ml Collagenase II-oplossing) bij 37 °C in 5% CO2 totdat er afzonderlijke cellen verschijnen uit volledige EB-dissociatie.
  6. Stop de dissociatiereactie door een gelijk volume blokkeerbuffer (RPMI-1640 zonder B27 en DNase II, met 6 μL DNase II per ml RPMI-1640) toe te voegen aan de eencellige suspensie. Tel de gedifferentieerde hiPSC-CM's, centrifugeer (200 × g, 5 min) en bereid je voor op stroomafwaartse toepassingen door de cellen gedurende 24 uur bij -80 °C in isopropanol te bevriezen en ze naar tanks met vloeibare stikstof te verplaatsen totdat het zaaien is uitgevoerd.

2. Geconstrueerde laminaire weefselfabricage

  1. Plak twee lagen laboratoriumtape, een witte en een blauwe, op een 1 mm dikke heldere, kras- en UV-bestendige acrylplaat. Snijd met behulp van een CO2 -lasergraveerder de acrylplaat in cirkels (20 mm diameter voor de 12 MW) en het chippatroon (3 x 7,5 mm vierkanten, drie per chip) op de tape zoals ontworpen in vector grafische software (bijv. CorelDraw); snijparameters voor acryl: 100 vermogen, 20 snelheid en 1,000 PPI; parameters voor het snijden van tape: 8 vermogen, 6 snelheid en 1,000 PPI. Verwijder de twee lagen tape in de binnenste lijn met een pincet, week de chips 30 minuten tot 1 uur in puur bleekmiddel om dikke lijnen en donkere vlekken van het snijden te verwijderen, zodat er een scherpe lijn overblijft, en spoel de chips een nacht of ten minste 3 uur af in een bekerglas met stromend gedeïoniseerd (DI) water.
    OPMERKING: Niet langer dan 2 uur bleken, omdat hierdoor de lijm op de zijwanden wordt geëtst, waardoor gelatine niet goed kan hechten.
  2. Sonificeer de spanen gedurende 10 minuten en de polydimethylsiloxaan (PDMS, Sylgard 184) stempels met lijngroefkenmerken (25 μm nokbreedte, 4 μm groefbreedte en 5 μm groefdiepte) gedurende 30 minuten in schone 70% ethanol. Breng de chips en stempels over op een schone plek onder een kap en laat ze ~1-2 uur drogen onder een luchtstroom.
  3. Weeg 1 g gelatine van varkenshuid (gelsterkte ~175 g Bloom, Type A) af in een tube van 50 ml. Voeg 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en meng grondig om ervoor te zorgen dat de gelatine onmiddellijk oplost. Plaats de buis gedurende 30 minuten in een waterbad van 65 °C om het oplosproces te voltooien. Weeg op dezelfde manier 1 g microbiële transglutaminase (MTG) af in een aparte buis van 50 ml. Voeg 12,5 ml PBS toe, meng grondig en plaats de tube gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C om ervoor te zorgen dat de MTG volledig is opgelost.
  4. Sonificeer de gelatinebuis gedurende 15 minuten en doe hem voor gebruik terug in het waterbad van 65 °C. Plaats de MTG-buis in een exsiccator met de dop iets los en zet de stofzuiger langzaam aan. Observeer hoe de bubbels onder vacuüm uit de MTG-oplossing worden verwijderd. Na het ontgassen plaatst u de MTG-buis terug in het waterbad van 37 °C.
    NOTITIE: Bewaak het proces en pas het vacuüm aan om krachtig koken te voorkomen.
  5. Bedek een rastervel met schone parafilm, leg de fiches op het rooster en houd de stempel in de buurt, klaar voor gebruik. Voeg 5 ml MTG toe aan de 5 ml gelatineoplossing en pipuleer voorzichtig om luchtbellen te voorkomen; pipetteer vervolgens snel de gelatine op de chip en gebruik voldoende om het chipgebied te bedekken (ongeveer 0,5 ml elk). Plaats vervolgens de PDMS22 (lijnbreedte 25 μm, hoogte 5 μm, afstand 4 μm) stempel met lijnpatroon erop en breng een gewicht van 200 g aan om ervoor te zorgen dat de gelatine evenwijdig aan de lengteas van het weefsel wordt gevormd. Zodra alle chips zijn gevormd, bedek je ze met een glazen pot om verstoring van het milieu te voorkomen en laat je ze een nacht verknopen.
    OPMERKING: Gebruik de gemengde oplossing gelatine-MTG binnen 5 minuten; Anders zal het doelpatroon worden gewijzigd als gevolg van een hogere verknoopte toestand van de gelatine.
  6. Breng de sandwich met chip en PDMS-stempel over op een nieuwe P150-schaal gevuld met PBS en hydrateer de gelatine gedurende 30 minuten tot 1 uur om de scheiding van de PDMS-stempel van de chip te vergemakkelijken. Verwijder overtollige niet-gevormde gelatine rond de chip en breng de schone chip over naar een nieuwe P150-schaal gevuld met PBS. Bewaar de PDMS-stempels in 70% ethanol.
  7. Steriliseer de chips door ze 10 minuten onder de kap in ethanol te laten weken.
    OPMERKING: Niet langer dan 10 minuten in ethanol gebruiken, omdat langere blootstelling de gelatine kan vervormen.
  8. Breng de frites over naar PBS, laat ze 10 minuten weken en spoel ze 3x af. Bereid coatingoplossingen voor door 20 μg/ml fibronectine te mengen met 1:100 verdunde basaalmembraanmatrix in kweekmedia (ongeveer 0,5 ml per putje). Dek de snippers gedurende 2 uur in de broedmachine in met een temperatuur van 37 °C en 5% CO2 of een nacht met 4 °C.
  9. Ontdooi- en zaadcellen (8 × 105 hiPSC-CM's per cm2) in RPMI-medium met Y-27632 (10 μM) en vervang deze vervolgens na 24 uur door RPMI zonder Y-27632.
  10. Drie dagen na het zaaien van de cellen verwijdert u de witte tape met een pincet.

3. Synthese en toepassing van de fototransducer

OPMERKING: Ziapin2 werd gesynthetiseerd volgens een eerder gepubliceerde procedure16,18 en werd rechtstreeks in het kweekmedium toegediend aan hiPSC-CM's.

  1. Voeg 25 μM Ziapin2 toe aan de celcultuur en incubeer gedurende 7 minuten bij 37 °C en 5% CO2 .
  2. Was overtollige moleculen voorzichtig uit en spoel af met vers kweekmedium.

4. Levensvatbaarheidstest

OPMERKING: Alamar Blue is een op resazurine gebaseerde test die cellen kan doordringen en kan fungeren als een redoxindicator om de levensvatbaarheid van cellen te bewaken. Resazurine lost op in fysiologische buffers, wat resulteert in een diepblauwe oplossing die rechtstreeks aan cellen in cultuur wordt toegevoegd. Levensvatbare cellen met een actief metabolisme reduceren resazurine tot resofurine, dat roze en fluorescerend is.

  1. Plaatcellen in een plaat met 96 putjes die eerder was gecoat met 20 μg/ml fibronectine en 1:100 verdunde basaalmembraanmatrix in kweekmedia. Meng door te schudden en voeg vervolgens aseptisch Alamar Blue toe aan elk putje in een hoeveelheid die gelijk is aan 10% van het putvolume.
  2. Incubeer culturen met Alamar Blue gedurende 4 uur.
  3. Behandel cellen met de fototransducer en het medium (DMSO) zoals eerder beschreven. Pas lichtstimulatie toe (1 Hz gepulseerd licht gedurende 1 minuut) door een optische vezel (cyaan, 470 nm) om het effect van Ziapin2-internalisatie en blootstelling aan licht op de levensvatbaarheid van hiPSC-CM te beoordelen.
  4. Lees fluorescentie af met een plaatlezer bij excitatie 560 nm en emissie 590 nm.

5. Beoordeling van gemanipuleerde anisotropie van laminair hartweefsel

OPMERKING: Dit protocol schetst een systematische benadering voor het beoordelen van de anisotropie van gemanipuleerd laminair hartweefsel met behulp van immunokleuring, confocale microscopie en kernanalyse27.

  1. Was de ondergrond meerdere keren met PBS alvorens gedurende 10 minuten te fixeren met 4% (v/v) paraformaldehyde met 0,05% (v/v) Triton X-100 in PBS.
  2. Blokkeer niet-specifieke binding door monsters te incuberen met 5% (m/v) runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 30 minuten.
  3. Incubeer de monsters met Hoechst (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Was met PBS voordat u ze op microscoopglaasjes monteert met een anti-vervagingsmiddel. Laat de glaasjes een nacht drogen en bewaar ze bij 4 °C tot ze beeldvorming zijn.
  5. Beeldmonsters met behulp van een confocale microscoop met een draaiende schijf bij een vergroting van 20x. Bepaal de oriëntatie van de cellen met behulp van OrientationJ Measure28, een FiJi-plug-in.

6. Optische mapping-opnames

OPMERKING: Optische kartering werd uitgevoerd na 5 dagen in cultuur op hiPSC-CM's gezaaid op gelatine-gegoten weefselchips.

  1. Om dit protocol te volgen, moet u ervoor zorgen dat het optische mappingapparaat bestaat uit een gemodificeerde microscoop met tandemlens die is uitgerust met een hogesnelheidscamera en de excitatielichtbron, een kwiklamp van 200 mW. Plaats een dichroïsche spiegel voor de aangewezen Ca2+ beeldcamera om ervoor te zorgen dat het preparaat wordt blootgesteld aan excitatielicht en om de uitgezonden fluorescentie van het monster op te vangen.
  2. Incubeer het monster met 2 μM X-Rhod 1 toegevoegd aan het kweekmedium gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Stel het monster alleen bloot aan licht tijdens het verkrijgen van de afbeelding om fotobleken van de kleurstof te voorkomen.
  3. Incubeer de fototrasducer zoals eerder beschreven in hoofdstuk 3.
  4. Was met vers kweekmedium en breng de chips over naar fenolroodvrij RPMI 1640 medium aangevuld met B27 minus insuline.
  5. Plaats de weefselchips in een schaal met temperatuurregeling en begin met opnemen bij fysiologische temperatuur (37 °C), waarbij beelden worden verkregen met een framesnelheid van 2.5 frames/s.
  6. Breng voor optische stimulatie de optische puntstimulatie aan het ene uiteinde van het weefsel aan met behulp van een LED-lichtbron (465/25 nm) waardoor Ziapin2-stimulatie mogelijk is. Breng de weefsels op een frequentie van 0,5 of 1 Hz via een tijdelijk gereguleerde optische vezel die op 1 mm afstand van het weefsel is geplaatst. Pas voor elektrische stimulatie een puntstimulatie toe met behulp van een bipolaire platina-elektrode die in het midden van het meest distale uiteinde van het rechthoekige weefsel is geplaatst. Deze plaatsing zorgt ervoor dat de voortplanting van de Ca2+ -golf afkomstig is van het middelpunt van de breedte van het weefsel, wat overeenkomt met de kortere zijde van de rechthoek. De stimulatie moet worden toegepast met een frequentie van 0,5 Hz, met een amplitude van 10 V en een pulsduur van 100 ms.
  7. Pas na de opnames een ruimtelijk filter toe met een pixelgrootte van 3 x 3 om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
  8. Bepaal de Ca2+ golfgeleidingssnelheid bij elke pixel voor elke puls en bereken de veranderingssnelheid langs zowel de x- als de y-richting. Om dit te doen, meet u de ruimtelijke gradiënt van de Ca2+ signaalintensiteit in deze richtingen en relateert u deze aan de tijdsvertraging van de voortplanting van het signaal. Door deze richtingsveranderingssnelheden te combineren, kwantificeert u hoe snel de golf in beide dimensies door het cellulaire veld reist.

7. Gegevensexport en -verwerking

  1. Extraheer en analyseer de gegevens met de software waarnaar wordt verwezen.
  2. Pas een ruimtelijk filter van 3 x 3 pixels toe om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
  3. Extraheer de Ca2+ transiëntensporen (CaT) als het gemiddelde van een specifieke, handmatig geselecteerde interesseregio (ROI).
  4. Meet de CaT-parameters in een centraal interessegebied (ROI) van 50 x 50 pixels (≈ 25 mm2).
  5. Analyseer voor elke CaT amplitude, stijgtijd (t-piek), tijd van maximale vervalhelling (Max Decay Slope) en tijd tot 90% voorbijgaand verval (Decay Time90).

8. Statistische analyse

  1. Beoordeel de normaliteit van de verdeling met behulp van een geschikte statistische test, zoals een normaliteitstest, om te bepalen of parametrische of niet-parametrische methoden moeten worden toegepast.
  2. Evalueer de statistische significantie tussen twee condities met behulp van de Student's t-test of Mann-Whitney U-test voor respectievelijk continue of categorische gegevens. Gebruik bij het vergelijken van meer dan twee groepen eenrichtings-ANOVA of de Kruskal-Wallis-test, afhankelijk van de gegevensaannames, gevolgd door geschikte post-hoctests om significante paarsgewijze verschillen te identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd een meerstappenproces ontwikkeld en geïmplementeerd voor de fabricage van gemanipuleerd laminair hartweefsel met behulp van een combinatie van laserpatronen, gelatinegieten en celzaaitechnieken. Oorspronkelijk ontwikkeld door McCain et al.22 en Lee et al.24, werd deze techniek opnieuw geïmplementeerd, volgens hun protocollen om de gemanipuleerde laminaire microweefsels te construeren. Het proces integreert nauwkeurige lasergebaseerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze benadering biedt een robuust platform voor het bevorderen van cardiaal onderzoek, dat inzicht biedt in de complexe dynamiek van hartweefsel, wat nieuwe mogelijkheden biedt voor in vitro cardiale mechanistische studies op lange termijn die mogelijk kunnen leiden tot nieuwe therapeutische strategieën. Om het succes van deze methodologie te garanderen, is het van cruciaal belang om een microfysiologische omgeving te reproduceren die in vivo de omstandigheden van het m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CB, GL en FL zijn uitvinders van "PHOTOCHROMIC COMPOUNDS" Patent No. EP 3802491 (02/07/2020).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Michael Rosnach voor de illustraties in Figuur 1 en Figuur 3, en Prof. William T. Pu voor de levering van hiPSC. Dit werk werd ondersteund door het NCATS Tissue Chips Consortium (UH3 TR003279) aan KKP, het Italiaanse Ministerie van Universiteiten en Onderzoek via het PRIN 2022-project (ID 2022-NAZ-0595) aan FL, het PRIN 2020-project (ID 2020XBFEMS) aan CB en GL, en het Fondo Italiano per la Scienza project (ID FIS00001244) aan GL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
alamarBlue Cell Viability ReagentThermo Fisher ScientificDAL1025Cellebensvatbaarheidstest
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601Voor celkweek
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9056-50GVoor celkleuring
BrainVision Analyzer software Brain Productshttps://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/Gegevensexport en -verwerking
BTSSigma203895-5MG
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
Clear Scratch- and UV-Resistant Acrylic Sheet, 12" x 12" x 0.01 inchMcMaster Carr4076N11Fabricage van weefselchip
Collagenase Type II WorthingtonCLS-2 / LS004176
DNase IIVWR89346-540
Essential 8 Medium Thermo Fisher ScientificA1517001Voor celkweek
FibronectinVWR47743-654Bekleding
Gelatin from porcine skin gel strength 175 Type ASigma-AldrichG2625-100GFabricage van weefselchip
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413302Bekleding
HBSS Thermo Fisher14175-095
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
Hoechst 33342 Life technologiesH1399Voor celkleuring
Insulin solution humanSigma AldrichI9278-5ML
IWR-1-endoStem Cell Technologies72564
Paraformadehyde 16% Aqueous Solution (PFA)VWR100503-917Voor celkleuring
PBS, steriel, 500 mLThermo Fisher Scientific10010049Fabricage van weefselchip
phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010049
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)Thermo Fisher ScientificP3000MPNiet-ionogene oppervlakteactieve stof
ROCK inhibitor Y-27632Stem Cell Technologies72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific61870127Voor celkweek
RPMI 1640 Medium, no phenol redThermo Fisher Scientific11835030Optische mapping
Versene SolutionThermo Fisher Scientific15040066chelating agent
VWR General-Purpose Laboratory Labeling TapeVWR89098-058Fabricage van weefselchip
X-Rhod-1 AMThermo Fisher ScientificX14210Optische mapping

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Maria, F., Lodola, F., Zucchetti, E., Benfenati, F., Lanzani, G. The evolution of artificial light actuators in living systems: from planar to nanostructured interfaces. Chem Soc Rev. 47 (13), 4757-4780 (2018).
  2. Manfredi, G., et al. The physics of plasma membrane photostimulation. APL Mater. 9 (3), 030901(2021).
  3. Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int J Nanomed. 9 Suppl 1 (Suppl 1), 65-83 (2014).
  4. Ford, S. M., Watanabe, M., Jenkins, M. W. A review of optical pacing with infrared light. J. Neural Eng. 15 (1), 011001(2018).
  5. Antognazza, M. R., et al. Shedding light on living cells. Adv Mater. 27 (46), 7662-7669 (2015).
  6. Zhang, J., Wang, J., Tian, H. Taking orders from light: progress in photochromic bio-materials. Mater Horiz. 1 (2), 169-184 (2014).
  7. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  8. Ambrosi, C. M., Entcheva, E. Optogenetics' promise: pacing and cardioversion by light. Future Cardiol. 10 (1), 1-4 (2014).
  9. Hopkins, J., et al. Photoactive organic substrates for cell stimulation: Progress and perspectives. Adv Mater Technol. 4 (5), 1800744(2019).
  10. Vurro, V., Venturino, I., Lanzani, G. A perspective on the use of light as a driving element for bio-hybrid actuation. Appl Phys Lett. 120 (8), 080502(2022).
  11. Bruno, G., et al. All-optical and label-free stimulation of action potentials in neurons and cardiomyocytes by plasmonic porous metamaterials. Adv Sci. 8 (21), 2100627(2021).
  12. Ronchi, C., et al. Nongenetic optical modulation of pluripotent stem cells derived cardiomyocytes function in the red spectral range. Adv Sci. 11 (3), 2304303(2023).
  13. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  14. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nat Protoc. 14 (5), 1339-1376 (2019).
  15. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  16. DiFrancesco, M. L., et al. Neuronal firing modulation by a membrane-targeted photoswitch. Nat Nanotechnol. 15 (4), 296-306 (2020).
  17. Paternò, G. M., et al. Membrane environment enables ultrafast isomerization of amphiphilic azobenzene. Adv Sci. 7 (8), 1903241(2020).
  18. Vurro, V., et al. Molecular design of amphiphilic plasma membrane-targeted azobenzenes for nongenetic optical stimulation. Front Mater. 7, 631567(2021).
  19. Vurro, V., et al. Optical modulation of excitation-contraction coupling in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. iScience. 26 (3), 106121(2023).
  20. Vurro, V., et al. Light-triggered cardiac microphysiological model. APL Bioeng. 7 (2), 026108(2023).
  21. Florindi, C., et al. Role of stretch-activated channels in light-generated action potentials mediated by an intramembrane molecular photoswitch. J. Transl. Med. 22 (1), 1068(2024).
  22. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
  23. Park, S. -J., et al. Insights into the pathogenesis of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia from engineered human heart tissue. Circulation. 140 (5), 390-404 (2019).
  24. Lee, K. Y., et al. An autonomously swimming biohybrid fish designed with human cardiac biophysics. Science. 375 (6581), 639-647 (2022).
  25. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  26. Prondzynski, M., et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 15 (1), 5929(2024).
  27. Pasqualini, F. S., Sheehy, S. P., Agarwal, A., Aratyn-Schaus, Y., Parker, K. K. Structural phenotyping of stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Rep. 4 (3), 340-347 (2015).
  28. Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40 (7), 2552-2556 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Calciumpropagatiemateriaalkundige fotostimulatiehumane cardiomyocytenfototransducer Ziapin2calciumimagingoptische mappingniet invasieve stimulatie3D bioreactorkweek

Gerelateerde artikelen