Methodenartikel

Onderzoek naar interacties tussen myeloïde cellen en CAR T-cellen in vitro en in vivo

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68013

⸱

25 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

In dit artikel

Samenvatting

Gezien de beperkte xenotransplantaatmodellen die beschikbaar zijn om interacties tussen menselijke CART- en myeloïde cellen te bestuderen, hebben we in vitro en in vivo modellen opgesteld om de effecten van menselijke macrofagen op CART-cellen te begrijpen. Bevindingen kunnen mogelijk worden gegeneraliseerd om de rol van macrofagen in de micro-omgeving van de tumor te evalueren en macrofaaggerichte immunotherapieën te testen.

Samenvatting

Chimere antigeenreceptor T (CART)-celtherapie heeft geleid tot opmerkelijke klinische successen bij de behandeling van hematologische maligniteiten. De meeste patiënten vallen echter binnen 1-2 jaar terug. Er zijn verschillende mechanismen geïdentificeerd die leiden tot CART-resistentie, waaronder remming van T-cellen door immunosuppressieve myeloïde cellen. Groeiend bewijs heeft aangetoond dat monocyten en macrofagen in de micro-omgeving van de tumor (TME) bijdragen aan slechte CART-prestaties en klinische resultaten. Preklinische modellen om interacties tussen menselijke macrofagen en CART-cellen te bestuderen zijn beperkt. Hier bespreken we benaderingen om de effecten van menselijke macrofagen op CART-cellen te begrijpen, zowel in vitro als in vivo. We beschrijven in vitro cocultuurmodellen om aan te tonen dat immunosuppressieve macrofagen CART-functies remmen. Daarnaast rapporteren we een xenotransplantaatmodel waarbij menselijke macrofagen en tumorcellen subcutaan worden geënt in NSG-muizen om M2-achtige macrofaaginteracties met CART-cellen en tumorcellen te bestuderen. Deze modellen kunnen worden gebruikt om de rol van macrofagen in de TME te evalueren en om macrofaaggerichte kankerimmunotherapieën te testen.

Inleiding

Autologe chimere antigeenreceptor T (CART)-celtherapie heeft klinische successen geboekt bij de behandeling van recidiverende of refractaire hematologische maligniteiten, wat heeft geleid tot de goedkeuring door de Amerikaanse FDA van zes CART-producten gericht op CD19- of B-celrijpingsantigeen (BCMA)1. Ondanks de indrukwekkende initiële activiteit van CART-celtherapie, vallen de meeste patiënten terug binnen de eerste 1-2 jaar na behandeling2. Er zijn verschillende mechanismen van CART-resistentie geïdentificeerd, waaronder suboptimale T-celfitness, antigeenontsnapping en slechte CART-persistentie, evenals remming gemedieerd door de immunosuppressieve tumormicro-omgeving (TME)2,3. Myeloïde cellen, zoals monocyten en macrofagen, vormen vaak een aanzienlijk deel van de TME en er is aangetoond dat ze belangrijke remmers zijn van andere immuuncellen, waaronder T-cellen 4,5. De schadelijke effecten van myeloïde cellen in de context van de therapeutische werkzaamheid van CART-cellen zijn gerapporteerd in preklinische modellen en in klinische onderzoeken met zowel hematologische als solide tumoren 3,6. Myeloïde-gemedieerde remming kan optreden vanaf het begin van het CART-productieproces - het is aangetoond dat monocyten in het startafereseproduct ex vivo CART-expansie remmen 7,8. Gezien het toenemende bewijs van myeloïde-gemedieerde CART-remming, hebben veel onderzoeken erop gericht CART-cellen te manipuleren om immunosuppressieve macrofagen in TME aan te pakken en te elimineren voor betere immuunresponsen5. De mechanismen achter interacties tussen CART-cellen en immunosuppressieve macrofagen zijn echter nog steeds niet volledig opgehelderd. Bovendien zijn er beperkte openbaar beschikbare xenotransplantaatmodellen van deze interacties. Daarom is er dringend behoefte aan modellen die interacties tussen menselijke macrofagen en CART-cellen bestuderen, zowel in vitro als in muismodellen.

Hier beschrijven we een methode waarbij menselijke CD19-gerichte CART (CART19) cellen worden gecocultureerd met CD19+ tumorcellen en ex vivo gepolariseerde M2-achtige macrofagen. Daarnaast rapporteren we een xenotransplantaatmuismodel waarin immunodeficiënte muizen subcutaan worden geënt met zowel doelwitcellen als menselijke macrofagen, waardoor immunotherapieën die van belang zijn kunnen worden geëvalueerd in een setting met immunosuppressieve macrofagen. Specifiek analyseerden we CART-antigeenspecifieke proliferatie in de aan- of afwezigheid van immunosuppressieve macrofagen in vitro, waarbij een significante remming van T-celexpansie in zowel transwell- als directe co-cultuurplaten werd aangetoond. In ons xenotransplantaatmodel werden NSG-muizen subcutaan geënt met tumorcellen en menselijke macrofagen gesuspendeerd in Matrigel voor therapiescreening. Dit diermodel toonde met succes aan dat ex vivo gedifferentieerde immunosuppressieve menselijke macrofagen in staat waren om tumorprogressie bij NSG-muizen te bevorderen. Door dit protocol te volgen, kan de werkzaamheid van immunosuppressieve macrofaaggerichte therapieën worden getest, inclusief die van geneesmiddelen met kleine moleculen, biologische geneesmiddelen en andere op cellen gebaseerde therapieën. Vanwege de beperkingen van het gebruik van immunodeficiënte muizen om de menselijke TME te bestuderen, zijn de voorgestelde modellen echter het meest geschikt voor proof-of-concept-studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderstaande protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB), de Institutional Biosafety Committee (IBC) en het Department of Comparative Medicine van Mayo Clinic onder protocol A00001767 van de Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparaat van menselijke klassieke monocyten voor in vitro onderzoek

  1. Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van gezonde bloeddonoren zoals eerder beschreven9. Kort gezegd, verdun volbloed met 2% FBS in PBS met een volumeverhouding van 1:1, gevolgd door PBMC-isolatie in dichtheidsgradiëntmedium.
  2. Isoleer menselijke klassieke monocyten (CD14+CD16-) van geoogste PBMC's door negatieve magnetische kralenselectie volgens de instructies van de fabrikant (Materiaaltabel). Was kort het juiste aantal PBMC's met isolatiebuffer en suspendeer de cellen in het aangegeven volume volgens de instructies van de fabrikant. Label cellen, behalve klassieke monocyten, met een antilichaamcocktail en magnetische microbeads. Verzamel klassieke monocyten uit de doorstroom, met behoud van niet-monocyten in de kolommen.
    OPMERKING: Ga ervan uit dat 5% van de hele PBMC's klassieke monocyten zijn en pas het startcelaantal PBMC's dienovereenkomstig aan. Bewaar de resterende PBMC's voor bevestiging van de zuiverheid van de monocytenpopulatie in stap 1.7. Klassieke monocyten moeten altijd worden geïsoleerd uit verse PBMC's zonder voorafgaande cryopreservatie.
  3. Tel het aantal geïsoleerde monocyten met behulp van een cellenteller (Materiaaltabel) en laat de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g bij 4 °C draaien. Resuspendeer de cellen in de celisolatiebuffer om 1 x 106 cellen/ml als eindconcentratie te bereiken. Neem 100 μL celsuspensie en breng over naar een plaat met 96 putjes met platte bodem.
  4. Breng 1 x 105 PBMC's over op dezelfde plaat als een negatieve poortcontrole om de zuiverheid van de klassieke monocytenpopulatie te bevestigen door middel van flowcytometrie. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Houd geïsoleerde monocyten op ijs tijdens stap 1.5-1.12.
  5. Spoel de cellen door ze opnieuw te suspenderen met 200 μl FACS-buffer en draai de cellen gedurende 3 minuten op 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig.
  6. Bereid voor elk monster 50 μL FACS-buffer met 0,3 μL levend/dood reagens (excitatie bij 405 nm), 0,5 μL APC-geconjugeerde anti-menselijkeCD14 10 (1 ng/μL) en 0,5 μL PE-geconjugeerde anti-menselijke CD1611 (1 ng/μL; Tabel met materialen).
    OPMERKING: Om de kleuring consistent te houden, maakt u een mastermix voor meerdere monsters op basis van het totale monsteraantal. Breng 50 μL kleuroplossing over in elk putje.
  7. Voeg 50 μL kleuroplossing toe aan elk putje en meng de cellen voorzichtig om luchtbellen te voorkomen. Incubeer cellen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  8. Voeg 200 μL FACS-buffer toe aan elk putje en draai de cellen gedurende 3 minuten bij 300 x g bij 4 °C naar beneden. Decanteer supernatanten zorgvuldig.
  9. Spoel door 200 μL FACS-buffer toe te voegen aan elk putje en draai de cellen gedurende 3 minuten op 300 x g bij 4 °C naar beneden. Decanteer supernatanten zorgvuldig en suspendeer de cellen in 200 μL FACS-buffer. Voer monsters uit op een flowcytometer (Materials Tables).
  10. Gate CD14+CD16- bevolking. Zorg ervoor dat de CD14+CD16-populatie meer dan 90% van de levende cellen bevat voor een ideale zuiverheid. Gate CD14+CD16- populatie van levende singlets.
    OPMERKING: Er wordt aangenomen dat gebruikers bekend zijn met flowcytometrie-analyse.

2. M0-macrofaagdifferentiatie van menselijke klassieke monocyten

OPMERKING: M2-achtige macrofaagdifferentiatie van menselijke klassieke monocyten is een bewerking van een eerdere publicatie12.

  1. Centrifugeer geïsoleerde monocyten bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op. Resuspendeer cellen in celkweekmedia om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml te bereiken.
  2. Voeg humaan recombinant GM-CSF toe om een eindconcentratie van 10 ng/ml te bereiken (materiaaltabel) en meng goed. Breng 100 μL cellen over in een met weefselkweek behandelde plaat met 48 putjes en voeg nog eens 50 μL celkweekmedia toe. Zorg ervoor dat elke conditie 3 replica's heeft voor de uiteindelijke uitlezing op dag 11.
    OPMERKING: Gebruikers kunnen dienovereenkomstig meer experimentgroepen toevoegen. Dit protocol omvat alleen experimentele coculturen van tumorcellen en T-cellen met of zonder M2-achtige macrofagen (Tabel 1).
  3. Breng 100 μL cellen over naar een andere plaat met 48 putjes en voeg nog eens 50 μL celkweekmedia toe voor fenotypering van macrofagen. Zorg ervoor dat je er een opneemt voor fenotypering van M0-macrofagen en een voor fenotypering van M2-achtige macrofagen.
  4. Voeg 200 μL PBS toe aan de omliggende putjes om verdamping van de celcultuur te voorkomen. Incubeer monocyten bij 37 °C gedurende 7 dagen om cellen te differentiëren tot M0-macrofagen.
  5. Om interacties tussen gedifferentieerde macrofagen en donor-gematchte CART19-cellen te bestuderen, isoleert u 1 x 107 T-cellen uit de PBMC's van dezelfde donor en genereert u CART19-cellen na een 8-daagse CART-productieprocedure zoals eerder beschreven 9,13,14.
    OPMERKING: CART-cellen gecostimuleerd met CD28-signaleringsdomein worden gegenereerd uit 5 x 106 T-cellen zoals eerder beschreven 9,13,14. Tegelijkertijd worden niet-getransduceerde (UTD) T-cellen gegenereerd volgens hetzelfde proces 9,13,14. UTD T-cellen zullen worden gebruikt als negatieve controle in de T-celproliferatie om te controleren op allogene proliferatie.

3. M2-achtige macrofaagdifferentiatie van M0-macrofagen door cocultuur met doelcellen

  1. Neem op dag 7 de plaat met 48 putjes met M0-macrofagen en incubeer deze minimaal 30 minuten op ijs. Piketcellen constant krachtig terwijl u de plaat op ijs houdt.
    OPMERKING: De duur van de ijsincubatie hangt af van hoe hechtend macrofagen zijn, wat kan verschillen als gevolg van donorvariatie. De eerste menging is het verzamelen van losjes aanhangende macrofagen, dus een pipetteren van 5 minuten zou voldoende moeten zijn.
  2. Breng de losgemaakte cellen over in een verse conische buis van 15 ml (materiaaltabel) die vooraf op ijs is gekoeld. Voeg 200 μL ijskoude PBS toe aan de putjes van de plaat met 48 putjes en pipetteer de resterende cellen elke 10 minuten krachtig totdat de meeste macrofagen van de bodem zijn losgekomen. Controleer na elk pipetteren de cellen onder een microscoop en pas de incubatietijd van het ijs zo nodig aan, met langere incubatietijden voor cellen die meer hechten.
  3. Breng de resterende losgemaakte M0-macrofagen over in de conische buis van 15 ml op ijs. Meng de cellen voorzichtig en tel de cellen op een cellenteller.
  4. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op. Resuspendeer in ijskoude PBS om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml te bereiken.
  5. Breng 200 μL cellen over op een plaat met 96 putjes met platte bodem (Materiaaltabellen). Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig. Voeg als negatieve poortcontrole een extra goed gekleurd met alleen markeringen van de ouderpopulatie toe.
  6. Voeg aan elk monster 100 μL FACS-buffer toe, aangevuld met 1 μL Fc-receptorblokkerende oplossing. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig.
    OPMERKING: Het is belangrijk om macrofagen vóór te incuberen met Fc-receptorblokkerende buffer voorafgaand aan de daadwerkelijke markerkleuring om vals-positieve resultaten te voorkomen.
  7. Bereid voor de monsterput 50 μL FACS-buffer met 0,3 μL levend/dood reagens (excitatie bij 405 nm), 0,5 μL APC-geconjugeerde anti-menselijke CD1410 (1 ng/μL), 0,5 μL APC/Cy7-geconjugeerde anti-menselijke CD20615 (2 ng/μL) en 0,5 μL PerCP-geconjugeerde anti-menselijke CD16316 (2 ng/μL; Tabel met materialen). Bereid voor de negatieve poortcontrole 50 μl FACS-buffer voor met 0,3 μl levend/dood reagens en 0,5 μl APC-geconjugeerd antihumaan CD14.
  8. Voeg 50 μL kleuroplossing toe aan elk putje en meng de cellen voorzichtig om luchtbellen te voorkomen. Incubeer cellen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  9. Voeg 200 μL FACS-buffer toe aan elk putje. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig.
  10. Wassen door 200 μL FACS-buffer toe te voegen. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig en suspendeer de cellen in 200 μL FACS-buffer.
  11. Voer monsters uit op een flowcytometer en bepoort de CD14+CD206+CD163+ celpopulatie. Gebruik de expressie van CD163 en CD206 op M0-macrofagen als basislijn voor M2-achtige fenotypes. Populatiemigratie van CD163laag, CD206laag naar CD163hoog of CD206hoog wordt verwacht in M2-achtige macrofagen. De omvang van de bevolkingsverschuiving kan afhankelijk zijn van donoren.
  12. Bereid de tumorcellijn voor en reken op een celteller.
    OPMERKING: Dit protocol gebruikt de niet-adherente CD19+ mantelcellymfoomcellijn, JeKo-1, als doelwit. Andere tumorcellijnen en hun vermogen om M0 te differentiëren tot M2-achtige macrofagen kunnen indien nodig worden getest.
    1. Onderhoud JeKo-1-cellen met de door de leverancier voorgestelde kweekmedia (materiaaltabel) op 1 x 106 cellen/ml in een weefselkweekkolf. Meng de tumorcellen in de kolf en tel ze met een cellenteller.
  13. Centrifugeer de doelcellen gedurende 3 minuten bij 300 x g bij 4 °C en aspireer supernatanten op. Resuspendeer doelcellen met celkweekmedia om een eindconcentratie van 2 x 106 cellen/ml te bereiken.
    OPMERKING: Bereid het juiste aantal tumorcellen voor op basis van het aantal experimentele groepen. Zorg ervoor dat er 2 x 105 doelcellen zijn voor elke M2-achtige macrofaagcocultuurgroep, inclusief de M2-fenotyperingsplaat.
  14. Breng 100 μL tumorcellen over naar M2-achtige macrofaagcocultuurgroepen in de plaat met 48 putjes die op dag 0 is voorbereid en pipetteer voorzichtig om te mengen. Incubeer de cellen nog 24 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Een 2:1 verhouding van JeKo-1: M0 macrofagen is getest op M2-achtige fenotype differentiatie. Andere verhoudingen kunnen indien nodig worden getest.
  15. Plaats op dag 8 een M2-achtige fenotyperingsplaat op ijs, maak de cellen krachtig los en bereid je voor op de fenotypering zoals beschreven in de stappen 3.4-3.11.
    OPMERKING: M2-achtige macrofagen zijn veel aanhankelijker dan M0-macrofagen, dus de behoefte aan een langere ijsincubatie wordt verwacht. Dit protocol gebruikt alleen ijs en ijskoude PBS om macrofagen los te maken om stress op de cellen te minimaliseren.
  16. Combineer de flowcytometriebestanden van de M0-fenotypering vanaf dag 7 met M2-achtige fenotypering. Gate CD206 en CD163 van de CD14+ oudercelpopulatie van de M0-macrofaagsteekproef en pas dezelfde poortstrategie toe op de M2-achtige macrofaagsteekproef om de populatieverschuiving te visualiseren.
  17. Om T-cellen in de coculturen te introduceren, oogsten dag 8 CART19- en UTD T-cellen gegenereerd in stap 2.5 en brengen de cellen over naar conische buisjes van 50 ml. Meng goed met een pipet en tel met een cellenteller.
  18. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en zuig de supernatanten voorzichtig op. Resuspendeer CART- of UTD T-cellen in celkweekmedia om een eindconcentratie van 2 x 106 cellen/ml te bereiken.
  19. Bereid de tumorcellijn voor en tel op de celteller. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C en aspireer de bovenstaande stoffen op.
  20. Resuspendeer tumorcellen met celkweekmedia om de uiteindelijke concentratie van 2 x 106 cellen/ml te bereiken. Breng 100 μL tumorcellen over in cocultuurputten zonder M2-achtige macrofagen (Tabel 1).
  21. Breng 100 μL CART- of UTD-T-cellen over in de juiste cocultuurputten (tabel 1). De uiteindelijke cocultuur met M2-achtige macrofagen moet tumorcellen, T-cellen en macrofagen bevatten in een verhouding van 2:2:1. Gebruik coculturen zonder macrofagen als controles.
  22. Om het uiteindelijke volume consistent te houden over de groepen heen, voegt u nog eens 100 μL celkweekmedia toe aan putjes zonder macrofagen. Incubeer de cellen gedurende 3 dagen bij 37 °C.
    OPMERKING: Als allogene CART-cellen worden gebruikt, moeten gebruikers donor-gematchte UTD-T-cellen in de coculturen opnemen als een goede controle om door allogeniteit geïnduceerde T-celexpansie te detecteren. In dit geval moeten gecryopreserveerde eerder gegenereerde CART- en UTD-T-cellen worden ontdooid en op de juiste manier worden hersteld, gevolgd door ten minste 3-4 uur rust voordat ze aan coculturen worden toegevoegd.

4. Analyse van antigeenspecifieke proliferatie van coculturen

  1. Plaats op dag 11 de cocultuurplaat op ijs en pipetteer de cellen krachtig. Meng de cellen goed en breng de cellen over in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
    OPMERKING: De primaire uitlezing van de coculturen is om de expansie van T-cellen te kwantificeren, dus het loskoppelen van macrofagen is niet nodig, tenzij gebruikers van plan zijn om ook andere markers op macrofagen in hetzelfde paneel te analyseren.
  2. Voeg 200 μL ijskoude PBS toe aan de monsterputjes en pipetteer krachtig. Breng de resterende oplossing over in dezelfde microcentrifugebuisjes.
  3. Controleer putjes onder de microscoop (10x) om er zeker van te zijn dat de suspensiecellen volledig worden geoogst. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op.
  4. Resuspendeer cellen onder alle omstandigheden met 200 μL FACS-buffer en breng ze over naar een plaat met 96 putjes met platte bodem. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig.
  5. Bereid 50 μL FACS-buffer voor met 0,3 μL levend/dood reagens (excitatie bij 405 nm) en 0,5 μL APC-geconjugeerde anti-menselijke CD317 (1 ng/μL; Tabel van materialen) voor elk monsterputje. Voeg 50 μL kleuroplossing toe aan elk putje en meng de cellen voorzichtig met een pipet om luchtbellen te voorkomen.
    OPMERKING: In deze stap zullen er grootcellige pellets zijn. Om er zeker van te zijn dat alle T-cellen worden gekleurd, controleert u de bodem van de plaat om te bevestigen dat er geen celpellets meer zijn na grondig mengen.
  6. Incubeer cellen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Voeg 200 μL FACS-buffer toe aan elk putje. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig.
  7. Wassen door 200 μL FACS-buffer toe te voegen. Draai de cellen 3 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Decanteer supernatanten zorgvuldig en suspendeer de cellen in 200 μL FACS-buffer.
  8. Voer monsters uit op een flowcytometer. Gate CD3+ -cellen en kwantificeer het absolute aantal levende CD3+ -cellen zoals hieronder:
    figure-protocol-1
  9. Maak een grafiek van het absolute aantal CD3+ -cellen in elke toestand met behulp van GraphPad Prism.
    OPMERKING: Coculturen met M2-achtige macrofagen zullen naar verwachting een veel lager absoluut aantal CD3 T-cellen hebben dan omstandigheden bij afwezigheid van M2-achtige macrofagen.

5. Impact van M2-achtige macrofagen op CART-cellen in een transwellsysteem

OPMERKING: Transwell-platen scheiden M2-achtige macrofagen fysiek van gestimuleerde CART-cellen en laten alleen oplosbare moleculen toe tussen de celtypen, waardoor gebruikers de dynamiek van contactonafhankelijke interacties tussen macrofagen en CART-cellen kunnen bestuderen (Figuur 1).

  1. Isoleer 1 x 106 menselijke klassieke monocyten en bevestig de zuiverheid van de populatie door middel van flowcytometrie zoals beschreven in de stappen 1.1-1.10. Centrifugeer 1 x 106 monocyten bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en zuig supernatanten op.
    OPMERKING: Gebruikers willen mogelijk autologe CART- en donor-gematchte UTD-cellen genereren, zoals beschreven in stap 2.5.
  2. Resuspendeer cellen in celkweekmedia om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml te bereiken. Voeg humaan recombinant GM-CSF toe om een eindconcentratie van 10 ng/ml te bereiken en meng goed.
  3. Breng 200 μL geresuspendeerde cellen over in het onderste putje van een transwellplaat met 24 putjes (0,4 μm) met 3 technische replicaten. Voeg een extra 100 μL celkweekmedia toe aan elk putje en zorg ervoor dat de bodem van het putje volledig bedekt is. Voeg 300 μL celkweekmedia toe aan nog eens 3 putjes voor omstandigheden zonder macrofagen (positieve controle).
  4. Voeg 200 μL PBS toe aan de omliggende putjes om verdamping van de celcultuur te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 7 dagen bij 37 °C.
  5. Bereid op dag 7 1,4 x 106 JeKo-1 tumorcellen voor en breng ze over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C en aspireer de bovenstaande stoffen op.
  6. Resuspendeer tumorcellen met celkweekmedia om een eindconcentratie van 2 x 106 cellen/ml te bereiken. Voeg 200 μL tumorcellen toe aan de bodemputjes van alle monstercondities en meng goed. Incubeer de cellen nog 24 uur bij 37 °C. Gebruik bodemputten met alleen JeKo-1 als positieve controle.
  7. Op dag 8, oogstdag 8, worden CART- en UTD T-cellen gegenereerd in stap 5.1. en resuspensie van T-cellen in celkweekmedia om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml te bereiken.
    OPMERKING: Als allogene CART-cellen worden gebruikt, moeten gebruikers donor-gematchte UTD-T-cellen opnemen in de coculturen zoals beschreven in stap 3.22.
  8. Tel en bereid 1,4 x 106 JeKo-1-cellen voor. Breng de tumorcellen over in een centrifugebuis van 15 ml en laat de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C draaien.
  9. Zuig supernatanten op en suspendeer cellen in celkweekmedia om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ ml te bereiken. Breng 100 μL bereide T-cellen en 100 μL tumorcellen over in elk bovenste putje voor alle monsteromstandigheden.
  10. Meng de cellen grondig in het bovenste putje en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 °C.
  11. Meng op dag 11 de cellen in de bovenste kamer en breng ze over naar microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Was de bovenste putjes met 200 μL PBS en breng de resterende cellen over in de microcentrifugebuisjes.
  12. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op. Voer een T-celproliferatietest uit zoals beschreven in de stappen 4.4-4.9.
    OPMERKING: JeKo-1-gepolariseerde M2-achtige macrofagen kunnen antigeenspecifieke T-celproliferatie op een contactonafhankelijke manier onderdrukken. Andere tumormodellen kunnen indien nodig worden getest.

6. Opstelling van een xenotransplantaatmodel met zowel menselijke macrofagen als tumor bij NSG-muizen

  1. Isoleer 1 x 107 menselijke klassieke monocyten en bevestig de zuiverheid door middel van flowcytometrie zoals beschreven in de stappen 1.1-1.10. Gebruik NSG-muizen die alleen met JeKo-1 zijn geënt als controle om pro-tumorale effecten van M2-achtige macrofagen te bevestigen, zoals geïllustreerd in figuur 2.
    OPMERKING: Dit protocol ent NSG-muizen subcutaan met 5 x 105 menselijke macrofagen. Het herstel van macrofagen na het losmaken op dag 7 is ongeveer 50%. Gebruikers kunnen de celnummers dienovereenkomstig aanpassen en ervoor zorgen dat ze extra cellen voorbereiden.
  2. Centrifugeer geïsoleerde monocyten bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op. Resuspendeer cellen in celkweekmedia om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml te bereiken.
  3. Voeg humaan recombinant GM-CSF toe om een eindconcentratie van 10 ng/ml te bereiken en meng goed. Breng de monocyten over in een T25-weefselkweekkolf en incubeer de cellen gedurende 7 dagen bij 37 °C.
  4. Pipeteer op dag 7 elke 10 minuten krachtig cellen op ijs en controleer de cellen onder een microscoop totdat de meeste macrofagen zijn losgemaakt. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml op ijs, was de kolf met ijskoude PBS om de resterende cellen los te maken en combineer de cellen in de conische buis.
  5. Tel cellen op de cellenteller. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op.
  6. Was en resuspendeer cellen met 5 ml ijskoude PBS. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer supernatanten op.
  7. Resuspendeer cellen in ijskoude PBS om een eindconcentratie van 2 x 107 cellen/ml te bereiken. Breng de celoplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze op ijs.
  8. Bereid 1,5 x 107 luciferase+ JeKo-1-cellen voor en breng de cellen over in een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Vanwege het lage aantal geïnjecteerde cellen is bioluminescentiebeeldvorming (BLI) nodig om de tumorbelasting te controleren. Het aantal macrofagen en tumorcellen voor subcutane injecties kan naar behoefte worden opgeschaald. Als tumoren na injectie zichtbaar en toegankelijk zijn met een schuifmaat, kunnen in plaats daarvan wildtype tumorcellen worden gebruikt.
  9. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4°C en aspireer supernatanten op. Resuspendeer de cellen in ijskoude PBS om een eindconcentratie van 4 x 107/ml te bereiken.
  10. Breng hetzelfde volume macrofagen en tumorcellen over in een andere verse microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng goed. Voeg hetzelfde volume opgeloste basaalmembraanmatrix toe aan de gemengde celoplossing en meng goed op ijs.
    OPMERKING: De matrix van het basaalmembraan moet een nacht op ijs worden ontdooid om stolling te voorkomen. Op dit moment heeft elke 100 μL celoplossing 5 x 105 macrofagen en 1 x 106 JeKo-1 gesuspendeerd in de basaalmembraanmatrix, die dezelfde celnummerverhouding gebruikt die wordt gebruikt in het in vitro M2-achtige macrofaagdifferentiatieprotocol.
  11. Breng als controle de resterende bereide JeKo-1-cellen met hetzelfde volume ijskoude PBS over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg hetzelfde volume van de basaalmembraanmatrix toe aan de celoplossing en meng goed op ijs.
  12. Bereid 10 6-8 weken oude vrouwelijke en mannelijke NOD-SCID-γ-/- (NSG) muizen (~20 g) voor op inhalatie-anesthesie met 2,5% isofluraan. Introduceer isofluraan-anesthesie met behulp van een anesthesieapparaat voor inhalatie bij knaagdieren. Het verdampte isofluraan wordt afgeleverd in een kamer en een verwarmde fase met neuskegels.
  13. Plaats de muizen 1-2 minuten in de anesthesiekamer. Breng muizen over naar de neuskegels op de verwarmde fase zodra de houdings- en rechterreflexen verloren zijn gegaan18. Houd muizen tijdens de hele procedure op de verwarmingsfase. Breng oogzalf aan op beide ogen van de muizen om beschadiging van het hoornvlies door het verlies van de knipperreflex tijdens de narcose te voorkomen.
  14. Scheer voorzichtig de rechterflank van elke muis om de huid bloot te leggen nadat de muizen zijn verdoofd. Vul een spuit van 0,5 ml met 100 μl JeKo-1-macrofaagcelmengsel en verwijder voorzichtig de belletjes in de oplossing.
  15. Til de blootgestelde huid voorzichtig met de hand op en steek de naald in het opgetilde gebied. Blijf de huid met de naald optillen en druk met één vinger op de injectieplaats. Probeer de naald niet te bewegen nadat deze is ingebracht om onbedoelde lekke banden en cellekkage te voorkomen.
  16. Laat de cellen langzaam los in de onderhuidse laag en verwijder voorzichtig de naald. Herhaal de subcutane injecties voor alle 10 NSG-muizen, waarbij 5 muizen zowel JeKo-1 als macrofagen krijgen en 5 muizen alleen JeKo-1.
  17. Bereid D-luciferine (materiaaltabel) in een concentratie van 15 mg/ml. Vul een spuit van 0,5 ml met 200 μl D-luciferine en injecteer deze intraperitoneaal in elke muis.
  18. Plaats verdoofde muizen op het podium voor BLI 10 minuten na injectie met D-luciferine. Voer BLI uit voor elke muis en registreer als baseline (dag 0) tumorlast. Plaats de muizen terug in hun kooien.
    OPMERKING: Gebruikers moeten ervoor zorgen dat de verdoofde muizen niet zonder toezicht worden achtergelaten totdat ze weer bij bewustzijn komen om sternale lighouding te behouden na de beeldvormingsprocedure.
  19. Bewaak de tumorlast 2x per week met BLI totdat experimentele of humane eindpunten zijn bereikt. Het totale overlevingseindpunt wordt bereikt zodra het tumorvolume op of boven 2000 mm3 is, berekend met behulp van de onderstaande formule:
    figure-protocol-2
    OPMERKING: De duur van de tumormonitoring kan worden aangepast op basis van het doel van de experimenten en de gewenste uitlezingen. Vanwege de extreem kleine tumorgroottes in de eerste 2-3 weken, wordt BLI aanbevolen voor indicatie van tumorlast. Zodra tumoren zichtbaar en toegankelijk worden met een schuifmaat, worden zowel BLI- als schuifmaatmetingen aanbevolen voor nauwkeurige tumoranalyse.
  20. Om interacties tussen geënte menselijke macrofagen en autologe CART19-cellen in NSG-muizen te bestuderen, genereert en transplanteert u ex vivo-gedifferentieerde menselijke macrofagen zoals beschreven in stappen 6.1-6.16. Isoleer autologe T-cellen van dezelfde bloeddonor in stap 6.1 volgens het 8-daagse CART-productieprotocol zoals eerder beschreven 9,13,14.
    OPMERKING: Elke NSG-muis wordt behandeld met 2 x 106 CART19-cellen. Gebruikers moeten ten minste 2 x 107 CART-cellen genereren om 10 muizen te behandelen. CART-cellen worden op dag 8 gecryopreserveerd en bewaard totdat JeKo-1/macrofagen in de muizen zijn geënt, 5 dagen na subcutane injecties.
  21. Na 5 dagen injecties met tumor/macrofaag randomiseert u muizen op basis van BLI zoals beschreven in stap 6.17-6.18. Ontdooi en bereid CART-cellen voor zoals beschreven in stap 3.22. Was CART-cellen met PBS en centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
  22. Resuspendeer CART-cellen in PBS om een eindconcentratie van 2 x 107 cellen/ml te bereiken. Vul een spuit van 0,5 ml met 100 μl bereide CART-cellen en injecteer deze intraveneus via de staartader in elke tumorgeënte muis.
  23. Controleer de tumorlast door BLI eenmaal per week gedurende 4 weken.
    OPMERKING: Vanwege de immunosuppressieve functies van getransplanteerde menselijke macrofagen worden verminderde CART-antitumoractiviteiten en een hogere tumorlast verwacht bij muizen die worden geïnjecteerd met JeKo-1/macrofagen.

7. M2-achtige fenotypebevestiging in de geënte menselijke macrofagen door immunofluorescentiekleuring

  1. Om het door JeKo-1 geïnduceerde M2-achtige fenotype te bevestigen in geënte menselijke macrofagen beschreven in stap 6 door immunofluorescentiekleuring, volgt u de stappen 6.1-6.19 en schaalt u het aantal geïnjecteerde macrofagen en luciferase+ JeKo-1 op tot respectievelijk 5 x 106 cellen en 1 x 107 cellen per NSG-muis.
    OPMERKING: Gebruikers moeten ervoor zorgen dat het uiteindelijke injectievolume voor elke muis 100 μl is.
  2. Euthanaseer op dag 7 NSG-muizen door CO2, voer cervicale dislocatie uit en bevestig het verlies van hoornvliesreflexen zoals eerder beschreven19. Plaats muizen op de werkbank met de tumoren naar boven. Spuit 70% ethanol op de tumorplaatsen en oogst getransplanteerde tumoren voorzichtig met een schaar en tang.
  3. Breng tumorweefsel over in conische buisjes van 50 ml gevuld met 20-30 ml 4% paraformaldehyde voor fixatie zoals eerder beschreven20. Cryopreservatie en cryosectie tumorweefsels voor immunofluorescentiekleuring volgens een eerder gepubliceerd protocol20.
  4. Kleuring tumorweefselglaasjes met muis-anti-humaan CD206-antilichaam geconjugeerd met AF546 (1:50) en konijn-anti-humaan iNOS-antilichaam geconjugeerd met AF647 (1:100) verdund in immunofluorescentiekleuringsbuffer, gevolgd door kernkleuring en conservering zoals eerder beschreven21.
    OPMERKING: Voor optimale kleuringsresultaten moeten gebruikers antilichaamtitratie dienovereenkomstig uitvoeren, vooral wanneer verschillende tumorcellijnen worden gebruikt.
  5. Verkrijg immunofluorescentiebeelden met confocale microscopie bij 40x. Om te bevestigen dat geënte menselijke macrofagen een M2-achtig fenotype ontwikkelen, kunt u expressie van humaan CD206 en minimale expressie van humaan iNOS verwachten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van dit protocol is om zowel in vitro als in vivo modellen op te zetten om interacties tussen humane immunosuppressieve macrofagen en CART-cellen te bestuderen vanwege de complexe aard en dynamiek van de interacties en de beperkte bestaande xenotransplantaatmodellen. Volgens het protocol worden geïsoleerde menselijke klassieke monocyten gedifferentieerd om M2-achtige fenotypes te verwerven en functioneel immunosuppressief te worden.

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CART-celtherapie heeft talrijke klinische successen opgeleverd bij de behandeling van subgroepen van patiënten met hematologische maligniteiten, maar de meeste patiënten vallen binnen 1-2 jaar na CART-infusieterug 1,2. Er zijn verschillende potentiële CART-resistentiemechanismen geïdentificeerd en immunosuppressieve myeloïde cellen blijken een belangrijke rol te spelen bij TME-immunosuppressie en daaropvolgend CART-falen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

SSK is een uitvinder van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Novartis (via een overeenkomst tussen Mayo Clinic, University of Pennsylvania en Novartis), MustangBio (via Mayo Clinic) en Sendero (via Mayo Clinic). RLS en SSK zijn uitvinders van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Humanigen (via Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES en SSK zijn uitvinders van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Immix. SSK ontvangt onderzoeksfinanciering van Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte en Lentigen. SSK heeft deelgenomen aan adviesvergaderingen met Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio en Novartis. SSK heeft samen met Humanigen en Carisma zitting gehad in het Data Safety and Monitoring Board. SSK heeft gediend als consultant voor Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma en Humanigen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door het Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), het Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), de National Institutes of Health grant R37CA266344-01 (SSK) en de Department of Defense grant CA201127 (SSK).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 mL spuitFisher Scientific329461
1.5 mL microcentrifugebuisjeEppendorf1415-2508 
15 mL conische buisCorning Life Sciences352097
24-well transwell plaat (0.4 μm)Corning Life Sciences3397
50 mL conische buisCorning Life Sciences352098
APC/Cy7-geconjugeerd anti-human CD206Biolegend321119Flow antibody
APC-geconjugeerd anti-human CD14Biolegend325607Flow antibody
APC-geconjugeerd anti-human CD3Biolegend344811Flow antibody
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222Classcial monocyte isolation buffer 
Basement Membrane MatrixCorning Life SciencesCLS356237Solubilized basement membrane matrix
Celcultuur media10% human AB serum 1% penicillin-streptomycin-glutamine in X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium
Classical monocyte isolation kit, humanMiltenyi Biotec130-117-337
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652Flow cytometer
D-luciferinGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190250 
OogzalfThermoFisher19-090-832
FACS buffer2% FBS 1% sodium azide in PBS
Foetaal bovien serumCorning Life Sciences35-011-CV
Vlakbodem 96-well plaatCorning Life SciencesCLS3997
Heat inactivated pooled human AB serum Innovative Research4931
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Isoflurane vloeibaar  Piramal Pharma Limited66794-017-10
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer124262
JeKo-1 cellijn cultuur media10% FBS 1% penicillin-streptomycin-glutamine in RPMI-1640 medium
Live/dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, voor 405 nm excitatieInvitrogenL34966
LS kolomMiltenyi Biotec130-042-401Negative bead selection
LymphoprepStemcell Technologies07811Density gradient medium
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376Classcial monocyte isolation buffer 
Mouse-anti-human CD206 antilichaam geconjugeerd met AF546 Santa Cruz Biotechnologysc-376232
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) muizenJackson Laboratory 5557
PE-geconjugeerd anti-human CD16Biolegend302007Flow antibody
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PerCP-geconjugeerd anti-human CD163Biolegend333625Flow antibody
Rabbit-anti-human iNOS antilichaam geconjugeerd met AF647 ProteintechCL647-18985
Recombinant human GM-CSFStemcell Technologies78015
RPMI-1640 mediumGibco11875093
SepMate-50 IVDStemcell Technologies85450PBMC isolation by density gradient centrifigation 
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
In tissuecultuur behandelde 48-well plaatCorning Life Sciences3548
Vi-cell XR Cellevensvatbaarheid AnalyzerBeckman CoulterCell counter
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Referenties

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interacties tussen myelo de cellenimmunosuppressieve macrofagentumoromgevingin vitro cocultuurin vivo xenotransplantatiehematopo tische stamcellenmacrofaag engraftmentbioluminescentie imagingmacrofaag gerichte immunotherapie

Gerelateerde artikelen