Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geavanceerde glycatie-eindproducten maken menselijke sensorische neuroncellen gevoelig voor door capsaïcine geïnduceerde calciuminstroom

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68036

⸱

2 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pain and Signaling, Butantan Institute, 2Center of Excellence in New Target Discovery, Butantan Institute, 3Innovation and Development Laboratory, Innovation and Development Center, Butantan Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Verhoogde van collageen afgeleide geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) worden consequent in verband gebracht met pijnlijke ziekten. Hier hebben we onderzocht of glycatie sensorische neuronen sensibiliseert voor capsaïcine-excitatie.

Samenvatting

Verhoogde van collageen afgeleide geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) worden consequent in verband gebracht met pijnlijke ziekten, waaronder artrose, diabetische neuropathie en neurodegeneratieve aandoeningen. Menselijke sensorische neuronen die zijn gedifferentieerd van de SH-SY5Y-cellijn krijgen pro-nociceptieve functies wanneer ze worden blootgesteld aan AGE's door substantie P vrij te geven en de transiënte receptorpotentiaal vanilloïde 1 (TRPV1)-expressie te verhogen. Hier onderzochten we of deze receptor functioneel actief was en of het glycatieproces sensorische neuronen gevoelig maakt voor capsaïcine-excitatie. Sensoenachtige neuroncellen werden verkregen uit de differentiatie van SH-SY5Y-cellen met all-trans-retinoïnezuur en van de hersenen afgeleide neurotrofe factor. Incubatie met geglyceerde collageen extracellulaire matrix (ECM-GC) simuleerde een pro-nociceptieve stimulus. Controlecellen werden geïncubeerd met een niet-geglyceerde extracellulaire collageenmatrix (ECM-NC). Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit werd gebruikt om de calciuminstroom te beoordelen, die werd gestimuleerd door capsaïcine. De resultaten tonen aan dat glycatie de calciuminstroom verhoogt in vergelijking met cellen die worden behandeld met normaal collageen, wat suggereert dat sensorische neuronen functionele TRPV1-kanalen tot expressie brengen en dat glycatie de excitatie van capsaïcine verhoogt. Deze gegevens duiden op overgevoelige sensorische neuroncellen van AGE's, die pro-nociceptieve signalering activeren. Samen suggereren onze resultaten dat we een functioneel model hebben opgesteld dat reageert op capsaïcine en dat nuttig kan zijn voor het screenen van kandidaten voor het beheersen van pijnlijke aandoeningen.

Inleiding

Glycatie is een niet-enzymatisch, onomkeerbaar en spontaan proces waarbij eiwitten, zoals collageen, zich binden aan reducerende suikermoleculen, wat resulteert in geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's). AGE's kunnen cellulaire membraanreceptoren activeren, waardoor intracellulaire routes worden geactiveerd, zoals extracellulair signaalgereguleerd eiwitkinase (ERK) 1/2, p38 mitogeen-geactiveerd eiwitkinase (MAPK) en c-jun n-terminale kinasen (JNK's), rho-GTPases, fosfoinositol-3-kinase (PI3K), Januskinase/signaaltransducer en activator van transcriptie (JAK/STAT) en eiwitkinase C (PKC), waardoor de afgifte van pro-inflammatoire moleculen en oxidatieve stress toenemen1. Geglyceerd collageen schaadt ook de structuur en eigenschappen van de extracellulaire matrix, en verhoogde van collageen afgeleide AGE's worden consequent in verband gebracht met pijnlijke ziekten, waaronder artrose, diabetische neuropathie en neurodegeneratieve aandoeningen 2,3.

Onze groep heeft eerder aangetoond dat de SH-SY5Y-cellijn kan worden gedifferentieerd tot sensorische neuroncellen, aangezien deze cellen kanalen tot expressie brengen die betrokken zijn bij nociceptie, zoals natriumkanalen (Nav 1.7, Nav 1.8 en Nav 1.9) en transient receptor potential vanilloïde type 1 (TRPV1), markers die doorgaans worden aangetroffen in perifere sensorische neuronen4. TRPV1 is een niet-selectief kationkanaal dat doorlaatbaar is voor calciumionen en gevoelig is voor capsaïcinestimulus. Belangrijk is dat wanneer de sensorische neuroncellen worden blootgesteld aan geglyceerde collageenmatrix (ECM-GC), ze pro-nociceptieve functies krijgen door de c-Fos-expressie te verhogen, een transcriptiefactor die betrokken is bij neuronale activering, en de afgifte van substantie P, een neuropeptide dat wijdverbreid is betrokken bij neuro-inflammatie en pijn. Deze cellen reageren op pijnstillers, zoals morfine, het prototype van het opiaat, waardoor de door ECM-GC geïnduceerde afgifte van stof P wordt verminderd. Samen geven deze gegevens aan dat dit model reageert op een pro- en anti-nociceptief molecuul 4,5.

Het monitoren van intracellulaire Ca2+- concentratieveranderingen is essentieel voor het bestuderen van tal van cellulaire processen. In neuronen kan het een nuttig hulpmiddel zijn om neuronale schade en neuroprotectieve eigenschappen van geneesmiddelen te voorspellen. Capsaïcine, het scherpe actieve ingrediënt van hete chilipepers, is de meest bestudeerde agonist van de TRPV1-receptor5 en een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de pijnmechanismen en het screenen van potentiële nieuwe pijnstillers. Eerdere studies hebben aangetoond dat primaire sensorische neuronen uit de dorsale wortelganglia van knaagdieren die zijn geïncubeerd met hoge glucose een significante toename vertonen van door capsaïcine geïnduceerde calciuminstroom6. Of het TRPV1-kanaal functioneel actief was in ons celmodel en of het geglyceerde collageen sensorische neuroncellen gevoelig maakt voor capsaïcine-excitatie, die nociceptieve signaalroutes kan activeren, blijft echter onbekend. Daarom wilden we een kosteneffectief protocol ontwikkelen met behulp van eenvoudige hulpmiddelen voor real-time calciummonitoring in sensorische cellen, terwijl we een betrouwbare analyse garanderen. Hier bieden we een uitgebreid protocol om onderzoekers te helpen bij het doorlopen van de stappen om SH-SY5Y-cellen te differentiëren in sensorische neuroncellen en hoe ze gevoelig te maken voor pro-nociceptieve stimuli. Deze methode kan bijdragen aan de ontdekking van nieuwe pijnstillende of neuroprotectieve verbindingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. SH-SY5Y-cultuur en differentiatie tot sensorische neuroncellen

OPMERKING 1: Alle stappen in dit hoofdstuk moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stromingskap en alle oplossingen en benodigdheden moeten steriel zijn.

  1. Bereid eerst een kweekkolf (25cm2) voor door 5 ml kweekmedium toe te voegen.
    OPMERKING: Gebruik voor het ontdooien, verlengen en onderhouden van dit celtype een mengsel van kweekmedium: Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12 (DMEM/F12) aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Verwijder vervolgens de cryobuis met de SH-SY5Y-cellen uit de vloeibare stikstof en bewaar deze op ijs. Ontdooi de cellen in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 min.
  3. Voeg 1 ml compleet kweekmedium toe aan de cryovial, breng de cellen over in een buisje van 15 ml, voeg 3 ml compleet kweekmedium toe (DMEM/F12 aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum) en meng door het herhaaldelijk op te zuigen en met een pipet terug in de buis te doseren.
  4. Pipetteer de cellen in de buis van 15 ml en centrifugeer bij 290 g. Gooi het bovenstaande weg om dimethylsulfoxide (DMSO) te verwijderen, een cryoprotectief middel dat wordt gebruikt om de vorming van ijskristallen tijdens het bevriezen van cellen te voorkomen.
  5. Voeg 1 ml kweekmedium toe aan de celpellet, meng ze goed met een pipet en doe ze in een kweekkolf van 25 cm2 om de cellen uit te zetten. Plaats de cellen in een broedmachine in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C.
    OPMERKING: Cellen kunnen worden gebruikt wanneer ze ongeveer 80% samenvloeiing bereiken. Voor neuronale differentiatie wordt aanbevolen om SH-SY5Y-cellen te gebruiken tot de celpassage twintig.
  6. Bereid de extracellulaire collageenmatrix (100 μg/ml) voor door rattenstaart type I collageen te verdunnen in steriel PBS en giet 1 ml van deze oplossing in een petrischaaltje (35/10 mm) voor een coating.
  7. Incubeer dit in een incubator in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 gedurende ongeveer 1 uur.
  8. Was de plaat na deze periode twee keer met steriel PBS en tel vervolgens de cellen met behulp van de Neubauer-kamer.
  9. Om cellen te tellen, wast u eerst de kweekkolf van 25cm2 met de cel met 5 ml steriel PBS om al het kweekmedium te verwijderen. Verwijder vervolgens de steriele PBS, voeg 3 ml 0,05% trypsine toe aan de cellen en plaats ze ongeveer 3-5 minuten in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de celloslating te voltooien.
  10. Verwijder vervolgens de cellen uit de incubator, voeg 6 ml kweekmedium toe aan de kweekkolf en breng deze oplossing over in een buis van 15 ml. Centrifugeer bij 290 g gedurende 5 min.
  11. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de cellen goed in 1 ml volledig kweekmedium.
  12. Tel ten slotte de cellen met behulp van een Neubauer-telkamer. Meng 20 μL cellen en 20 μL trypan blauw en voeg 10 μL van dit mengsel toe aan een Neubauer-kamer. Tel de levende cellen die niet blauw kleuren.
  13. Plaat 5 × 10cellen van 4 cellen/ml in een petrischaaltje (35/10 mm) op hetzelfde eerder beschreven kweekmedium. Gebruik het totale volume van 1 ml per plaat.
  14. Wacht vervolgens 24 uur om het neuronale differentiatieprotocol te starten. Verwijder daarvoor het kweekmedium en vervang het door 1 ml DMEM/F12 aangevuld met 2% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 10 μM all-trans-retinoïnezuur (RA 10 μM).
  15. Wacht 48 uur en vervang de voedingsbodem elke dag gedurende 3 dagen. Plaats de cellen in een broedmachine in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C.
  16. Verwijder op de vijfde dag het medium uit de cellen en voeg in elke plaat 1 ml serumvrij kweekmedium toe, aangevuld met van de menselijke hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF 50 ng/ml).
    OPMERKING: BDNF van verschillende bedrijven (zie materiaaltabel) is getest. Ze werkten allemaal op dezelfde manier.
  17. Was op de zevende dag van differentiatie de cellen één keer met steriel PBS en gebruik sensorische neuroncellen voor experimenten. Als het onmogelijk is om deze cellen onmiddellijk voor experimenten te gebruiken, voeg dan een serumvrij kweekmedium toe om ze in leven te houden tot gebruik.
    OPMERKING: Aan het einde van de neuronale differentiatie is het noodzakelijk om cellen met steriele PBS te wassen om de resterende BDNF te verwijderen, waardoor celtoxiciteit wordt vermeden.

2. Geglyceerd collageen en glycatieproces

NOTITIE: Alle stappen in dit gedeelte moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stromingskap en alle oplossingen en benodigdheden moeten steriel zijn.

  1. Bereid de collageenglycatie voor door collageen type I uit de fibrillaire toestand van de rattenstaart (3,89 mg/ml) te incuberen met 200 mM D-ribose, 160 mM D-glucose en 200 mM D-threose bij 4 °C gedurende 7 dagen.
    OPMERKING: Om geglyceerd collageen te bereiden, weegt u de suikers op basis van hun molecuulgewicht en mengt u ze met collageen type I uit de fibrillaire toestand van de rattenstaart (3,89 mg/ml).
  2. Incubeer gedurende 24 uur sensorische neuroncelcultuur met geglyceerde collageen extracellulaire matrix (ECM-GC, 100 μg/ml) of normale collageen extracellulaire matrix (ECM-NC, 100 μg/ml) bereid in DMEM/F12-kweekmedium zonder serum- en antibioticasuppletie.

3. Calciuminflux test

  1. Gebruik voor calciuminflux de calciumfluxtestkit en bereid de oplossingen volgens de instructies van de fabrikant, zoals hieronder aangegeven.
  2. Bereid eerst 1 ml Fluo-8 kleurstoflading voor door 2 μL Fluo-8 stockoplossing toe te voegen in 998 μL 1x assaybuffer (een mix van HBSS-buffer en 10x Pluronic F127 Plus.
    OPMERKING: Deze werkoplossing is minimaal 2 uur stabiel bij kamertemperatuur (RT).
  3. Incubeer vervolgens 250 μl van deze oplossing in elk verguld schaaltje van sensorische neuroncellen die eerder zijn gedifferentieerd en behandeld met ECM-NC of ECM-GC gedurende 30 minuten in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C. Haal vervolgens de schaal uit de broedmachine en houd deze 30 minuten op RT (in het donker).
    OPMERKING: Deze oplossing wordt cytotoxisch als de incubatie van 2 uur wordt geëxtrapoleerd. Bereid de capsaïcine-oplossing voor tijdens de incubatietijd.

4. Capsaïcine inductie

OPMERKING: Capsaïcine, een TRPV1-agonist, werd gebruikt om calciuminstroom in de cellen te induceren.

  1. Weeg en verdun capsaïcine in 1% ethanol en ultrapuur water. Bereid vervolgens een oplossing met een concentratie van 2 μM, die ook is verdund in ultrapuur water.
    OPMERKING: Capsaïcine-oplossing moet worden gemaakt op de dag van gebruik. Verdun capsaïcine eerst in ethanol en vervolgens in water; anders zal het neerslaan.
  2. Voeg 250 μL 2 μM capsaïcineoplossing toe aan elke 35/10 mm petrischaaltje zodat de uiteindelijke concentratie 1 μM is.
    OPMERKING: De concentratie van capsaïcine in de standaardoplossing was 2 μM om een betere dispersie te garanderen en geïsoleerde fluorescentiepieken te voorkomen.

5. Beeldvorming van calciuminstroom en analyse van confocale microscopie

OPMERKING: De beeldvorming werd uitgevoerd in een confocale microscoop die was uitgerust met een 20x/0,75NA-objectief en een excitatielaser van 488 nm (intensiteit 0,5%). Emissie werd gedetecteerd bij 520 nm. Cellen werden in de loop van de tijd (t) gescand in xy-assen (512 x 512 pixels) met een snelheid van 600 Hz met een acquisitie-interval van 433 ms en een totale acquisitietijd van 5 min. Beeldvorming werd uitgevoerd bij 37 °C om de fysiologische conditie van de cellen te behouden met behulp van de microscopiesoftware.

  1. Bereid een spuit voor met 250 μL 2 μM capsaïcineoplossing (de uiteindelijke concentratie in de plaat is 1 μM) en sluit deze aan op een hoofdhuidaderset - Butterfly type 23 GA steriel. Zet de spuit vast met een laboratoriumstandaard en klem.
  2. Plaats de petrischaal op de microscooptafel en plaats met uiterste voorzichtigheid de hoofdhuidnaald in de petrischaal, vermijd contact met de bodem, de punt van de naald mag niet worden ondergedompeld in de vloeistof.
    OPMERKING: Een plakband kan worden gebruikt om de hoofdhuidpositie te fixeren.
  3. Zoek een veld met een voldoende aantal cellen (meer dan 20) en pas de focus aan met behulp van helder veldlicht.
  4. Start de Live-modus met een laser van 488 nm en pas de focus- en verlichtingsparameters aan.
  5. Start de acquisitieregistratie en breng na de basislijnperiode (t = 0 tot t = 60 seconden) 250 μL 2 μM capsaïcine aan en duw voorzichtig op de zuiger van de spuit om de calciuminstroom in de cellen te stimuleren.
    OPMERKING: De uiteindelijke opname-acquisitietijd was ongeveer 300 s per plaat.

6. Nabewerking/data-analyse

  1. Voer de celanalyse uit met behulp van de microscopiesoftware in de kwantificeringsmodus . Analyseer eerst fluorescentie-spikecellen voor en na de capsaïcine-stimulus.
  2. Creëer een interessegebied (ROI) in elke responsieve cel, d.w.z. cellen die een fluorescentiepiek vertonen na capsaïcine. Zorg ervoor dat u de ROI in het hele celgebied tekent, zoals hierboven aangetoond (Figuur 1).
  3. Exporteer de gegevens in een bestand met door komma's gescheiden waarden (CSV) voor latere analyse.
  4. U kunt de analyse ook uitvoeren met behulp van de gratis verkrijgbare software FIJI7 (https://fiji.sc).
    1. Om de afbeeldingsbestanden te openen, gebruikt u de plug-in Bio-Formats door naar Bestand > importeren > Bio-Formats te navigeren en het bestand te selecteren.
  5. Gebruik vervolgens het vergrootglas om in te zoomen en het gereedschap Selectie uit de vrije hand om een interessegebied (ROI) rond de responsieve cellen te tekenen.
  6. Nadat u elke ROI hebt getekend, drukt u op de T-toets om deze toe te voegen aan de ROI Manager. Herhaal dit proces voor alle cellen die van belang zijn (Figuur 2).
  7. Zodra alle ROI's zijn toegevoegd, gaat u naar het ROI Manager-venster , selecteert u alle ROI's en navigeert u vervolgens naar Analyseren > Metingen instellen in het hoofdmenu.
  8. Keer vervolgens terug naar de ROI-manager en selecteer Meer > Multi Measure om de intensiteit van alle frames te meten. De resultaten verschijnen in een nieuw venster; exporteren als een CSV-bestand door naar Bestand > Opslaan als te gaan.
    OPMERKING: Het CSV-bestand kan worden geanalyseerd in Excel-, Google Spreadsheets- en GraphPad-software. Gebruik de vergelijking ΔF/F0 = (F(t) - F0)/F0 om fluorescentie-intensiteitswaarden verkregen met de Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit om te zetten in een relatieve maat voor de verandering van de calciuminstroom. Hier vertegenwoordigt F0 de basisfluorescentie, berekend als de gemiddelde intensiteit van beelden die zijn vastgelegd van t = 0 s tot t = 60 s vóór stimulatie met capsaïcine. F(t) is de waarde van de maximale fluorescentie-intensiteit die wordt waargenomen na de stimulus, waarmee de piekcalciuminstroom kan worden beoordeeld. Deze benadering benadrukt de toename van fluorescentie ten opzichte van de basislijn, waarbij een stijging van ΔF/F0 duidt op een verhoogd intracellulair calciumgehalte.

figure-protocol-1
Figuur 1: Voorbeeld van de ROI in de geselecteerde cellen voor calciuminstroomanalyse in LAS X-software. (A) LAS X-interface in kwantificeermodus. De roze rechthoek geeft het kwantificeringstabblad aan. De gele rechthoek toont het gereedschap voor het tekenen van een polylijn en de cyaankleurige rechthoek toont de gereedschappen voor uitzoomen en inzoomen. (B) Gezichtsveld (FOV) vastgelegd. (C) Zoom in op FOV om het tekenen van ROI in de hele cel te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Voorbeeld van ROI in de geselecteerde cellen voor calciuminstroomanalyse in FIJI-software. (A) FIJI-interface met het hoofdmenu en de tool. Het rode vierkant toont het vergrootglas en het groene vierkant toont de selectie uit de vrije hand. (B) Gezichtsveld (FOV) vastgelegd met inzoomen en een getekende ROI. (C) Het ROI-managervenster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Problemen oplossen

  1. Als de afbeelding onscherp is, probeer dan het volgende:
    1. Controleer de hechting van de tape; Als deze is losgeraakt, kan de naald verschuiven en de scherpstelling beïnvloeden.
    2. Bevestig de naald opnieuw met extra tape voor meer stabiliteit.
    3. Vervanging van standaard naalden. Gebruik voorgebogen tandnaaldpunten om de uitlijning op de plaat te verbeteren.
  2. Als de cellen een verzadigd signaal vertonen, probeer dan de volgende stappen:
    1. Verlaag de laserintensiteit en versterkingsinstellingen.
    2. Controleer de incubatietijd van het reagens. Als het de aanbeveling van de fabrikant overschrijdt, kan dit leiden tot signaalverzadiging, wat de detectie van calciuminstroom bemoeilijkt.
  3. Volg deze aanvullende suggesties voor het oplossen van problemen:
    1. Regelmatige kalibratie: Zorg ervoor dat de beeldvormingsapparatuur regelmatig wordt gekalibreerd om de focus en signaaldetectiekwaliteit te behouden.
    2. Documenteer wijzigingen: Houd een logboek bij van alle wijzigingen die in het protocol zijn aangebracht voor toekomstig gebruik en om het oplossen van problemen te vergemakkelijken.
    3. Reactieve aanpassingen: Als de problemen aanhouden, overweeg dan om te testen met verschillende reagensconcentraties of alternatieve methoden voor signaaldetectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

SH-SY5Y-celdifferentiatie in sensorische neuron
Screeningbeelden met een hoge inhoud tonen aan dat het protocol van neuronale differentiatie de SH-SY5Y-celmorfologie verandert. De sensorische neuroncellen (gedifferentieerde cellen) vertonen een afgerond cellichaam dat een uitgebreid netwerk van neurofilamenten projecteert. Ze vormen vertakkingen van meer langwerpige neurietuitsteeksels die omliggende neuronen met elkaar verbinden, wat consistent is met volwassen neuro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Nociceptoren zijn gespecialiseerde subsets van sensorische neuronen die pijn bemiddelen. Deze cellen brengen spanningsafhankelijke en ligandionkanalen tot expressie, zoals TRPV1, waarvan de activering leidt tot calciuminstroom en de afgifte van neuropeptiden en neurotransmitters die de nociceptieve transmissie reguleren. Hier beschrijven we een protocol voor het differentiëren van SH-SY5Y in sensorische neuroncellen om de door capsaïcine geïnduceerde calciuminstroom te evalueren

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

MCB, AMCT en VOZ bezitten een patent op het proces van het identificeren van moleculaire entiteiten die betrokken zijn bij artrosepijn (BR102018008561-1).

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Grant nummer 2015/50040-4 en 2020/13139-0, São Paulo Research Foundation en GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 en 2024/04023-0.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
All-trans retinoic acidTocris695
BDNFTocrisTOCR-2837
BDNFSigma-AldrichB3795
Butterfly type 23GA sterieleBeckton Dickinson Asepto38833814Veneneetje
CapsaïcineSigma-AldrichM2028
D-glucoseSigma-AldrichG5767
DMEM/F12Gibco12500062Basismedium
D-riboseSigma-AldrichR7500
D-threoseSigma-AldrichT7392
Fluo-8 Calcium Flux Assay KitAbcamab112129Geen wassen
Heat-inactivated foetaal bovien serumGibcoA5670801
High Content Screening Molecular Devices
LASX softwareLeica MicrosystemsMicroscoop software
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsLeica TCS SP8Confocale microscoop
Penicilline-streptomycineGibco15140130
Petrischaal (35/10 mm)Greiner bio-one627965
Rat tail type I collageenCorning354236
SH-SY5YMerck94030304-1VLNeuroblastoom cel lijn

Referenties

  1. Bierhaus, A., et al. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products. J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).
  2. Hudson, B. I., et al. Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders. Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).
  3. Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior. Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).
  4. Bufalo, M. C., et al. Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds. Cells. 11 (2), 247(2022).
  5. Frias, B., Merighi, A. Capsaicin, nociception and pain. Molecules. 21 (6), 797(2016).
  6. Lam, D., et al. RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose. PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).
  7. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  8. Li, F., et al. TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception. Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).
  9. Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain. Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).
  10. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  11. Vetter, I., et al. Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).
  12. Dekker, L. V., et al. Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).
  13. Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death. J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).
  14. Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).
  15. Tominaga, M., et al. The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Capsa cine excitatieTRPV1 kanaalgeglyceerd collageenFluo 8 calciumassayconfocale microscopieSH SY5Y differentiatiepro nociceptieve signalering
Geavanceerde glycatie-eindproducten maken menselijke sensorische neuroncellen gevoelig voor door capsaïcine geïnduceerde calciuminstroom
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.