Methodenartikel

Ontwikkeling van een model voor acuut longletsel bij neonatale biggen dat de vroege omgeving van te vroeg geboren longen nabootst

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68058

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een neonataal biggenmodel van acuut longletsel dat vroege pathogene gebeurtenissen modelleert die optreden in de premature long, waaronder een subadequate hoeveelheid oppervlakteactieve stoffen, hyperoxie, hogedrukventilatie en ontsteking, om het begrip van moleculaire triggers van bronchopulmonale dysplasie te vergemakkelijken en de therapeutische vertaling te verbeteren.

Samenvatting

Vroeggeboorte is een belangrijke oorzaak van pediatrische morbiditeit en mortaliteit. Bronchopulmonale dysplasie (BPS) is een ernstig gevolg van extreme prematuriteit, wat leidt tot veranderingen in de longgroei en langdurige ontwikkelingseffecten. De pathogenese van BPS is multifactorieel, met mechanische beademing, hyperoxie en ontsteking als de belangrijkste drijfveren van de ontwikkeling ervan. Momenteel is er geen behandeling voor BPS. In deze studie wordt een haalbaar en reproduceerbaar nieuw neonataal biggenmodel van acuut longletsel (ALI) gepresenteerd, dat de klinische stimuli nabootst waarmee de te vroeg geboren long van de mens wordt geconfronteerd. Het multi-hit ALI neonatale biggenmodel - een combinatie van uitputting van oppervlakteactieve stoffen, hyperoxie, hogedrukventilatie en intratracheale lipopolysaccharide (LPS) resulteert in verminderde oxygenatie, verstoorde longfunctie, ontsteking met neutrofieleninfiltratie en histologische longbeschadiging. De belangrijkste voordelen zijn het gebruik van de schadelijke stimuli waarvan bekend is dat ze de pathogenese van BPS stimuleren en het lage onderhoud ervan. Het genereert high-fidelity ALI en voldoet aan de ALI-criteria van de American Thoracic Society. Grote diermodellen, zoals dit biggenmodel, zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van vroege pathogene factoren, het identificeren van therapeutische doelen en het vergemakkelijken van klinische vertaling naar patiënten.

Inleiding

Extreme prematuriteit is een belangrijke doodsoorzaak bij kinderen vóór de leeftijd van vijf jaar1. De meest voorkomende ernstige complicatie van prematuriteit is bronchopulmonale dysplasie (BPS), een chronische longziekte, met multifactoriële bijdragen, waaronder ontsteking, oxidatieve stress door hyperoxie en door beademing geïnduceerd trauma2. Deze micro-omgeving leidt tot verminderde longgroei, wat een langdurige impact kan hebben op de groei en ontwikkeling van te vroeg geboren baby's3. Momenteel is er geen behandeling voor BPS.

Een recente systematische review over het gebruik van mesenchymale stromale cellen als mogelijke behandeling voor BPS wees uit dat preklinische gegevens uitsluitend bij knaagdieren waren4. Dit fenomeen komt vaak voor gezien de brede beschikbaarheid, het gebruiksgemak en het onderhoud van knaagdiermodellen. De reproductie van studies in grote diermodellen is echter van cruciaal belang om succes te garanderen bij translationele inspanningen voor nieuwe en toekomstige therapieën voor te vroeg geboren baby's. Veel klinische onderzoeken mislukken vanwege ontoereikende preklinische studies5, waardoor de ontwikkeling van de behandeling voor patiënten wordt vertraagd. Hoewel het gebruik van een niet-menselijk primatenmodel een preklinisch model is dat de voorkeur geniet om de basis te leggen voor klinische proeven bij mensen, is het arbeidsintensief, kostbaar en niet gemakkelijk toegankelijk. Het neonatale biggenmodel is voordelig, met het gebruik van medicijnen en apparatuur die vergelijkbaar zijn met neonatale zorg, waarbij de klinische neonatale intensive care-omgeving wordt nagebootst, wat leidt tot een grotere haalbaarheid voor klinische vertaling. Bovendien lijkt het immuunsysteem van de varkenslongen sterk op dat van mensen 6,7,8,9 en deelt het meer dan 80% van de genetische variantie van de toll-like receptor 410, waarbij macrofagen reageren op lipopolysacchariden (LPS)11,12 en de productie van stikstofmonoxide13 - mogelijke veroorzakers van ontstekingen in de menselijke long14. Bovendien is van varkens afgeleide longoppervlakteactieve stof een klinisch vastgestelde behandeling die wordt gebruikt voor acute longziekte bij te vroeg geboren baby's15.

Dit protocol presenteert de generatie van een nieuw eendaags model voor multi-hit acute longbeschadiging (ALI) bij pasgeboren biggen met consistente, gestandaardiseerde en vertaalbare resultaten in overeenstemming met de ALI-criteria van de American Thoracic Society 16,17,18. Herhaalde longspoelingen met zoutoplossing voor de uitputting van oppervlakteactieve stoffen met hoge druk en daaropvolgende LPS of andere toxische blootstelling zijn bij volwassen varkens gebruikt om longbeschadiging te veroorzaken18. Vergelijkbare modellen die beschikbaar zijn bij neonatale biggen zijn echter schaars19,20. Dit protocol beschrijft hoe longbeschadiging kan worden geïnduceerd met een aangepast protocol van longspoelingen met uitputting van oppervlakteactieve stoffen 21,22,23 onder hyperoxische en hogedrukventilatie, gevolgd door een ontstekingstrigger met behulp van LPS die rechtstreeks in de long wordt ingedruppeld. Dit model is klaar voor de toediening van een behandeling naar keuze, hetzij lokaal (intratracheaal - IT) of systemisch (intraveneus - IV) na de geïnduceerde longbeschadiging, met monitoring van het effect gedurende 5 uur. Het algemene raamwerk bootst de toestand van premature longen van baby's nauwkeurig na. De uitputting van de oppervlakteactieve stof herschept het respiratory distress syndrome, gekenmerkt door een gebrek aan oppervlakteactieve stof bij de geboorte. Deze aandoening kan in verband worden gebracht met barotrauma, atelectotrauma en oxygenatieproblemen die een hoog zuurstofgehalte en mechanische ventilatie vereisen. Ten slotte worden de meeste te vroeg geboren baby's geboren in een inflammatoire omgeving als gevolg van chorioamnionitis of infectie, kenmerken die werden geprobeerd te repliceren door LPS-toediening in dit biggenmodel. Dit multi-hit model van ALI creëert vergelijkbare klinische stimuli waarmee de menselijke premature long wordt geconfronteerd en die onschatbare inzichten zullen bieden in vroege pathogene processen van BPS en mogelijke optimalisatie van de therapietoediening voor effectieve klinische vertaling24.

Protocol

Alle experimenten worden uitgevoerd door gecertificeerd personeel in overeenstemming met de nationale en institutionele regelgeving (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) na goedkeuring door de regionale Commissie Dierenverzorging en de Veterinaire Dienst (protocol OHRIe-3731). Voor dit model werden pasgeboren biggen van beide geslachten gebruikt, 0-3 dagen oud, met een gemengd ras van Yorkshire, Landrace en Duroc. Gedetailleerde beschrijving van de stappen (stapnummer tussen haakjes) voor voorbereiding, anesthesie, vocht- en medicatiebeheer en monitoring die gedurende de gehele duur van het experiment worden gebruikt (1-3), chirurgische ingrepen (4) inclusief een stabilisatieperiode (5) voordat het multi-hit longletsel wordt geïnduceerd (7), met observatie na het letsel en onderhoudsbeademing (6, 8) eindigend met euthanasie en voltooiing van het experiment (10) worden gegeven. Er wordt ook een optionele gestandaardiseerde procedure voor intratracheale behandeling (9) gepresenteerd. De totale tijd van de boerderij tot het einde van het experiment en het verzamelen van monsters is ongeveer 12-15 uur. De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Zet de monitoren en de ventilator aan en kalibreer ze voordat de big arriveert. Zorg ervoor dat geheugenkaarten in de monitor zijn geplaatst voor voortdurende gegevensregistratie tijdens het experiment.
  2. Stel de ventilator in op een piekinspiratoire druk (PIP) van 15 cmH2O, positieve eindexpiratoire druk (PEEP) van 6 cmH2O, inspiratoire stroom van 8 L/min, ademhalingsfrequentie (RR) van 30/min, inspiratoire tijd (Tinsp) van 0.4 s, fractie ingeademde zuurstof (FiO2) van 1.0 en sluit een nieuw ventilatiecircuit en luchtbevochtiger aan.
  3. Bereid steriele chirurgische pakketten, afdeklakens, verbruiksartikelen (inclusief medicijnen - zie materiaaltabel), katheters en het bedrukte CRF voor. Verhoog de temperatuur van de chirurgische ruimte tot 25 °C of hoger als het onderzoeksteam dit nodig acht. Zet de warmhouddeken/watermatras op 39 °C. Bereid een warmhoudsysteem met geforceerde lucht voor dat klaar is voor gebruik als er extra temperatuurregeling nodig is.
  4. Plaats 1 L zak normale zoutoplossing in een warmwaterbad (39 °C) om de longspoelingen voor te bereiden.
  5. Stel infuuspompen voor geneesmiddelen (ketamine en propofol) in en voeg nieuwe zakken Ringers met lactaat en dextrose op kamertemperatuur toe aan vloeistofpompen.
  6. Biggetje blijft bij de zeug op de lokale boerderij en heeft er gratis toegang toe totdat het wordt opgehaald door een lid van het onderzoeksteam. Noteer het geslacht, de leeftijd, de worpgrootte en het tijdstip van geboorte.
    LET OP: In een goedgekeurd universitair transportvoertuig met een gekwalificeerde chauffeur is gedurende het hele transport een ervaren teamlid aanwezig. De big wordt in een grote afgesloten zachte drager geplaatst, waardoor de big zich veilig, vrij kan bewegen en onbeperkt kan liggen (indien nodig met een rubberen warmwaterwarmtekussen gewikkeld in dekens). Dit zorgt ervoor dat de big rustig blijft (vaak in slaap valt) in deze rustgevende omgeving. De reismand met daarin de big wordt met de veiligheidsgordel vastgezet. Het teamlid heeft de rol om de big zachtjes te kalmeren en harde geluiden te vermijden om het stressniveau van de big tot een minimum te beperken.
  7. Beperk bij aankomst in de onderzoeksinstelling het lawaai tot een minimum en houd de big voorzichtig vast terwijl u de anesthesiekegel op zijn gezicht plaatst.

2. Voorbereiding van dieren

OPMERKING: Dit gedeelte omvat de inductie en het onderhoud van anesthesie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).

  1. Start de O2-stroom zonder isofluraan wanneer u de neuskegel op zijn plaats zet. Als de big kalm is, begin dan met isofluraan en verhoog tot 3% isofluraan is toegediend (ongeveer 60 s). Houd de ademhaling zorgvuldig in de gaten en pas het isofluraan dienovereenkomstig aan.
  2. Controleer of de big niet reageert door de teen hard af te knijpen.
  3. Zodra de big niet meer reageert, weegt en meet u deze voor de juiste medicatiedosering.
  4. Injecteer buprenorfine HCL (0,04 mg/kg) via intramusculaire (IM) route met een naald van 25 G in het achterbeen voor analgesie.
  5. Bevestig de pulsoximeter aan de hoef rechtsboven (preductaal), de niet-invasieve bloeddrukmanchet (totdat de dijbeenslagader is gecanuleerd) en de ECG-kabels.
  6. Plaats 24 G angiocaths in beide oren. Bevestig met zoutoplossing gespoelde 6" verlengsets met 4-weg afsluitkranen. Ondersteun het oor met een tongspatel om positionele obstructie te voorkomen.
  7. Haal bloed uit de ingebrachte oorkatheter voor het meten van de bloedglucose (BG) met een gekalibreerde glucometer volgens de instructies van de fabrikant.
  8. Start de D5W-infusie intraveneus (IV) met 5 ml/kg/uur en pas deze aan op basis van de bloedglucosespiegel om een BG-waarde van 4-5 mmol/l te bereiken.
  9. Dien bolusinjecties met analgesie/anesthesie toe in de tweede oorader.
    OPMERKING: Kritisch begrip van de eigenschappen en bijwerkingen van deze medicijnen is vereist voor een optimaal en veilig gebruik.
    1. Dien een bolus van 2 mg/kg IV verdunde ketamine (10 mg/ml) en een bolus van 5 mg/kg IV propofol (10 mg/ml, 1%) toe, toegediend in meerdere bolussen met een kleiner volume. Pas op voor de mogelijkheid dat apneu optreedt na een bolus propofol. Ga door met zorgvuldige toediening van bolussen met propofol (voor een totaal van 5 mg/kg) totdat de big niet meer reageert op de knijptest met harde teen en de continue infusie met propofol tot stand is gebracht.
    2. Stop met isofluraan (zodra de intraveneuze propofolinfusie is gestart) en ga door met continue intraveneuze anesthesie gedurende de rest van het experiment.
  10. Begin met continue infusie van het volgende anesthesieregime met zorgvuldige titratie op basis van hartslag en bloeddruk, inclusief terugtrekkingsreflex om de stabiele chirurgische diepte van de anesthesie te bereiken:
    1. Propofol (10 mg/ml) met een snelheid van 10-30 mg/kg/uur (overeenkomend met 1-3 ml/kg/uur) IV.
    2. Ketamine (100 mg/ml) met een snelheid van 5-10 mg/kg/uur (gelijk aan 0,05-0,1 ml/kg/uur) IV.
      OPMERKING: Analgesie-/anesthesie-infuuslijnen worden bevestigd aan de contralaterale oorkatheter van de D5W-infusie. Aanpassing aan de totale vochtinname en de omgevingstemperatuur kan nodig zijn om de juiste ondersteuning en homeostase te garanderen.

3. Vloeistoffen, medicijnen en monitoring

OPMERKING: Dit gedeelte bevat informatie over het handhaven van hydratatie, glucosetoevoer, analgesie/anesthesie en het waarborgen van een goede beoordeling van experimentele gegevens, zorgen of problemen.

  1. Zorg ervoor dat de totale gecombineerde vloeistof (LRS en D5W) IV-infusiesnelheid voor homeostase over het algemeen 5-8 ml/kg/uur is.
    1. Dien D5W toe aan de oorveneus katheter met 5-10 ml/u (elk uur aangepast op basis van arteriële bloedglucosewaarden (BG) - streefdoel 4-5 mmol/l).
    2. Dien LRS toe via de femorale veneuze katheter met een snelheid van 1-6 ml/kg/uur om de vloeistofhomeostase te behouden. Om stolling van zowel arteriële als veneuze toegang te voorkomen, bevestigt u een onder druk gehepariniseerde NS-infuuszak aan de transducer en houdt u de druk tussen 250-300 psi.
    3. Zorg voor de juiste algemene anesthesiediepte en analgesie tijdens de operatie en voordat de stabilisatieperiode begint (stap 5.1) en spierontspanning induceert.
  2. Monitoring van de verschillende parameters (fulltime baan voor één persoon gedurende het hele experiment).
    OPMERKING: Monitoring en documentatie van vitale functies, beademingsinstellingen, interventies, genomen monsters, medicijnen, met doses en tijden, in een vooraf gemaakte gedrukte CFR (zie Aanvullend dossier 1) gedurende het gehele experiment. De geregistreerde continue gegevens van de drukmonitor en de ventilator worden aan het einde van het experiment opgeslagen voor latere analyse.
    1. Bewaak de zuurstofverzadiging (SpO2) - zorg voor het preductale (rechtsbovenhoef) pulsoximetersignaal.
    2. Bewaak de hartslag (HR) - bevestig de ECG-kabels aan de big.
    3. Om de temperatuur te controleren, plaatst u de gesmeerde rectale thermometer 3-4 cm diep en bevestigt u deze met tape aan de staart. Houd de rectale temperatuur van de big op 38-39 °C door het verwarmingskussen en de omgevingstemperatuur (25 °C) aan te passen. Als u een elektrische verwarmingsbron gebruikt, zorg er dan voor dat er een extra deken tussen de big en de verwarmingsmat wordt gelegd om brandwonden te voorkomen.
      OPMERKING: Gebruik een extra verwarmingsbron, zoals een verwarmingssysteem met geforceerde lucht (zoals een deken die boven de big wordt gelegd) als de temperatuurhomeostase niet voldoende wordt bereikt.
    4. Voer voor de bloeddruk niet-invasieve monitoring uit met een manchet van de juiste maat tot na de operatie, bepaal vervolgens de invasieve bloeddruk, inclusief gemiddelde arteriële druk (MAP) en centrale veneuze druk (CVP), en documenteer op de CRF.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat arteriële en veneuze transducerkoepels op harthoogte worden geplaatst en op nul worden gezet voor nauwkeurige metingen.
    5. Voer bloedafname uit op vooraf gespecificeerde tijdstippen via een centrale arteriële of veneuze katheter. Voer een bloedgasanalyse uit van 0,1 ml gehepariniseerd arterieel bloed met behulp van een draagbare bloedanalysator (een apparaat dat minimaal de pH, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, lactaat, creatinine, Na, K, Cl kan beoordelen - te noteren op CRF) om de ventilatie en metabole controle tijdens het experiment te beheren.
    6. Voer biologische bemonstering uit voor toekomstige experimenten en analyses: verzamel doorlopend volbloed, plasma en urine op relevante tijdstippen tijdens het experimentele protocol, volgens de onderzoeksdoelstellingen. Verzamel ook eindpuntmonsters, waaronder bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), longweefsel en andere weefsels16,17, indien relevant voor de onderzoeksdoelstellingen.
      1. Beperk iatrogene anemie en hypovolemie:
        1. Zuig langzaam (equivalent van drie keer het volume van de dode ruimte) bloed op in een spuit, zet opzij en neem voldoende volume op voor toekomstige experimentele analyse (0,4-1,5 ml)25 zoals inflammatoire en oxidatieve stressmarkers. Pas de monstervolumes aan het lichaamsgewicht, het hemoglobinegehalte en de stabiliteit van de big aan.
          OPMERKING: Het bloed uit de dode ruimte wordt teruggegeven aan het dier en de lijn wordt gespoeld met een zoutoplossing met ten minste het equivalente volume dat is afgenomen voor bloedafname (bloedgas ± bloed voor toekomstige experimenten) om de bloedlijn vrij te maken, waardoor mogelijke occlusie als gevolg van bloedstolsels wordt beperkt.
    7. Registreer alle vitale functies en beademingsparameters in CRF met regelmatige tussenpozen om de 15-30 minuten, vaker tijdens de inductie van anesthesie en operatie, of als de big onstabiel is.
    8. Noteer veranderingen in medicijnen vanaf het begin van de anesthesie tijdens het experiment door de begin- en eindtijd en dosisaanpassingen te noteren.
    9. Evalueer de diepte van de anesthesie door de teen/kransslagader te beoordelen op terugtrekkingsreflex, in eerste instantie met een regelmatige frequentie. Zodra volledige spierontspanning is bereikt, controleert u de hartslag en bloeddruk voor een voortdurende dieptebeoordeling van de anesthesie.
    10. Streef tijdens het experiment naar het volgende, als er niets anders wordt vermeld: HR: 120-180 bpm, MAP: 50-80 mmHg, CVP: 3-10 cmH2O, Lichaamstemperatuur: 38-39 °C, BG: 4-5 mmol/L, PaCO2: 35-45 mmHg, RR aanpassen (max. 60 ademhaling/min), Ademvolume (VT): 7 ml/kg, pas de PIP aan.

4. Chirurgische ingreep (tijd: ~30-40 min)

  1. Zorg voor ventilatie tijdens de operatie.
    1. Houd een RR van 30 ademhalingen/min aan, richt de expiratoire VT op 10 ml/kg aangepast door PIP, constante PEEP van 6 cmH2O, Tinsp van 0,4 s en FiO2 op 1,0.
  2. Creëer een steriel veld door een geprefereerde aseptische huidscrub uit te voeren in de nek voor tracheotomie en lies voor toegang tot het dijbeenvat met behulp van standaard schrobtechnieken.
    1. Voer de incisie in de nek uit.
      1. Maak een incisie in de huid in de nek met een scalpel tussen het cricoid kraakbeen en de sternale inkeping (ongeveer 10 cm). Gebruik stompe dissectie om de luchtpijp te isoleren.
      2. Rijg twee 12-inch navelstrengbanden onder de luchtpijp.
      3. Maak een incisie van 5 mm tussen de tracheale ringen en het meest voorste deel van de luchtpijp, net onder het cricoid kraakbeen. Breng de endotracheale tube (ETT) in. Leg de eerste knoop bovenop de luchtpijp die zich het dichtst bij de incisie bevindt.
      4. Blaas de ETT-manchet op, trek de ETT voorzichtig in totdat de manchet wordt tegengehouden door de stropdas. Draai de eerste stropdas vast en bevestig een tweede stropdas aan de ETT. Deze methode zorgt ervoor dat de punt zich boven de carina bevindt, bevestigd door auscultatie van symmetrische en bilaterale ademgeluiden.
        OPMERKING: De bronchus van de rechterkwab van de schedel ontstaat proximaal van de vertakking van de luchtpijp. Wees voorzichtig met verstopping van deze bronchiën als de ETT te diep wordt geplaatst. Als er problemen zijn met ventilatie of plotselinge veranderingen, overweeg dan om de slang aan te passen. De vagosympathische romp en larynxzenuwen liggen in dit deel van de nek. Er moet voor worden gezorgd dat stimulatie of letsel aan deze zenuwen wordt voorkomen.
    2. Voer de incisie in de lies uit.
      1. Palpeer de dijbeenslagader, maak een oppervlakkige huidincisie in de rechter lies met een scalpel (ongeveer 8-10 cm).
      2. Gebruik stompe dissectie om de dijbeenslagader en ader te isoleren.
      3. Rijg twee hechtingen (3.0 zijde) onder elk van de dijbeenslagaders en -aders om ze te isoleren26. Bereid katheters voor om te worden ingebracht.
        1. Voor de juiste katheterisatie van de dijbeenader tilt u beide hechtingen op om de bloedstroom af te sluiten. Bind de dijbeenader distaal af van de voorgestelde inbrengplaats.
          1. Breng de katheter volledig in, trek de stilet iets terug en bind de distale band vast om de katheter op zijn plaats te houden. Verwijder de stilet en bevestig de 6-inch uitbreidingsset met een driewegkraan die is geprimed met zoutoplossing.
          2. Voordat u de katheter vastzet, moet u een kleine hoeveelheid bloed terugtrekken om de doorgankelijkheid te garanderen. Zet de katheter vast in het bloedvat met behulp van de proximale hechtband, zodat de katheter er niet uit kan glijden.
          3. Bevestig de secundaire poort voor de toediening van onderhoudsvloeistof en de infusie van medicijnen. Sluit de primaire poort voor centrale veneuze druk aan.
        2. Gebruik voor de juiste femorale arteriële katheterisatie dezelfde stappen op de dijbeenslagader als voor de ader beschreven in de stappen 4.2.2.3.1.1 tot 4.2.2.3.1.3.
          1. Bevestig de eerste poort van de 3-weg kraan voor invasieve bloeddrukmeting en verlies lies- en nekincisies met chirurgische nietjes.
    3. Voer het inbrengen van de suprapubische blaaskatheter uit voor toegang tot de urine.
      1. De blaas bevindt zich oppervlakkig in de onderbuik, iets links van de mid-sagittale lijn. Reinig de buik met behulp van een aseptische techniek.
      2. Breng een steriele 18 G angiokatheter (2") evenwijdig aan de buikwand in, craniaal tot het laagste paar tepels (5-6 cm onder de navel), gericht naar de navel, terwijl u met één hand lichte druk uitoefent op beide zijden van de blaas om te stabiliseren en iets groter te maken (optioneel protocol voor suprapubische aspiratie is elders te vinden27).
      3. Zodra de urinestroom is bevestigd, plakt u de katheter op de buik om de positie vast te zetten. Bevestig een verlengset met grote boring aan de katheter. Plaats het distale uiteinde in een buis van 50 ml die onder het dier wordt geplaatst.

5. Stabilisatie en gestandaardiseerde longrekrutering na de operatie (tijd: ~30-60 min)

OPMERKING: De stabilisatie begint wanneer alle chirurgische ingrepen zijn voltooid. Voldoende analgesie/anesthesiediepte is essentieel vóór spierontspanning, omdat het ervoor zorgt dat vitale functies, zoals de MAP en HR, binnen het normale bereik liggen en er geen ontwenningsreflexen zijn. MAP en HR worden gedurende het hele protocol continu gecontroleerd om de juiste anesthesiediepte te garanderen.

  1. Dien rocuronium (0,3 mg/kg) bolus IV toe (via oorader D5W-toegang) en start een continue infusie van rocuronium (5,5 mg/kg/uur) voor spierontspanning vóór de longrekruteringsmanoeuvre. Deze infusie zal voor de duur van het experiment worden voortgezet om de spoelingsprocedure te standaardiseren en asynchronie met het beademingsapparaat te voorkomen.
  2. Voer een gestandaardiseerde longrekruteringsmanoeuvre uit.
    1. Stapsgewijze verhoging van PEEP: begin bij PEEP 6 cmH2O, ga elke minuut met 1 cmH2O omhoog totdat PEEP 10 cmH2O is bereikt. Pas de PIP aan om VT 10 ml/kg te behouden.
    2. Blijf 2 minuten op PEEP 10 cmH2O voordat u op de omgekeerde manier terugkeert naar een PEEP 6 cmH2O (zoals in stap 5.2.1) met behoud van VT 10 ml/kg.
    3. Bij stabiliteit bij VT 10 ml/kg op een PEEP 6 cmH2O, noteer dan de ademhalingsinstellingen, fysiologische parameters en neem een arterieel bloedgas (tijdstip VT 10 ml/kg op CRF).
      1. Zorg ervoor dat PaO2 >400 mmHg is (verwachte respons op hyperoxie bij een dier met gezonde longen). FiO2 1.0 wordt tijdens de beginfase van het experiment gebruikt om een passende respons op hyperoxie als inclusiecriterium te garanderen.
      2. Als dit niet wordt bereikt:
        1. Controleer de positie van de endotracheale tube, de instellingen van de beademingsapparatuur, de toevoer van zuurstof en de juiste bloedafnametechniek. Herhaal de longrekruteringsmanoeuvre één keer om een goede rekrutering te garanderen.
        2. Als het nog steeds niet is verbeterd, sluit het dier dan uit en euthanaseer het onmiddellijk (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) vanwege het mogelijke intrinsieke probleem van de long (ongezonde long door eerdere niet-experimentele blootstelling - d.w.z. op de boerderij).
      3. Pas de RR aan om PaCO2 tussen 35-45 mmHg te houden.
      4. Verlaag de PIP om VT 7 ml/kg te bereiken, waarbij FiO2 1.0 en PEEP 6 cmH2O blijven.
      5. Noteer na stabilisatie de basislijnwaarden voor VT 7 ml/kg op het CRF-blad met fysiologische parameters en monsters, waaronder arterieel en veneus bloedgas. Stabilisatie omvat vitale functies, zoals in stap 3.2.10, en bloedgaswaarden van: PaO2: 400-500 mmHg, PaCO2: 35-45 mmHg, pH: 7,35-7,45, BG: 4-5 mmol/L.

6. Ventilatie voor controledieren

  1. Gebruik volumegestuurde ventilatie met een ademvolume van 7 ml/kg, PEEP van 6cmH2O en FiO2 van 1,0. Veroorzaakt geen longbeschadiging bij controledieren (d.w.z. voer geen uitputting van oppervlakteactieve stoffen of endotoxine-instillatie uit).
  2. Ga ongeveer 90 minuten door met beademen om overeen te komen met de gemiddelde duur die nodig is om longbeschadiging bij proefdieren te veroorzaken (zie stap 7 en figuur 1). Ga na deze periode direct door naar stap 10.

7. Inductie van acuut longletsel (multi-hit model)

  1. Voer uitputting van oppervlakteactieve stoffen uit (tijd: 1-2 uur)
    1. Voordat u met longspoeling begint, moet u het afzuigapparaat inschakelen en ervoor zorgen dat het klaar is voor gebruik. Plaats de opvangemmer voor het spoelen op zijn plaats. Plaats absorberende kussentjes onder het hoofd van het dier en onder de operatietafel om alle vloeistof op te vangen die tijdens het spoelen is gelekt en teruggewonnen.
      1. Weeg de pads voor en na het lavagen. Stel de ventilator in op PEEP 5 cmH2 O, PIP 25 cmH2O, RR 25/min en FiO2 1.0. Handhaaf deze drukgecontroleerde beademingsinstellingen tijdens de spoelprocedure. Verwacht dat de VT met ongeveer 35%-45% zal afnemen tijdens de volledige lavage.
    2. Koppel het ventilatiecircuit los van de ETT en bevestig het spoeltrechterapparaat (zie aanvullend dossier 1).
    3. Druppel 30 ml/kg warme isotone zoutoplossing (NS) in de longen door NS voorzichtig in de trechter te gieten die ongeveer 30 cm boven de big wordt gehouden.
    4. Masseer de ribbenkast door bilateraal op het laterale aspect te drukken om een mechanische "knijp" te bieden. Help zoutoplossing in de longen te brengen en circuleer het in het spoelapparaat. Wacht 2-3 s tussen de massages.
      OPMERKING: Vermijd te snel of te langzaam masseren om onvoldoende verwijdering van oppervlakteactieve stoffen of verminderde veneuze terugkeer te voorkomen. Niet meer dan 30 s per wasronde.
      1. Verwijder spoelvloeistof door de trechter onder de big te laten zakken. Koppel de trechter iets los van de ETT om de vloeistof in de opvangemmer op de vloer te laten lopen.
      2. Voer actieve afzuiging uit gedurende niet langer dan 10 s. Breng de afzuigkatheter in de ETT in terwijl u doorgaat met de massage van de ribbenkast om de vochtafvoer te vergemakkelijken. Bewaak MAP en HR en sluit de ventilatie vroegtijdig weer aan als een van beide parameters aanzienlijk daalt.
      3. Sluit het ventilatiecircuit weer aan. Als er overtollig vocht in de ETT achterblijft, voer dan een tweede zuigbeurt uit.
    5. Laat de big tussen de spoelrondes minstens 3 minuten herstellen om stress en het risico op intolerantie te verminderen.
    6. Start de volgende spoelronde zodra SpO2 weer 100% is. Als SpO2 niet terugkeert naar 100%, controleer dan PaO2via bloedgas zodra SpO2 is gestabiliseerd
      1. Als PaO2 >100 mmHg - herhaal dan de longspoelingen (stappen 7.1.2-7.1.6).
      2. Als PaO2 <100 mmHg - wacht dan 15 minuten met behoud van de ventilatie-instellingen van de spoeling en herhaal vervolgens de bloedgasanalyse.
      3. Indien PaO2 >100 mmHg - ga door met spoelen en ga verder met stap 7.1.6 om de omvang van de verwonding opnieuw te beoordelen.
    7. Controleer of de schade door de uitputting van de oppervlakteactieve stof optreedt wanneer PaO2 gedurende 15 minuten <100 mmHg blijft. Stop de spoeling en ga verder met de volgende stap.
  2. Indruppel intratracheaal endotoxine (Tijd: 15 min)
    1. Bereid lipopolysaccharide (LPS) van Escherichia coli (1,5 mg/kg) door te verdunnen in NS tot een totaal volume van 2 ml in een spuit van 3 ml.
      OPMERKING: Selecteer de stam en dosis indien van toepassing, rekening houdend met mogelijke stamafhankelijke variatie in effecten.
    2. Wacht 15 minuten na de laatste longspoeling en druppel vervolgens LPS intratracheaal (IT) in met de big in rugligging.
    3. Verbeter de homogene LPS-verdeling in de atelectatische long met behulp van de volgende stappen:
      1. Vervang het standaard ETT-uiteinde door een Y-poortadapter om gelijktijdige beademing en LPS-toediening mogelijk te maken via een katheter via de poort aan de zijkant met ventiel.
      2. Breng PEEP van 10 cmH2O aan gedurende 1 min. Pas de PIP aan om de VT op 7 ml/kg te houden en stel de RR in op 40 ademhalingen/min.
      3. Steek een katheter via de zijpoort in de ETT tot een vooraf gemeten diepte, zodat de punt 1-2 mm voorbij de ETT uitsteekt.
      4. Injecteer de LPS via de katheter. Spoel de katheter door met 1 ml NS, gevolgd door een luchtbolus van 9 ml om een volledige toediening te garanderen.
      5. Verwijder de katheter en sluit de zijpoort.
      6. Ga door met beademen met PEEP 10 cmH2O (pas de PIP aan om VT 7 ml/kg te behouden) gedurende 3 minuten na toediening van LPS.
      7. Koppel het beademingscircuit gedurende 30 s los van de ETT om onbedoelde rekrutering van longweefsel om te keren.
      8. Stel tijdens het loskoppelen de ventilatorinstellingen in op FiO2 0.5, PEEP 6 cmH2O, PIP om VT 7 ml/kg te behouden en verhoog de RR tot 40-60 ademhalingen/min om PaCO2 van 35-45 mmHg te bereiken.
      9. Zodra VT is gestabiliseerd op 7 ml/kg, registreert u de fysiologische metingen van Timepoint 0 uur en vult u het CRF-blad in. Pas de RR aan op basis van PaCO2 uit bloedgasanalyse.

8. Ventilatie tijdens de observatieperiode (Tijd: ~6 uur)

  1. Schakel over op volumegestuurde ventilatie met FiO2 op 0.5 en PEEP op 6 cmH2O. Pas de PIP naar behoefte aan om de VT op 7 ml/kg te houden (stel geen maximale PIP in). Pas RR aan, tot een maximum van 60 ademhalingen/min, om de normale PaCO2 te behouden.
  2. Gebruik bloedgasmetingen per uur om RR-aanpassingen gedurende de rest van het experiment te begeleiden. Pas de PIP continu aan om de VT op 7 ml/kg te houden.
  3. Pas deze ventilatieparameters gelijkmatig toe op zowel controledieren als dieren met meerdere treffers gedurende de gehele observatieperiode van 6 uur (zie figuur 1).

9. Behandelingsprocedure - optioneel (Tijd: ~10-20 min)

  1. Voor mogelijke interventiestudies dient u het therapeutische middel toe te dienen via een klinisch relevante route, zoals intratracheaal (IT), intraveneus (IV), subcutaan, intramusculair of intranasaal. Selecteer de timing van de behandeling op basis van het experimentele ontwerp. Als er geen behandeling wordt toegediend, ga dan verder met stap 10. Hieronder vindt u een voorbeeld van IT-beheer:
    1. Plaats de big in de rechter zijlighouding.
    2. Houd de PEEP op 6 cmH2O. Pas de PIP aan om een VT van 7 ml/kg te bereiken.
    3. Steek de katheter in de poort aan de zijkant met ventiel tot de vooraf bepaalde lengte (zoals beschreven in stap 7.2.3.3). Drink de helft van de beoogde dosis of het beoogde volume van de interventie. Volg met een bolus van 1 ml NS en 9 ml lucht. Beperk het totale volume tot 2,5 ml/kg om het risico op ventilatie-occlusie na de bolusinjectie te minimaliseren.
    4. Sluit de zijpoort met ventiel af met de dop om lekkage van ventilatie te voorkomen.
    5. Zet de big terug in de linker zijlighouding en herhaal de stappen 9.1.3-9.1.4.
    6. Zet de big terug in rugligging. Pas de PIP aan om de VT op 7 ml/kg te houden.
    7. Ga door met ventileren zoals beschreven in stap 8.

10. Euthanasie en voltooiing van het experiment

  1. Voer de definitieve fysiologische opnames en monsterverzamelingen uit na 6 uur ventilatie tijdens de observatieperiode (stap 8).
  2. Euthanaseer het dier met 120 mg/kg pentobarbital-natrium IV (240 mg/ml) toegediend als bolus (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  3. Zorg voor de dood van een dier met de afwezigheid van vitale functies (hartslag, bloeddruk en ademhaling). Auscultaat voor de afwezigheid van hartslag en ademgeluiden met een stethoscoop voor bevestiging van de dood. De dood wordt verder bevestigd met een terminale weefselverzameling van het hart en de longen.
  4. Verzamel de weefselmonsters en lichaamsvloeistoffen voor verdere biochemische, moleculaire en/of histologische analyse14,17 voor toekomstige experimenten.
  5. Sla alle gegevens op in de bewakingsapparatuur en het beademingsapparaat, zorg ervoor dat back-upkopieën worden geüpload naar de lokale schijf en gedeelde schijf en schakel alle apparatuur uit.
  6. Gooi alle scherpe voorwerpen/biologisch gevaarlijke materialen weg zoals voorgeschreven door het lokale beleid.
  7. Reinig alle oppervlakken met het antiseptische product van het voorkeur.
  8. Was alle instrumenten en laat ze een nacht drogen.

Resultaten

Eindpunten van dit model zijn afgestemd op de criteria van de American Thoracic Society voor ALI (minimaal 3 van 4), waaronder fysiologische, histologische, inflammatoire en alveolaire-capillaire barrièreveranderingen16,17. Verdere eindpunten kunnen worden opgenomen, afhankelijk van de studie en naar goeddunken van elke onderzoeksgroep die dit model wil implementeren. Matig longletsel wordt gedefinieerd als een verhouding van de gedeeltelijke fractie zuurstof in arterieel bloed tot de fractie ingeademde zuurstof (PaO2/FiO2, ook bekend als P/F-ratio) < 200 mmHg en ernstige < 100 mmHg17. De zuurstofindex (OI) wordt berekend met behulp van de volgende formule: OI = (gemiddelde luchtwegdruk (mAWP) * %O2)/PaO2, en waarden tussen 8-16 worden geclassificeerd als matig letsel28. In vergelijking met controledieren vertoonden meervoudige dieren ernstig tot matig longletsel vanwege hun verminderde oxygenatie-index, P/F-ratio en verminderde therapietrouw van het ademhalingssysteem (Figuur 2). Duidelijke tekenen van histologisch letsel waren aanwezig met behulp van een histologische longletselscore van 5 modaliteiten16,17 (Figuur 3), met instroom van neutrofielen in de alveolaire en interstitiële ruimte, eiwitachtig puin dat de luchtruimten vulde en verdikking van het alveolaire septum. De instroom van neutrofielen in de BALF geeft een indicatie van ontstekingsprocessen naast een verhoogd IL-6-cytokine in het longweefsel (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Stroomschema van acuut longletsel bij neonatale biggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Een matige tot ernstige ALI wordt waargenomen door het multi-hit-letsel te volgen dat in dit protocol wordt gepresenteerd. (A,B) Verhoogde oxygenatie-index (tussen 8-12) en lage PaO2/FiO2 (P/F)-ratio worden verkregen in het hierin gepresenteerde multi-hit-model (rode lijn) in vergelijking met de controle (blauwe lijn), in lijn met matig tot ernstig longletsel. (C) De longfunctie is aangetast bij dieren met meerdere treffers, hier weergegeven als een afname van >50 % van de therapietrouw van het ademhalingssysteem. Aantal dieren (N): controle (N = 5) en multi-hit (LPS-stam Ø55:B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Alle gebruikte waarden betekenen ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Multi-hit ALI-model vertoont een heterogene histologische schade. (A,B) Macroscopisch bewijs van fragmentarisch longletsel dat bij voorkeur het achterste centrale aspect van de multi-hit long aantast, wordt waargenomen. (C,D) Representatieve beelden (100x) van met hematoxyline en eosine (H&E) gekleurde longsecties die neutrofiele influx in de alveolaire en interstitiële ruimte laten zien, met alveolaire en septale verdikking in de multi-hit long. (E,F) Representatieve beelden (400×) van met H & E gekleurde longsecties benadrukken aantasting van de structurele integriteit, neutrofiele infiltratie en afzetting van puin in de alveolaire ruimte van de multi-hit long. Blauwe vierkanten geven het ingezoomde gebied in (E,F) aan. De zwarte schaalbalk staat voor 100 mm (C,D) en 50 mm (E,F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Multi-hit model toont een ontstekingsreactie na ALI. (A) Instroom van neutrofielen met neutrofielen die meer dan 75% van de fractie van het totale aantal cellen in de bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) bereiken 6 uur na geïnduceerde longbeschadiging (multi-hit) in vergelijking met controledieren. (B) Pro-inflammatoir cytokine IL-6 is verhoogd in bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) en (C) longweefsel 6 uur na geïnduceerde ALI. Het aantal dieren (N) varieert afhankelijk van het beschikbare materiaal op het tijdstip voor analyse. Voor BALF (B) werd een enzymgekoppelde immunosorbenttest gebruikt, terwijl voor longweefsel (C) multiplexlaserpareltechnologie werd uitgevoerd. Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Case-monitoringformulier voor model voor acuut longletsel bij neonatale biggen. Klik hier om deze brochure te downloaden.

Discussie

Het ALI-model voor neonatale biggen bestaat uit een multi-hit-model met longspoeling voor het verwijderen van oppervlakteactieve stoffen (het nabootsen van respiratory distress syndrome dat leidt tot atelectotrauma), hoge blootstelling aan zuurstof (leidend tot reactieve zuurstofsoorten), mechanische ventilatie (baro/volu-trauma), evenals IT-toediening van LPS als een ontstekingsstimulus, een weerspiegeling van de verschillende componenten waarvan wordt aangenomen dat ze betrokken zijn bij de pathogenese van BPS bij te vroeg geboren baby's2. Tijdens het uitputtingsproces van de oppervlakteactieve stof is er een doelbewuste verhoging van druk en zuurstof om bij te dragen aan letsel. De blootstelling aan hyperoxie met FiO2 1.0 is ongeveer 3 uur en er wordt gedurende ongeveer 90 minuten hoge druk toegevoegd tijdens de fase van geïnduceerde longbeschadiging (overvloedige depletie, lavage en endotoxine-installatie). Hoge zuurstofgehaltes tijdens reanimatie (hoge FiO2 0,9 vs. lage FiO2 0,3) bij extreem te vroeg geboren baby's resulteerden in hogere oxidatieve stress en ontsteking, met blootstelling aan hyperoxie minder dan 1 uur29. Bij uitputting van de oppervlakteactieve stof in het biggenmodel zullen de longen inklappen, wat resulteert in atelectase, en het vermogen om de alveolaire doorgankelijkheid te behouden zal worden verminderd voor de juiste ventilatie en oxygenatie. Als zodanig, ook al worden de instellingen in de observatieperiode verminderd, zal de verwijdering van de oppervlakteactieve stof resulteren in een behoefte aan hogere druk om een ademvolume van 7 ml/kg te bereiken. De longen zullen in staat zijn om oppervlakteactieve stof te produceren naarmate de tijd verstrijkt, en de omvang van het aanhoudende schadelijke proces kan in de loop van de tijd afnemen. Dit nieuwe neonatale biggenmodel van ALI vertoont echter weinig herstel (Figuur 2) van longfunctie (compliantie) en oxygenatie (PF-ratio) tijdens de observatieperiode gedurende 6 uur na de geïnduceerde longschade. Dit model lijkt sterk op de meest voorkomende initiële postnatale omstandigheden waarmee extreem premature baby's worden geconfronteerd, waardoor het zeer relevant is voor translationele inspanningen. Het model creëert een matig (100-200 mmHg) tot ernstig (<100 mmHg) acuut longletsel, gedefinieerd door de P/F-verhouding28. Het LPS-effect met ontsteking piekt één tot 2 uur na het letsel30. Dit model kan worden gebruikt als een steiger die door andere groepen kan worden gemanipuleerd door de duur van de observatie of behandeling aan te passen aan hun onderzoeksprogramma.

Kritieke stappen in het protocol

Ondanks de prioriteit die wordt gegeven aan toegankelijkheid, blijft dit grote diermodel complex, waardoor een zeer bekwaam team moet samenwerken om dit experiment tot een goed einde te brengen. Er zijn kritieke stappen in het protocol die extra voorzichtigheid vereisen. Deze overwegingen zijn van cruciaal belang om het succes van dit complexe experimentele kader te garanderen.

Transport van het dier

Vroege loslating van de moeder zal naar verwachting een uiterst stressvolle tijd zijn voor het dier, wat mogelijk leidt tot het onvermogen om cardiovasculaire stabiliteit te behouden en mogelijk overlijden tijdens transport. Het hierin gepresenteerde transportprotocol (zie stap 3) maakte het echter mogelijk om zeer rustige dieren te krijgen (sommige vielen zelfs in slaap), waardoor volledige experimenten mogelijk waren. Hoewel het moeilijk is om duidelijke aanbevelingen te doen over de maximale duur van het transport, waren de biggen in onze ervaring comfortabel bestand tegen een transport van ongeveer 60 minuten.

Ventilatie optimalisatie

Het beademingsapparaat moet worden ingesteld om te compenseren voor de naleving van het circuit om ervoor te zorgen dat het volledige ademvolume aan de longen wordt afgegeven. Dit is vooral belangrijk tijdens de uitputting van de oppervlakteactieve stoffen, omdat de big hemodynamisch onstabiel kan worden als het ademvolume in het circuit verloren gaat. Onderzoekers moeten bevestigen dat het beschikbare beademingsapparaat de juiste afgifte van ademvolume voor een pasgeborene mogelijk maakt. Beademingsapparaten voor volwassenen zullen vaak niet in staat zijn om de juiste neonatale ademvolumes te bereiken. PIP wordt gebruikt om de waarden van het expiratoire teugvolume te handhaven (7 ml/kg gebruikt in dit protocol zoals eerder beschreven door anderen 14,19,20,21,31,32, behalve tijdens longspoeling - zie de volgende paragraaf). Het gestandaardiseerde gebruik van de endotracheale tube-adapter met een poort aan de zijkant met klep tijdens LPS-toediening, of voor elke IT-behandeling, maakt het mogelijk om de luchtwegdruk op peil te houden door te voorkomen dat de verbinding met het beademingscircuit wordt losgekoppeld.

Gestandaardiseerde longrekruteringsstrategie na een operatie

Atelectase kan zich ontwikkelen in de longen van biggen tijdens de voorbereidende en chirurgische fase. Een "longrekrutering"-manoeuvre na spierontspanning is gegeven33 om een goede longbeluchting te garanderen. Na de rekruteringsmanoeuvre wordt verwacht dat de partiële zuurstofdruk in arterieel bloed meer dan 400 mmHg zal zijn, gegeven de normale hyperoxische respons in gezonde open longen. Als dit niet wordt bereikt, moet de onderzoeker overwegen of de longen niet op de juiste manier zijn gerekruteerd vanwege niet-geoptimaliseerde experimentele omstandigheden of dat de big een reeds bestaande aandoening kan hebben (bijvoorbeeld als de big is verkregen van een bedrijf waar onbekende blootstellingen kunnen optreden). Het protocol maakt het mogelijk om de vorige verklaring te testen met de herstart van de rekruteringsmanoeuvre om te zien of dit doel kan worden bereikt. Als het niet lukt om voor de tweede keer 400 mmHg PaO2 te bereiken, beschouw dan de uitsluiting van het dier als een reeds bestaande aandoening die zou kunnen bestaan en die de experimentele resultaten op ongepaste wijze zou beïnvloeden.

Voldoende vocht en metabole homeostase zijn van het grootste belang

Dit beperkt belangrijke verstorende effecten die verband houden met slechte hydratatie en metabolische controle. Deze pasgeboren biggetjes, meestal geboren in een groot nest, zullen niet allemaal een vergelijkbare kans hebben om te zogen. Als zodanig kunnen ze worden blootgesteld aan een zekere mate van postnatale uitdroging voordat ze in het experiment worden gebruikt. Een totale vochtinname van 5-8 ml/kg/u is voldoende om een goed intravasculair volume te behouden 14,34. Ervoor zorgen dat de metabole controle plaatsvindt met het handhaven van een bloedglucosespiegel tussen 4-5 mmol/L (normaal fysiologisch bereik voor pasgeboren biggen35,36). Hoog bloedlactaat is een andere referentie die wordt gebruikt om een slechte zuurstoftoevoer weer te geven en kan mogelijk een lage intravasculaire vloeistofstatus vóór hypoxie weerspiegelen. Een voldoende vochtregime en een goed gehydrateerd dier zijn bestand tegen uitputting van oppervlakteactieve stoffen met cardiovasculaire stabiliteit en genereren geen ernstige acidose. Referentiewaarden van hemoglobine en andere biochemische parameters variëren afhankelijk van de leeftijd en de soort 37,38. Een lager hemoglobine kan van invloed zijn op de oxygenatie, wat geoptimaliseerde en conservatieve bloedafname vereist39,40. Elke bloedafname wordt gecompenseerd met een gelijk volume NS. Bloedelektrolyten-, ureum- en creatininespiegels werden gebruikt om een voldoende vochtregime te volgen.

Rekening houden met voldoende hersteltijd tijdens de longspoelingsprocedure

Tijdens de longspoeling is een belangrijk herstelvenster van ten minste 3-5 minuten tussen elke spoeling vereist om een goede veneuze terugkeer mogelijk te maken en gevaarlijke levercongestie41, leverbloeding en rechterhartfalen te voorkomen. Dit fenomeen werd waargenomen bij enkele dieren binnen het experimentele cohort. Een goed en proactief vloeistofbeheer is noodzakelijk voor het behoud van de klinische stabiliteit. Door een kleine intensive care-omgeving voor dit biggenmodel na te bootsen, is het essentieel dat er een clinicus, neonatoloog of een senior dierenartstechnicus is die de kennisvertaling tussen de teamleden kan vergemakkelijken om belangrijke situaties en de bijbehorende noodplannen te herkennen.

Aanbevolen probleemoplossing

De big zal gedurende de gehele chirurgische en experimentele tijd onder algemene anesthesie en analgesie staan. Eén persoon is toegewijd aan het monitoren van de big gedurende het hele experiment. Elk dier is anders in zijn gevoeligheid en reactie op anesthetica. Het is van cruciaal belang om de toestand van het dier onmiddellijk na de inductie van de anesthesie met vitale functies en bloedgas per uur te controleren. Het zal informatie geven over het anesthesieniveau en de metabole stabiliteit, naast de fysieke beoordeling indien nodig. Er is een variabiliteit in het aantal longspoelingen (van 6 tot 20) en dus tijd (van 28-115 minuten) die nodig is om de uitputting van de oppervlakteactieve stoffen te bereiken.

Mogelijke problemen en oplossingen tijdens anesthesie-inductie, stabilisatie en chirurgie: (1) Als apneu zich ontwikkelt, moet het anesthesiegas worden uitgeschakeld en moet de ademhaling worden ondersteund met beademing met een zakmasker totdat de spontane ademhaling terugkeert. (2) Als er tekenen van hypovolemie via hoge HR, lage MAP of lage CVP aanwezig zijn, moet een vloeistofbolus van 10 ml/kg NS worden toegediend en moet een verhoogde dosering van onderhoudsvloeistof worden overwogen. (3) Wanneer hypotensie met afnemende MAP tot 30-40 mmHg, die niet is opgelost met de vloeistofbolus, moeten anesthesiepompen worden verlaagd/gestopt en worden de tekenen van perfusie en hypotensie na 10-15 minuten opnieuw geëvalueerd. Bloedgasanalyse voor hemoglobinespiegels om te evalueren op mogelijke inwendige bloedingen. (4) Als de ademhalingssymptomen wijzen op pneumothorax (acute desaturatie of bradycardie >20%), wordt de big onmiddellijk geëuthanaseerd.

Beperkingen

Het model hierin stelt een neonatale ALI op korte termijn (6 uur) voor in een groot diermodel. De chroniciteit van letsel dat leidt tot BPS is een belangrijke factor om te overwegen. Dit model geeft dit aspect van de pathogenese mogelijk niet volledig weer, en gegevens die de voortgang van het longletsel na 6 uur informeren, blijven onbepaald. Desalniettemin vormt de consistentie van dit model een sterke basis om op voort te bouwen (uitbreiding van de lengte/wijzigingsprotocol), waardoor het veelzijdig is voor onderzoeksgroepen die het zullen implementeren. Ondanks de nadruk die tijdens de conceptie werd gelegd op de toegankelijkheid en haalbaarheid van dit grote diermodel, zijn specifieke vaardigheden gerechtvaardigd voor een vlotte uitvoering van het experiment. Klinische expertise met een sterke basis in fysiologie en kennis om snelle veranderingen/verslechteringen via medicijnen/infusie/etc. te beheersen, is noodzakelijk voor implementatie en succesvolle afronding in vroege fasen. Deze set vaardigheden kan vervolgens worden overgedragen aan teamleden voor doorlopend onderhoud van het model in de loop van de tijd. Bovendien kan een team bestaande uit een veterinair technicus, laboratoriumtechnici en ouderejaars afgestudeerde studenten met wie sterke communicatie en samenwerking tot stand zijn gebracht, zorgen voor een passende dekking van alle componenten van elk experiment. Verwacht wordt dat er ten minste drie teamleden nodig zijn om het experiment van begin tot eind uit te voeren wanneer de workflow is geoptimaliseerd.

Betekenis en de mogelijke toepassing ervan

Klinische vertaling is gebaseerd op sterke fundamentele studies op preklinisch niveau. Veel klinische onderzoeken mislukken echter vanwege de mismatch tussen het preklinische model en de menselijke fysiologie, wat het belang benadrukt van nauw verwante grote diermodellen om het vertaalpotentieel te versterken. Het genereren van een nieuw neonataal biggenmodel van longbeschadiging is van cruciaal belang om vroege pathogene gebeurtenissen beter te begrijpen en een gunstige omgeving te bevorderen voor de ontwikkeling van BPS in de premature longen bij de mens. Het hier gepresenteerde model herschept belangrijke aspecten van een intensive care-omgeving (hyperoxie, hogedrukventilatie en een gebrek aan oppervlakteactieve stof) voor premature baby's tijdens de eerste paar dagen van het leven, die nauwkeurig wordt gemodelleerd. Dit veelzijdige nieuwe multi-hit model voor neonatale biggen zal een onschatbaar inzicht bieden in vroege pathogene processen van BPS, kennis over therapeutische kandidaten vergroten, evenals hun optimalisatie van de therapeutische toediening voor effectieve klinische vertaling. Het zal fungeren als een uitstekende vector voor samenwerkingen en een kader voor het testen van hypothesen bevorderen voor proof-of-concept-studies, variërend van veiligheid tot werkzaamheid en kennisgeneratie. Dit model dient als basis voor toekomstige onderzoeken en zal de klinische vertaalinspanningen voor acuut longletsel bij te vroeg geboren baby's aanzienlijk bevorderen.

Openbaarmakingen

Alle andere auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

We zijn Dr. Martin Post, Hospital for SickKids, Toronto, dankbaar dat hij ons genereus een neonataal beademingsapparaat heeft geleend dat tijdens dit project is gebruikt. We danken ook Dan DeVette en zijn team van de Animal Care and Veterinary Service, Heart Institute, University of Ottawa, voor alle hulp tijdens de ontwikkeling van dit model. Dit werk is ondersteund door het CHAMO-innovatiefonds van CHEO, het Stamcelnetwerk, de vereniging van prinses Lovisa [HKH Kronprinsessan Lovisas förening], de David en Astrid Hagelén Foundation en de Swedish Heart Lung Foundation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#10 scalpel bladehuid incisie
1 ml spuitBectonDicksonBD309659slip tip 
10 ml spuitenBectonDicksonBD302995spoelspuiten voor arteriële en veneuze lijnen
18 G angiocatheter Insyteblaaskanulatie
20 ml spuitenBectonDicksonBD302830vloeistof bolus indien nodig
22 G hypodermische naaldenBectonDicksonopvulspuit
24 G angiocathetersInsyte160465oor iv toegang en femorale slagader en ader
25 G hypodermische naaldenBectonDicksonintramusculaire (IM) bupenorfine-injectie
3 ml spuitenBectonDicksonmedicatie-injectie en monitoringslijn dode ruimte verwijdering
3-0 zijden bandenEthiconA304Hgebruikt om arteriële en veneuze katheters vast te zetten
4 weg stopkoppelingenDiscofix, BraunD500456020bevestigd aan vloeistof en monitoringslijnen voor spoelen en bemonstering
6" verlengsetSAI Infusion TechnologiesExt-6bevestigd aan IV/arteriële lijnen 
60" verlengsetBBV6223medicijninfusielijnen
AirLife Neo-Verso Y luchtwegtoegangsadapter voor endotracheale buizenVyaireCSC300gebruikt om materiaal intratracheal toe te dienen
Bupenorfine, 0,3 mg/mLCDMV128140IM bolus als pijnstiller
Dextrose, 5%BaxterJB0063Bloedglucose-onderhoud
Disponibele drapes3M3M1050steriele veld drapes
ECG-elektroden3M220790elektroden voor eenmalig gebruik voor ECG
Endotracheale buis (ETT) toedieningskatheter
Endotracheale buis 3,5 Teleflex5-10107gebruikt voor tracheostomie
Epinefrine, 1 mg/mLHospira07541L01Verdund met steriele normale zoutoplossing tot 0,1 mg/mL voor reanimatie indien nodig
Epoc bloedgasanalysator Siemens10736398epoc bloedanalysesysteem met NXS-host
Epoc steekproefkaartenSiemensBD309659bloedgas cartridges
Formaline, 10% gebufferdFisher ScientificSF100-4Longfixatie
VerwarmingskussenKent ScientificTPZ-814EAwatercirculerende deken
Intraveneuze (IV) infuuspompen x 3Sigma AldrichZ401358Infusie van ketamine/propofol en rocuronium
Ketamine, 10 mg/mLVetoquinol112170Continue infusie (verdund met steriele normale zoutoplossing) in spuitpomp voor anesthesieonderhoud 
Ketamine, 100 mg/mLVetoquinol112170Gebruikt als bolus voor inductie van algemene anesthesie en spuitpomp voor anesthesieonderhoud 
Lactaat RingerBaxterJB2323Bloedvolume-onderhoud
Lavageapparatuur: trechter, 3 weg connector, ETT-connector, slang 4 voetn/an/azelfgemaakte slang voor lavaging
Lipopolysaccharide, LPS (O55:B5), 100 mgSigma-AldrichL2880-100mg2e hit longbeschadiging
MR850 ademhalingsbevochtigerFisher and PaykelMR850JXX*
Pentobarbital natrium (Euthanyl), 240 mg/mLVetoquinol381IV bolus voor humane euthanasie
DruktransducerMcCarthy Veterinary SuppliesV6402voor arteriële/veneuze druk op Surgivet
Propofol, 10 mg/mLGebruikt als bolus voor inductie van algemene anesthesie en spuitpomp voor anesthesieonderhoud 
PulsoximeterMaismoNEOPT-500
Rocuronium, 10 mg/mLAuropharma2498820Gebruikt na de operatie en voor het begin van de inductie van longbeschadiging, gevolgd door continue infusie
Salina, 0,9%BaxterJB1324Bloedlijn spoelen en bloedvolumereanimatie
Steriele watern/an/avoor ventilator bevochtiger
zuigkatheter 10 CH/25 cmMediplast608810251gebruikt voor broncheoalveolaire lavage van longkwab
zuigkatheter 6 CH/40 cmMediplast60880640verwijder overtollig zoutoplossing tijdens lavage
Chirurgische instrumenten: scalpelhandvat, pincet, duimtang, Metzenbaum schaar, hechtingen, chirurgische schaar, retractoren, gaas, roestvrijstalen komN/AN/Achirurgische pack autoclaved
Surgivet: NIBP manchet, temperatuur sonde,  2x invasieve BP, ECG, pulsoximeterMcCarthy Veterinary Suppliesv9203bevat: niet-invasieve bloeddruk manchet (NIBP), thermometer, 2x invasieve bloeddruk (BP), elektrocardiografie (ECG) en pulsoximeter
Spuitpompen x 3anesthesiepompen
Tapebeveiliging oor IV lijnen
Umblical tapeEthiconbevestigt endotracheale buis in de luchtpijp
Ventilator (Servo-I)Getingemoet neonatale instellingen hebben voor juiste tijdelijk volume
VentilatorcircuitFisher and PaykelRT265met bevochtiger
Vorse buis occluderende klemn/an/aoccludeert slang tijdens lavage

Referenties

  1. Perin, J., et al. regional, and national causes of under-5 mortality in 2000-19: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet Child Adolesc Health. 6 (2), 106-115 (2022).
  2. Thebaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  3. Demauro, S. B., et al. Early motor development in infants with moderate or severe bronchopulmonary dysplasia. J Neonatal Perinatal Med. 15 (1), 55-62 (2022).
  4. Augustine, S., et al. Mesenchymal stromal cell therapy in bronchopulmonary dysplasia: Systematic review and meta-analysis of preclinical studies. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2079-2093 (2017).
  5. Contopoulos-Ioannidis, D. G., Ntzani, E., Ioannidis, J. P. Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med. 114 (6), 477-484 (2003).
  6. Haworth, S. G., Hislop, A. A. Adaptation of the pulmonary circulation to extra-uterine life in the pig and its relevance to the human infant. Cardiovasc Res. 15 (2), 108-119 (1981).
  7. Rendas, A., Branthwaite, M., Reid, L. Growth of pulmonary circulation in normal pig--structural analysis and cardiopulmonary function. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 45 (5), 806-817 (1978).
  8. Starbaek, S. M. R., et al. Animal models for influenza a virus infection incorporating the involvement of innate host defenses: Enhanced translational value of the porcine model. ILAR J. 59 (3), 323-337 (2018).
  9. Schneberger, D., Aharonson-Raz, K., Singh, B. Pulmonary intravascular macrophages and lung health: What are we missing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (6), L498-L503 (2012).
  10. Thomas, A. V., Broers, A. D., Vandegaart, H. F., Desmecht, D. J. Genomic structure, promoter analysis and expression of the porcine (sus scrofa) TLR4 gene. Mol Immunol. 43 (6), 653-659 (2006).
  11. Islam, M. A., et al. Age-related changes in phagocytic activity and production of pro-inflammatory cytokines by lipopolysaccharide stimulated porcine alveolar macrophages. Cytokine. 60 (3), 707-717 (2012).
  12. Kapetanovic, R., et al. The impact of breed and tissue compartment on the response of pig macrophages to lipopolysaccharide. BMC Genomics. 14, 581(2013).
  13. Chen, L., He, H., Fernandez Mondejar, E., Hedenstierna, G. Cyclooxygenase inhibitor blocks rebound response after no inhalation in an endotoxin model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284 (1), H290-H298 (2003).
  14. Spengler, D., Rintz, N., Krause, M. F. An unsettled promise: The newborn piglet model of neonatal acute respiratory distress syndrome (nards). Physiologic data and systematic review. Front Physiol. 10, 1345(2019).
  15. Tridente, A., De Martino, L., De Luca, D. Porcine vs. bovine surfactant therapy for preterm neonates with RDS: Systematic review with biological plausibility and pragmatic meta-analysis of respiratory outcomes. Respir Res. 20 (1), 28(2019).
  16. Kulkarni, H. S., et al. Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: An official American Thoracic Society workshop report. Am J Respir Cell Mol Biol. 66 (2), e1-e14 (2022).
  17. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  18. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (3), L379-L399 (2008).
  19. Preuss, S., et al. Inositol-trisphosphate reduces alveolar apoptosis and pulmonary edema in neonatal lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol. 47 (2), 158-169 (2012).
  20. Spengler, D., et al. Novel therapeutic roles for surfactant-inositols and -phosphatidylglycerols in a neonatal piglet ARDS model: A translational study. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (1), L32-L53 (2018).
  21. Von Bismarck, P., et al. Improved pulmonary function by acid sphingomyelinase inhibition in a newborn piglet lavage model. Am J Respir Crit Care Med. 177 (11), 1233-1241 (2008).
  22. Van Kaam, A. H., et al. Response to exogenous surfactant is different during open lung and conventional ventilation. Crit Care Med. 32 (3), 774-780 (2004).
  23. Lachmann, B., Robertson, B., Vogel, J. In vivo lung lavage as an experimental model of the respiratory distress syndrome. Acta Anaesthesiol Scand. 24 (3), 231-236 (1980).
  24. Thebaud, B., et al. Benefits and obstacles to cell therapy in neonates: The incubator (innovative neonatal cellular therapy for bronchopulmonary dysplasia: Accelerating translation of research). Stem Cells Transl Med. 10 (7), 968-975 (2021).
  25. Davies, M. W., Mehr, S., Morley, C. J. The effect of draw-up volume on the accuracy of electrolyte measurements from neonatal arterial lines. J Paediatr Child Health. 36 (2), 122-124 (2000).
  26. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Gottingen minipig: Intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
  27. Stenersen, E. O., et al. A piglet perinatal asphyxia model to study cardiac injury and hemodynamics after cardiac arrest, resuscitation, and the return of spontaneous circulation. J Vis Exp. (191), e64788(2023).
  28. Force, A. D. T., et al. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  29. Vento, M., et al. Preterm resuscitation with low oxygen causes less oxidative stress, inflammation, and chronic lung disease. Pediatrics. 124 (3), e439-e449 (2009).
  30. Vincent, D., et al. Intratracheal E. coli lipopolysaccharide induces platelet-dependent bronchial hyperreactivity. J Appl Physiol (1985). 74 (3), 1027-1038 (1993).
  31. Preuss, S., et al. 18:1/18:1-dioleoyl-phosphatidylglycerol prevents alveolar epithelial apoptosis and profibrotic stimulus in a neonatal piglet model of acute respiratory distress syndrome. Pulm Pharmacol Ther. 28 (1), 25-34 (2014).
  32. Von Bismarck, P., et al. Surfactant "fortification" by topical inhibition of nuclear factor-kappa b activity in a newborn piglet lavage model. Crit Care Med. 35 (10), 2309-2318 (2007).
  33. Pape, A., et al. Neuromuscular blockade with rocuronium bromide increases the tolerance of acute normovolemic anemia in anesthetized pigs. Eur Surg Res. 48 (1), 16-25 (2012).
  34. Gasthuys, E., et al. Repetitive urine and blood sampling in neonatal and weaned piglets for pharmacokinetic and pharmacodynamic modelling in drug discovery: A pilot study. Lab Anim. 51 (5), 498-508 (2017).
  35. Noblet, J., Dourmad, J. Y., Etienne, M., Le Dividich, J. Energy metabolism in pregnant sows and newborn pigs. J Anim Sci. 75 (10), 2708-2714 (1997).
  36. Keibl, C., Kerbl, M., Schlimp, C. J. Comparison of Ringer's solution with 0.4% glucose or without in intraoperative infusion regimens for the prevention of hypoglycemia in juvenile pigs. Lab Anim. 48 (2), 170-176 (2014).
  37. Perri, A. M., O'sullivan, T. L., Harding, J. C., Wood, R. D., Friendship, R. M. Hematology and biochemistry reference intervals for Ontario commercial nursing pigs close to the time of weaning. Can Vet J. 58 (4), 371-376 (2017).
  38. Egeli, A. K., Framstad, T., Morberg, H. Clinical biochemistry, haematology and body weight in piglets. Acta Vet Scand. 39 (3), 381-393 (1998).
  39. Linderkamp, O., et al. Blood volume in newborn piglets: Effects of time of natural cord rupture, intra-uterine growth retardation, asphyxia, and prostaglandin-induced prematurity. Pediatr Res. 15 (1), 53-57 (1981).
  40. Talbot, R. B., Swenson, M. J. Blood volume of pigs from birth through 6 weeks of age. Am J Physiol. 218 (4), 1141-1144 (1970).
  41. Berger, D., et al. Effect of PEEP, blood volume, and inspiratory hold maneuvers on venous return. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 311 (3), H794-H806 (2016).

Herprints en machtigingen

Tags

Neonataal biggenmodelbronchopulmonale dysplasiesurfactantdepletieblootstelling aan hyperoxieventilatie met hoge druktoediening van lipopolysacharidelongontstekingbloedgasanalyseneutrofieleninfiltratie
Ontwikkeling van een model voor acuut longletsel bij neonatale biggen dat de vroege omgeving van te vroeg geboren longen nabootst
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.