In vivo beeldvorming van de gewrichten is een waardevolle techniek om het migratiegedrag van leukocyten en moleculaire dynamiek binnen de ontstoken gewrichten te ontdekken. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor in vivo beeldvorming van de gewrichten met behulp van een muismodel van type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vivo Beeldvorming onthult het migratiegedrag van leukocyten binnen de gewrichten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Leukocyten zijn bloedgedragen cellen afkomstig uit het beenmerg die in weefsels moeten migreren om ontsteking te bemiddelen. Het beheersen van deze migratie vormt daarom een cruciaal punt voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om ontstekingen te verminderen. Traditionele eindpuntstudies hebben het niet mogelijk gemaakt om het migratiegedrag van leukocyten in vivo volledig te ontleden. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologie hebben echter ongekende inzichten opgeleverd in de migratie van immuuncellen bij levende dieren, waardoor ons begrip van de moleculaire regulatie van immuunceltransport aanzienlijk is vergroot.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor in vivo beeldvorming van de gewrichten met behulp van een muismodel type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA). Muizen worden gevaccineerd met type II collageen geëmulgeerd in het volledige Freund-adjuvans, en de progressie van artritis wordt gemonitord door klinische scores en pootdiktemetingen. Op het hoogtepunt van artritis worden leukocyten in vivo gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie in transgene muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, of bij wildtypemuizen na intraveneuze injectie van fluorescentie-gelabelde antilichamen en hoogmoleculair gewicht-Dextran voor vaatkleuring. Zorgvuldige chirurgische blootstelling van het gewricht, het aanbrengen van agarose en de juiste positie van het been zorgen voor stabiele langdurige beeldvorming, die doorgaans enkele uren duurt. Deze aanpak maakt realtime analyse mogelijk van leukocytenarrest, kruipen en transendotheliale migratie binnen ontstoken gewrichten.
Dit protocol zal waardevol zijn voor onderzoeksgroepen die leukocytenhandel bij artritis en andere ontstekingsziekten onderzoeken. Het kan ook dienen als platform voor preklinische evaluatie van therapieën gericht op immuniteitsmigratie.
Inleiding
Omdat leukocyten bloedgedragen cellen zijn die afkomstig zijn van het beenmerg, moeten ze weefsel binnendringen om ontstekingte veroorzaken 1. De controle van dit proces vormt een belangrijk punt waarop nieuwe therapieën ontwikkeld kunnen worden om ontsteking te verzachten2. In het algemeen vindt leukocytentransport in ontstoken weefsel plaats in postcapillaire venulen en volgt het de adhesiecascade, beginnend met het vangen van vrij stromende leukocyten door de vaatwand. Verder wordt het proces gevolgd door leukocyten die langs de vaatwand rollen in de richting van de stroming, leukocyten stoppen op het endotheel, loslaten uit adhesie en kruipen in alle richtingen over het oppervlak van het vat om een receptieve plaats voor transendotheliale migratie (TEM) naar een specifieke locatie binnen het weefselte vinden.
Deze verschillende stappen worden geregeld door een combinatie van moleculaire signalen, waaronder de selectinen (voor rollen), integrines (voor arrestatie, kruipen) en chemoattractanten (CA's) (voor arrestatie, mogelijk kruipen en TEM)3. CA's activeren leukocyten via zeven transmembraan-overspannende G-eiwitgekoppelde chemoattractante receptoren (CAR's) en spelen een cruciale rol in de adhesiecascade door de integrineaffiniteit op te reguleren (wat leidt tot een arrest) en het induceren van TEM. De exacte mechanismen van TEM zijn echter niet volledig begrepen. Traditionele eindpuntstudies en in vitro-experimenten hebben geen inzicht gegeven in hoe CA-CAR-signalering dynamisch het migratiegedrag van leukocyten in vivo reguleert.
Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologie hebben ongekende inzichten gegeven in de migratie van immuuncellen bij levende dieren, wat ons begrip van de moleculaire regulatie van immuunceltransport in vivo aanzienlijk heeft vergroot 4,5,6. Zo heeft deze technologie de moleculaire controle van neutrofielentransport naar plaatsen van weefselontsteking verduidelijkt, zoals thermisch leverletsel7 en laserhuidletsel8. Daarom hebben we een toepassing gezocht op het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de neutrofieltransport naar plaatsen van gewrichtsontsteking9 reguleren. De hier beschreven in vivo gewrichtsbeeldvorming toonde aan dat complementcomponent C5a-receptor 1 (C5aR1) cruciaal is voor het initiëren van neutrofiele adhesie aan het gewrichtsendotheel, waardoor ontsteking in de gewrichten ontstaat. C5aR1 faciliteerde integrine-afhankelijke neutrofielarrestatie en verspreiding, gevolgd door TEM gemedieerd door leukotrieen B4-receptor, en kruipen aangedreven door CC chemokinereceptor 1 (CCR1). CXC chemokinereceptor 2 (CXCR2) speelde een rol in de latere stadia van neutrofiele TEM in de ontstoken gewrichten10. Daarnaast onthulde in vivo gewrichtsbeeldvorming een nieuw paradigma in type III overgevoeligheidsreacties binnen het gewricht, waarbij C5a als initiator van ontsteking fungeert, terwijl weefselresidente cellen een belangrijkere rol spelen in ontsteking in het huidige paradigma van type III overgevoeligheidsreacties10,11.
Daarnaast hebben we in vivo beeldvorming van het gewricht toegepast om de moleculaire dynamiek van C5a binnen het gewricht te bestuderen. C5a die bij wildtypemuizen op het gewrichtsweefsel werd geladen, werd snel getransporteerd naar het vaatlucht, terwijl bij C5aR2-deficiënte muizen C5a volledig binnen het synoviale weefsel12 bleef. Deze gegevens tonen aan dat C5aR2, tot expressie gebracht op het gewrichtsendotheel, C5a naar het vatlumen transporteert, een proces dat noodzakelijk is voor C5aR1-afhankelijke neutrofiele adhesie in degewrichten 13.
In vivo beeldvorming van de gewrichten is toepasbaar op alle modellen van inflammatoire artritis en maakt langdurige observatie mogelijk (meestal een paar uur), hoewel de visualisatie van diep weefsel (>1 mm) beperkt kan zijn afhankelijk van de gebruikte microscoop. Gezamenlijk biedt deze techniek een krachtig hulpmiddel om het migratiegedrag van leukocyten en de moleculaire dynamiek binnen de ontstoken gewrichten te onderzoeken. We delen dit protocol voor in vivo gewrichtsbeeldvorming ter ondersteuning van onderzoeksgroepen die dit proces bestuderen bij ontstoken gewrichten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de St. Marianna University School of Medicine (Goedkeuringsnummer TG240926-2 en TG250801-2) en uitgevoerd volgens institutionele en nationale richtlijnen.
1. Voorbereiding van een muismodel van artritis
OPMERKING: Diermodellen van artritis hebben waardevolle hulpmiddelen geboden om de pathogenese van de ziekte te begrijpen en nieuwe therapieën te ontwikkelen14. Hoewel verschillende muismodellen van artritis unieke voordelen en beperkingen hebben, is type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA) veelvuldig gebruikt in studies naar de pathogenese van reumatoïde artritis (RA)14. In deze sectie beschrijven we het protocol van CIA-modellen van artritis (Materialen en instrumenten zijn weergegeven in Figuur 1).
- Bereid een verdunning van rundvlees type II collageen voor in 0,05 M azijnzuur (eindconcentratie 4 mg/mL) door een nacht te schudden bij 4 °C.
- Om de emulsie te creëren, meng je de collageenverdunning (4 mg/mL in 0,05 M azijnzuur) met complete Freund's adjuvant (CFA) in een verhouding van 1:1 in een glazen spuit. Dit levert een uiteindelijke collageenconcentratie van 2 mg/mL in de emulsie op. Meng het met de hand gedurende ongeveer 20 minuten stevig. Dit proces genereert warmte, dus laat de glazen spuit met de emulsie op ijs liggen. Gebruik een beker om de consistentie van de emulsie tijdens de bereiding te controleren.
NOTITIE. Bewaar eventueel resterende collageenverdunning bij -80 °C. Dit kan worden gebruikt voor de tweede immunisatie. - Breng de emulsie over naar een 1 mL glazen spuit met een naald van 26 x 1/2 G en laat deze op ijs tot de immunisatie.
- Verdoof 8 weken oude DBA1/J-muizen (mannelijk of vrouwelijk) met intraperitoneale injecties van medetomidine (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) en vetorphale (5 mg/kg).
NOTITIE. Transgene muizen hebben vaak een C57BL6-achtergrond. Kippencollageen wordt typisch gebruikt voor CIA bij C57BL6-muizen; echter, de incidentie en ernst van CIA bij C57BL6-muizen zijn lager dan bij DBA/1J-muizen. Als je transgene muizen gebruikt op een C57BL6-achtergrond, overweeg dan een pilotstudie uit te voeren om de incidentie en ernst van CIA te beoordelen. - Scheer het haar rond de staart met een tondeuse ter voorbereiding op immunisatie.
- Injecteer langzaam 100 μL volume van de emulsie (met 200 μg collageen) in de subcutane ruimte langs de caudale dorsum (nabij de basis van de staart) (Figuur 2).
- Herhaal stappen 1,2 tot 1,6 op dag 21 voor de tweede immunisatie (Figuur 2).
2. Evaluatie van de klinische artritisscore en meting van pootdikte
OPMERKING: Klinische beoordeling van artritis en het meten van de pootdikte zijn essentieel voor het beoordelen van ziekteactiviteit. Meestal worden klinische scores en pootdiktemetingen bij artritis elke 1-3 dagen na de eerste vaccinatie gedaan.
- Klinische artritisscore: Noteer de som van de scores voor alle vier de poten van elke muis. Gebruik het volgende puntensysteem:
0 = Normaal
1 = Erythema en zwelling van één cijfer
2 = Erythema en zwelling van twee vingers of erythema en zwelling van het enkelgewricht
3 = Erythema en zwelling van meer dan drie vingers of zwelling van twee vingers en enkelgewrichten
4 = Erythema en ernstige zwelling van de enkel, voet en vingers met misvorming.
NOTITIE. Een gezwollen enkelgewricht wordt gedefinieerd als een pootdikte van meer dan 4 mm. - Meting van de pootdikte: Meet de dikte van elke poot met digitale schuifklauwen. Gebruik de gemiddelde pootdikte over alle vier de poten van elke muis.
3. In vivo beeldvorming van gewrichten
OPMERKING: In vivo beeldvorming van gewrichten stelt ons in staat leukocytmigratie naar de gewrichten te observeren en hun gedrag binnen het weefsel bij levende muizen te analyseren. Om cellen te visualiseren worden transgene muizen gebruikt die genetisch zijn gemodificeerd om fluorescerende eiwitten in specifieke cellen tot expressie te brengen, evenals muizen die intraveneus anticellen marker-antilichamen krijgen. De gebruikte materialen zijn weergegeven in Figuur 3.
- Verdoof arthritogene muizen intraperitoneaal met medetomidine (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) en vetorphale (5 mg/kg).
- Scheer het muispootje met een tondeuse en gebruik ontharingscrème (<60 s) om eventueel achtergebleven haar te verwijderen. Vermijd langdurige toepassing om huidirritatie te voorkomen.
- Verwijder de crème met vochtig gaas (Figuur 4A). Zorg ervoor dat al het haar wordt verwijderd om ongewenste autofluorescentie in het beeldvormingsgebied te voorkomen. Herhaal indien nodig.
- Breng steriele hoornvliesolie aan op beide ogen tijdens de narcose om uitdroging of ulceratie van het hoornvlies te voorkomen.
- Maak onder een chirurgische scoop een incisie van 1 cm langs de huid met een microschaar (Figuur 4B).
NOTITIE. Deze stap is cruciaal. Chirurgie kan leukocyten (vooral neutrofielen) werven veroorzaken. Vermijd schade die artefacten kan veroorzaken. Door angiogenese in artritische gewrichten zijn deze gewrichten gevoelig voor bloedingen. Meerdere oefensessies kunnen nodig zijn voor een succesvolle operatie. - Plaats de artritische verbindingen op de plastic plaat (Figuur 4C).
NOTITIE. Weefsellijm kan worden gebruikt om het pootje van de muis vast te zetten. Deze studie gebruikt klei om een glazen glaasje aan een plastic plaat vast te maken. - Bedek het beeldgebied met ongeveer 1 mL van 1,5% agarose met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (Figuur 4D).
NOTITIE. Zorg ervoor dat de agarose is afgekoeld om weefselbeschadiging te voorkomen, wat leukocytenrekrutering naar het beeldvormingsgebied kan bevorderen. - Zet het podium op de microscoop.
NOTITIE. Gebruik een warmtekussen om de lichaamstemperatuur van de muis tijdens langdurige beeldvormingssessies op peil te houden. - Pas de instellingen voor de confocale microscoop aan (laservermogen, versterking, offset, locatie, enzovoort). Voer hier beeldvorming uit met een confocale microscoop met een 25-wateronderdompelingsobjectieflens, NA 1.1. Stel de laserexcitatie in op 488 nm, 561 nm en 640 nm, en verzamel de emissie op 488,0 nm, 561,6 nm en 638,5 nm.
- Controleer de scansnelheid van de microscoop. Gebruik een pixelresolutie van 512 x 512, met 5 optische secties, een Z-stack van 4 μm en een cyclustijd van 15 s om analyse van individuele beweeglijke cellen over voldoende tijd mogelijk te maken om betekenisvolle data te verkrijgen.
- Zodra een geschikte locatie is gevonden, begin je met het verkrijgen van beelden.
NOTITIE. Als je anticelmarker-antilichamen gebruikt om leukocyten te labelen, injecteer dan de antilichamen intraveneus 3 minuten voordat de beeldvorming begint. Voor de visualisatie van bloedvaten kunt u gelijktijdig Qdots, CD31-antilichaam of Dextran injecteren. Injecteer bijvoorbeeld ongeveer 2 μg antilichamen per muis Ly6G voor neutrofielen en CD4 voor T-cellen, samen met ongeveer 80 μg 680-250k Dextran per muis voor bloedvatkleuring. Antilichamen en Dextran worden meestal opgelost in 100 μL steriele PBS. Wees je ervan bewust dat sommige antilichamen leukocyten kunnen uitputten, dus controleer of de geselecteerde antistoffen het aantal leukocyten niet verlagen. - Verwerk de ND2-bestandsbeelden die met de confocale microscoop zijn verkregen met behulp van de General Analysis 3 (GA3) module van NIS-Elements beeldanalysesoftware (versie 6.20.00). Voer het extraheren van vasculaire gebieden uit en het aftrekken van achtergronden. Na het verwerken van alle tijdsframes exporteer je de beelden als video.
NOTITIE. Tel als onderdeel van de analyse het aantal plakkende en extravaseerde cellen. - Na voltooiing van de beeldvorming laat je het dier herstellen als overlevingsprocedure of euthanasen het human, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Als overleving wordt beoogd, sluit dan voorzichtig de operatielocatie en bied passende postoperatieve zorg volgens de richtlijnen voor de institutionele dierenzorg.
OPMERKING: In deze studie werden alle dieren direct na beeldvorming humaan geëuthanaseerd in overeenstemming met institutionele en nationale richtlijnen.
4. Statistische analyse
- Presenteer de gegevens als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Voer statistische analyses uit met behulp van de Student's t-test voor tweegroepsvergelijkingen of eenrichtings-ANOVA voor meerdere groepen, gevolgd door Tukey's post hoc-test. Beschouw een p-waarde < 0,05 als statistisch significant.
OPMERKING: Alle analyses zijn uitgevoerd met GraphPad Prism versie 10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier worden 8 weken oude mannelijke DBA/1J-muizen gevaccineerd met een emulsie die bovine type II collageen en CFA bevat in een verhouding van 1:1 op dag 0 en dag 21. Klinische beoordelingen voor artritis en pootdiktemetingen worden elke 1-3 dagen tussen dag 0 en 42 uitgevoerd. Gewoonlijk wordt het begin van artritis waargenomen rond dag 28, waarbij de klinische score en pootdikte van artritis een piek bereiken rond dag 35 (Figuur 5A-C
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In vivo beeldvorming van gewrichten biedt, in tegenstelling tot traditionele eindpuntstudies, ongekende inzichten in dynamische biologische processen bij levende muizen. Deze techniek stelt ons bijvoorbeeld in staat te begrijpen hoe vier verschillende chemoattractiereceptoren - C5aR1, BLT1, CCR1 en CXCR2 - samenwerken om neutrofiel-rekrutering in ontstoken gewrichten bij artritis10,11 te initiëren. Daarnaast heeft in...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Y.M. ontving subsidie/onderzoekssteun van Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Dankbetuigingen
Het werk van Y.M. wordt ondersteund door de Japanse Vereniging voor de Bevordering van Wetenschap (JSPS) KAKENHI [subsidienummer JP22K08531, JP25K02574]; Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) [subsidienummer 25bm1423033]; De Mochida Memorial Foundation voor Medisch en Farmaceutisch Onderzoek; De JCR-subsidie voor het bevorderen van onderzoek voor FRONTIER en The Mitsubishi Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2" | Terumo | SS-10M2913 | |
| 0.1 M azijnzuur | Fujifilm | 016-18835 | |
| 1 mL plastic spuit | TOP | 19531 | |
| 1 mm spuit voor vet | Terumo | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2" | Terumo | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2" | Terumo | NN-2613S | |
| 680-250 kDa dextran | Biotium | 80135 | |
| Agarose | invitrogen | 16520-100 | |
| Rund type II collageen | Collagen Research Center | K42 | |
| Klei | debika | 93186 | |
| Complete Freund’s adjuvant (CFA) | Chondrex | 7001 | |
| Confocal microscoop | Nikon | A1 | |
| Dekglas | Matsunami Glass IND.,Ltd | C024401 | |
| Digitale glijbaan | Mitsutoyo | 500-180-30 | |
| Falcon buis (15 mL) | Corning | NA | |
| Falcon buis (50 mL) | Corning | NA | |
| FITC-geconjugeerd anti-muis Ly6G-antilichaam | Biolegend | 127606 | |
| Pincet | Roboz | RS-5070 | |
| Pincet | NAPOX | MA-48-2 | |
| Glas spuit en connector | Tsubasa Industry Co., Ltd | S7P | |
| Vet | Toray Dow Corning Silicone | NA | |
| Haarscheerder | Wahl | WA5109 | |
| Haarscheerder | Wahl | 9966 | |
| Haarverwijderingscrème | Kracie | N/A | |
| Medetomidine | meiji | N/A | |
| Micro-schaar | Roboz | RS-5610 | |
| Micro-schaar | Roboz | RS-5630 | |
| Midazolam | Sandoz | N/A | |
| Vochtige gaas | Nippon Paper Crecia Co., Ltd | S-200 | |
| NIS-Elements beeldanalyse 6.20.00 | Nikon | NA | |
| PBS in Falcon buis (50 mL) | Shimadzu Diagnostics Corporation | 5913 | |
| PE geconjugeerd anti-muis CD4-antilichaam | Biolegend | 100408 | |
| Kunststof plaat | Corning | 351029 | |
| Prism 10.3.1 | GraphPad | NA | |
| Glijglas | Muto Pure Chemicals Co.,Ltd | 5115 | |
| Chirurgische scope | Olympus | VMZ | |
| Weefselbinding | 3M | 1469SB | |
| Vetorphale | meiji | N/A |
Referenties
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications. Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Murooka, T. T., et al. HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination. Nature. 490 (7419), 283-287 (2012).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Miyabe, Y., Kim, N. D., Miyabe, C., Luster, A. D. Studying chemokine control of neutrophil migration in vivo in a murine model of inflammatory arthritis. Methods Enzymol. 570, 207-231 (2016).
- Miyabe, Y., et al. Complement C5a receptor is the key initiator of neutrophil adhesion igniting immune complex-induced arthritis. Sci Immunol. 2 (7), eaaj2195(2017).
- Sadik, C. D., Miyabe, Y., Sezin, T., Luster, A. D. The critical role of C5a as an initiator of neutrophil-mediated autoimmune inflammation of the joint and skin. Semin Immunol. 37, 21-29 (2018).
- Miyabe, Y., Miyabe, C., Mani, V., Mempel, T. R., Luster, A. D. Atypical complement receptor C5aR2 transports C5a to initiate neutrophil adhesion and inflammation. Sci Immunol. 4 (35), eaav5951(2019).
- Kohl, J. Igniting the flame in arthritis: C5aR2 controls endothelial transcytosis of C5a. Sci Immunol. 4 (35), eaax0352(2019).
- Miyabe, Y., Miyabe, C., Luster, A. D. LTB4 and BLT1 in inflammatory arthritis. Semin Immunol. 33, 52-57 (2017).
- Miyabe, Y., et al. Necessity of lysophosphatidic acid receptor 1 for development of arthritis. Arthritis Rheum. 65 (8), 2037-2047 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
