Methodenartikel

Op DNA-barcode gebaseerde multiplex immunofluorescentiebeeldvorming om FFPE-monsters van genetisch geherprogrammeerd muizenmelanoom te analyseren

DOI:

10.3791/68124

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University, 3Johns Hopkins Translational ImmunoEngineering Center, Johns Hopkins University, 4Department of Dermatology, Johns Hopkins University, 5Department of Oncology, Johns Hopkins University, 6Department of Pathology, Johns Hopkins University, 7Convergence Institute, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Johns Hopkins University School of Medicine, 8Bloomberg Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 9Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 10Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 11Departments of Neurosurgery and Ophthalmology, Johns Hopkins University School of Medicine, 12Departments of Materials Science & Engineering and Chemical & Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerpen van een multiplex immunofluorescentie-antilichaampaneel voor op DNA-barcodes gebaseerde beeldvorming van muizen FFPE-melanoomweefsels. We beschrijven ook een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van open-source tools voor het genereren van ruimtelijke proteomics-inzichten in de immuunmicro-omgeving van de muizenmelanoomtumor.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een opkomende op DNA-barcode gebaseerde multiplexbeeldvormingstechniek gepresenteerd op basis van Co-Detection-by-indEXing die de ruimtelijke proteomics van weefselmicro-omgevingen analyseert. Succesvolle beeldvorming vereist een repertoire van goed ontworpen en goed gevalideerde antilichaampanelen, maar er bestaan er momenteel maar heel weinig voor in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) monsters. FFPE biedt verschillende voordelen ten opzichte van vers ingevroren exemplaren, zoals wijdverbreide beschikbaarheid, gemakkelijke hantering en opslag, en de mogelijkheid om weefselmicroarrays (TMA's) te maken. Hier presenteren we een protocol om een antilichaampanel te ontwikkelen voor het visualiseren en analyseren van FFPE-weefsels van een muizenmelanoommodel behandeld met nanodeeltjes, die plasmide-DNA leveren dat codeert voor immunologische signalen voor het herprogrammeren van de micro-omgeving van de tumor. We beschrijven ook een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van open-source computationele tools voor het annoteren van weefsels, het segmenteren van cellen, het verwerken van proteomics-gegevens, het fenotyperen van celpopulaties en het kwantificeren van ruimtelijke metrieken. Het protocol biedt toepassingen voor het ontwerpen van antilichaampanels in muizen FFPE en het genereren van nieuwe inzichten in de ruimtelijke proteomics van complexe weefselmicro-omgevingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cutaan melanoom is de meest voorkomende huidkanker, met verschillende ziekte- en sterftecijfers over de hele wereld, afhankelijk van het tijdstip van diagnose en eerstelijnszorg1. In het afgelopen decennium heeft een groter biologisch begrip van melanoom bijgedragen aan de ontwikkeling van nieuwe kankermodellen voor de behandeling van solide tumoren2. De recente opkomst van immunotherapie heeft geleid tot een revolutionair concept van kankerbehandeling op basis van het activeren van het endogene immuunsysteem 3,4.

De tumormicro-omgeving (TME) is zeer complex en bestaat uit diverse immuuncellen, kanker-geassocieerde fibroblasten, pericyten, endotheelcellen en verschillende weefselcellen5. In het verleden zijn verschillende technieken toegepast om de TME te bestuderen, zoals flowcytometrie en single-cell sequencing, die de ruimtelijke context in gevaar brengen omdat ze nodig zijn om het tumorweefsel te vernietigen. Traditionele microscoopbeeldvorming, zoals immunofluorescentie (IF) en immunohistochemie (IHC), maakt de visualisatie van eiwitbiomarkers mogelijk zonder monsterweefsels te vernietigen. Deze benaderingen zijn echter beperkt tot twee of drie biomarkers en kunnen geen volledig begrip geven van ruimtelijke en structurele relaties binnen het complexe TME 6.

Om dit probleem aan te pakken, zijn verschillende multiplexbeeldvormingstechnieken ontwikkeld om de complexe TME ruimtelijk te visualiseren 7,8,9,10. Een daarvan is CoDetection-by-inDEXing, omgedoopt tot het PhenoCycler-systeem, gebaseerd op DNA-oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen11. Het systeem kan eencellige beeldvorming en analyse van meer dan 100 biomarkers voor menselijke monsters bieden. Er zijn echter zeer weinig geïnventariseerde antilichamen beschikbaar om muizenmonsters te visualiseren en te analyseren, met name in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) monsters12. FFPE biedt verschillende voordelen ten opzichte van de conservering van vers ingevroren (FF), zoals gemakkelijke hantering en opslag, goed bewaarde morfologie in de loop van de tijd en, belangrijker nog, de mogelijkheid om weefsel-/tumormicroarrays (TMA) te bereiden die visualisatie van meerdere exemplaren op een enkel glaasje mogelijk maken. We hebben onlangs een muizen FFPE CODEX/PhenoCycler-antilichaampanel ontworpen en ontwikkeld en met succes toegepast om de ruimtelijke proteomics van genetisch geherprogrammeerde muizenmelanoommonsters te visualiseren en te analyseren13.

Het algemene doel van dit protocol is om een stapsgewijze handleiding te bieden voor het ontwerpen van een muizen FFPE-antilichaampaneel en om het proces van antilichaam-barcodeconjugatie, weefselkleuring en beeldvorming te beschrijven. Daarnaast presenteren we een gedetailleerde pijplijn voor beeldanalyse met behulp van open-source tools zoals QuPath en R-pakketten. Na het volgen van dit protocol zullen onderzoekers leren hoe ze een op maat gemaakt antilichaampaneel kunnen ontwerpen, multiplexbeeldvorming kunnen uitvoeren met behulp van een Phenocycler-Fusion-apparaat en nieuwe inzichten kunnen verwerven in de ruimtelijke proteomics van het melanoom TME. Bovendien kan dit protocol worden aangepast om verschillende tumorimmuunmicro-omgevingen te bestuderen en worden gecombineerd met bestaande ruimtelijke transcriptomics-technieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het dierenwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, met behulp van de goedgekeurde protocolnummers MO18M388 en MO21M384.

1. Selectie van antilichamen

  1. Ontwerp een antilichaampanel op basis van het weefsel van interesse en de overvloed van de specifieke biomarker. Kies antilichaamklonen op basis van succesvolle eerdere toepassingen van immunofluorescentie (IF) en immunohistochemie (IHC) kleuring in de literatuur. Veilige dragervrije versies van deze antilichamen.
    OPMERKING: Een gezuiverd antilichaam dat vrij is van drager is belangrijk voor de barcodeconjugatie. Vermijd conserveermiddelen op basis van eiwitten zoals BSA, gluten, glycerol, enz. Als het dragervrije antilichaam niet beschikbaar is, vraag dan een aangepast antilichaam aan bij de leverancier of gebruik een BSA-verwijderingskit om het dragervrije antilichaam te maken. Natriumazide interfereert niet met de conjugatie van antilichamen. IgG-isotypes worden aanbevolen boven IgM-isotypes.
  2. Verifieer deze geselecteerde klonen op het weefsel van belang met behulp van conventionele immunofluorescentie (IF) beeldvorming11. Gebruik dubbele IF-beeldvorming om de specificiteit van bepaalde klonen te bevestigen (voer bijvoorbeeld dubbele IF-beeldvorming uit met FOXP3 en CD4 om kleuring voor regulatoire T-cellen te bevestigen).
    OPMERKING: Waar mogelijk is het belangrijk om voor IF-validatie hetzelfde weefsel te gebruiken dat voor de kleuring zal worden gebruikt. Selecteer de juiste oplossing voor het ophalen van antigeen. In dit protocol gebruikten we een AR9-buffer geleverd door Akoya Biosciences om alle muizenmelanoom FFPE-weefselepitopen op te halen. Andere oplossingen voor het ophalen van antigeen, zoals AR6 of Universal, kunnen worden gebruikt op basis van de epitoopvereisten.

2. Conjugatie en bevestiging van antilichamen

  1. Wijs geverifieerde antilichamen toe aan barcodes waaraan complementaire verslaggevers zijn bevestigd aan ATTO550 (Cy3), AF647 (Cy5) of AF750 (Cy7) fluoroforen. Antigenen met een lage overvloed produceren meestal lagere signalen; conjugeren dergelijke antilichamen aan kanalen met lage autofluorescentie, zoals AF647 (Cy5). Conjugaat sterk tot expressie gebrachte antigenen tegen ATTO550 (Cy3) en AF750 (Cy7) vanwege de mogelijkheid van autofluorescentie.
    OPMERKING: Bij deze cruciale stap wordt rekening gehouden met kanaalgevoeligheid en de overvloed aan antigeen. Het gebruik van het AF488-kanaal voor FFPE-weefsel wordt niet aanbevolen vanwege de hogere autofluorescentie.
  2. Voor conjugatie van antilichamen en barcodes (4,5 uur) moet u de antilichaamconjugatiekit aanschaffen. Bewaar alle reagentia bij 4 °C, met uitzondering van reductieoplossing 1, die bij -20 °C moet worden bewaard in de vorm van kleine injectieflacons voor eenmalig gebruik.
    1. Meet de antilichaamconcentratie met behulp van een spectrofotometer.
    2. Begin met antilichaamconjugatie door 500 μL van de filterblokkerende oplossing aan te brengen op een MWCO-filterkolom van 50 kDa om de niet-specifieke binding van antilichamen aan het filter te blokkeren. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder extra vloeistof uit de kolom met behulp van een micropipet van 200 μl.
      OPMERKING: Reductieoplossing 1 is een injectieflacon met oplossing voor eenmalig gebruik, wat voldoende is voor drie antilichaamconjugaties tegelijk. Gebruik de oplossing niet opnieuw na het ontdooien; Gooi het resterende reagens weg. Gebruik geen filter boven de 50 kDa MWCO filterkolom, dit kan leiden tot een slechte zuivering en conjugatie.
    3. Gebruik een equivalent volume van 50 μg van de antilichaamoplossing en voeg dit toe aan een MWCO-filter van 50 kDa. Stel het totale volume indien nodig in op 100 μL met behulp van PBS. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Bereid gedurende deze tijd het reductiemastermengsel voor met 19,8 μl reductieoplossing 1 + 825 μl reductieoplossing 2 voor drie antilichaamconjugaties.
    4. Gooi de doorstroom weg en voeg 260 μL reductiemastermix toe aan de bovenkant van elke filtereenheid. Vortex-oplossing in de filtereenheid gedurende 2-3 seconden en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de incubatie van 30 minuten niet te overschrijden om overmatige reductie van antilichamen te voorkomen, omdat dit ze beschadigt en kan leiden tot mislukte conjugatie.
    5. Na 30 minuten incubatie 8 minuten bij 4 °C naar beneden centrifugeren bij 12.000 x g en de stroom op de bodem weggooien. Voeg 450 μL conjugatieoplossing toe aan de bovenkant van de kolom en draai naar beneden op 12.000 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Bereid tijdens het centrifugeren de CODEX-barcodeoplossing voor. Beweeg snel na het ophalen van de barcode van -20 °C, omdat de barcode begint te verslechteren.
      OPMERKING: Barcodes worden meestal geleverd in kleine glazen flesjes met gevriesdroogde producten (vlokken of poeder) die bij -20 °C worden bewaard. Deze injectieflacons kunnen worden gebruikt om 50 μg antilichaam in één keer te conjugeren. Het wordt aanbevolen om niet meer dan drie antilichamen tegelijk te conjugeren.
    6. Zoek voorzichtig de gevriesdroogde barcode op de bodem van de glazen injectieflacon (deze kan ook aan de wanden zijn geplakt). Tik met de glazen injectieflacon op een tafel om de vaste stoffen naar de bodem te brengen. Het lokaliseren van het gevriesdroogde product is essentieel bij het oplossen ervan in 10 μL nucleasevrij water van moleculaire biologische kwaliteit. Voeg na het toevoegen van 10 μL nucleasevrij water 210 μL conjugatieoplossing toe aan elke barcode. Los al het gevriesdroogde materiaal op en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Gereserveerd.
    7. Nadat u het centrifugeren in stap 2.2.5 hebt voltooid, gooit u de doorstroom weg en voegt u de respectieve barcodeoplossing uit stap 2.2.6 toe aan de bovenkant van elke filtereenheid. Bewaar 1 μg van het initiële ongeconjugeerde antilichaam; dit zal samen met het geconjugeerde 5 μL-antilichaammonster worden uitgevoerd tijdens de validatie van gelelektroforese.
    8. Label elke buis met de respectievelijke antilichaam- en barcodenaam. Sluit het deksel en meng de oplossing door 2-3 s te vortexen. Incubeer de antilichaam-barcodeconjugatiereactie gedurende 2 uur bij RT.
    9. Verwijder na 2 uur incubatie 5 μL geconjugeerd antilichaam en bewaar in een PCR-buisje van 0,2 ml om de conjugatie te bevestigen door middel van gelelektroforese.
    10. Draai de resterende geconjugeerde antilichaamoplossing gedurende 8 minuten bij 12.000 x g bij 4°C naar beneden. Voeg 450 μL zuiveringsoplossing toe aan de bovenkant van de kolom, draai 8 minuten op 12.000 x g bij 4 °C en gooi de doorstroming weg. Herhaal deze zuiveringsstap 2x, voeg elke keer 450 μL zuiveringsoplossing toe en draai deze naar beneden.
    11. Na de3e centrifugatie gooit u de stroom weg. Het bovenste filter bevat de met barcode geconjugeerde antilichamen.
    12. Om het geconjugeerde antilichaam te verzamelen, labelt u de nieuwe buitenste buis die de filterkolom bevat met het bijbehorende antilichaam en de streepjescode. Snijd het deksel van de buitenste buis voordat u gaat centrifugeren. Voeg 100 μL antilichaamopslagoplossing toe aan elke filtereenheid en plaats de nieuw geëtiketteerde buitenbuis ondersteboven op de filterkolom.
    13. Keer de filterkolom om om het geconjugeerde antilichaam in de buitenste buis te verzamelen en draai gedurende 2 minuten naar beneden bij 3.000 x g bij RT. Dit zou ongeveer 120 μL geconjugeerde antilichaamoplossing moeten verzamelen. Breng over naar een steriele microcentrifugebuis en bewaar bij 4 °C gedurende 18-24 maanden.
      OPMERKING: Om hoge achtergrondkleuring van de kern na conjugatie te voorkomen, wordt aanbevolen deze antilichamen gedurende ten minste 2 dagen niet te gebruiken.
  3. Voer conjugatiebevestiging uit door middel van gelelektroforese zoals beschreven in reeds gepubliceerd protocol13.
    OPMERKING: Dit proces bevestigt alleen het succes van de chemische conjugatiereactie die wordt gebruikt om de streepjescodes met antilichamen te vervoegen. Het is optioneel, omdat validatie van antilichamen alleen mogelijk is na succesvolle kleuring en beeldvorming van het weefsel.

3. Voorbereiding van het muizenFFPE-specimen

  1. Verkrijg FFPE-weefselmonsters van C57BL/6J vrouwelijke muizen geïmplanteerd met B16F10-flanktumoren. Behandel muizen met intratumorale injecties van op poly(β-amino-ester) gebaseerde nanodeeltjes die 4-1BBL- en IL-12-plasmiden bevatten, samen met intraperitoneale toediening van anti-PD1 9, 11, 16 en 18 dagen na implantatie14. Offer muizen op dag 20 en repareer tumoren in 10% formaline, ingebed in paraffine, en vervolgens in de kern van de Johns Hopkins Oncology Tissue Services.
  2. Houd zorgvuldig rekening met de specificaties van het beeldgebied in de gebruikershandleiding en monteer 5 μm-monsters op een dia in het beeldgebied. We waren in staat om vier verschillende tumorspecimens op een enkel glaasje te monteren.
    OPMERKING: Het is essentieel om de aanbevolen dia's te gebruiken die beschikbaar zijn voor beeldvorming, zoals Leica Apex Adhesive Slides of Fisherbrand Superfrost Plus Slides. Dit zorgt ervoor dat de flowcel stevig aan de slede hecht.

4. FFPE-weefselkleuring en beeldvorming

  1. Verificatie en optimalisatie van de antilichaamconcentratie en blootstellingstijden: Om het succes van antilichaam-barcodeconjugatie te verifiëren, kleurt u het weefsel van belang met 6-9 geconjugeerde antilichamen. Voer het multiplexbeeldvormingsapparaat uit en noteer elke antilichaamconcentratie en belichtingstijd. Pas de verdunningen en blootstellingstijden indien nodig aan, voer vervolgens 6-9 nieuwe antilichamen uit met de eerder geverifieerde antilichamen en noteer eventuele aanpassingen. Volg de onderstaande stappen voor kleuring en beeldvorming.
  2. Weefselkleuring en beeldvorming
    1. Bak de dag voor het kleuren de FFPE-tissue dia's een nacht in een oven van 60 °C. Laat de dia's de volgende dag 10 minuten afkoelen bij RT voordat u begint met de stappen voor deparaffinisatie en weefselrehydratatie.
    2. Begin met deparaffinisatie van weefsel door 2x 5 minuten in een xyleenoplossing te incuberen.
    3. Om het weefsel te rehydrateren, beweegt u het door twee rondes van 100% ethanoloplossing gedurende elk 5 minuten. Beweeg het vervolgens door een reeks alcoholoplossingen van 90% tot 70%, 50% en 30% gedurende elk 5 minuten. Was ten slotte de tissue twee keer met gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk.
      OPMERKING: Minder giftige alternatieven voor xyleen, zoals een Neoclear-oplossing, kunnen worden gebruikt voor deparaffinisatiestappen. Voer deparaffinisatie en rehydratatie uit onder een zuurkast.
    4. Verdun 10x AR9 buffer tot 1x met gedestilleerd water. Vul een Coplin-pot met 50 ml 1x AR9-buffer en zorg ervoor dat de objectglaasjes volledig zijn ondergedompeld in de antigeenbuffer.
    5. Vul een snelkookpan met water zodat het niveau halverwege de Coplin-pot is en incubeer vervolgens 20 minuten onder hoge druk.
      OPMERKING: Het is mogelijk om een gespecialiseerde snelkookpan of decloakingkamer te gebruiken voor een betere verwijdering van antigeen door deze gedurende 120 minuten op 10 °C in te stellen.
    6. Na het voltooien van de snelkookpanstap, laat u de dia's 45-60 minuten afkoelen. Spoel de dia 2x 2x 2 minuten af met gedestilleerd water. Breng vervolgens het glaasje over naar de pot met 1x PBS.
    7. Om autofluorescentie te minimaliseren, voert u een bleekstap uit op het weefsel voordat u het kleurt met antilichamen. Bereid vers een bleekoplossing (25 ml 1x PBS + 0,8 ml 1M NaOH + 4,5 ml H2O2) met behulp van de aanbevolen reagentia en concentraties. Incubeer de objectglaasjes in een plastic bak met de bleekoplossing tussen twee LED-lampen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal met verse bleekoplossing voor nog eens 45 min.
    8. Begin met het bereiden van de antilichaamcocktailoplossing tijdens deze bleekstap, vooral als er meerdere antilichamen in het paneel zitten met verschillende verdunningen. Haal alle vier de blokkers (G, S, J en N) op en plaats ze op ijs, want sommige hebben tijd nodig om te ontdooien vanaf -20 °C.
    9. Was de tissue na het fotobleken met 1x PBS, 2x gedurende 2 minuten elk. Verplaats de tissue naar potten met hydratatiebuffer en was 2x gedurende 2 minuten elk.
    10. Breng de weefselglaasjes over naar de kleuringsbuffer en laat ze 30 minuten in evenwicht zijn. Als het niet wordt bereid tijdens de bleekstap, bereid dan gedurende deze tijd de antilichaamcocktailoplossing voor.
    11. Bereid 300 μL antilichaamcocktailoplossing voor om twee objectglaasjes te kleuren (meestal, als u een hybridisatieplastic kamer gebruikt, is 100-120 μL antilichaamcocktail voldoende om elk glaasje te kleuren.)
    12. Kleur de objectglaasjes door een antilichaamcocktailoplossing een nacht bij 4 °C in de vochtigheidskamer aan te brengen.
      OPMERKING: Alle antilichamen vertonen hier een positief signaal wanneer ze 's nachts bij 4 °C worden gekleurd. De kleuringstijd en -temperatuur van elk antilichaam kunnen echter variëren en moeten worden geoptimaliseerd. De meest gebruikte kleuringscondities zijn 3 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C. Indien nodig is het ook mogelijk om enkele antilichamen eerst bij verschillende temperaturen te kleuren en vervolgens de resterende antilichamen 's nachts bij 4 °C. Was het weefsel daarna met PBS als opeenvolgende kleuring nodig is.
    13. Voer de volgende dag fixatie na de kleuring uit. Verwijder de plastic kamer en bewaar de verzamelde antilichaamcocktail bij 4 °C. Was de dia's 2x in de kleurbuffer gedurende 2 minuten per stuk. Verplaats de dia's vervolgens naar een fixeeroplossing van 40 ml na de kleuring (4 ml 16% paraformaldehyde + 36 ml opslagbuffer) en incubeer gedurende 10 minuten. Spoel 3x 2 minuten af met PBS.
    14. Verplaats de dia's 5 minuten in ijskoude methanol en spoel vervolgens 3x 2 minuten af met PBS. Breng een laatste fixeeroplossing (20 μL, één tube + 1 ml PBS) aan op de objectglaasjes onder een vochtigheidskamer. Meestal is 200 μL van de fixeeroplossing voldoende per objectglaasje. Laat het fixatief 20 minuten zitten bij RT. Voer drie laatste wasbeurten uit in PBS van elk 2 minuten.
      OPMERKING: Verwijder de fixeerbuis niet van tevoren bij -20 °C; Alleen ontdooien voordat u het aanbrengt.
    15. Als u onmiddellijk beeldvorming uitvoert, veegt u het objectglaasje rond het weefsel af met een pluisvrij weefsel en brengt u de flowcel aan door deze 30 s ingedrukt te houden met behulp van flowcelassemblageapparatuur. Als u later beeldvorming maakt, bewaar het objectglaasje dan (zonder de flowcel aan te brengen) in de opslagbuffer bij 4 °C. Wanneer u klaar bent om een afbeelding te maken, brengt u de dia's gedurende 10 minuten over van de opslagbuffer naar PBS voordat u de flowcel toepast.
  3. Begin met het voorbereiden van 1x lopende buffer met additief op basis van de gewenste cycli in het experiment. Bereid lage (1:4) en hoge DMSO-buffers (9:1) voor door te mengen als 1-delige DMSO met 4-delige lopende buffer en 9-delige DMSO met 1-delige lopende buffer die nodig is voor de gewenste cycli. Bespaar ongeveer 20 ml 1x buffer met additief voor het maken van een reporterplaat. Raadpleeg de instrumentmanager om de benodigde 1x buffer met additieve en hoog/laag DMSO-buffers te berekenen.
  4. Begin met het voorbereiden van de reporterplaat. Maak eerst de reportervoorraadoplossing die nodig is voor het totale aantal cycli. Label zwarte of amberkleurige microcentrifugebuisjes van 1 ml met cyclusnamen. Voeg 250 μL reporter stockoplossing en 5 μL van elke reporter toe aan de corresponderende buis. Breng de oplossing vervolgens over op een zwarte plaat met 96 putjes en sluit deze af met plakfolie.
  5. Start het apparaat, gebruik de instrumentmanager om de parameters en belichtingstijden in te stellen (zoals in tabel 1) en verkrijg de beelden. Figuur 1 geeft een overzicht van de processen voor en na het kleuren.

5. Weefselannotatie en celsegmentatie

  1. Stel een project en werkruimte in.
    1. Installeer de nieuwste versie van digitale pathologieanalysesoftware (bijv. QuPath versie 0.5.1 of hoger). Klik op Project maken om een doelmap voor de projectruimte te kiezen.
    2. Klik op Afbeeldingen toevoegen > Bestanden kiezen en navigeer vervolgens naar het QPTIFF-bestand (geproduceerd op basis van multiplex-immunofluorescentiebeeldvorming). Stel het afbeeldingstype in op Fluorescentie, behoud alle andere standaardinstellingen en klik op Importeren.
    3. Als u QuPath gebruikt, dubbelklikt u op de nieuwe afbeelding om een werkruimte te openen. Klik regelmatig op Bestand > Opslaan om de wijzigingen in het project bij te houden. Schakel de zichtbaarheids- en weergave-instellingen van markeringen in met behulp van de helderheid en contrast (pictogram voor een halve maan) in het midden van de werkbalk.
      OPMERKING: Klik met de rechtermuisknop op een afbeelding in de lijst met afbeeldingen om de naam ervan te wijzigen. Dit zal later belangrijk zijn bij het visualiseren van fenotypeclassificaties.
  2. Annoteer de volledige weefseldoorsnede, het intratumorale compartiment en het stromale compartiment.
    1. Gebruik het penseel en/of de toverstok om een annotatie te maken rond het hele weefselgedeelte. Definieer deze annotatie als Full_Tissue. Sluit de bovenliggende huid en/of regio's uit die niet mogen worden geanalyseerd. Als u een negatieve annotatie wilt maken en/of de annotatiegrens wilt verkleinen, houdt u de Alt-toets ingedrukt terwijl u een van de annotatietools gebruikt.
    2. Dupliceer de volledige weefselannotatie. Selecteer de Annotatie onder het tabblad Annotaties en ga vervolgens naar Objecten > Annotaties... > Geselecteerde annotaties dupliceren.
    3. Zet het SOX10-kanaal aan. Verklein bij de gedupliceerde annotatie de annotatiegrens om het intratumorale compartiment vast te leggen met behulp van het Alt + penseel/staaf-gereedschap. Definieer deze annotatie als een tumor (Figuur 2).
    4. Als u de volledige weefselannotatie selecteert, gaat u naar Objecten > Annotaties... > Annotaties uitvouwen. Definieer de uitbreidingsstraal als 1 μm en klik op Uitvoeren.
    5. Wijzig de naam van de nieuwe annotatie in Full_Tissue_Expansion. Selecteer de tumorannotatie, klik met de rechtermuisknop en selecteer Invoegen in hiërarchie.
    6. Selecteer de tumorannotatie opnieuw, ga naar Objecten > annotaties... > Maak omgekeerd. Definieer deze nieuwe annotatie als Stroma. Herhaal dit voor alle weefselcoupes.
  3. Voer celsegmentatie uit en exporteer resultaten.
    1. Ga naar het tabblad Afbeelding om de pixelbreedte en -hoogte van de afbeelding te vinden (Afbeelding 3A).
    2. Download de StarDist-extensie op https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases. Sleep het bestand qupath-extension-stardist-[version].jar naar het QuPath-venster en klik vervolgens op het tandwielpictogram in de rechterbovenhoek van het QuPath-venster. Definieer onder Extensies de QuPath-gebruikersmap als de locatie van de StarDist-map.
    3. Download de StarDist groovy scriptbestanden en het StarDist-modelbestand van https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (StarDist-scripts zijn oorspronkelijk georganiseerd vanuit Akoya Biosciences).
    4. Selecteer voor elk weefselgedeelte zowel de tumor - als de stroma-annotaties (gebruik Ctrl om meerdere annotaties te selecteren). Klik in de bovenste instellingenbalk op Automatiseer > scripteditor om de scriptinterface te openen. Open het juiste StarDist-celsegmentatiescript (groovy-bestand) dat overeenkomt met de pixelgrootte van de afbeelding. Wanneer u wordt gevraagd om het celsegmentatiebestand te selecteren, opent u het bestand stardist_cell_seg_model.pb.
    5. Sla de afbeelding na celsegmentatie op. Ga naar Meten > Metingen exporteren en selecteer vervolgens de bijbehorende afbeelding(en). Wijs het type Exporteren als cellen en het scheidingsteken als .csv toe en kies vervolgens de locatie van het uitvoerbestand . Klik op Invullen naast Kolommen om interessante statistieken op te nemen. Belangrijke kolommen om te exporteren zijn Afbeelding, Object-ID, Bovenliggend, Zwaartepunt X, Zwaartepunt Y en Kerngebied.
      OPMERKING: De object-ID wordt in de volgende stappen gebruikt om classificaties terug te koppelen naar het multiplex-immunofluorescentiebeeld in de digitale pathologieanalysesoftware. De kolom Bovenliggend geeft de annotatienaam aan waartoe de cel behoort. X- en Y-gegevens worden gebruikt voor ruimtelijke analyse.
    6. Selecteer voor elke afstammingsmarkering die moet worden gebruikt bij clustering/fenotypering één gemiddelde waarde om te exporteren. Voor nucleaire markers (bijv. SOX10 en FOXP3) exporteert u de optie Nucleus: Mean. Voor cytoplasmatische/membraneuze markers (bijv. CD45, CD3, CD4) exporteert u de optie Cytoplasma: Gemiddelde.

6. Voorverwerking en normalisatie van Proteomics-gegevens

  1. Open het geëxporteerde CSV-bestand. Voor elke markering die moet worden gebruikt bij clustering/fenotypering, kapt u de naam van de kolomkop af zodat alleen de markering wordt opgenomen. Hernoem bijvoorbeeld SOX10: Nucleus: Mean naar SOX10 en CD3: Cytoplasma: Mean naar CD3.
  2. Installeer de nieuwste versie van R en RStudio. Download het bestand Marker Normalization.R van https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis en voer het script uit. Dit omvat eerst het filteren van cellen op nucleaire grootte.
  3. Voor elke markering wordt vervolgens een min-max-normalisatie uitgevoerd, zodat de laagste MFI-waarde in het expressiebereik wordt ingesteld op 0 en de MFI-waarde op het 99,7e percentiel op 1. Alle intensiteiten boven het 99,7e percentiel worden geknipt op 1. Als u klaar bent, slaat u het nieuwe CSV-bestand op dat is gegenereerd met de genormaliseerde gegevens.

7. Clustering en fenotypering

  1. Kies een algoritme voor het clusteren van cellen op basis van markerexpressieprofielen. Op https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis worden R-scripts geleverd voor clustering met behulp van Seurat v4.415 en FlowSOM v2.13.9 (clustering- en visualisatietool)16.
  2. Fenotypeer cellen volgens de markerexpressieprofielen van de belangrijkste afstammingsmarkers. Het hier gepresenteerde protocol gebruikte 14 afstammingsmarkers voor clustering en fenotypering: SOX10, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD11C, F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206, NK1.1 en CD31.
    1. Definieer tumorcellen als SOX10hi. Definieer CD4T-cellen als CD45 mod-hi/ CD4hi/CD8laag/FOXP3laag. Definieer CD8 T-cellen als CD45mod-hi/ CD8hi/CD4laag. Definieer Tregs als CD45mod-hi/CD4hi/CD8low/FOXP3hi. Definieer andereT-cellen als CD45 mod-hi/CD3hi/CD4laag/CD8laag.
    2. Definieer M1-macrofagen als CD45mod-hi/F4/80hi/CD68hi/CD86hi/CD163low /CD206low. Definieer M2-macrofagen als CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86laag/CD163hi/CD206laag, CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86laag/CD163laag/CD206hi, of CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86laag/CD163hi/CD206hi. Definieer andere macrofagen als CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86laag/CD163laag/CD206laag , of CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86hi/CD163hi/CD206hi.
    3. Definieer dendritische cellen als CD45mod-hi/CD11chi/CD86mod-hi. Definieer NK-cellen als CD45mod-hi/NK1.1hi. Definieer andere immuuncellen als CD45mod-hi die niet voldeden aan de hierboven beschreven voorwaarden. Definieer endotheelcellen als CD31mod-hi. Verwijder alle andere expressieprofielen.

8. Fenotypeclassificaties opnieuw toewijzen en kwaliteitscontrole uitvoeren

  1. Download het Remapping Classifications.groovy script van https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (dit script is aangepast van een bericht op https://forum.image.sc/ door petebankhead).
  2. Open het gefenotypeerde CSV-bestand en zorg ervoor dat alle labels onder het tabblad Afbeelding exact overeenkomen met de naam van het afbeeldingsbestand in de digitale pathologieanalysesoftware die zal worden gebruikt voor het opnieuw toewijzen. Als u snel grote hoeveelheden etiketten in het CSV-bestand wilt wijzigen, gebruikt u de functie Alles vervangen.
  3. Als u QuPath gebruikt, voert u het groovy-bestand voor het opnieuw toewijzen van classificaties uit door te klikken op > scripteditor automatiseren.
  4. Klik op het tabblad Annotaties op de drie puntjes naast de knop Automatisch instellen en klik vervolgens op Vullen van bestaande objecten > Alle klassen (inclusief subklassen) > Ja.
  5. Scroll naar beneden in de lijst met markeringen om de verschillende fenotypeclassificaties te bekijken en het kleurenschema naar behoefte aan te passen. Dubbelklik op een cel om het fenotype (naast de classificatietag) en cluster (naast de naamtag) weer te geven. Controleer representatieve gezichtsvelden om de nauwkeurigheid van fenotypetoewijzingen te bepalen en herzie de fenotyperingsstrategie indien nodig (Figuur 3B).

9. Kwantificering van de dichtheid en ruimtelijke analyse

  1. Zodra de fenotypering is voltooid, verkrijgt u annotatiegebieden in de digitale pathologieanalysesoftware onder het tabblad Annotaties. Converteer gebiedswaarden naar mm2 en deel vervolgens het aantal door annotatiegebieden om dichtheden te berekenen.
  2. Download het SPIAT Spatial Analysis.R-script van https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis en voer het uit. Verzamel gegevens over gemiddelde minimumafstanden (AMD), buurtsamenstellingen en genormaliseerde mengscores (NMS).
  3. Genereer cijfers in statistische analysesoftware om bevindingen te presenteren. Bij het genereren van een enkele heatmap voor de gemiddelde minimumafstanden van de behandelingsomstandigheden, neemt u het gemiddelde van de resultaten van verschillende weefselsecties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het ontwerpen van een antilichaampanel voor muizen FFPE-weefsel, het uitvoeren van multiplex immunofluorescentiebeeldvorming en het analyseren van afbeeldingen voor proteomics-kwantificering en ruimtelijke relaties. Het gevalideerde panel bevat 27 antilichamen die markers leveren voor het visualiseren van melanoomcellen (SOX10), leukocyten (CD45), T-cellen (CD3, CD4, CD8, FOXP3), B-cellen (CD20), macrofagen en subtype...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van beeldvorming hangt af van een goed ontworpen en gevalideerd antilichaampanel. Multiplex-immunofluorescentiebeeldvorming van FFPE-monsters brengt uitdagingen met zich mee vanwege de hoge autofluorescentie en de moeilijkheid om epitopen op te halen die worden gemaskeerd door paraffine-inbedding. Aangezien FFPE echter verschillende voordelen biedt in vergelijking met FF-monsters, is het essentieel om FFPE-antilichaampanelen te ontwerpen en te valideren. Het afronden van de an...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.S. erkent financiële steun van Emerson Collective LLC en de National Institutes of Health. J.J.G. erkent ook financiering van de National Institutes of Health. J.C.S. heeft een relatie met Palleon Pharmaceuticals Inc., waarbij subsidies worden verstrekt. S.Y.T. en J.J.G. hebben een relatie met OncoSwitch Therapeutics waarbij aandelen of aandelen betrokken zijn. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. en K.M.L. hebben een aangevraagd patent. Alle andere auteurs stellen dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die kunnen worden gezien als van invloed op het onderzoek dat in dit artikel wordt gepresenteerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.S. erkent de Dermatology Foundation en de Dermatopathology Career Development Award voor het bevorderen van de carrière van de auteur. De auteurs bedanken Hsin-Pei Lee van het Cancer Data Science Laboratory van het National Cancer Institute voor hulp bij computationele analysetechnieken. Dit onderzoek werd gefinancierd door het Emerson Collective en de National Institutes of Health (R37CA246699, P41EB028239 en R01CA228133). Bovendien wordt de kern van de Johns Hopkins Oncology Tissue Services (OTS) ondersteund door de National Institutes of Health (P30CA006973).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy SciencesPN# 15710Vereist tijdens het weefselkleuringsproces
50kDa MWCO filterMilliporeUFC50509625 kDa en 100 kDa resulteren in falen
Akoya barcodes en reportersAkoya BiosciencesVariabelElke barcode kan worden gebruikt om 50 µg van een dragervrije antilichaam te koppelen en wordt geleverd met twee flacons reporters
Antilichaam-koppelingskitAkoya Biosciences7000009Een koppelingskit wordt gebruikt om aangepaste barcode-gekoppelde antilichamen te maken. Elke kit bevat voldoende reagentia voor tien koppelingen. De kit bestaat uit een subkitbox opgeslagen bij 4 °C en een subkitbox opgeslagen bij -20 °C. De 4 °C subkit bevat Filter Blocking Solution, Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution en Antibody Storage Solution. De -20 °C subkit bevat Reduction Solution 1.
Beta2MGAbcam ab214769
CD11bCST #41028
CD11CCST #39143SF
CD163CST #68922BF
CD20CST #45839
CD206CST #87887
CD3CST #24581
CD31CST #92841
CD38CST #68336BF
CD4Abcam ab271945
CD45CST #98819
CD68CST #29176
CD8Invitrogen #14-0808-82
CD86CST #20018
Dimethyl sulfoxideAvantor/VWRBDH1115-4LP
EOMESAbcam ab222226
Eppendorf PCR-buisjesEppendorfE0030124286Vereist om 5 μL geconjugeerd antilichaam op te slaan voor bevestiging van koppeling door gelelektroforese
Ethanol 200 proof
F4/80CST # 25514
FoxP3CST #72338
Gran-BCST #79903SF
Verwarmingsoven
HybridisatiekamerGebaten om weefsel te kleuren met antilichaamcocktail
WaterstofperoxideSigma#216763Vereist voor het bereiden van bleekoplossing
Instant pot drukpan of Decloaking Chamber ARCInstant pot of Biocare Medical
Ki-67Akoya Biosciences
LAG3CST #80282BF
LMP2Abcam ab243556
Methanol
MHC-IIeBioscience #14-5321-82
NK1.1CST #24395SF
KernkleuringAkoya Biosciences7000003
PDL1CST #85095
Salmon Sperm DNA, gescheurd (10 mg/mL)InvitrogenAM9680Kan worden gebruikt als alternatief voor assayreagens (Akoya) tijdens de voorbereidingsstap van de reporterplaat.
SOX-10Abcam ab245760
Kleurkit voor PhenoCycler-FusionAkoya Biosciences7000017De PhenoCycler-Fusion Sample Kit bevat de buffers en reagentia die nodig zijn voor weefselkleuring met behulp van antilichamen geconjugeerd met PhenoCycler-barcodes, samen met flow cellen voor hele-glijbeeldvorming. Elke kit is voldoende voor 10 PhenoCycler-Fusion-experimenten. Het bestaat uit een subkit opgeslagen bij 4 °C, een andere bij -20 °C en een pakket van 10 flow cellen bewaard op kamertemperatuur. De subkit opgeslagen bij 4 °C bevat Hydration Buffer, Staining Buffer, Storage Buffer, N Blocker en J Blocker. De subkit opgeslagen bij -20 °C bevat G Blocker, S Blocker en Fixatie Reagens.
T-betCST #53753
TIM-3CST #72911
UltraPure DNase/RNase-vrije gedestilleerd waterInvitrogen10977015Vereist om barcodes op te lossen tijdens antilichaammoppeling

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schadendorf, D., et al. Melanoma. Lancet. 392 (10151), 971-984 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathol. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Marzagalli, M., Ebelt, N. D., Manuel, E. R. Seminars in cancer biology. 59, 236-250 (2019).
  4. De Visser, K. E., Joyce, J. A. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer cell. 41 (3), 374-403 (2023).
  5. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  6. Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by codex tissue imaging. Front Immunol. 12, 687673(2021).
  7. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nat Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  8. Keren, L., et al. Mibi-tof: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Sci Adv. 5 (10), eaax5851(2019).
  9. Lin, J. R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method. Nat Comm. 6 (1), 8390(2015).
  10. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  11. Black, S., et al. Codex multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  12. Aung, T. N., Bates, K. M., Rimm, D. L. High-plex assessment of biomarkers in tumors. Mod Pathol. 37 (3), 100425(2024).
  13. Surwase, S. S., et al. Highly-multiplexed immunofluorescence phenocycler panel for murine ffpe yields insight into tumor microenvironment immunoengineering. Lab Invest. 105 (1), 102165(2024).
  14. Luly, K. M., Green, J. J., Sunshine, J. C., Tzeng, S. Y. Biomaterial-mediated genetic reprogramming of merkel cell carcinoma and melanoma leads to targeted cancer cell killing in vitro and in vivo. ACS Biomater Sci Eng. 9 (11), 6438-6450 (2023).
  15. Satija, R., Farrell, J. A., Gennert, D., Schier, A. F., Regev, A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 33 (5), 495-502 (2015).
  16. Van Gassen, S., et al. Flowsom: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry Part A. 87 (7), 636-645 (2015).
  17. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 36 (5), 411-420 (2018).
  18. Watson, S. S., et al. Microenvironmental reorganization in brain tumors following radiotherapy and recurrence revealed by hyperplexed immunofluorescence imaging. Nat Comm. 15 (1), 3226(2024).
  19. Greenwald, N. F., et al. Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning. Nat Biotechnol. 40 (4), 555-565 (2022).
  20. Goldsborough, T., et al. Instanseg: An embedding-based instance segmentation algorithm optimized for accurate, efficient and portable cell segmentation. arXiv. , (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplex ImmunofluorescenceDNA Barcode ImagingFFPE SpecimensMurine MelanomaSpatial ProteomicsAntibody Panel DesignTissue MicroenvironmentImage Analysis PipelineCell PhenotypingTumor Microenvironment

Gerelateerde artikelen