Dit protocol beschrijft in ovo xenotransplantatie van van de patiënt afgeleide B- en T-acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen, die 4 dagen na injectie plaatsvindt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Ovo Xenotransplantatie van van patiënten afgeleide acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen (PDX-ALL)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie introduceert een snelle, kosteneffectieve en efficiënte methode voor in ovo xenotransplantatie van van patiënten afgeleide acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen, die zowel B-cel- als T-cellijnen omvatten. Met behulp van bevruchte kippenembryo's injecteerden we 11 dagen na de bevruchting (11dpf) van patiënten afgeleide B-ALL- en T-ALL-cellen in het vaatstelsel van embryo's. Opmerkelijk is dat vier dagen na de injectie de geënte menselijke leukemiecellen een significante overleving, proliferatie en vasculaire kolonisatie vertoonden in het zich ontwikkelende kippenembryo. Bij 15dpf detecteerden we een opmerkelijke toename van CD10/CD19+ B-ALL en CD4/CD8+ T-ALL cellen in bloedmonsters van het vaatstelsel van het embryo, wat een succesvolle implantatie bevestigt. Dit systeem vergemakkelijkt een efficiënte en reproduceerbare beoordeling van het gedrag van leukemiecellen in een levend organisme zonder de aanzienlijke kosten en ethische beperkingen die gepaard gaan met andere diermodellen. Deze snelle aanpak biedt een high-throughput en biologisch relevant in vivo platform voor het evalueren van potentiële therapeutische verbindingen. Het in ovo patiënt-afgeleide xenotransplantaat (PDX)-ALL-systeem dat hier wordt gepresenteerd, biedt een veelbelovend hulpmiddel voor preklinische screening van geneesmiddelen, mechanistische studies en mogelijk voor gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen in leukemieonderzoek.
Inleiding
Het chorioallantoïsche membraan (CAM) van kuikens begint vorm te krijgen op dag 7 na de bevruchting na incubatie en is voltooid op dag 12. De CAM staat in de schijnwerpers als een geschikt in vivo model voor angiogenese1 en het transplanteren van kankercellen 2,3,4,5,6,7,8,9,10, met name bloedgerelateerde kankercellen11, omdat het inherent immunodeficiënt is en een goed ontwikkelde vascularisatie heeft. Bovendien is de CAM ook een wenselijk systeem voor het onderzoeken van tumorinvasie en metastase, aangezien het een aantal extracellulaire matrixeiwitten vervoert, waaronder collageen, integrine αVβ3, fibronectine, laminine en matrixmetalloproteïnase-2 (MMP-2)10.
Acute lymfatische leukemie (ALL) is een kanker van het beenmerg en bloed die wordt gekenmerkt door de snelle toename van onrijpe B- en T-lymfocyten. Het is de meest voorkomende kinderkanker en de belangrijkste doodsoorzaak door kanker bij kinderen. ALL is te genezen bij >85% van de getroffen kinderen, maar volwassenen en zuigelingen hebben aanzienlijk lagere genezingspercentages, en recidiverende/refractaire ALL heeft een 5-jaarsoverleving van <10%12. Er is dus dringend behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën om recidiverende of refractaire ALL te voorkomen of te stoppen. Hoewel er een aantal xenotransplantaatmodellen zijn ontwikkeld, zoals muis en rat13, zijn deze methoden tijdrovend (bijv. maanden) en duur, en vereisen ze uitgebreide ethische voorschriften. Om tegemoet te komen aan een onvervulde klinische behoefte aan nieuwe ALL-therapie, is het absoluut noodzakelijk om een reproduceerbaar, tijd- en kosteneffectief diermodel te ontwikkelen dat geschikt is voor het uitbreiden van fundamenteel in-vitrowerk .
In deze studie rapporteren we de succesvolle opstelling van een in ovo xenotransplantaatprotocol dat op betrouwbare wijze 3D-vasculaire kolonisatie van B- en T-ALL-cellen van patiënten produceert, dat mogelijk wordt gebruikt voor het ontwerp van nieuwe therapie die ALLE progressie zou kunnen stoppen en voor de ontwikkeling van een voorspellend hulpmiddel voor ALLE behandelingsresultaten en risico's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd op basis van het protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Calgary (REB15-1143; waar geïnformeerde toestemming werd verkregen van ALLE proefpersonen) en de Health Research Ethics Board van het Alberta Cancer Committee (HREBA. CC-17-0108_REN8). Patiënten met ALL bij de diagnose (vóór het starten van de therapie), die circulerende blasten hadden (blasten niet alleen in het merg maar ook in het bloed), werden in het onderzoek opgenomen. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Incubatie van eieren
- Koop bevruchte kippeneieren. Verkrijg ~10% meer eieren dan nodig is om rekening te houden met het aantal eieren dat tijdens het transport of de kraakprocedure is beschadigd.
- Bewaar de bevruchte eieren maximaal twee weken bij 12 °C zonder de levensvatbaarheid te verliezen.
- Breng de eieren over in een bevochtigde (~50%-60%) rollende broedmachine bij 39 °C.
- Broed de eieren uit in de broedmachine voor 10dpf. Merk op dat dag 1 begint wanneer de eieren in de broedmachine worden overgebracht.
2. Isolatie van acute lymfoblastische leukemiecellen uit bloedmonsters van patiënten met ALL
- Isoleer de cellen zoals eerder beschreven14,15.
- Verzamel 10 ml perifeer bloed (of merg) van B- en T-ALL-patiënten in gehepariniseerde reageerbuisjes.
- Breng de bloedmonsters over in een steriele centrifugebuis van 50 ml en verdun driemaal met 2 volumes 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4 bevat.
- Leg 1 volume van de verdunde bloedmonsters op 1 volume dichtheidsgradiëntmedium en centrifugeer bij kamertemperatuur zonder onderbreking op 300 x g gedurende 30 min.
- Verzamel de buffy laaglaag van mononucleaire cellen (MNC's) van de interface en breng deze over naar een nieuwe steriele buis van 15 ml met behulp van een steriele pipet.
- Voeg 10 ml 1x PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g om eventuele resterende serumcomponenten te verwijderen (herhaal deze stap twee keer).
- Voeg 2 ml 0,8% NH4Cl toe aan de celpellet, vortex voorzichtig, incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur en draai 5 minuten op 300 x g om rode bloedcellen te lyseren (herhaal deze stap indien nodig).
- Was de cellen in 1x PBS zoals beschreven in stap 2.6.
- Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 met 10% FBS en tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de Trypan Blue Exclusion-assay.
- Resuspendeer de cellen in het vriesmedium (10% DMSO in FBS), vries ze in bij -80 °C en bewaar ze in vloeibare stikstof.
3. Amplificatie van 2e generatie replicatie-incompetente lentivirus dragend mCherry
- Zaad HEK293T menselijke embryonale niercellen met ~60%-70% confluentie in een plaat met 6 putjes met DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Cotransfecteer de cellen (1,5 x 106) met FUW-Luc-mCherry-puro-transfer, pCMVΔr8.91-verpakking en pVSV-G-envelopvectoren in een verhouding van 3:2:1 met behulp van Lipofectamine 3000 gedurende 2 dagen.
- Oogst het lentivirus-bevattende supernatans en filtreer door een filter van 0,45 μm.
- Breng het geklaarde virale supernatans over in centrifugebuisjes, centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C, gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in 100 μl PBS of serumvrij medium.
- Meet de multipliciteit van infectie (MOI) met behulp van de qPCR Lentivirus Titer-kit.
4. Labelen van continu groeiende ALLE cellijnen en patiënt-afgeleide ALLE cellen met mCherry
- Plaat 1 x 106 cellen/ml B-(SEM) en T-ALL (MOLT3)16,17 cellijnen en van de patiënt afgeleide B- of T-ALL-cellen in platen met 6 putjes die RPMI 1640 + 10% FBS bevatten.
- Infecteer de cellen met 300 μL lentiviraal preparaat met een virale titer van 3,47 x 106 IE/ml om een MOI van 1 te verkrijgen voor 1 x 106 cellen, meng voorzichtig en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 dagen.
- Voeg 1 μg/ml puromycine toe aan het kweekmedium om gedurende 2 dagen stabiel getransduceerde cellen te selecteren.
- Visualiseer mCherry-gelabelde cellen met een fluorescentiemicroscoop.
5. In ovo xeno-enting
- Onderzoek op dag 10 (zie hierboven het gedeelte over het incuberen van eieren) het vaatstelsel van de kuikenembryo's onder licht om de levensvatbaarheid van het embryo te beoordelen. Was de eieren vervolgens voorzichtig met 70% ethanol om het oppervlak te steriliseren.
- Boor in de luchtcel van de eieren om met een handboor een klein venster (~2,0 cm in diameter) te maken.
- Sluit af met transparant plakband en plaats terug in een 5% CO2 -incubator.
- Injecteer op dag 11 1 x 107 mCherry-gelabelde ALLE cellen in de bloedvaten van de zich ontwikkelende embryo's met behulp van naalden van 34 G. Merk op dat het moeilijk bleek te zijn om te bevestigen of ALLE cellen op identieke locaties in verschillende embryo's werden geïnjecteerd, omdat het openen van het raam op dezelfde locaties niet gegarandeerd is.
- Sluit de ramen af met transparant plakband, keer terug naar de 5% CO2 -incubator en controleer de levensvatbaarheid van het embryo dagelijks.
- Ontleed op dag 15 bloedvaten uit embryo's, plaats ze op glasplaatjes en fotografeer succesvolle xenotransplantaten met behulp van een ontleedmicroscoop die is uitgerust met fluorescentiemogelijkheden.
OPMERKING: Boven 15 dpf (aangezien veren het hele lichaam bedekken en het eiwit bijna verdwenen is), moet immunohistochemie worden uitgevoerd om de veranderingen in proliferatie en kolonisatie van ALLE cellen in het vaatstelsel van het kuikenembryo te beoordelen.
6. Flowcytometrie
- Op dag 15 wordt bloed uit het vaatstelsel van het kippenembryo afgenomen met behulp van een steriele spuit met een naald van 32 G, overgebracht in een steriel buisje van 1,5 ml met heparine en centrifugeert bij 226 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het bovenstaande (plasma) en suspendeer de celpellet in 1x PBS met 1% BSA (runderserumalbumine).
- Voer stap 2.7 en stap 2.8 uit om rode bloedcellen te lyseren.
- Label B-ALL-cellen met humane FITC-CD10- en humane PE-CD19-antilichamen en T-ALL-cellen met humane FITC-CD4- en humane PE-CD8-antilichamen respectievelijk 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Was de gelabelde cellen twee keer met PBS met 1% BSA, centrifugeer bij 226 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, resusureer in 1x PBS en analyseer met flowcytometrie.
- Stel de spanningen van de voorwaartse verstrooiing (FSC) en de zijverstrooiing (SSC) in op respectievelijk 400 V en 360 V. Pas de detectorversterking voor de FITC- en PE-kanalen aan op respectievelijk 450-500 V en 400-450 V.
OPMERKING: Gating strategie: (a) light scatter gating (FSC vs. SSC): gebruik FSC-A vs. SSC-A om een populatie te identificeren met intermediaire voorwaartse verstrooiing (grootte) en lage zijverstrooiing (granulariteit), die overeenkomt met het lymfoblastgebied. Merk op dat deze stap helpt bij het uitsluiten van puin en meer korrelige cellen zoals monocyten of granulocyten; (b) singlet selectie (FSC-H vs. FSC-A): doubletdiscriminatie uitvoeren door te gating op FSC-H vs. FSC-A, dat ervoor zorgt dat alleen gebeurtenissen met één cel worden geanalyseerd18. - Kwantificeer CD10/CD19+ B-ALL- en CD4/CD8+ T-ALL-cellen door gebeurtenissen in kwadrant 2 (Q2; FITC/PE+) van FITC vs. PE standplaatsen18. Present betekent ± SEM van drie onafhankelijke experimenten (n = 3).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te bepalen of de enting van menselijkeALL-cellen in zich ontwikkelende kippenembryo's succesvol was, werd 2e generatie replicatie-incompetente lentivirus met mCherry geamplificeerd en gebruikt om B- en T-ALL-cellijnen, respectievelijk SEM en MOLT316,17, te labelen. Zoals te zien is in figuur 1A, waren ~50% van B- (linksboven twee panelen) en T-(rechtsboven twee panelen) ALLE cellen gela...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er werden drie kritieke stappen tijdensde in ovo xenotransplantatie geïdentificeerd om microbiële besmetting te voorkomen en de overleving van kippenembryo's te maximaliseren: d.w.z. (1) sterilisatie van het eierschaaloppervlak met 70% ethanol voorafgaand aan het maken van het venster en (2) goede afdichting van het eierschaalvenster met cellotape om verdamping van de inhoud van het kippenembryo tijdens incubatie te voorkomen, en (3) het gebruik van de fijne naald (bijv. 34 G) ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Andrew Kung van Columbia University voor het verstrekken van FUW-Luc-mCherry-puro. Dit werk werd ondersteund door subsidies van CIHR (PJT-174983) aan KYL en van de National Research Foundation of Korea (NRF; RS-2023-00284121) naar KYL en M-YJ.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 34 G naalden | BD Perisafe | ||
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | ||
| BD Perisafe Spuit (32 G) | BD Perisafe | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Millipore Sigma | A9647 | |
| Celvriesmedium | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Centrifuge (Allegra X-22R Centrifuge ) | Beckman Coulter | ||
| Disponibel handschoenen | Royal Touch300 Nitrile Exam Gloves | ||
| Dissectiemicroscoop | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Ei-incubator, Vevitts 120 rolling Incubator | Vixest Trading Co. | ||
| Ethyl alcohol (95%) | VWR International | BDH1158-4LP | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Ficoll oplossing (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10 antilichaam | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| FITC-CD4 antilichaam | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| Fluorescentiemicroscoop | Leica Microsystems | ||
| Handboor (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, USA | CRL-3216 | |
| Hemocytometer | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Heparidinatriumzout uit varkensdarm mucosa | Millipore Sigma | H3149 | |
| Heparinisatie buisjes | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Multiplex Lentivirus Titer Kit (qPCR Lentivirus Titer Kit) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (Ammoniumchloride_ | Millipore Sigma | A9434 | |
| Olympus IX71 invers microscoop | Olympus | ||
| PE-CD19 antilichaam | Santa Cruz Biotech | sc-19650 PE | |
| PE-CD8 antilichaam | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pipetten (instelbaar volume) | Eppendorf | ||
| Puromycin | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Scotch Cellotape | 3M | ||
| Steriele 6-well platen | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| Steriele centrifuge buisjes | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Steriele kweekkolven (75T) | VWR International | 10062-872 | |
| Steriele Falcon buisjes (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Steriele Falcon buisjes (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Steriele filter (0,45 µm filter) | VWR International | 76778-974 | |
| Steriele tang | VWR International | 82027-404 | |
| Steriele glazen objectglaasjes | VWR international | 48300-031 | |
| Steriele pipettentips | VWR International | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Steriele spuiten | BD spuit | 309628? | |
| Trypan Blauw | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
Referenties
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (5), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK activity as a determinant of tumor growth and dormancy: Regulation by p38. Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
- Sys, G. M. L., et al. The CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
- Li, M., et al. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. J Vis Exp. (104), e52411(2015).
- Pontel, L. B., et al. Acute lymphoblastic leukemia necessitates GSH-dependent ferroptosis defenses to overcome FSP1-epigenetic silencing. Redox Biol. 102408, (2022).
- Oriol, A., et al. Outcome after relapse of acute lymphoblastic leukemia in adult patients included in four consecutive risk-adapted trials by the PETHEMA Study Group. Haematologica. 95 (4), 589-596 (2010).
- Xin, Q., Chen, Z., Wei, W., Wu, Y. Animal models of acute lymphoblastic leukemia: Recapitulating the human disease to evaluate drug efficacy and discover therapeutic targets. Biochem Pharmacol. 198, 114970(2022).
- Gilmore, M. J., Prentice, H. G., Blacklock, H. A., Janossy, G., Hoffbrand, A. V. A technique for rapid isolation of bone marrow mononuclear cells using Ficoll-Metrizoate and the IBM 2991 blood cell processor. Br J Haematol. 50 (4), 619-626 (1982).
- Boyer, T., et al. Flow cytometry to estimate leukemia stem cells in primary acute myeloid leukemia and in patient-derived xenografts, at diagnosis and follow-up. J Vis Exp. (133), e56976(2018).
- Kang, S. M., et al. Genome-wide loss-of-function genetic screening identifies opioid receptor mu1 as a key regulator of L-asparaginase resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 36 (42), 5910-5913 (2017).
- Lee, J. K., et al. HAP1 loss confers L-asparaginase resistance in ALL by downregulating the calpain-1-Bid-caspase-3/12 pathway. Blood. 133 (20), 2222-2232 (2019).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
