Een olfactorische voorkeurstest voor het meten van olfactorische hedonische vooroordelen in muismodellen van depressie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol van een olfactorische voorkeurstest die het mogelijk maakt om negatieve olfactorische vooroordelen ten opzichte van zowel eetlust als aversieve geurstimuli in muismodellen van depressie te beoordelen.

Samenvatting

Depressie is wereldwijd de grootste veroorzaker van invaliditeit en treft jaarlijks 280 miljoen mensen. Naast verminderde activiteit en motivatie is aangetoond dat depressie geassocieerd is met een negatieve valentiebias: patiënten vinden neutrale en positieve sensorische stimuli minder aangenaam en negatieve prikkels onaangenamer in vergelijking met gezonde personen. In het bijzonder kan olfactorische hedonische bias een toestandsmarker van de ziekte bij patiënten zijn en kan deze gemakkelijk worden gemeten in muismodellen. Er zijn echter maar heel weinig tests bij dieren om emotionele vooringenomenheid op een translationele manier te meten. Hier stellen we een protocol voor voor een betrouwbare evaluatie van de toeschrijving van geurvalentie van controle- en depressieve muizen door het onderzoeken van geurstoffen die verband houden met verschillende hedonistische waarden. Met behulp van deze olfactorische voorkeurstest en verschillende gedragsuitlezingen bevestigen we een negatieve olfactorische bias ten opzichte van zowel appetitieve als aversieve stimuli in twee verschillende muismodellen van depressie. Belangrijk is dat deze methode van toepassing is op zowel mannelijke als vrouwelijke individuen. Ten slotte maakt dit protocol meerdere aanpassingen mogelijk om de evaluatie van de emotionele respons te verbeteren en kan het gemakkelijk worden gecombineerd met klassieke hulpmiddelen voor het live monitoren van neuronale activiteit.

Inleiding

Depressie is een ernstige stemmingsstoornis en wereldwijd een belangrijke oorzaak van invaliditeit. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie ervaren ongeveer 280 miljoen mensen, d.w.z. 4% van de bevolking, een depressie. Het komt 50% vaker voor bij vrouwen dan bij mannen, en de uitbraak van COVID-19 verhoogde de prevalentie van depressieve stoornissen met 25% in het eerste jaar van de pandemie (Wereldgezondheidsorganisatie, 2022). Bovendien reageert ongeveer een derde van de patiënten niet op klassieke antidepressiva, duurt het weken om antidepressieve effecten waar te nemen en blijft de fysiopathologie van stemmingsstoornissen grotendeels onbekend.

Op basis van de DSM-5¹ is een diagnose van depressie gebaseerd op verschillende symptomen, waaronder een depressieve stemming, verlies van interesse of plezier, aanzienlijke gewichtsvariatie, een fysieke en psychologische vertraging, vermoeidheid, gevoelens van waardeloosheid, concentratieproblemen en terugkerende gedachten aan de dood. Klinische studies hebben ook aangetoond dat stemmingsstoornissen gepaard gaan met sensorische veranderingen: depressieve patiënten vinden sensorische prikkels minder prettig dan controlepersonen ^2,3,4.

Hedonistische "valentie" verwijst naar de mate waarin iets plezierig (positieve valentie) of aversief (negatieve valentie) is. Valentietoewijzing aan een stimulus kan een aangepast gedrag uitlokken, inclusief benadering of vermijding⁵. Interessant is dat dit proces sterk geconserveerd is tussen soorten, van insecten tot mensen⁶. Depressie wordt dus geassocieerd met een negatieve bias van valentie. Klinische diagnose is echter nog weinig afhankelijk van beoordelingen van sensorische vooroordelen.

Onder sensorische modaliteiten is reukzin bijzonder interessant, omdat olfactorische inputs thalamische relais grotendeels omzeilen en projecteren op het limbisch systeem bij zoogdieren, inclusief mensen. Vanuit evolutionair oogpunt is aangetoond dat dit systeem van cruciaal belang is bij het coderen van een reeks primaire reacties op omgevingsstimuli 7,8,9,10,11,12. Bovenop deze gedeelde neurale circuits onthullen klinische studies een bilaterale relatie tussen reukzin en depressie, waarbij depressieve patiënten olfactorische veranderingen ervaren en olfactorische stoornissen depressieve symptomen veroorzaken¹³. Bovendien wordt de reukfunctie hersteld bij depressieve patiënten na medicatie of therapie 14,15,16,17. Deze resultaten suggereren dat olfactorische tekorten een biomarker van de toestand (status van klinische manifestaties bij patiënten) kunnen zijn in plaats van een eigenschap (eigenschappen die een antecedent, mogelijk causale, rol spelen in de pathofysiologie van de psychiatrische stoornis en dus kunnen worden gebruikt voor vroege, presymptomatische diagnose) voor de ziekte¹⁸. Dienovereenkomstig zou een beter en verder begrip van hoe de olfactorische modaliteit bij depressie wordt veranderd, de weg kunnen effenen voor nieuwe therapeutische hulpmiddelen voor diagnose en detectie van responsiviteit van de behandeling.

Daarom zou het beoordelen van olfactorische hedonische bias in modellen van depressie van bijzonder belang zijn, zowel om het geïnduceerde depressieve fenotype te evalueren als als een hulpmiddel om neurale mechanismen achter deze veranderingen in valentietoewijzing te onderzoeken. Eerdere studies hebben al gedragsbenaderingen gebruikt om de toewijzing van geurvalentie bij muizen te evalueren. Deze tests vertonen echter verschillende kanttekeningen: ze vereisen geavanceerde apparaten¹⁹ die meestal betrekking hebben op dozen die worden afgesloten door een deksel 19,20,21, impliceren constant fysiek contact met geuroplossing 20,21,22 en/of resulteren in zeer korte geurexploratietijden 21,22,23 . Dit maakt deze tests onverenigbaar met klassieke instrumenten voor het live monitoren van neuronale activiteit die een langere bemonsteringsduur vereisen bij vastgebonden muizen.

Bovendien ontwikkelden Malkesman et al. al de Female Urine Sniffing Test (FUST) om beloningszoekende activiteit bij knaagdieren te monitoren door olfactorisch onderzoek te meten van mannelijke muizen die werden blootgesteld aan vrouwelijke muizenurine²⁴. Deze test evalueert echter alleen de gedragsrespons op één bepaalde positieve stimulus van sociale aard, en met korte interactietijden. Bovendien is deze test uitsluitend bedoeld voor mannelijke knaagdieren, hoewel depressie twee keer zo vaak voorkomt bij vrouwen als bij mannen.

Om al deze beperkingen te overwinnen, hebben we hier een Olfactory Preference Test (OPT) ontwikkeld, aangepast van Bigot et ^al.14, waarbij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen worden blootgesteld aan een grote verscheidenheid aan neutrale, positieve en negatieve geuren om de hedonische respons in de context van depressie nauwkeurig te beoordelen. De keuze van geuren kan gebaseerd zijn op eerdere publicaties ^14,25, maar deze test maakt het ook mogelijk om nieuwe sociale, voedings- en infectiegerelateerde stimuli te verkennen, waarbij zowel natuurlijke componenten als monomoleculaire of specifiek ontworpen chemische mengsels worden gebruikt.

Protocol

Alle dierverzorgings- en experimentele procedures volgden de nationale en Europese (2010/63/EU) richtlijnen en werden goedgekeurd door het Franse Ministerie van Onderzoek (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). C57BL/6JRj mannelijke en vrouwelijke muizen (UCMS-model) en C57BL/6NTac (CORT-model) mannelijke muizen (8 weken oud) werden sociaal gehuisvest (4-5 muizen per kooi) en gehouden onder standaardomstandigheden (23 ± 1 °C; luchtvochtigheid 40%) op een licht/donkercyclus van 14/10 uur (lichten aan om 7 uur 's ochtends) met voedsel en water ad libitum.

1. De experimentele opstelling

1. Installatie van de arena
   1. Bereid de experimentele opstelling voor, die bestaat uit een arena met twee compartimenten (45 cm × 50 cm × 25 cm) gemaakt van grijze plexiglas wanden en een witte vloer. Verdeel de twee compartimenten (25 cm × 45 cm) door een grijze plexiglazen wand (37 cm × 25 cm).
   2. Plaats vanuit elk compartiment een geperforeerd petrischaaltje (60 mm × 15 mm met 7 gaten van 5 mm diameter) op de bodem van de muur.
   3. Bevestig de petrischalen verticaal op de muur met dubbelzijdige lijm of drukgevoelige lijm (bijv. Blu-tack).
   4. Plaats een camera bovenop de arena om het gedrag van de dieren vast te leggen (2 m boven de arena) en volg automatisch hun bewegingen tijdens het experiment.
2. Keuze uit geuren
   1. Kies voorafgaand aan het experiment een lijst met geuren met neutrale, positieve en negatieve valentie die zullen worden getest (zie tabel 1 voor voorbeelden).
   2. Controleer of alle gekozen geuren een vergelijkbare dampspanning hebben. Evalueer bovendien de diffusie door de arena op sommige geuren met een foto-ionisatiedetector (PID)²⁶.
   3. Test elke geur op een aparte dag.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om eerst het gebruik van neutrale geuren te plannen, dan eetlust en te eindigen met de aversieve geuren om de exploratie-effecten van de ene op de andere dag te minimaliseren. Deze volgorde minimaliseert overdrachtseffecten van de ene testdag naar de andere. Als alternatief kan een willekeurige presentatie worden gebruikt, maar alle experimentele groepen moeten worden getest met dezelfde geursequentie.
3. Opzet van experimentele groepen
   1. Verdeel muizen in ten minste twee experimentele groepen: controlemuizen en muizen die het model van depressie zullen ondergaan. Huisvesting van de dieren uit dezelfde groep in dezelfde kooien.
      LET OP: Elke experimentele groep moet ten minste ongeveer 7-8 personen bevatten om statistische significantie te verkrijgen. Kooien moeten in de buurt van het dierenverblijf worden geplaatst om het kooieffect te minimaliseren.
   2. Induceer een depressief-achtig fenotype in relevante muisgroepen met behulp van het model van depressie naar keuze.
      OPMERKING: Het beschrijven van protocollen om depressie-achtig gedrag bij muizen op te wekken, valt buiten het bestek van dit artikel. Deze studie presenteert echter experimenten met twee verschillende modellen (de Unpredictable Chronic Mild Stress [UCMS] en Corticosterone [CORT])^27,28 als representatieve resultaten voor deze olfactorische voorkeurstest. In het kort vertrouwt het UCMS-model op de blootstelling aan een verscheidenheid aan verschillende omgevingsstressoren gedurende meerdere weken, terwijl het CORT-model bestaat uit het chronisch toedienen van corticosteron opgelost in het drinkwater van muizen (ongeveer 5 mg/kg/dag, afhankelijk van hoeveel muizen drinken).

2. Gewenningsfase

1. Algemene gewenning en behandeling
   1. Laat de muizen bij aankomst 1 week ongestoord zonder strooisel te verschonen. Voeg extra katoenen materiaal toe en een iglo in de kooi om stress te verminderen.
   2. Behandel na 1 week alle muizen dagelijks voorzichtig gedurende 3-4 dagen en laat ze wennen aan het hanteren van bekers, bij voorkeur in de experimentele ruimte.
2. Experimentele omstandigheden van de test
   1. Breng de muis 30 minuten voor aanvang van het experiment naar de gedragstestruimte.
      OPMERKING: Idealiter zou de gedragsruimte twee afzonderlijke delen moeten bevatten, zodat dieren in het ene deel kunnen zijn terwijl de geteste muis in het andere deel presteert.
   2. Houd er rekening mee dat de standaard huisvestingsomstandigheden worden gehandhaafd (23 ± 1 °C; luchtvochtigheid 40%) en dat er geen storend geluid, verlichting of geur in de kamer is.
   3. Stel met behulp van een luxmeter de verlichting in op ongeveer 40 lux in de arena. Zorg ervoor dat de verlichting in de arena homogeen is.
3. Gewenning aan de arena
   1. Plak een schoon filtreerpapier (42,5 mm) in beide petrischaaltjes (60 mm × 15 mm).
   2. Gebruik doorzichtige tape om het deksel van de petrischaal op de bodem te bevestigen (omdat deze verticaal wordt geplaatst).
   3. Plaats op de eerste dag alle muizen uit dezelfde kooi voorzichtig samen in de arena gedurende 10 minuten om neofobie te verminderen.
      LET OP: Plaats muizen altijd in de arena door de beker te hanteren om stress door het oppakken bij de staart te voorkomen.
   4. De volgende dag brengt u elke muis afzonderlijk in de arena, net tussen de twee compartimenten, en registreert u het gedrag gedurende 10 minuten.
   5. Herhaal dit 2-3 dagen achter elkaar.
4. Exploratie criterium
   1. Definieer de twee gebieden (25 cm, 15 cm) waarin de petrischaaltjes zijn geplaatst en meet de tijd die elk dier in elke zone doorbrengt.
   2. Neem het gemiddelde van deze metingen door alle individuele wenningsstappen.
   3. Als de gemiddelde tijd die in elk van de zones wordt doorgebracht hoger is dan 50 s, is aan het criterium voldaan. Als dit niet het geval is, herhaal dan de gewenningssessies totdat het criterium is bereikt, of sluit het dier uit van de analyse.
      LET OP: Er kunnen maximaal twee gewenningssessies per dag worden uitgevoerd (ochtend en middag).

3. Testfase

1. Bereiding van de geur
   1. Bereid op de dag van de test de geur met de juiste verdunning onder een chemische kap. Verdun de geur in minerale olie of gedestilleerd water, afhankelijk van de chemische structuur. Om besmetting te voorkomen, bewaart u minerale olie in een aparte geventileerde ruimte, uit de buurt van geurstoffen.
      OPMERKING: Het gebruik van een nieuwe fles minerale olie wordt aanbevolen bij het starten van een nieuw experiment.
   2. Bewaar de geuroplossing in een glazen injectieflacon. Vermijd plastic buiscontainers die geurverontreiniging kunnen toevoegen.
   3. Verzamel vlak voordat elke muis wordt getest 200 μL van de geuroplossing met een micropipet met behulp van filtertips en plaats deze op het filterpapier in een van de twee petrischaaltjes.
   4. Laat het andere filtreerpapier in het tweede petrischaaltje onaangeroerd.
   5. Breng de petrischaaltjes over in de testruimte en bevestig ze verticaal op de wand van de arena.
      LET OP: Bereid de geuroplossingen niet voor en gooi ze niet weg in de experimentele ruimte om geurbesmetting te voorkomen. Wissel tijdens het experiment regelmatig van handschoenen. Als het vermoeden bestaat dat de handschoenen besmet zijn geraakt tijdens geurmanipulatie, verwissel ze dan voordat u de muizen vastpakt om te testen.
2. Gedragstest
   1. Plaats elke muis afzonderlijk in de arena, net tussen de twee compartimenten.
   2. Opnemen voor 10 min.
   3. Haal de muis uit de arena.
   4. Verwijder de geur petrischaaltje.
   5. Reinig de arena met een desinfecterende oplossing (bijv. ethanol 70%) en droog deze af.
   6. Gooi het filterpapier weg en herhaal de geurbereiding voor de volgende muis.
   7. In het ideale geval test u slechts één geur per dag. Gebruik bij voorkeur eerst neutrale geuren, dan positieve geuren en ten slotte negatieve geuren (zie afbeelding 1).
      LET OP: Voer zowel de gewennings- als de teststappen ongeveer op hetzelfde tijdstip van de dag uit gedurende de dagen van het experiment (idealiter tussen 9 uur en 3 uur). Als het aantal dieren een langere periode vereist, zorg er dan voor dat de verschillende experimentele groepen afwisselend worden getest om vertekening overdag te voorkomen. Als mannen en vrouwen in hetzelfde experiment moeten worden getest, geef er dan de voorkeur aan om het ene geslacht na het andere te testen.
      OPMERKING: Gebruik elke dag van de test schone petrischaaltjes om geurbesmetting te voorkomen. Merk op dat geperforeerde petrischalen kunnen worden hergebruikt voor verschillende experimenten na een goede reiniging en geurontsmetting.

4. Gegevensanalyse

1. Gedrag volgen
   1. Gebruik een automatisch volgprogramma om de positie van de muis tijdens de tests vast te leggen.
   2. Definieer afzonderlijke zones in de arena voor analyse (zie figuur 1):
      1. Definieer een "geurzone" (25 cm × 15 cm), het gebied waar de petrischaal wordt geplaatst met het filterpapier doordrenkt met de geur (d.w.z. het gebied dat zich het dichtst bij de geur bevindt, wat ongeveer een derde van het oppervlaktecompartiment vertegenwoordigt).
      2. Definieer een "controlezone" (25 cm × 15 cm), symmetrisch met de "geurzone", maar zonder toevoeging van geur in de petrischaal.
      3. Definieer een "achter de geurzone" (25 cm × 30 cm), d.w.z. de rest van het compartiment is waar de geurpetrischaaltje wordt geplaatst.
      4. Definieer een "achter controlezone" (25 cm × 30 cm), symmetrisch ten opzichte van de "achterste controlezone", bestaande uit de rest van het niet-geurcompartiment.
         OPMERKING: Het volgen van het middelpunt van het lichaam van de muis is voldoende om de olfactorische voorkeur van het dier te analyseren. Het specifiek volgen van de neus van elke muis kan echter het olfactorisch onderzoek door het dier nauwkeuriger illustreren.
2. Uitlezingen van de hedonistische reactie
   1. Verzamel met behulp van de automatische tracking de volgende informatie voor elke muis en elke dag van de test, inclusief gewenningsstappen:
      1. Noteer de totale afstand die in de arena is afgelegd (m).
      2. Noteer de tijd die in elke zone van de arena('s) is doorgebracht.
      3. Noteer het aantal inschrijvingen in elke zone van de arena.
   2. Gebruik de totale afgelegde afstand om de belangrijkste locomotorische effecten te beoordelen.
   3. Om verschillen in olfactorische voorkeur voor verschillende geuren te beoordelen, gebruikt u de belangrijkste uitlezingen:
      1. Gebruik de tijd die in de geurzone wordt doorgebracht.
      2. Gebruik het aantal ingangen in de geurzone.
      3. Gebruik een voorkeursindex, berekend als de tijd doorgebracht in de geurzone, genormaliseerd naar de tijd doorgebracht in deze zone tijdens de gewenning (normalisatie wordt uitgevoerd op muizen uit alle groepen). Het gemiddelde verwijst naar het rekenkundig gemiddelde van de tijd die in de geurzone wordt doorgebracht, en sd verwijst naar de standaarddeviatie.
         
      4. Gebruik een geurexploratie-index, berekend als het gemiddelde van de genormaliseerde waarden van de afgelegde afstand, de tijd doorgebracht in de geurzone en het aantal ingangen in de geurzone, als volgt:
         
         
         OPMERKING: Deze voorkeursindex kan indien nodig worden aangepast, bijvoorbeeld door de tijd die in de geurzone wordt doorgebracht te vergelijken met die van de controlezone. Als groepen tijdens gewenning significante verschillen vertonen in hun verkenning van de "geurzone", kan normalisatie alleen worden uitgevoerd met betrekking tot de controlegroep, in plaats van met alle groepen samen.
   4. Geef deze uitlezingen voor controle- en depressieve muizen visueel weer als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
   5. Gebruik tweerichtingsvariantieanalyse met herhaalde metingen (ANOVA) gevolgd door post-hoctests (hier ongecorrigeerde Fisher's Least Significant Difference-test) om rekening te houden met zowel experimentele groepen, geuren (herhaalde meetfactor) als interactie-effectfactoren. De interactiefactor geeft aan of de verschillen tussen de groepen consistent zijn over alle gepresenteerde geuren.
   6. Verifieer normaliteit en homoscedasticiteit met behulp van aangepaste tests (Shapiro-Wilk-test, Bartlett-test). Statistische significantie werd vastgesteld op *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultaten

Om te verifiëren dat depressieve muizen een negatieve olfactorische bias vertonen^14,29 en dat deze betrouwbaar kan worden gemeten met behulp van het protocol van de olfactorische voorkeurstest die we hier beschrijven, hebben we de hedonische respons op verschillende geuren beoordeeld in twee verschillende muismodellen van depressie.

Eerst gebruikten we een muismodel van onvoorspelbare chronische milde stress (UCMS) van 4 weken, aangepast van²⁸ (zie aanvullend bestand 1 voor een gedetailleerd protocol) om een depressief-achtig fenotype te induceren bij jonge vrouwelijke C57BL/6JRj-muizen (Figuur 2A,B). Deze vrouwelijke muizen werden getest in de olfactorische voorkeurstest met mannelijke muizenurine (MU, puur) als eetlust en 2,4,5-trimethylthiazol (TMT, 5% in minerale olie) als aversieve geur. Gemiddeld bracht elke muis tijdens de gewenning ten minste 50 s door in zowel de "controle"- als de "geur"-zone, waarmee hij aan het criterium voldeed (Figuur 2C). Door gewenning brachten UCMS-muizen echter aanzienlijk meer tijd door in de "controlezone" in vergelijking met controles, maar aangezien er geen significant verschil is met betrekking tot de zone waar de geur wordt toegevoegd, kan dit verschil worden afgewezen. Wat de afstand betreft, bewogen controlemuizen significant meer dan UCMS bij blootstelling aan MU, maar niet tijdens gewenning of in aanwezigheid van TMT (Figuur 2D). Ten slotte vertonen alle uitlezingen van de hedonische respons (tijd doorgebracht in de geurzone, aantal inzendingen in de geurzone en voorkeursindex) significante verschillen of een statistische tendens tussen controle- en UCMS-vrouwtjes (Figuur 2E-G). Dit effect is ook zichtbaar door de wereldwijde geurexploratie-index, die een gecombineerde maat is voor hedonische en locomotorische respons (Figuur 2H). Consequent vertoont elke uitlezing dus een negatieve hedonistische vooringenomenheid als reactie op zowel eetlust als aversieve olfactorische stimuli. Interessant is dat de emotionaliteitsscore, die wordt berekend als een genormaliseerde waarde van angst- en depressief-achtig fenotype op basis van een grote reeks gedragstests¹⁴, positief gecorreleerd is met de geurexploratie-index van zowel MU als TMT (Figuur 2I), wat een verband laat zien tussen de gedragsrespons op positieve en negatieve geurstoffen en het angst- en depressief-achtige fenotype.

Ten tweede gebruikten we hetzelfde UCMS-protocol om deze keer een depressief-achtig fenotype bij mannelijke muizen te induceren. Tijdens de olfactorische voorkeurstest werden deze muizen blootgesteld aan vrouwelijke muizenurine (FU, puur), die eetlust heeft, en TMT, zoals eerder, als een negatieve geur (Figuur 3A,B). Er is geen verschil in de tijd die tijdens de gewenning in de vier zones wordt doorgebracht, noch in de afstand die door de test wordt afgelegd (Figuur 3C,D). De tijd doorgebracht in de geurzone vertoont een significante vermindering van FU- en TMT-exploratie in UCMS in vergelijking met controles (Figuur 3E). Bovendien komen UCMS-muizen significant minder in de geurzone, of hebben ze de neiging om, en vertonen ze een significant verminderde voorkeursindex voor zowel FU als TMT (Figuur 3F,G), wat een negatieve olfactorische bias bevestigt in een depressieve toestand. Evenzo vertoont de geurexploratie-index een negatief verschoven gedragsrespons op FU en TMT van UCMS-muizen in vergelijking met controles (Figuur 3H), die meestal positief gecorreleerd zijn met de emotionaliteitsscore van de dieren (Figuur 3I).

In een derde experiment namen we onze toevlucht tot een ander model van depressie dat gebaseerd is op de chronische toediening van corticosteron (CORT) in het drinkwater van mannelijke C57BL/6NTac-muizen, terwijl controlemuizen alleen de vehiculum (Veh) -oplossing (10% 2-hydroxypropyl-bèta-cyclodextrine) krijgen ²⁷. Na vier weken CORT- of Veh-behandeling waren de muizen gedurende vier dagen gewend en vervolgens blootgesteld aan een neutrale geur (OCT: 2-trans octenal, 1% in water), een positieve geur (PO: arachideolie) en een negatieve geur (TMT: 2,4,5-trimethylthiazol, 5% in minerale olie) (Figuur 4A,B). Door gewenning waren er geen verschillen tussen Veh en CORT (Figuur 4C). Beide groepen brachten echter aanzienlijk meer tijd door in de "geurzone" in vergelijking met de "controlezone". Er zijn geen verschillen voor de verplaatste afstand, behalve voor de positieve geur (PO) waarvoor Veh-muizen meer bewogen dan CORT (Figuur 4D). Belangrijk is dat, net als bij UCMS-muizen, de tijd die in de geurzone werd doorgebracht aanzienlijk werd verminderd voor CORT-muizen bij blootstelling aan een neutrale en smakelijke geur (Figuur 4E). Verminderde geurexploratie is ook zichtbaar door een significante vermindering of een neiging tot een lager aantal binnenkomsten in de geurzone (Figuur 4F). In dit geval worden verschillen tussen groepen onthuld, afhankelijk van de geanalyseerde uitlezing, waarschijnlijk als gevolg van de beperkingen met betrekking tot het aantal gebruikte dieren en een mogelijk vloereffect veroorzaakt door de lage exploratietijd die werd waargenomen na TMT-expositie. Over het algemeen is de voorkeursindex significant lager in CORT-muizen voor alle geurstimuli in vergelijking met Veh (Figuur 4H). Ten slotte is de geurexploratie-index voor alle geuren significant gecorreleerd met de emotionaliteitsscore van de dieren (Figuur 4I), wat nog maar eens aantoont dat deze olfactorische voorkeurstest een geschikt hulpmiddel is om negatieve emotionele vooringenomenheid in verschillende muismodellen van depressie te beoordelen.

Ten slotte kunnen we de mogelijkheid uitsluiten dat de waargenomen verschillen kunnen worden veroorzaakt door een vermindering van de locomotorische activiteit, in plaats van emotionele vooroordelen. De voortbeweging verschilt inderdaad niet tussen groepen tijdens gewenning bij het evalueren van de totale afgelegde afstand (Figuur 2D, Figuur 3D, Figuur 4D). Bovendien kan op basis van de statistische analyse een algemene vermindering van de taakbetrokkenheid of een nieuwigheidseffect deze vertekeningen ook niet verklaren. In feite vonden we een significant effect van de geurfactor in de analyse van de voorkeursindex, zonder significante interactie tussen experimentele groepen en geuren. Deze resultaten tonen aan dat depressieve muizen inderdaad de taak uitvoeren en dat hun verminderde exploratie specifiek is voor elke olfactorische cue.

Figuur 1: Algemeen schema van de tijdlijn en opzet van de olfactorische voorkeurstest. Muizen wennen eerst aan de arena. Op de eerste dag van gewenning worden muizen uit dezelfde woonkooi bij elkaar geplaatst om neofobie te verminderen. De volgende dag worden ze individueel in de arena geplaatst. Na gewenning wordt een geur toegevoegd aan een van de kamers. Neutrale geuren worden bij voorkeur eerst getest, gevolgd door positieve geuren en tot slot negatieve geuren. Voor analyse kan de arena worden opgedeeld in vier verschillende zones. Gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Negatieve olfactorische bias in een UCMS vrouwelijk muismodel van depressie. (een, b) Tijdlijn en experimentele groepen van de studie: Controle en UCMS (Unpredictable Chronic Mild Stress) vrouwelijke muizen worden getest in de Olfactory Preference Test met een positieve (MU: mannelijke muizenurine, puur) en negatieve geur (TMT: 2,4,5-trimethylthiazol, 5% in minerale olie). Gemaakt met Biorender. (C) UCMS-muizen brachten gemiddeld significant meer tijd door in de "controlezone" en minder tijd in de "achtergeurzone" in vergelijking met controles tijdens gewenning (Groep: F(1, 12) = 74,03, p < 0,0001; Zone: F(2.434, 29.21) = 7.688, p = 0.0012; Interactie: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) De totale afgelegde afstand is significant verminderd in UCMS bij blootstelling aan MU, maar niet voor gewenning (Hab) en TMT (Groep: F(1, 12) = 4,664, p = 0,0518; Geur: F(1.871, 22.45) = 4.846, p = 0.0195; Interactie: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) UCMS-muizen besteedden significant minder tijd aan het onderzoeken van MU en TMT (Groep: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Geur: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interactie: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) UCMS-muizen kwamen minder binnen dan de geurzone of hadden de neiging om (Groep: F(1, 12) = 9,279, p = 0,0102; Geur: F(1, 12) = 5.100, p = 0.0433; Interactie: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) De voorkeursindex voor MU en TMT is significant verlaagd in UCMS-muizen (Groep: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Geur: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interactie: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) De geurexploratie-index voor MU en TMT is significant verminderd bij UCMS-muizen (F(1, 12) = 14,71, p = 0,0024; Geur: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Interactie: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) De geurexploratie-index voor MU en TMT is beide positief gecorreleerd met de emotionaliteitsscore van de dieren (MU: Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Negatieve olfactorische bias in een UCMS mannelijk muismodel van depressie. (een, b) Tijdlijn en experimentele groepen van de studie: Controle- en UCMS-muizen worden getest in de Olfactory Preference Test met een positieve (FU: vrouwelijke muizenurine, puur) en negatieve geur (TMT: 2,4,5-trimethylthiazol, 5% in minerale olie). Gemaakt met Biorender. (C) Er zijn gemiddeld geen verschillen in de tijd die in de verschillende zones van de wordt doorgebracht door gewenning (Groep: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Zoner = F(1.688, 21.94) = 34.57, p < 0.0001; Interactie: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Er zijn geen verschillen in de totale afstand die wordt afgelegd tussen Controls en UCMS (Groep: F(1, 13) = 2,313, p = 0,1522; Geur: F(1.722, 22.38) = 1.746, p = 0.1998; Interactie: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) De tijd die wordt besteed aan het verkennen van de geurzone met FU en TMT is significant verminderd bij UCMS-muizen (Groep: F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Geur: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interactie: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) UCMS-muizen kwamen significant minder vaak in de geurzone voor TMT, en neigden naar FU (Groep: F(1, 13) = 6,572, p = 0,0236; Geur: F(1, 13) = 3.784, p = 0.0737; Interactie: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) De voorkeursindex van UCMS-muizen is significant verlaagd voor FU en TMT (Groep: F(1,13 ) = 6,808, p = 0,0216; Geur: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interactie: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) De geurexploratie-index van UCMS is significant verlaagd voor beide geuren (Groep: F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037; Geur: F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603; Interactie: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) De geurexploratie-index voor FU en TMT is meestal positief gecorreleerd met de emotionaliteitsscore van de dieren (FU: Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Negatieve olfactorische bias in een CORT mannetje muismodel van depressie. (A,B) Tijdlijn en experimentele groepen van de studie: Veh en CORT mannelijke muizen worden getest in de Olfactorische Voorkeurstest met een neutrale (OCT: trans-2-octenaal, 1% in water), positieve (PO: arachideolie, puur) en negatieve geur (TMT: 2,4,5-trimethylthiazool, 5% in minerale olie). Veh- en CORT-muizen worden gedurende de gehele duur van het experiment toegediend met respectievelijk de Vehicle en Vehicle + Corticosterone-oplossing. Gemaakt met Biorender. (C) Gemiddelde tijd doorgebracht in de verschillende zones van de arena tijdens de gewenning (Groep: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Zone: F(2.224, 22.24) = 6.939, p = 0.0036; Interactie: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Totale afstand die tijdens de test voor gewenning (Hab) en de verschillende geuren is afgelegd (Groep: F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678; Geur: F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001; Interactie: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) CORT-muizen brengen minder tijd door in de geurzone dan Veh voor OCT en PO (Groep: F(1, 10) = 5,094, p = 0,0476; Geur: F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001; Interactie: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) CORT-muizen komen minder vaak in de geurzone of worden verzorgd in vergelijking met Veh (Groep: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Geur: F(2, 20) = 2.738, p = 0.0889; Interactie: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) CORT qmice vertonen een lagere voorkeursindex voor OCT en PO (Groep: F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356; Geur: F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001; Interactie: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) De geurexploratie-index is significant verlaagd in UCMS-muizen voor alle geuren (Groep: F(1, 10) = 12,35, p = 0,0056; Geur: F(2, 20) = 0.04381, p = 0.9572; Interactie: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) De geurexploratie-index voor elke geur is positief gecorreleerd met de emotionaliteitsscore van de dieren (OCT: Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam	Afkorting	Verdunning	Valentie
2,4,5-trimethylthiazol	TMT	5% in minerale olie	Negatief
2-trans-octenaal	OCT	1% in water	Neutraal
Vrouwelijke muizenurine	FU	Zuiver	Positief
Mannelijke muizenurine	MU	Zuiver	Positief
Arachideolie	PO	Zuiver	Positief

Tabel 1: Voorbeelden van geuren met neutrale, positieve en negatieve valentie.

Aanvullend Dossier 1: Protocol voor 4 weken onvoorspelbare chronische milde stress. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Negatieve emotionele vooringenomenheid is een belangrijk kenmerk van depressieve stoornissen en is van bijzonder belang om de fysiopathologie van de ziekte beter te begrijpen. Het is dus van cruciaal belang om zowel de evaluatie van sensorische vooroordelen in preklinische modellen op te nemen om de karakterisering van het depressieve-achtige fenotype te verbeteren als om te onderzoeken welke biologische mechanismen ten grondslag liggen aan emotionele verwerking en de veranderingen ervan in pathologische aandoeningen. Bovendien is reukzin een gevoel van keuze om emotionele vooroordelen te bestuderen. Vanuit een translationeel perspectief is het ethologisch relevant om emotionele verwerking zowel bij muizen als bij mensen te beoordelen. Bovendien zijn olfactorische en emotionele systemen sterk met elkaar verweven en delen ze gemeenschappelijke neuronale structuren gedurende de evolutie. Er is een sterke, wederkerige relatie tussen verminderde reukzin en depressie¹⁰, waardoor reukzin een veelbelovend en krachtig hulpmiddel is dat kan worden gebruikt voor diagnose en responsiviteit van de behandeling, maar ook in fundamenteel onderzoek.

Hier hebben we een protocol ontwikkeld voor een olfactorische voorkeurstest om olfactorische emotionele vooroordelen te beoordelen in twee muismodellen van depressie. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om de respons op een grote verscheidenheid aan stimuli met variabele valentie, zowel positieve als negatieve, te evalueren, evenals neutrale stimuli die onder pathologische omstandigheden in waarde kunnen veranderen. Deze latere stimuli zijn niet verplicht voor de validiteit van de test, maar ze kunnen interessante aanvullende informatie aan het experiment toevoegen. Deze test maakt het ook mogelijk om de schaalbaarheid van de respons te evalueren door verschillende geurconcentraties te gebruiken. Het beoordelen van de respons op stimuli met verschillende hedonistische waarden en het scheiden van positieve van negatieve emotionele verwerking in de context van depressie is cruciaal. Preklinische resultaten geven inderdaad aan dat behandeling met antidepressiva mogelijk niet uniform even positieve als negatieve olfactorische verwerking herstelt¹⁴. Spontane exploratie van aangeboren opvallende appetitieve of aversieve olfactorische stimuli voorkomt ook verstorende factoren van cognitieve of motivationele tekorten geassocieerd met depressieve toestanden^30,31. Daarom vereist dit protocol geen lange leerfasen, wat technische voordelen heeft. Het is belangrijk op te merken dat beide modellen die in deze studie worden gebruikt, gebaseerd zijn op interventies die op volwassen leeftijd worden uitgevoerd, dus toekomstige experimenten zullen nodig zijn om te evalueren of dit protocol ook gevoelig is voor het evalueren van andere risicofactoren voor depressie, waaronder tegenspoed in het vroege leven.

Belangrijk is dat dit protocol van toepassing is op zowel mannelijke als vrouwelijke individuen, wat van cruciaal belang is omdat vrouwen twee keer zoveel kans hebben om door depressie te worden getroffen als mannen. Mannen worden echter waarschijnlijk te weinig gediagnosticeerd door depressie vanwege sociale verwachtingen, schaamte of stigma, zoals besproken in Shi et ^al.32. Desalniettemin lijkt depressie te verschillen tussen mannen en vrouwen, in termen van symptomatologie (klinische manifestaties), etiologie (biologische oorzaken) en behandelingsvoorspelbaarheid 33,34,35, maar veel modellen en tests van depressie zijn nog steeds in de eerste plaats ontworpen voor alleen mannelijke proefpersonen. De standaard urinesnuffeltest^{voor vrouwen 24} gebruikt bijvoorbeeld een soortgelijk protocol, maar vertrouwt op een unieke sociale geurcue. Hoewel deze test zeer informatief is, resulteert deze test in een korte exploratietijd (30 s bij controles) en is hij voornamelijk aangepast aan mannelijke muizen, aangezien vrouwelijke urine niet dezelfde ethologische en hedonische betekenis heeft voor beide geslachten. Ten slotte lijkt het erop dat de olfactorische hedonische respons gevoelig is voor behandeling met antidepressiva¹⁴, waardoor onze test een hulpmiddel bij uitstek is om depressieve toestanden betrouwbaar te karakteriseren, ter vervanging van andere controversiële testen zoals de krachtzwemtest 36,37,38.

Belangrijk is dat de test resulteert in langere verkenningstijden van stimulus (100-200 s) in vergelijking met eerder beschreven tests 21,22,23. Een langere exploratieduur is vooral belangrijk wanneer deze test wordt gecombineerd met live monitoringtechnieken van bijvoorbeeld neuronale activiteit. Bovendien vereist deze test geen voedsel-/watertekort, waardoor metabole verstorende factoren worden vermeden. Ten slotte kan deze test worden uitgevoerd tijdens de lichtperiode, waardoor de experimentele beperkingen worden verminderd (inverse cyclus, infraroodopnames).

Om dit protocol met succes uit te voeren, zijn enkele technische stappen echter van cruciaal belang. Ten eerste is het essentieel dat experimenten worden uitgevoerd in een zeer gecontroleerde en niet-stressvolle omgeving: de verlichting moet homogeen zijn en niet te fel, en er mag geen storend geluid of geur in de kamer zijn. Muizen kunnen één keer per dag in de arena worden getest en de test moet elke dag ongeveer op hetzelfde tijdstip worden uitgevoerd. Daarnaast wordt bij het uitvoeren van deze experimenten een unieke onderzoeker aanbevolen om stress bij dieren te verminderen.

Ten tweede moet er worden gezorgd voor voldoende verkenning van de arena door middel van gewenningsdagen. Als een muis gemiddeld minder dan 50 s doorbrengt in een van de zones waar petrischaaltjes tijdens de gewenning worden geplaatst, kunnen een of twee extra wenningsdagen worden toegevoegd voordat de geuren worden getest. Als de muis de arena nog steeds niet lang genoeg verkent, moet hij worden uitgesloten van de analyse. In het geval van initiële dissymmetrische exploratie van de "geurzone" tijdens gewenning tussen experimentele groepen, kan de berekening van de voorkeursindex worden aangepast om te corrigeren voor differentiële spontane voorkeursbias, bijvoorbeeld door te normaliseren op basis van de tijd die tijdens de gewenning is doorgebracht ten opzichte van elke groep, of zelfs met betrekking tot hun eigen exploratie tijdens de gewenning. Een andere moeilijkheid kan inderdaad de grote variabiliteit tussen experimentele groepen zijn. Als het probleem zich voordoet, kunnen muizen op twee opeenvolgende dagen met dezelfde geur worden getest om de intra-individuele variabiliteit te beperken. De resultaten kunnen dan worden gemiddeld over de twee dagen. Belangrijk is dat het achtereenvolgens testen van de olfactorische respons geen significante invloed heeft op exploratief gedrag¹⁴.

Wat de geurbereiding betreft, moeten oplossingen in een andere ruimte worden bereid dan de testruimte, en onderzoekers moeten zich ervan bewust zijn dat de oplossing niet overmatig diffundeert in de gedragsruimte. Ten slotte moeten oplossingen bij voorkeur kort voor de test worden bereid en bewaard in een geurvrije glazen injectieflacon, zodat de geur niet vervaagt of besmet raakt. Voor sommige geuren, zoals urine van mannelijke en vrouwelijke muizen die zogenaamd zeer smakelijk zijn, moet de oplossing worden gecontroleerd als controlemuizen geen exploratie-uitlezingen vertonen die verband houden met zeer positieve valentie. In het bijzonder moet muizenurine kort voor het testen (maximaal 2-3 dagen ervoor) vers worden verzameld bij jonge muizen (maximaal 5 maanden oud) en worden bewaard bij 4 °C om de olfactorische eigenschappen te behouden. Merk op dat verzameling van meerdere opeenvolgende dagen effecten als gevolg van oestrische cyclusstadia bij vrouwelijke muizen zou moeten voorkomen. Indien nodig kan urine bij -20 °C worden bewaard voor langere opslag, hoewel deze procedure niet wordt aanbevolen omdat het de geurintensiteit aanzienlijk vermindert. Evenzo kan de waargenomen aangenaamheid van arachideolie ook variabel zijn, bijvoorbeeld afhankelijk van de batch of het merk. Belangrijk is dat twee verschillende geuren of geuren met verschillende concentraties in de compartimenten kunnen worden toegevoegd, in plaats van de niet-geurende "controlezone", om de voorkeur tussen twee geuroplossingen te meten.

Ten slotte kan de olfactorische voorkeurstest op verschillende manieren worden aangepast om het ontwerp te verbeteren en de potentiële toepassingen te verbreden. Afgezien van de motorische uitlezing, zou de beoordeling van de emotionele respons door middel van deze test kunnen worden verbeterd door verschillende technieken te combineren om verschillende componenten van emoties te meten⁶. Er kan bijvoorbeeld een ultrasone microfoon naast de arena worden geplaatst om ultrasone vocalisaties op te nemen, die kunnen worden uitgezonden als reactie op bepaalde positieve en negatieve stimuli^24,39. De lichaamstemperatuur kan ook worden gecontroleerd met behulp van een infraroodcamera of een implanteerbare real-time telemetriezender 40,41,42. Sommige van deze zenders zijn zelfs in staat om toegang te krijgen tot hart- en ademhalingsfrequenties 43,44,45. Het combineren van deze instrumenten zou helpen bij het opbouwen van een meer verfijnde gedragsbeoordeling van de emotionele respons. De olfactorische voorkeurstest kan ook gemakkelijk worden gekoppeld aan andere technieken om neuronale mechanismen achter emotionele ontregeling verder op te helderen, zoals optogenetica, vezelfotometrie of mini-scope live-imaging of in vivo elektrofysiologische opnames. Ten slotte kan dit protocol gemakkelijk worden vertaald naar de kliniek door de beoordeling van sensorische vooroordelen en hedonische olfactorische respons te integreren in menselijk onderzoek en zelfs als een diagnostisch of behandelingsresponsief instrument.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,4,5-Trimethylthiazole	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans octenal	Sigma-Aldrich	52464-1ML
Blu-tack	UHU	N/A
Filter paper	Fisher Scientific	11710125	42,5 mm
Glass vial	DUTSCHER DOMINIQUE	958983
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Versie 17.5	Alternatief, Single Mouse Tracker in de open-source ICY software of Deeplabcut kan worden gebruikt
Petrischaal	Falcon	351007	60 mm x 15 mm petrischaal met 7 op maat gemaakte gaten van 5 mm diameter
Plexiglas arena	Op maat gemaakt	N/A	45 cm x 50 cm x 25 cm plexiglas arena verdeeld in twee kamers door een 37 cm x 25 cm muur in het midden.