Het genereren van vrij zwevende normale menselijke epitheliale-fibroblast sferoïde co-culturen

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudig en zeer praktisch maar betrouwbaar protocol voor directe sferoïdale co-cultivatie van menselijke longepitheelcellen en fibroblasten zonder te vertrouwen op een matrix.

Samenvatting

Driedimensionale (3D) kweeksystemen zijn steeds populairder geworden vanwege hun vermogen om natuurlijke celeigenschappen en architecturen te reproduceren, waardoor weefselachtige structuren in vitro worden nagebootst. Van deze modellen vertegenwoordigt de cultuur van sferische celaggregaten (zogenaamde sferoïden) ingebed in een halfvaste extracellulaire matrix (ECM) een geavanceerd bijna-in vivo celcultuurmodel, omdat het verschillende functionele celtoestanden mogelijk maakt als gevolg van cel-cel en cel-ECM-interacties, evenals zuurstof- en nutriëntengradiënten. Omdat sferoïden technisch minder veeleisend en relatief goedkoop te verkrijgen zijn, worden ze vaak gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen en toxiciteitstests, waardoor screening met een hoog gehalte mogelijk is voor het testen van nieuwe geneesmiddelen in de preklinische fase. Voor dit doel worden voornamelijk 3D-structuren van verschillende tumoren nagemaakt. Tegelijkertijd is Matrigel momenteel een van de meest gebruikte ECM's en wordt het beschouwd als de gouden standaard in de sferoïde- en organoïdeteelt, hoewel dit een 3D-matrix is op basis van muizenexperimenten, waarvan de extractie - net als dierproeven in het algemeen - gepaard gaat met grote ethische bezwaren. Hier presenteren we een matrixvrij protocol voor directe sferoïdale co-cultivatie van menselijke bronchiale epitheelcellen en fibroblasten, dat kan worden beschouwd als een geoptimaliseerde co-cultivatiemethode, vooral met betrekking tot epitheel-fibroblastcommunicatie en interacties binnen de respectievelijke sferoïden, zonder te vertrouwen op een (dierlijke) dragermatrix. Door deze vrij zwevende epitheel-fibroblastoïde sferoïde co-culturen op te zetten als een patiëntgericht in vitro platform om normale (long)weefseltoxiciteit van kankertherapeutische benaderingen te modelleren, kan niet alleen een vermindering van het aantal proefdieren worden bereikt, maar ook een adequate en zinvolle vervanging van overeenkomstige dierproeven.

Inleiding

Tweedimensionale (2D) celculturen, waarin platte monolaagcellen worden gekweekt, geëxpandeerd en vervolgens geplateerd voor celgebaseerde onderzoekstests, blijven een gemakkelijke, handige, kosteneffectieve en veelgebruikte methode voor standaard preklinische screeningprocedures ^1,2. Om de interactieve (paracriene) overspraak tussen verschillende soorten cellen in vitro te bestuderen, kan een geconditioneerd medium van het ene celtype worden gebruikt voor stimulatie van een ander celtype. Daarnaast ontstonden er verschillende co-cultuurmethoden, bijvoorbeeld indirecte methoden, waarbij co-gekweekte cellen fysiek worden gescheiden met behulp van een microporeus membraan. Deze 'Transwell-systemen' omvatten een insert (het microporeuze membraan) die in een traditionele 2D-celkweekplaat wordt geplaatst. Het ene celtype wordt vervolgens gezaaid en op het membraan gekweekt, waarbij dezelfde media worden gedeeld als het andere type dat op de begeleidende put groeit, waardoor bidirectionele paracriene communicatie mogelijk is². De twee celtypen kunnen zelfs aan de twee zijden van het membraan worden gezaaid, waardoor meer een directe cel-tot-cel contactco-cultuur ontstaat, die geschikt is voor het onderzoeken van barrière-gestructureerde weefsels ^3,4.

De cellulaire responsen van deze zelfs geavanceerde 2D-celkweeksystemen weerspiegelen echter niet altijd de resultaten van de overeenkomstige dierproeven en zelfs klinische studies, wat onder meer te wijten is aan het gebrek aan directe signalering tussen de verschillende celtypen en dus het ontbreken van in vivo-achtige cellulaire organisaties. Daarom zijn driedimensionale (3D) kweeksystemen steeds populairder geworden vanwege de mogelijkheden van natuurlijk-achtige celkenmerken en architecturen die weefselachtige structuren in vitro nabootsen ^5,6. Van deze modellen biedt de cultuur van sferische celaggregaten, sferoïden genaamd, ingebed in halfvaste extracellulaire matrices een geavanceerder celcocultuurmodel waar verschillende functionele cellulaire toestanden na cel-cel- en cel-ECM-interacties, evenals gradiënten van zuurstof en voeding kunnen worden bereikt⁷. Deze gewenste complexere in vivo-achtige in vitro culturen 3D-culturen moeten worden gegenereerd en homogeen worden gehouden wat betreft de grootte van de celassemblage, terwijl de celontwikkeling en differentiatie worden bevorderd, terwijl ze nog steeds effectief, snel, consistent en handig zijn ^7,8.

Met behulp van de natuurlijke kenmerken van zelfaggregatie en adhesie worden sferoïden (voornamelijk tumorsferoïden) meestal gegenereerd met behulp van de hangdruppeltechniek ^9,10. Als een van de eerste technieken die werden gebruikt om embryonale lichamen te genereren, is de hangende druppeltest een veelgebruikte methode geworden om talrijke homogene sferoïden te genereren op basis van de principes van zwaartekracht en oppervlaktespanning voorafgaand aan ECM-inbedding met behulp van Matrigel, de 'gouden standaard' van extracellulaire matrices, hoewel ze op muizen zijn gebaseerd. Er werden aanzienlijke inspanningen geleverd om sferoïden te genereren in steigervrije benaderingen ^8,11. Sferoïden kunnen bijvoorbeeld worden gegenereerd met behulp van een celkweekfles met een roerwerk, waardoor celzaaiing wordt voorkomen, de eenvoudigste methode om sferoïden op grote schaal te produceren¹².

Het moeilijkste bij het complexeren van celculturen en dus bij het opzetten van een fysiologisch waardevol systeem als in vivo-achtige in vitro alternatieven in het laboratorium zijn complexe protocollen met veel verschillende stappen (die nog moeten worden vastgesteld). Bijvoorbeeld, het eerst genereren van cellulaire structuren met behulp van een methode, ze oogsten en ze vervolgens inbedden in een matrix, vooral het gebruik van matrices die niet gemakkelijk te hanteren zijn, zijn cruciale stappen die meer overtuigingskracht vereisen voordat een methode routinematig en serieel kan worden gebruikt. Hier gebruikten we een ultra-lage hechtingsplaat in een formaat met 96 putjes, waardoor er vrijwel geen celhechting aan het kweekwerk mogelijk is voor het maken van complexe 3D-sferoïden van longepitheelcellen en fibroblasten. De resulterende sferoïden worden binnen 24 uur zeer uniform en vrij snel gevormd, wat de experimentele tijdlijn verkort. Langdurige teelt en dus betrouwbare celgroei en differentiatie worden gedurende de gehele periode in dezelfde put uitgevoerd, zodat na de eerste beplating alleen het medium over de gehele teeltperiode hoeft te worden vervangen. Daarom presenteren we een zeer eenvoudig, snel en dus zeer praktisch protocol voor het genereren van menselijke longsferoïden die het luchtwegepitheel morfologisch en functioneel repliceren op bijna-fysiologische niveaus. Een ander voordeel is dat dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan andere cellen.

Protocol

Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden (Bioveiligheidskast). Voor de mediacomposities die in dit onderzoek zijn gebruikt, zie Tabel 1.

1. Voorbereiding van experimenteel materiaal

1. Kweek en expandeer menselijke normale longepitheelcellen (HBEC3-KT) op standaard plastic celkweekschaaltjes (T75-kolven) in normaal epitheelgroeimedium met behulp van een standaard incubator¹³ (zie tabel 1).
   OPMERKING: Voor een betere groei kan het medium extra worden aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS).
2. Kweek humane fibroblasten (HS-5) in RPMI Medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en penicilline/streptomycine^10,14 (zie tabel 1).
3. Bereid vertakt longorganoïde medium (BLO-Medium) voor door DMEM/F12 aan te vullen met N-2, B27, penicilline-streptomycine, runderserumalbumine, monothioglycerol, ascorbinezuur, KGF/FGF7, FGF10, ATRA en CHIR99021. (zie Tabel 1 en Tabel van Materialen).
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het medium vers te bereiden, in ieder geval met toevoeging van KGF/FGF7, FGF10, ATRA en CHIR99021. Als er in korte tijd meer medium nodig is, wordt alleen een korte opslagperiode van enkele dagen (maximaal 1 week) bij 4 °C aanbevolen. Als alternatief kan het in de handel verkrijgbare PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium worden gebruikt.

2. Preparaat van epitheelcellen en fibroblasten

OPMERKING: Gebruik beide celtypen wanneer cellen ongeveer 80% samenvloeien. Bereid elk celtype afzonderlijk voor.

1. Verwijder het kweekmedium en gooi het weg.
2. Spoel de cellen door de cellaag kort te spoelen met 5 ml PBS.
3. Trypsiniseer epitheelcellen door 2 ml 0,5% trypsine-EDTA toe te voegen, gevolgd door een korte incubatie bij 37 °C gedurende 4-8 minuten.
4. Oogst afgeronde en bijna losgeraakte cellen door toevoeging van normale groeimedia of PBS aangevuld met 10% FCS met behulp van een serologische pipet van 5 ml.
5. Pipetteer het juiste volume meerdere keren op en neer in de T75-kolf (langs het groeioppervlak) om de celklonten verder te scheiden en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 ml.
6. Oogst respectievelijk HS5-fibroblasten met behulp van TE-trypsinisatie bij 37 °C gedurende 3-5 minuten.
7. Pellet elk celtype (en dus vrij van trypsine) door centrifugatie (bijv. 300-400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur [RT]) en resustrien (zowel epitheelcellen als fibroblasten) in 1-2 ml normaal epitheelgroeimedium voorafgaand aan het tellen.
8. Bepaal het aantal levensvatbare cellen met behulp van een geschikt volume geresuspendeerde cellen; elk verdund 1/5 met behulp van 0,4% Trypan Blue Stain in een Neubauer-telkamer onder een microscoop.

3. Generatie van epitheliale-fibroblast 3D sferoïde culturen

1. Verdun het gewenste aantal cellen in een normaal epitheelgroeimedium met behulp van een buisje van 15 ml. Bereken 2000 epitheelcellen met 50 fibroblasten in 100 μL medium voor elk putje van de 96 putjesplaten. Het resulterende aantal cellen, voldoende voor één plaat met 96 putjes, is 200.000 HBEC-cellen en 5.000 HS5-fibroblasten in 10 ml normaal epitheelgroeimedium.
2. Meng voorzichtig met behulp van steriele serologische pipetten van 10 ml.
3. Breng de celsuspensie over naar een steriel reagensreservoir voor een meerkanaals micropipet.
4. Zaai de cellen in een ultralage hechtingsplaat door 100 μL van de celsuspensie over te brengen naar elk putje met behulp van een (12-kanaals) meerkanaals pipet.
5. Incubeer onder standaard celkweekomstandigheden bij 37 °C en 5% CO₂ in een bevochtigde atmosfeer.
   OPMERKING: De vorming van sferoïden wordt beoordeeld door middel van regelmatig microscopisch onderzoek met behulp van een omgekeerde microscoop en door sferoïden te fotograferen voor elk gewenst tijdstip.
6. Voeg na 4 dagen 100 μL BLO-Medium per putje toe aan gegenereerde sferoïden.
7. Incubeer verder onder standaard celkweekomstandigheden bij 37 °C en 5% CO₂ in een bevochtigde atmosfeer.

4. Regelmatig wisselen van media

1. Voer na 7-8 dagen regelmatig een mediawissel uit. Plaats de plaat daarom onder een kleine hoek zodat de sferoïden in de kantelrichting zinken, afhankelijk van de zwaartekracht.
2. Zuig het bovenstaande voorzichtig en zo goed mogelijk op met een pipetpunt van 100-200 μl.
3. Plaats de plaat horizontaal terug en vul deze met 100-150 μL BLO-medium per putje (met behulp van een meerkanaals pipet)
4. Incubeer verder onder standaard celkweekomstandigheden bij 37 °C en 5% CO₂ in een bevochtigde atmosfeer of start een experiment/behandeling.
   OPMERKING: De sferoïden kunnen voor langere perioden (tot 21 dagen) worden gekweekt. Vervolgens moet ten minste twee keer per week een volledige mediumwissel worden uitgevoerd.

5. Downstream-analyses (oogst van sferoïden)

1. Voer regelmatig microscopisch onderzoek en documentatie uit door foto's te maken in combinatie met sferoïde-groottemetingen en volumeberekeningen, waardoor uiteindelijk kwantificering van sferoïde groei en mogelijke groeiveranderingen na behandelingen mogelijk is.
2. Voor beeldvorming van levende cellen op de gewenste tijdstippen, incubeer de sferoïden nog eens 15 minuten met 1 μg/ml Hoechst 33342 (of DAPI) voor kernkleuring en analyseer ze met fluorescentiemicroscopie.
3. Oogst gegenereerde sferoïden op het gewenste tijdstip met behulp van een pipet van 200 μl met de uitlaat afgesneden (steriel houden) om de diameter te vergroten. Zuig daarom ook de media op die de sferoïde bevatten. Combineer en verzamel de sferoïden in een buis van 2-5 ml. Na 2-5 minuten, wanneer de sferoïden door de zwaartekracht zijn gezonken, verwijdert u het bovenstaande en gaat u verder met stroomafwaartse analyse.
4. Voor het genereren van hele sferoïde eiwitlysaten wordt direct ijskoude lysisbuffer (150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat, 50 mmol/L Tris/HCl, pH 8, aangevuld met proteaseremmercocktail) toegevoegd aan de buis met de geoogste sferoïden. Bepaal na twee tot drie vries- en dooicycli het eiwitgehalte van de lysaten en ga verder met stroomafwaartse analyse, bijvoorbeeld Western blot-analyse¹⁵.
5. Voor het genereren van hele sferoïde RNA-lysaten voegt u rechtstreeks RNA-lysisbuffer toe aan de buis met de geoogste sferoïden en voert u RNA-isolatie uit volgens de instructies van de fabrikant van de respectieve RNA-isolatiekit die wordt gebruikt.
6. Voor immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentiekleuring volgt u de stappen 5.6.1-5.6.3.
   1. Behandel de geoogste sferoïden met 1-2 ml 4% paraformaldehyde/fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 30 minuten en onderwerp vervolgens paraffine-inbedding en -secties (3-5 μm).
   2. Vóór immunofluorescerende kleuring, bereidt u monsters voor met behulp van een aflopende reeks alcohol en incubatie met een oplossing voor het ophalen van doelen. Blokkeer daarna de objectglaasjes met een blokkerende oplossing (2% normaal geitenserum/PBS) om niet-specifieke interacties te verminderen en incubeer primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C.
   3. Detecteer antigenen door fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Tegenvlek kernen met DAPI. Voer aanvullende kleuringen uit (bijv. PAS-kleuringskit) volgens de protocollen van de fabrikant voor histologische evaluatie.
7. Voor suspensies met één cel volgt u de stappen 5.7.1 en 5.7.2.
   1. Resuspendeer de geoogste sferoïden in 1-2 ml trypLE met 100 E/ml DNase I, gevolgd door een incubatie van 15 minuten bij 37 °C. Stop de spijsvertering door PBS toe te voegen met 2-5% FCS, 2 mM EDTA en DNAse I.
   2. Leid de cellulaire oplossing door een celzeef van 70 μm in een verse conische buis voorafgaand aan stroomafwaartse analyse (bijv. flowcytometrie of analyse van één cel).
8. Volg voor analyse van eencellige RNA-sequencing de stappen 5.8.1-5.8.3.
   1. Label de verschillende single-cell suspensies die verschillende tijdstippen of behandelingen vertegenwoordigen met behulp van een (menselijke) single-cell multiplexingkit volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Combineer monsters daarna en laad ze op een baan op een cartridge met één cel als doel 10.000-40.000 cellen.
   3. Haal afzonderlijke cellen op, voer reverse transcriptie en bibliotheekvoorbereiding uit volgens de instructies van de fabrikant en sequentie geïsoleerd RNA.

Resultaten

Dit eenvoudige protocol maakt de matrixvrije sferoïdale co-cultivatie van menselijke bronchiale epitheelcellen en fibroblasten mogelijk in combinatie met ultralage hechtingsplaten (Figuur 1A). Tijdens het kweekproces vormen zich geleidelijk complexere longsferoïden uit de aanvankelijk gegenereerde sferoïden, waarbij de efficiënte generatie van verschillende epitheliale en fibroblastische structuren directe cellulaire interacties vertegenwoordigen, zoals onth...

Discussie

Er zijn 3D-celcultuurmodellen voorgesteld om de kloof tussen 2D-culturen en in vivo-studies te overbruggen, aangezien dit type (co-)cultuur de fysiologische, morfologische en pathologische eigenschappen die in vivo aanwezig zijn beter nabootst, omdat er meer in vivo-achtige cel-celinteracties, cel-ECM-interacties, reacties op stimuli, genexpressie, eiwitexpressie en differentiatie aanwezig zijn^{17, 18}. o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mL steriele serologische pipetten	ThermoFischer	170356N	Nunc steriele serologische pipetten, of equivalent
15 mL conische buis	Corning	430052	of equivalent
37 °C/ 5% CO2 bevochtigde  incubator
5 mL steriele serologische pipetten	ThermoFischer	170355N	Nunc steriele serologische pipetten, of equivalent
50 mL conische buis	Corning	CLS430829	of equivalent
ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 Supplement (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	gebruik volgens de instructies van de fabrikant
Bioveiligheidscabinet
Rundserumalbumine	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0,4% (v/v)
Celzevener	Corning	352350	Falcon 70 µm Celzevener, Wit, Steriele, Individueel Verpakt
Centrifuge	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	bijv. Eppendorf Centrifuge 5804 - Benchtop Centrifuge
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNase I, RNase-vrij (1 U/μL)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNase-vrij	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research plus 12 kanaals multikanaals pipet	Eppendorf		bijv. #3125000044 (10–100 µL) of #3125000060 (30–300 µL)
Fetaal runder serum	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	menselijke normale long epitheel cel lijn
Heparine Oplossing (0,2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0,8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 µg/mL
HS-5	ATCC	CRL-3611	menselijke stromale fibroblasten
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/mL
Human Single-Cell Multiplexing Kit	BD Bioscience	Cat#633781	gebruik volgens de instructies van de fabrikant
Hydrocortisine Stock Oplossing	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 mL per 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µM
L-Ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µg/mL
Microscoop	ZEISS
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0,4 µM
N-2 Supplement (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
Neubauer tellingkamer	Merck	BR718605	bijv. BRAND tellingkamer BLAUBRAND Neubauer patroon
Normaal geitenserum	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) in PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternatief, 1 %
PAS Kleurset	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	gebruik volgens de instructies van de fabrikant
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899.AK	Paraformaldehyd, 4 % in PBS
PneumaCult Airway Organoid Differentiatie Medium (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Airway Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) en PneumaCult Airway Organoid Differentiatie Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit bestaande uit PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL ) en PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Protease inhibitor cocktail	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 tab/10 mL
Rhapsody cDNA Kit	BD Bioscience	Cat#633773	gebruik volgens de instructies van de fabrikant
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Natriumchloride	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Natriumcitraat	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0,10%
Natriumdeoxycholaat	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0,50%
Natriumdodecylsulfaat	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Steriele reagent reservoir voor multikanaals micropipet (bijv. 60 ml)	ThermoFischer	9510037	of equivalent
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stück	Sarstedt (of facellitate)	83